CN108587934A - 一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一株产生柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。所述基因工程菌为解脂耶氏酵母宿主中导入D柠檬烯合酶基因或L‑柠檬烯合酶基因并且过表达甲羟戊二酸单酰辅酶A还原酶基因(HMGR)基因所得。在YPD培养基中摇瓶发酵后，能够异源合成柠檬烯，产D‑柠檬烯的工程菌株异源合成D‑柠檬烯的产量为0.6305mg/L，产L‑柠檬烯的工程菌株异源合成L‑柠檬烯的产量为0.3672mg/L。

Description

一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母及其构建方法与应用
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种产生柠檬烯的解脂耶氏酵母基因 工程菌及其应用。
背景技术：
解脂耶氏酵母是一种具有典型代表性的非常规酵母。该酵母无致病性，最高 生长温度一般在34℃以下，并且已经被认定为GRAS(generally regarded as safe) 安全级微生物。与酿酒酵母不同，该酵母为严格好氧菌，并具有二型性生长的特 点，碳源、氮源、pH等生长条件都会影响该菌的菌落形态，因此它成为了研究 酵母及真菌菌丝分化的模式菌株。该酵母的另外一个显著优点是它广泛存在于各 类食物和各种生存环境中，这是因为其可以利用的碳源类型极为广泛，包括有机 酸、烷烃、烯烃、油类、醇类、酯类等。此外，解脂耶氏酵母在其代谢过程中能 够产生和分泌多种代谢产物，包括蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶、赖氨酸、γ-癸内酯、 柠檬酸、异柠檬酸和α-酮戊二酸等。由于解脂耶氏酵母具有以上这些生理、代谢 特征和独特优势，因此它也成为了生物化学品等各种产品生产的潜在微生物细胞 工厂。
早期的研究工作主要是利用解脂耶氏酵母发酵生产各种代谢产物。随着分子 生物学的发展，解脂耶氏酵母的全基因组测序工作已经完成，基因表达载体和遗 传转化方法也相继建立并不断发展完善。这些都为新型酵母表达系统—解脂耶氏 酵母表达系统的开发奠定了良好基础。利用代谢工程和合成生物学技术对解脂耶 氏酵母进行改造来改进自身代谢产物的生产以及合成新的目标产物，已成为目前 的一个研究热点。
柠檬烯是一种植物来源的天然活性化合物，具有很高的市场价值。柠檬烯属 于单环单萜类化合物，化学式为C10H16，有右旋体(D型，图1A)、左旋体(L 型，图1B)和外消旋体三种异构体。D-柠檬烯有类似柠檬或甜橙的悦人香味， 并且已经被认定为GRAS(generallyregarded as safe)化合物，因此作为优质香 精香料被广泛应用于食品、饮料、化妆品、化学和医药工业中。L-柠檬烯则有类 似松油和松脂的气味，也具有芳香添加用途。D-柠檬烯还是一种天然、绿色、环 保的工业清洗剂，被广泛应用于印刷、机械、航空、电子和电器工业部件的清洗。 在农业上，D-柠檬烯还作农作物被用的生物杀虫剂。L-柠檬烯和D-柠檬烯还是 极具潜力的新型生物燃料和生物材料。此外，以L-柠檬烯和D-柠檬烯作为前体 物，可以转化合成多种具有高附加值的工业产品。最新的研究表明L-柠檬烯和 D-柠檬烯都有很好的药用价值，例如D-柠檬烯具有抑菌抗菌活性，可以作为良 好的天然抗菌活性物质；D-柠檬烯还具有抗癌活性、促进消化和减肥作用。
柠檬烯的市场需求正越来越大，但由于从植物组织中提取这些宝贵的天然产 物存在着植物来源有限、目标物质含量低和分离提取难度大等缺点，因此利用微 生物生产这些植物来源的天然产物就具有独特优势，也引起了越来越多研究者的 关注。
目前关于利用微生物代谢工程技术生产柠檬烯的研究并不多见，主要集中在 大肠杆菌和酿酒酵母这两种模式菌株中，但是产量并不高，难以实现工业化。针 对柠檬烯在大肠杆菌和酿酒酵母中合成产量低的问题，可能存在诸多原因，有待 于进行进一步的探索。而为柠檬烯的生物合成寻找新的、更理想的微生物宿主是 一个很好的研究方向，借此可以找到柠檬烯合成代谢通路与微生物宿主之间的最 大兼容性。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题就是针对目前柠檬烯异源合成产量低的问题，提 供一株导入D-柠檬烯合酶基因(DLS)或L-柠檬烯合酶基因(LLS)的解脂耶 氏酵母基因工程菌以及该菌株在异源合成柠檬烯的应用，其能够合成柠檬烯以及 通过代谢工程或合成生物学手段构建能够提高柠檬烯产量的工程菌株。
本发明的技术方案之一是：提供一种解脂耶氏酵母基因工程菌，所述基因工 程菌为解脂耶氏酵母宿主中导入D柠檬烯合酶基因或L-柠檬烯合酶基因并且过 表达甲羟戊二酸单酰辅酶A还原酶基因(HMGR)基因所得。
所述D-柠檬烯合酶基因序列是将GenBank登录号为AF514289.1的核苷酸序 列5＇端截去210bp以及3＇端截去262bp并在前后分别加上起始密码子ATG和 终止密码子TGA后经密码子优化并添加his标签得到，其核苷酸序列如序列表 中SEQ ID NO：1所示；
所述L-柠檬烯合酶基因序列是将GenBank登录号为L13459.1的核苷酸序列 5＇端截去196bp以及3＇端截去345bp并在前后分别加上起始密码子ATG和终 止密码子TGA后经密码子优化并添加his标签得到，其核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO：2所示；
所述HMGR基因Genebank登录号为XM_503558，核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO：3所示；
优选的，所述解脂耶氏酵母宿主为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1gku70Δ。
所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1g ku70Δ是在解脂耶氏酵母Po1g菌株中敲除KU70基因获得的，其构建方法参考文献Genetic engineering of anunconventional yeast for renewable biofuel and biochemical production.Journalof Visualized Experiments,2016,115,e54371。所述解脂耶氏酵母Po1g菌株购买自中 国台湾的Yeastern Biotech Co.公司。
本发明的技术方案之二是：提供一种技术方案一所述解脂耶氏酵母基因工程 菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)将D-柠檬烯合酶基因或L-柠檬烯合酶基因分别与HMGR基因插入质粒中， 得到重组质粒；
(2)将重组质粒线性化后导入所述出发菌株中，重组后得到所述基因工程菌。
具体如下：
(1)重组质粒的构建
①根据Genebank中的D-柠檬烯合酶基因和L-柠檬烯合酶基因的核苷酸序列以解脂耶氏酵母密码子使用偏好性分别进行密码子优化，并在基因3′端加入His标签， 之后进行基因合成；
②以带有合成基因的质粒为模板，PCR扩增出D-柠檬烯合酶基因和L-柠檬烯合 酶基因；
③根据Genebank中的HMGR基因序列设计并合成引物，以解脂耶氏酵母Po1g ku70Δ的基因组为模板扩增HMGR基因；
④将②和③中获得的D-柠檬烯合酶基因、L-柠檬烯合酶基因和HMGR基因分别 插入到pYLEX1质粒的多克隆位点上，分别得到重组质粒pYLEX1-D、pYLEX1-L 和pYLEX1-HMGR；
⑤从重组质粒pYLEX1-HMGR上PCR扩增出HMGR表达盒，其核苷酸序列如 序列表SEQID NO：3所示，然后将HMGR表达盒分别克隆到质粒pYLEX1-D 和pYLEX1-L上，分别得到重组质粒pYLEX1-DHR和pYLEX1-LHR；
(2)获得基因工程菌
①将步骤(1)中的重组质粒pYLEX1-DHR和pYLEX1-LHR线性化；
②用醋酸锂转化法将①中的线性化载体分别转化入宿主菌株中；
③用亮氨酸缺陷板筛选转化子，挑选长出的菌株即得到重组后的基因工程菌株。
所述pYLEX1质粒是一种用于基因导入的重组质粒，其依次含有营养缺陷 筛选基因亮氨酸表达盒、标记基因Amp、启动子hp4d、以及终止子XPR2term。 pYLEX1质粒购买自中国台湾的Yeastern Biotech Co.公司
本发明的技术方案之三是：提供技术方案一所述基因工程菌应用于异源合成 柠檬烯中的发酵方法，具体如下：
取所述基因工程菌一环，接种于含25-50mL YPD培养基的250mL三角瓶 中，28-30℃，200-250rpm/min，振荡培养24h左右，以1％的接种量接种于接种 于含25-50mL YPD培养基的250mL三角瓶中，28-30℃，200-250rpm/min，继 续振荡培养16h左右后，以1％的接种量接种于含25-50mL YPD培养基的250mL 三角瓶中，并加入8％-10％的十二烷，25-30℃，200-250rpm/min，摇瓶发酵4-5 天。
所述YPD培养基质量体积百分比组成为：2％(w/v)蛋白胨，1％(w/v) 酵母浸粉，2％(w/v)葡萄糖，115℃，20min灭菌。
有益效果：
1、本发明导入了D-柠檬烯合酶基因或L-柠檬烯合酶基因并且过表达HMGR 基因，得到能够异源合成柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌，不易产生回复突变， 并首次以异源合成D-柠檬烯及L-柠檬烯为目的将该基因工程菌用于异源合成D- 柠檬烯和L-柠檬烯中，其生物合成途径见图2。筛选得到的工程菌生存环境广泛 并对发酵设备及条件没有特殊要求，一般的发酵设备和条件均可使用，因而具有 广泛的应用前景，为柠檬烯产业化生产奠定基础。
2、本发明获得的解脂耶氏酵母基因工程菌与宿主菌株解脂耶氏酵母相比： 在YPD培养基中摇瓶发酵后，能够异源合成柠檬烯，产D-柠檬烯的工程菌株异 源合成D-柠檬烯的产量为0.6305mg/L，产L-柠檬烯的工程菌株异源合成L-柠檬 烯的产量为0.3672mg/L。而现有技术中，以酿酒酵母为宿主菌的工程菌中产柠 檬烯的最高产量为：D-柠檬烯0.028mg/L，L-柠檬烯0.060mg/L。
附图说明：
图1是柠檬烯的结构示意图
其中，A为D-柠檬烯结构示意图，B为L-柠檬烯结构示意图；
图2是重组菌株中柠檬烯的生物合成途径；
图3是重组菌株构建的技术路线图；
图4是重组质粒pYLEX1-D、pYLEX1-L和pYLEX1-HMGR的构建示意图；
图5是重组质粒pYLEX1-DHR和pYLEX1-LHR的构建示意图；
图6是重组质粒pYLEX1-DHR和pYLEX1-LHR的酶切验证图；
其中，泳道1是用SpeⅠ单酶切重组质粒pYLEX1-DHR得到的片段大小为 12853bp，泳道2是用SpeⅠ和NruⅠ双酶切重组质粒pYLEX1-DHR得到的片段 大小分别为5139bp和7713bp；泳道3是用SpeⅠ单酶切重组质粒pYLEX1-LHR 得到的片段大小为12819bp，泳道4是用SpeⅠ和NruⅠ双酶切重组质粒 pYLEX1-LHR得到的片段大小分别为5139bp和7680bp；M为DNAMarker；
图7是D-柠檬烯合酶基因、L-柠檬烯合酶基因和HMGR重组解脂耶氏酵母 的PCR验证图
其中，泳道1是重组解脂耶氏酵母Po1g ku70Δ-DHR基因组为模板，用PYL-F 和PYL-R进行PCR扩增出的片段，泳道2是以重组解脂耶氏酵母Po1g ku70Δ-LHR基因组为模板，用PYL-F和PYL-R进行PCR扩增出的片段，泳道3 是重组解脂耶氏酵母Po1g ku70Δ-DHR基因组为模板，用DJY-F和DJY-R进行 PCR扩增出的片段，泳道4是以重组解脂耶氏酵母Po1gku70Δ-LHR基因组为模 板，用DJY-F和DJY-R进行PCR扩增出的片段；M为DNA Marker；
图8是重组解脂耶氏酵母Po1g ku70Δ-DHR的发酵验证
其中，1为D-柠檬烯标品；2为导入空质粒的宿主菌Po1g ku70Δ发酵液；3为 Po1gku70Δ-DHR发酵液；
图9是重组解脂耶氏酵母Po1g ku70Δ-LHR的发酵验证
其中，1为L-柠檬烯标品；2为导入空质粒的宿主菌Po1g ku70Δ发酵液；3为 Po1gku70Δ-LHR发酵液。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例， 对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解 释本专利，并不用于限定本发明。
下面通过具体的实施方案叙述本发明能产柠檬烯的解脂耶氏酵母及其构建 方法与应用。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1：产柠檬烯的解脂耶氏酵母菌株的构建
重组菌株的构建流程如图3所示。
根据Genebank中的D-柠檬烯合酶基因核苷酸序列(5＇截去210bp以及3＇ 端截去262bp并在前后分别加上起始密码子ATG和终止密码子TGA)和L-柠 檬烯合酶基因核苷酸序列(5＇截去196bp以及3＇端截去345bp并在前后分别 加上起始密码子ATG和终止密码子TGA)以解脂耶氏酵母密码子使用偏好性分 别进行密码子优化并在基因3′端加入His标签，之后由基因合成公司合成，合 成的D-柠檬烯合酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，L-柠檬烯合酶基因核 苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。根据合成后的基因序列、Genebank中HMGR参考序列和整合质粒序列，设计了下述实施例中各引物(表1所示)。
表1.本实例中所用到的引物
划线部分为KpnⅠ酶切位点。
本发明所述基因工程菌的构造过程如下：
(1)以含有合成的D-柠檬烯合酶基因的质粒为模板，用引物D-LS-CL YL-F 和D/L-LS YL-R PCR扩增出D-柠檬烯合酶基因；以含有合成的L-柠檬烯合酶基 因的质粒为模板，用引物L-LS-MS YL-F和D/L-LS YL-R PCR扩增出L-柠檬烯 合酶基因；以解脂耶氏酵母Po1gku70Δ(所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) Po1g ku70Δ是在解脂耶氏酵母Po1g菌株中敲除KU70基因获得的，Po1g菌株可 购买自Yeastern Biotech Co.公司，中国台湾；Po1g ku70Δ的构建方法参考下述 文献中Po1g ku70Δ的构建方法：Genetic engineeringof an unconventional yeast for renewable biofuel and biochemicalproduction.Journal of Visualized Experiments, 2016,115,e54371。)的基因组为模板，用引物HMGR-CZ-F和HMGR-CZ-R PCR 扩增出HMGR基因；
PCR反应条件：95℃5min；95℃30s；54℃30s；72℃4min，30个循环； 72℃10min，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；
PCR反应体系(20μL)：
(2)将纯化的D-柠檬烯合酶基因或L-柠檬烯合酶基因片段用KpnⅠ进行单酶切， 用PmlⅠ和KpnⅠ进行双酶切pYLEX1质粒(购自Yeastern Biotech Co.公司， 中国台湾)，将酶切后的D-柠檬烯合酶基因、L-柠檬烯合酶基因及HMGR基因 片段分别与酶切后的pYLEX1质粒连接，得到含有D-柠檬烯合酶基因的重组质 粒pYLEX1-D、含有L-柠檬烯合酶基因的重组质粒pYLEX1-L和含有HMGR基 因的重组质粒pYLEX1-HMGR(构建示意图见图4)。
(3)用引物BDH-LS-F和BDH-LS-R从重组质粒pYLEX1-HMGR上PCR扩增 出HMGR表达盒，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3，然后将HMGR表 达盒分别克隆到质粒pYLEX1-D和pYLEX1-L上，分别得到重组质粒 pYLEX1-DHR和pYLEX1-LHR(构建示意图见图5)。
图6为重组质粒pYLEX1-DHR和pYLEX1-LHR的酶切验证电泳图，重组质 粒pYLEX1-DHR用SpeI单酶切片段大小为12853bp，用SpeI和NruⅠ酶切片段 大小为5139bp和7713bp；重组质粒pYLEX1-LHR用SpeⅠ单酶切片段大小为 12819bp，用SpeI和NruI酶切片段大小为5139bp和7680bp，其中Marker为 10000bp。
(4)将(3)中重组质粒pYLEX1-DHR和pYLEX1-LHR分别用SpeI酶切线性 化后，用醋酸锂转化法将线性化片段分别转化入Po1g ku70Δ中，在亮氨酸缺陷 板YNB上筛选得到重组后的解脂耶氏酵母菌株Po1g ku70Δ-DHR和Po1g ku70Δ-LHR。提取转化子Po1g ku70Δ-DHR和Po1g ku70Δ-LHR的基因组DNA， 并以此为模板，进行PCR验证(图7)。以实验设计的上下游引物PYL-F和PYL-R 进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段，转化子Po1gku70Δ-DHR 和Po1g ku70Δ-LHR的基因组分别扩增出了检测序列1-1966bp(SEQ ID NO:4)和检测序列2-1933bp(SEQ ID NO:5)大小条带；以实验设计的上下游引物DJY-F 和DJY-R进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段，转化子Po1g ku70Δ-DHR和Po1g ku70Δ-LHR的基因组扩增出了检测序列3-4347bp(SEQ ID NO:6)大小条带，从电泳结果(图7)可以看出，PCR产物大小与预期一致。此 结果说明线性化重组质粒已经成功整合到出发菌株的染色体基因组上，即得产 D-柠檬烯基因工程菌株Po1g ku70Δ-DHR和产L-柠檬烯的基因工程菌株Po1g ku70Δ-LHR。
实施例2：实施例1所得基因工程菌发酵生产柠檬烯
将实施例1中所得的工程菌Po1g ku70Δ-DHR、Po1g ku70Δ-LHR和宿主菌 株解脂耶氏Po1g ku70Δ各取一环，接种于含25mL YPD培养基的250mL三角 瓶中，30℃，225rpm/min，振荡培养24h后，以1％的接种量接种于含25mL YPD 培养基的250mL三角瓶中，30℃，225rpm/min，继续振荡培养16h后按1％的 接种量接种到含25mL YPD培养基的250mL三角瓶中，并加入10％的十二烷， 28℃，225rpm/min，摇瓶发酵5天。
发酵结束后，将发酵液全部倒入50mL离心管中，7500rpm，4℃，离心5min， 取有机相过膜，气相色谱-质谱联用备用待测。结果如图8和图9。由结果可知， 工程菌与导入空质粒的宿主菌株解脂耶氏酵母Po1g ku70Δ相比，能够产生柠檬 烯，产D-柠檬烯的工程菌株异源合成柠檬烯的产量为0.6305mg/L，产L-柠檬烯 的工程菌株异源合成柠檬烯的产量为0.3672mg/L。
YPD培养基组成：2％(w/v)蛋白胨、1％(w/v)酵母浸粉、2％(w/v)葡 萄糖，115℃，20min灭菌。
气相色谱-质谱联用检测条件：
色谱柱HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm，美国瓦里安)，载气：高纯氦气， 流速为1mL/min，进样口温度280℃，升温程序：60℃2min，5℃/min升到140℃， 10℃/min升到280℃，280℃2min，溶剂延迟3min，离子扫描模式为选扫(67、 93、136m/z)，进样量为1μL。
实施例3：实施例1所得基因工程菌发酵生产柠檬烯
将实施例1中所得的工程菌Po1g ku70Δ-DHR、Po1g ku70Δ-LHR各取一环， 接种于含50mL YPD培养基的250mL三角瓶中，28℃，250rpm/min，振荡培养 24h后，以1％的接种量接种于含50mL YPD培养基的250mL三角瓶中，28℃， 250rpm/min，继续振荡培养16h后按1％的接种量接种到含50mL YPD培养基的 250mL三角瓶中，并加入8％的十二烷，30℃，200rpm/min，摇瓶发酵4天。
经检查，中产D-柠檬烯的工程菌株异源合成柠檬烯的产量为0.6175mg/发酵 液，产L-柠檬烯的工程菌株异源合成柠檬烯的产量为0.3564mg/L发酵液。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技 术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变 形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以 权利要求为准。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种产柠檬烯的解脂耶氏酵母及其构建方法与应用
<130> 1
<141> 2018-05-10
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1686
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
atgcgacgat ctgccaacta ccagccctcc atctgggacc acgactttct ccagtccctc 60
aactctaact acaccgatga gacctacaga cgacgagccg aggagctgaa gggcaaggtc 120
aagatcgcca tcaaggacgt gactgagccc ctggaccaat tagaactcat tgacaacctg 180
cagcgactgg gcctggccta tagatttgag accgagatca gaaatattct gcacaacatc 240
tataacaaca acaaggacta cgtctggcga aaggagaacc tgtacgccac ttctttagag 300
tttagactcc tgcgacagca cggttaccct gtctcccagg aagtgtttaa cggcttcaag 360
gacgaccagg gtggcttcat tttcgatgac ttcaagggta ttctgtctct gcacgaggct 420
tcttactact ccctggaggg cgagtctatc atggaggagg cctggcagtt tacctccaag 480
cacctgaagg aggtcatgat ctctaagtct atggaggagg acgtgtttgt ggctgagcag 540
gctaaacgtg ctttagaact gcccctccac tggaaggtcc ccatgctcga agcccgatgg 600
ttcatccatg tttacgagaa gcgagaggat aagaaccacc tcctgttaga actggccaag 660
atggagttta acaccctcca ggccatttac caggaggagc tcaaggagat ttccggctgg 720
tggaaggata ccggcctggg cgagaaactg tcctttgccc gaaaccgact ggtcgcctct 780
ttcctctggt ccatgggcat tgcctttgaa ccccaattcg cctactgcag acgagtcctc 840
accatctcca tcgccctcat caccgtgatc gacgacattt acgatgtcta cggcactctg 900
gacgagctgg aaatttttac cgacgctgtg gcccgatggg atatcaacta cgccctcaag 960
cacctccctg gttacatgaa gatgtgtttc ctcgccctct acaacttcgt caacgagttc 1020
gcctattacg tgctcaagca gcaggacttc gatatgctgc tgtccatcaa gaacgcttgg 1080
ctgggcctga tccaggccta cctggtcgag gccaagtggt atcattccaa gtacacccct 1140
aagctggagg agtatctgga gaacggcctg gtgtctatca ccggtcccct cattattgcc 1200
atctcctacc tctccggcac caaccccatc atcaagaagg agttagaatt tctggagtcc 1260
aaccccgaca ttgtccactg gtcctccaaa atttttcgac tccaggacga cctgggcact 1320
tcctctgacg agatccagcg aggtgacgtc cctaagtcca tccagtgcta catgcatgag 1380
actggcgcct ccgaagaagt cgcccgagag catattaagg acatgatgcg acagatgtgg 1440
aagaaggtga atgcctacac cgccgacaaa gactctcctc tcacccgaac caccaccgag 1500
tttctgctga acctcgtccg aatgtctcac ttcatgtacc tccatggcga cggtcacggc 1560
gtccagaacc aagaaactat cgacgtcggc tttactctgc tcttccagcc cattcccctg 1620
gaggacaagg acatggcctt tactgcttct cccggcacca agggtcatca tcaccatcac 1680
cactaa 1686
<210> 2
<211> 1653
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atggagcgac gatccggcaa ttataatccc tcccgatggg acgtcaattt catccagtct 60
ctcctctccg actacaagga agacaagcat gtgatcagag cctccgagct ggtgaccctg 120
gtgaagatgg agctggagaa ggagaccgac cagatcagac aactcgaact catcgacgac 180
ctccagcgaa tgggcctgtc cgaccacttc cagaacgagt ttaaggaaat cctctcttct 240
atctacctgg accatcacta ctacaagaac ccctttccta aggaggagcg tgatttatac 300
tccacctccc tggcctttcg actgctccga gagcacggtt tccaggtggc ccaggaggtc 360
ttcgactcct tcaagaacga agagggcgag ttcaaggagt ccctctccga cgacacccga 420
ggcctgctgc agctgtacga ggcctctttc ctgctcactg agggcgagac tactctggag 480
tctgcccgag agttcgctac taaattttta gaagagaagg tcaacgaggg cggcgtcgac 540
ggtgatctcc tgaccagaat tgcctactct ctcgacatcc ctctccactg gcgaatcaag 600
agacccaatg cccctgtgtg gatcgagtgg tatcgtaagc gacccgacat gaatcccgtc 660
gtgttagaac tggctatcct ggacctcaac atcgtgcagg cccagttcca ggaggagctg 720
aaagagtcct tccgatggtg gcgaaacacc ggctttgtcg agaagctccc ttttgcccga 780
gaccgactcg tcgagtgcta cttctggaac accggcatca ttgaaccccg acagcatgct 840
tctgctcgta ttatgatggg taaggtgaac gctctgatca ccgtgatcga cgacatctac 900
gacgtgtacg gcaccctgga ggagctggaa cagtttactg atctgattcg acgatgggac 960
attaactcta tcgaccagct gcccgactat atgcagctgt gctttctcgc cctgaataac 1020
tttgtggacg acacctccta cgacgtcatg aaggaaaaag gcgtgaacgt catcccctac 1080
ctgcgacaat cctgggtcga tctggctgac aagtacatgg tcgaagcccg atggttctac 1140
ggcggccaca agccctcttt agaagagtac ctggagaact cctggcagtc catctccggt 1200
ccctgtatgc tcacccacat tttcttcaga gtcaccgact ctttcactaa agaaactgtt 1260
gattccctct acaagtacca cgacctggtc agatggtctt cttttgtcct gcgactcgct 1320
gacgacctgg gcacttctgt ggaggaagtg tcccgaggtg acgtgcctaa gtccctccaa 1380
tgctacatgt ccgattacaa cgcctctgag gctgaggcca gaaagcacgt caagtggctc 1440
attgccgaag tctggaagaa gatgaacgcc gagcgagtct ccaaggactc ccccttcggt 1500
aaggacttca tcggctgcgc cgtcgacctg ggcagaatgg cccagctcat gtaccacaac 1560
ggcgacggcc acggcactca gcaccctatc atccaccagc agatgacccg aaccctgttc 1620
gagcctttcg ctcatcatca ccatcaccac taa 1653
<210> 3
<211> 3000
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolyticaPo1g ku70Δ)
<400> 3
atgctacaag cagctattgg aaagattgtg ggatttgcgg tcaaccgacc catccacaca 60
gttgtcctga cgtccatcgt ggcgtcaacc gcatacctcg ccatcctcga cattgccatc 120
ccgggtttcg agggcacaca acccatctca tactaccacc ctgcagcaaa atcttacgac 180
aaccctgctg attggaccca cattgcagag gccgacatcc cttcagacgc ctaccgactt 240
gcatttgccc agatccgtgt cagtgatgtt cagggcggag aggcccccac catccctggc 300
gccgtggccg tgtctgatct cgaccacaga atcgtcatgg actacaaaca gtgggccccc 360
tggaccgcca gcaacgagca gatcgcctcg gagaaccaca tctggaagca ctccttcaag 420
gaccacgtgg ccttcagctg gatcaagtgg ttccgatggg cctacctgcg tttgtccact 480
ctcatccagg gggcagacaa cttcgacatt gccgtggtcg cccttggcta tcttgccatg 540
cactacacct tcttcagtct cttccgatcc atgcgaaagg ttggctcgca cttttggctt 600
gcctccatgg ctctggtctc ttccaccttc gctttcctgc ttgcggtggt ggcttcctct 660
agcctgggtt accgacctag catgatcacc atgtccgagg gcctgccctt cctcgtggtc 720
gccattggct ttgaccgaaa ggtcaacctg gctagcgagg tgctcacatc caagagcagc 780
cagctcgctc ccatggtgca ggtgatcaca aagatcgcct ccaaggcgct gtttgagtac 840
agccttgagg tggccgccct gtttgctggc gcctataccg gagttcctcg actgtcccag 900
ttttgcttct tatctgcttg gatcctcatc ttcgactaca tgtttttgct gaccttctac 960
tctgctgtcc ttgctatcaa gtttgagatc aatcacatta agcgaaaccg aatgatccag 1020
gatgctctca aggaggatgg tgtatctgct gctgttgccg agaaggtagc cgactcttct 1080
cccgacgcca agctcgaccg aaagtccgac gtttctcttt ttggagcctc tggcgccatt 1140
gcggtgttca agatcttcat ggtccttggg ttccttggtc tcaacctcat caacctgact 1200
gccatccctc accttggcaa ggcggccgcc gctgcccagt ctgtgactcc catcaccctc 1260
tcccccgagc ttctccatgc catccccgcc tctgtgcccg ttgttgtcac ctttgtgccc 1320
agcgttgtgt acgagcactc ccagctcatt ctgcagctgg aggacgccct cactaccttc 1380
ctggctgcct gctccaaaac tattggtgac cccgtcatct ccaagtacat cttcctgtgc 1440
ctgatggtct ccaccgccct gaacgtctac ctgtttggag ccacccgaga agttgtgcga 1500
acccagtctg tgaaggtggt tgagaagcac gttcctatcg tcattgagaa gcccagcgag 1560
aaggaggagg acacctcttc tgaagactcc attgagctga ctgtcggaaa gcagcccaag 1620
cccgtgaccg agacccgttc tctggacgac ctagaggcta tcatgaaggc aggtaagacc 1680
aagcttctgg aggaccacga ggttgtcaag ctctctctcg agggcaagct tcctttgtat 1740
gctcttgaga agcagcttgg tgacaacacc cgagctgttg gcatccgacg atctatcatc 1800
tcccagcagt ctaataccaa gactttagag acctcaaagc ttccttacct gcactacgac 1860
tacgaccgtg tttttggagc ctgttgcgag aacgttattg gttacatgcc tctccccgtt 1920
ggtgttgctg gccccatgaa cattgatggc aagaactacc acattcctat ggccaccact 1980
gagggttgtc ttgttgcctc aaccatgcga ggttgcaagg ccatcaacgc cggtggcggt 2040
gttaccactg tgcttactca ggacggtatg acacgaggtc cttgtgtttc cttcccctct 2100
ctcaagcggg ctggagccgc taagatctgg cttgattccg aggagggtct caagtccatg 2160
cgaaaggcct tcaactccac ctctcgattt gctcgtctcc agtctcttca ctctaccctt 2220
gctggtaacc tgctgtttat tcgattccga accaccactg gtgatgccat gggcatgaac 2280
atgatctcca agggcgtcga acactctctg gccgtcatgg tcaaggagta cggcttccct 2340
gatatggaca ttgtgtctgt ctcgggtaac tactgcactg acaagaagcc cgcagcgatc 2400
aactggatcg aaggccgagg caagagtgtt gttgccgaag ccaccatccc tgctcacatt 2460
gtcaagtctg ttctcaaaag tgaggttgac gctcttgttg agctcaacat cagcaagaat 2520
ctgatcggta gtgccatggc tggctctgtg ggaggtttca atgcacacgc cgcaaacctg 2580
gtgaccgcca tctaccttgc cactggccag gatcctgctc agaatgtcga gtcttccaac 2640
tgcatcacgc tgatgagcaa cgtcgacggt aacctgctca tctccgtttc catgccttct 2700
atcgaggtcg gtaccattgg tggaggtact attttggagc cccagggggc tatgctggag 2760
atgcttggcg tgcgaggtcc tcacatcgag acccccggtg ccaacgccca acagcttgct 2820
cgcatcattg cttctggagt tcttgcagcg gagctttcgc tgtgttctgc tcttgctgcc 2880
ggccatcttg tgcaaagtca tatgacccac aaccggtccc aggctcctac tccggccaag 2940
cagtctcagg ccgatctgca gcgtctacaa aacggttcga atatttgcat acggtcatag 3000
<210> 4
<211> 1966
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
cctcgatccg gcatgcactg atcacgggca aaagtgcgta tatatacaag agcgtttgcc 60
agccacagat tttcactcca cacaccacat cacacataca accacacaca tccacaatgc 120
gacgatctgc caactaccag ccctccatct gggaccacga ctttctccag tccctcaact 180
ctaactacac cgatgagacc tacagacgac gagccgagga gctgaagggc aaggtcaaga 240
tcgccatcaa ggacgtgact gagcccctgg accaattaga actcattgac aacctgcagc 300
gactgggcct ggcctataga tttgagaccg agatcagaaa tattctgcac aacatctata 360
acaacaacaa ggactacgtc tggcgaaagg agaacctgta cgccacttct ttagagttta 420
gactcctgcg acagcacggt taccctgtct cccaggaagt gtttaacggc ttcaaggacg 480
accagggtgg cttcattttc gatgacttca agggtattct gtctctgcac gaggcttctt 540
actactccct ggagggcgag tctatcatgg aggaggcctg gcagtttacc tccaagcacc 600
tgaaggaggt catgatctct aagtctatgg aggaggacgt gtttgtggct gagcaggcta 660
aacgtgcttt agaactgccc ctccactgga aggtccccat gctcgaagcc cgatggttca 720
tccatgttta cgagaagcga gaggataaga accacctcct gttagaactg gccaagatgg 780
agtttaacac cctccaggcc atttaccagg aggagctcaa ggagatttcc ggctggtgga 840
aggataccgg cctgggcgag aaactgtcct ttgcccgaaa ccgactggtc gcctctttcc 900
tctggtccat gggcattgcc tttgaacccc aattcgccta ctgcagacga gtcctcacca 960
tctccatcgc cctcatcacc gtgatcgacg acatttacga tgtctacggc actctggacg 1020
agctggaaat ttttaccgac gctgtggccc gatgggatat caactacgcc ctcaagcacc 1080
tccctggtta catgaagatg tgtttcctcg ccctctacaa cttcgtcaac gagttcgcct 1140
attacgtgct caagcagcag gacttcgata tgctgctgtc catcaagaac gcttggctgg 1200
gcctgatcca ggcctacctg gtcgaggcca agtggtatca ttccaagtac acccctaagc 1260
tggaggagta tctggagaac ggcctggtgt ctatcaccgg tcccctcatt attgccatct 1320
cctacctctc cggcaccaac cccatcatca agaaggagtt agaatttctg gagtccaacc 1380
ccgacattgt ccactggtcc tccaaaattt ttcgactcca ggacgacctg ggcacttcct 1440
ctgacgagat ccagcgaggt gacgtcccta agtccatcca gtgctacatg catgagactg 1500
gcgcctccga agaagtcgcc cgagagcata ttaaggacat gatgcgacag atgtggaaga 1560
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tgctgaacct cgtccgaatg tctcacttca tgtacctcca tggcgacggt cacggcgtcc 1680
agaaccaaga aactatcgac gtcggcttta ctctgctctt ccagcccatt cccctggagg 1740
acaaggacat ggcctttact gcttctcccg gcaccaaggg tcatcatcac catcaccact 1800
aaggtacctc catggcctgt ccccacgttg ccggtcttgc ctcctactac ctgtccatca 1860
atgacgaggt tctcacccct gcccaggtcg aggctcttat tactgagtcc aacaccggtg 1920
ttcttcccac caccaacctc aagggctctc ccaacgctgt tgccta 1966
<210> 5
<211> 1933
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
cctcgatccg gcatgcactg atcacgggca aaagtgcgta tatatacaag agcgtttgcc 60
agccacagat tttcactcca cacaccacat cacacataca accacacaca tccacaatgg 120
agcgacgatc cggcaattat aatccctccc gatgggacgt caatttcatc cagtctctcc 180
tctccgacta caaggaagac aagcatgtga tcagagcctc cgagctggtg accctggtga 240
agatggagct ggagaaggag accgaccaga tcagacaact cgaactcatc gacgacctcc 300
agcgaatggg cctgtccgac cacttccaga acgagtttaa ggaaatcctc tcttctatct 360
acctggacca tcactactac aagaacccct ttcctaagga ggagcgtgat ttatactcca 420
cctccctggc ctttcgactg ctccgagagc acggtttcca ggtggcccag gaggtcttcg 480
actccttcaa gaacgaagag ggcgagttca aggagtccct ctccgacgac acccgaggcc 540
tgctgcagct gtacgaggcc tctttcctgc tcactgaggg cgagactact ctggagtctg 600
cccgagagtt cgctactaaa tttttagaag agaaggtcaa cgagggcggc gtcgacggtg 660
atctcctgac cagaattgcc tactctctcg acatccctct ccactggcga atcaagagac 720
ccaatgcccc tgtgtggatc gagtggtatc gtaagcgacc cgacatgaat cccgtcgtgt 780
tagaactggc tatcctggac ctcaacatcg tgcaggccca gttccaggag gagctgaaag 840
agtccttccg atggtggcga aacaccggct ttgtcgagaa gctccctttt gcccgagacc 900
gactcgtcga gtgctacttc tggaacaccg gcatcattga accccgacag catgcttctg 960
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gccacaagcc ctctttagaa gagtacctgg agaactcctg gcagtccatc tccggtccct 1320
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acctgggcac ttctgtggag gaagtgtccc gaggtgacgt gcctaagtcc ctccaatgct 1500
acatgtccga ttacaacgcc tctgaggctg aggccagaaa gcacgtcaag tggctcattg 1560
ccgaagtctg gaagaagatg aacgccgagc gagtctccaa ggactccccc ttcggtaagg 1620
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<213> 人工序列()
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aatcgccgtg acgatcagcg gtccagtgat cgaagttagg ctggtaagag ccgcgagcga 60
tccttgaagc tgtccctgat ggtcgtcatc tacctgcctg gacagcatgg cctgcaacgc 120
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acctcgatcc ggcatgctga ggtgtctcac aagtgccgtg cagtcccgcc cccacttgct 360
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cacatacaac cacacacatc cacaatgcta caagcagcta ttggaaagat tgtgggattt 780
gcggtcaacc gacccatcca cacagttgtc ctgacgtcca tcgtggcgtc aaccgcatac 840
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cccgttgttg tcacctttgt gcccagcgtt gtgtacgagc actcccagct cattctgcag 2100
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ggagccaccc gagaagttgt gcgaacccag tctgtgaagg tggttgagaa gcacgttcct 2280
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ttcaatgcac acgccgcaaa cctggtgacc gccatctacc ttgccactgg ccaggatcct 3360
gctcagaatg tcgagtcttc caactgcatc acgctgatga gcaacgtcga cggtaacctg 3420
ctcatctccg tttccatgcc ttctatcgag gtcggtacca ttggtggagg tactattttg 3480
gagccccagg gggctatgct ggagatgctt ggcgtgcgag gtcctcacat cgagaccccc 3540
ggtgccaacg cccaacagct tgctcgcatc attgcttctg gagttcttgc agcggagctt 3600
tcgctgtgtt ctgctcttgc tgccggccat cttgtgcaaa gtcatatgac ccacaaccgg 3660
tcccaggctc ctactccggc caagcagtct caggccgatc tgcagcgtct acaaaacggt 3720
tcgaatattt gcatacggtc atagggtacc tccatggcct gtccccacgt tgccggtctt 3780
gcctcctact acctgtccat caatgacgag gttctcaccc ctgcccaggt cgaggctctt 3840
attactgagt ccaacaccgg tgttcttccc accaccaacc tcaagggctc tcccaacgct 3900
gttgcctaca acggtgttgg catttaggca attaacagat agtttgccgg tgataattct 3960
cttaacctcc cacactcctt tgacataacg atttatgtaa cgaaactgaa atttgaccag 4020
atattgttgt aaatagaaaa tctggcttgt aggtggcaaa atgcggcgtc tttgttcatc 4080
aattccctct gtgactactc gtcatccctt tatgttcgac tgtcgtattt cttattttcc 4140
atacatatgc aagtgagatg cccgtgtccg aattctcatg tttgacagct tatcatcgat 4200
gatcgcgaac gccagcaaga cgtagcccag cgcgtcggcc gccatgccgg cgataatggc 4260
ctgcttctcg ccgaaacgtt tggtggcggg accagtgacg aaggcttgag cgagggcgtg 4320
caagattccg aataccgcaa gcgacag 4347
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
cctcgatccg gcatgcactg atcacg 26
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
taggcaacag cgttgggaga gcccttgagg 30
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
aatcgccgtg acgatcagc 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
ctgtcgcttg cggtattcgg 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
aatgcgacga tctgccaact ac 22
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
ggggtacctt agtggtgatg gtgatgatg 29
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
aatggagcga cgatccggca attataatc 29
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
acaaccacac acatccacaa tgctacaagc agctattgga aa 42
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
gggacaggcc atggaggtac cctatgaccg tatgcaaata ttcgaa 46
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
ccatccagcc tcgcgtcggt taactatcct agggtgcatg ctgag 45
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
acgtcttgct ggcgttcgcg atcatcgatg ataagctgtc aaaca 45

Claims (7)

1.一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为解脂耶氏酵母宿主中导入D柠檬烯合酶基因或L-柠檬烯合酶基因，并且过表达甲羟戊二酸单酰辅酶A还原酶基因HMGR基因所得。
2.如权利要求1所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述D柠檬烯合酶基因其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；所述L柠檬烯合酶基因其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；所述HMGR基因其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。
3.如权利要求1所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述解脂耶氏酵母宿主为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1g ku70Δ。
4.权利要求1所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体如下：
(1)将D-柠檬烯合酶基因或L-柠檬烯合酶基因分别与HMGR基因插入质粒中，得到重组质粒；
(2)将重组质粒线性化后导入所述出发菌株中，重组后得到所述基因工程菌。
5.如权利要求4所述的一种解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体如下：
(1)重组质粒的构建
①将D-柠檬烯合酶基因、L-柠檬烯合酶基因和HMGR基因分别插入到pYLEX1质粒的多克隆位点上，分别得到重组质粒pYLEX1-D、pYLEX1-L和pYLEX1-HMGR；
②从重组质粒pYLEX1-HMGR上PCR扩增出HMGR表达盒，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：3所示，然后将HMGR表达盒分别克隆到质粒pYLEX1-D和pYLEX1-L上，分别得到重组质粒pYLEX1-DHR和pYLEX1-LHR；
(2)获得基因工程菌
①将步骤(1)中的重组质粒pYLEX1-DHR和pYLEX1-LHR线性化；
②用醋酸锂转化法将①中的线性化载体分别转化入宿主菌株中；
③用亮氨酸缺陷板筛选转化子，挑选长出的菌株即得到重组后的基因工程菌株。
6.权利要求1所述解脂耶氏酵母基因工程菌的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于应用于异源合成柠檬烯中的发酵方法，具体如下：
取所述基因工程菌一环，接种于含25-50mL YPD培养基的250mL三角瓶中，28-30℃，200-250rpm/min，振荡培养24h左右，以1％的接种量接种于接种于含25-50mL YPD培养基的250mL三角瓶中，28-30℃，200-250rpm/min，继续振荡培养16h左右后，以1％的接种量接种于含25-50mL YPD培养基的250mL三角瓶中，并加入8％-10％的十二烷，25-30℃，200-250rpm/min，摇瓶发酵4-5天。
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