CN108795836A - 一种合成甘露醇的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
一种合成甘露醇的基因工程菌及其构建方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种能够利用果糖合成甘露醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法。利用Crispr/Cas9基因组编辑技术对大肠杆菌K‑12 MG1655的甘露醇磷酸转移酶基因及其IIA、IIB和IIC元件进行敲除，得到大肠杆菌突变体，并通过质粒pTrc99a整合来源于布氏乳杆菌的甘露醇脱氢酶基因，构建重组载体，并实现了其在大肠杆菌突变体中的高效表达，获得重组大肠杆菌，通过发酵技术诱导表达获得甘露醇。利用本发明方法构建的基因工程菌经发酵培养12h后，使用高效液相色谱进行检测，大肠杆菌具备生产甘露醇的能力，在常温下，甘露醇的产量可达30g/L‑40g/L，有利于甘露醇的工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种合成甘露醇的基因工程菌及其构建方法与应用，属于生物技术和基因工程技术领域。
背景技术
D-甘露醇(D-mannitol)，又名己六醇，分子式为C6H14O6，是一种天然的六元糖醇。D-甘露醇广泛存在于植物的根茎叶中，是目前唯一可从植物中提取的具有工业价值的精醇，也是进入人们生活中最早的一种功能性糖醇。由于D-甘露醇具有优良而稳定的性质，所以在医药、化学和食品工业中有着广泛的应用。目前，D-甘露醇的生产方法有海藻提取法、化学氢化法、发酵法和电化学法等。
利用发酵法生产D-甘露醇，是利用微生物所产特异性的酶，专一性的催化底物合成D-甘露醇，可有效解决产物特异性差的问题，已发现乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oencoccus)、球拟酵母(Torulopsis)、假丝酵母(Candida)、青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)等微生物均可合成D-甘露醇，其中关于乳酸菌产D-甘露醇的研究较多。其中异型乳酸菌可利用自身的甘露醇脱氢酶(MDH，EC 1.1.1.138；EC1.1.1.67)实现以β-NADH或β-NADPH为辅酶将D-果糖转化成D-甘露醇。然而利用异型乳酸菌发酵生产甘露醇，尽管底物果糖的转化率较高，但果糖的成本相对也较高，除乳酸以外的其它副产物也较多，会影响菌体的密度和甘露醇的合成。
CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPR RNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(singleguide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。
大肠杆菌作为目前研究最透彻的模式生物，由于其遗传背景、代谢机理清晰，遗传操作方法和培养条件成熟、完善，被认为是用来合成基础化学品的非常好的底盘微生物，因此，利用大肠杆菌具有重要的研究意义和工业生产前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够利用果糖合成甘露醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法。
实现本发明目的的技术方案概述如下：
以大肠杆菌K-12 MG1655为出发菌株，通过基本的分子生物学技术手段获得其基因组上的甘露醇磷酸转移酶基因及其IIA、IIB和IIC元件，通过PCR、重叠PCR等构建打靶片段之后，利用Crispr/Cas9基因组编辑技术对大肠杆菌K-12 MG1655的甘露醇磷酸转移酶基因及其IIA、IIB和IIC元件进行基因敲除，得到大肠杆菌突变体，并通过质粒pTrc99a整合来源于布氏乳杆菌的甘露醇脱氢酶编码基因，构建重组载体，并实现了其在大肠杆菌突变体中的高效表达，获得重组大肠杆菌。再通过发酵技术诱导表达获得甘露醇。
在本发明中采用如下定义：
1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2、大肠杆菌突变体的标识
采用“Δ”来表示大肠杆菌突变体中要敲除的基因。如ΔcmtA，表示要敲除的基因为cmtA。
在本发明中，小写斜体cmtA表示甘露醇磷酸转移酶编码基因中的IIB和IIC元件，小写斜体cmtB表示甘露醇磷酸转移酶编码基因中的IIA元件，小写斜体mtlA表示甘露醇磷酸转移酶的编码基因
3、敲除、敲入的各目标基因的Genebank ID如下：
进一步地，本发明上述基因工程菌的构建方法包括如下步骤：
1)以大肠杆菌K-12 MG1655为出发菌株，利用Crispr/Cas9基因编辑技术敲除甘露醇磷酸转移酶编码基因中的IIA(Genebank ID：945125)、IIB和IIC元件(Genebank ID：945256)，获得大肠杆菌突变菌株K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtB)；
2)以K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtB)为出发菌株，利用Crispr/Cas9基因编辑技术进一步敲除甘露醇磷酸转移酶编码基因mtlA(Genebank ID：948118)，获得大肠杆菌突变菌株K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)；
3)以布氏乳杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增NADH依赖型的甘露醇脱氢酶基因mdh(NADH)(Genebank ID：34323815)，与质粒pTrc99a经相同双酶切后连接，构建重组质粒pTrc99a-mdh(NADH)，转入大肠杆菌K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)，即获得合成甘露醇的重组基因工程菌K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)/pTrc99a-mdh(NADH)。
本发明还提供上述基因工程菌以果糖为底物合成甘露醇的用途。
所述基因工程菌接种于液体LB培养基中，30-37℃、180-220r/min振荡培养过夜，再按2％的接种量接种于液体LB培养基中，30-37℃振荡培养至菌液的OD600值达到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，16℃、160r/min诱导表达10h，离心、收集沉淀，进行超声破碎，向破碎后的细胞破碎液中添加0.8-1.2mol/L果糖作为底物在室温下进行转化合成甘露醇。
有益效果：
1)本发明利用Crispr/Cas9基因组编辑技术对甘露醇磷酸转移酶进行基因敲除，得到阻断甘露醇分解的突变体K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)，cmtA、cmtB、mtlA三个基因全部敲除后，菌株已无法再利用甘露醇作为碳源进行生长，彻底阻断了甘露醇的分解途径。
2)本发明分别使用了大肠杆菌表达系统、Crispr/Cas9基因组编辑技术，实现突变体不同方式的高效表达。
3)本发明选择了布氏乳杆菌来源的甘露醇脱氢酶基因，利用基因工程手段，克隆得到了甘露醇脱氢酶基因，应用到大肠杆菌中，本发明以敲除甘露醇分解途径中的关键基因并且敲入了甘露醇脱氢酶基因的重组菌为生产菌株，利用本发明方法构建的生产甘露醇的基因工程菌经发酵培养12h后，使用高效液相色谱进行检测，大肠杆菌具备生产甘露醇的能力，在常温下，甘露醇的产量可达30g/L-40g/L，是目前已报道的基因工程菌中合成甘露醇能力较高的基因工程菌，有效地促进甘露醇的合成，实现了大肠杆菌中甘露醇产量的积累。本发明的基因工程菌大大提高了生物合成甘露醇的产量，有利于甘露醇的工业化生产，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：菌株K-12 MG1655、K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtB)、K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)的生长曲线比较。
图2：菌株K-12 MG1655、K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtB)、K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)利用甘露醇的能力比较。
图3：mdh(NADH)基因的扩增结果。其中，M：DNA marker，1：PCR产物。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明实施例所用培养基如下：
MRS液体培养基(g/L)：牛肉膏10.0，蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，K2HPO4 2.0，柠檬酸三铵2.0，CH3COONa 5.0，葡萄糖20.0，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.19，吐温-801mL/L；115℃灭菌20min；在MRS液体培养基中添加1.5-2％琼脂粉作为MRS固体培养基。用于培养布氏乳杆菌，37℃静置培养。
LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸粉5.0，NaCl 5.0。用于大肠杆菌培养，37℃、220r/min摇床振荡培养。
LA培养基：LB培养基中添加20g/L琼脂粉。
SOB培养基(g/L)：胰蛋白胨20.0，酵母浸粉5.0，NaCl 0.5，KCl溶液(0.25mol/L)10mL/L，MgCl2溶液(2mol/L)5mL/L。
SOC培养基：1L的SOB中添加20mL 1mol/L葡萄糖溶液(终浓度20mmol/L)，葡萄糖先进行过滤除菌，在无菌条件下加入灭菌的SOB培养基中。
上述培养基的固体培养基均添加2％琼脂。
实施例1：重组大肠杆菌的构建
1.1以大肠杆菌K-12 MG1655基因组为模板，敲除甘露醇磷酸转移酶编码基因中的IIA、IIB和IIC元件，获得突变菌株K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtB)
以菌株K-12 MG1655为出发菌株，敲除基因cmtA、cmtB。以大肠杆菌K-12 MG1655基因组为模板，分别用两对引物cmtAcmtB-up-1/2、cmtAcmtB-down-1/2(如表1所示)扩增靶基因cmtAcmtB的上下游同源臂，所得两个PCR产物大小均为600bp。将两个片段进行重叠PCR得到线性目的片段，大小为1200bp，纯化回收PCR产物，-20℃保存备用。再将由金唯智公司合成的sgRNA片段(如表2所示)与经反向PCR获得的pGRB质粒进行连接，用同源重组酶ClonExpress于37℃连接30min。利用化学转化法将重组质粒pGRB转入大肠杆菌DH5α，通过氨苄青霉素抗性平板筛选转化子。提取转化子并经菌落PCR验证，所得片段大小为600bp，与预期一致。然后利用Crispr/Cas9系统对大肠杆菌进行基因敲除，制备大肠杆菌K-12MG1655感受态细胞并将核酸酶Cas9表达质粒化学转化其中，再将打靶片段、sgRNA重组质粒pGRB电转入感受态细胞中，电转化后在32℃下复苏，菌液涂于抗性板上，32℃倒置培养12h，筛选转化子。对筛选得到的转化子进行菌落PCR鉴定，出发菌株K-12 MG1655验证引物间的大小应为3033bp，而发生基因敲除和同源重组后的菌株，其验证引物间的大小应为1200bp，条带大小均与预期大小相符，说明靶基因被成功敲除，最终可获得菌株K-12MG1655(ΔcmtAΔcmtB)。
扩增单个目的基因的反应体系如下：
mdh(NADH)的退火温度是53℃，延伸时间与基因长度对应，以mdh(NADH)为例，反应程序如下：
重叠PCR反应体系如下：
进行重叠PCR时，采用的退火温度均为55℃，延伸时间为2min30s。
菌落PCR鉴定反应体系如下：
1.2以K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtB)为出发菌株，进一步敲除甘露醇磷酸转移酶编码基因，获得突变菌株K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)
以菌株K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtB)为出发菌株，敲除基因mtlA。以大肠杆菌K-12MG1655基因组为模板，分别用两对引物mtlA-up-1/2、mtlA-down-1/2(如表1所示)扩增靶基因mtlA的上下游同源臂，所得两个PCR产物大小均为600bp。将两个片段进行重叠PCR得到线性目的片段，大小为1200bp，纯化回收PCR产物，-20℃保存备用。再将由金唯智公司合成的sgRNA片段(如表2所示)与经反向PCR获得的pGRB质粒进行连接，用同源重组酶ClonExpress于37℃连接30min。利用化学转化法将重组质粒pGRB转入大肠杆菌DH5α，通过氨苄青霉素抗性平板筛选转化子。提取转化子并经菌落PCR验证，所得片段大小为600bp，与预期一致。而后利用Crispr/Cas9系统对大肠杆菌进行基因敲除，制备大肠杆菌K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtB)感受态细胞并将核酸酶Cas9表达质粒化学转化其中，再将打靶片段、sgRNA重组质粒pGRB电转入感受态细胞中，电转化后在32℃下复苏，菌液涂于抗性板上，32℃倒置培养12h，筛选转化子。对筛选得到的转化子进行菌落PCR鉴定，出发菌株K-12 MG1655验证引物间的大小应为3114bp，而发生基因敲除和同源重组后的菌株，其验证引物间的大小应为1200bp，条带大小均与预期大小相符，说明靶基因被成功敲除，最终可获得菌株K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)。
表1：上述所用引物
表2：sgRNA序列
1.3菌株生长曲线的测定
(1)分别挑取原始菌株和敲除后的菌株K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)的单菌落于5mL的LB液体培养基中，过夜培养。
(2)测培养后菌液在OD600的吸光值，并按照约2％接种量接种于50mL LB液体培养基中，测定初始OD600值，确保初始值相同，每瓶做三个平行。
(3)将实验组与对照组均在37℃、220r/min的摇床上培养，每隔30min测定两个组的OD600值，绘制菌株的生长曲线。
(4)分别测定出发菌株K-12 MG1655、重组菌株K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtB)与重组菌株K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)在LB培养基中的生长曲线。结果如图1所示，与出发菌株K-12 MG1655相比，菌株K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtB)的生长情况基本不受影响，二者的生长曲线基本重合，菌株K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)比出发菌株的生长速率略低，说明将三个基因全部敲除后对菌体生长影响不大。
1.4基因敲除重组菌对甘露醇的利用能力
甘露醇能够作为碳源被菌体利用，将大肠杆菌PTS系统中的cmtA、cmtB、mtlA敲除后，菌株不能对甘露醇进行磷酸化，则菌株无法再利用其生长。因此本发明测定了出发菌株K-12 MG1655、菌株K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtB)和菌株K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)对甘露醇的利用情况，以甘露醇作为唯一碳源，结果如图2所示，K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)基本没有生长，说明敲除菌株已无法利用甘露醇作为碳源进行生长。实验表明，cmtA、cmtB、mtlA基因全部敲除后，菌株利用甘露醇的途径已被阻断。
1.5进一步在菌株K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)中游离表达来源于布氏乳杆菌的甘露醇脱氢酶基因mdh(NADH)，获得重组基因工程菌K-12
MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)/pTrc99a-mdh(NADH)
以布氏乳杆菌基因组DNA为模板，利用高保真DNA聚合酶扩增NADH依赖型的甘露醇脱氢酶基因mdh(NADH)，PCR产物大小理论值为1629bp。经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增产物大小与理论值一致，如图3所示。将mdh(NADH)的PCR产物和质粒pTrc99a分别用EcoRI和HindⅢ进行双酶切，酶切产物经纯化回收后，用连接酶Solution I于16℃连接过夜。利用化学转化法将重组质粒pTrc99a-mdh(NADH)转入大肠杆菌K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)，通过氨苄青霉素抗性平板筛选转化子。挑取转化子并提质粒进行双酶切验证，在1.5kb左右有条带，进一步进行PCR验证，条带大小也是1629bp左右，与理论值一致。
目的基因与载体的双酶切获得体系如下：
目的基因与载体双酶切验证体系如下：
solutionⅠ连接体系如下：
实施例2：构建的重组基因工程菌用于合成甘露醇
挑取重组大肠杆菌K-12 MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)/pTrc99a-mdh(NADH)单菌落接种于5mL液体LB培养基中，37℃、220r/min振荡培养过夜。再按2％的接种量，将过夜培养物接种于50mL的液体LB培养基中。37℃振荡培养至菌液的OD600值达到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L。16℃、160r/min诱导10h，进行诱导表达。取诱导表达后的菌体离心、收集沉淀，进行超声破碎，向破碎后的细胞破碎液中添加1mol/L果糖作为底物进行转化，收集转化后的上清液，通过HPLC法对其进行分析，结果如表3所示，最终计算得到甘露醇的转化率为20％，说明重组菌株K-12(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)/pTrc99a-mdh能够较为有效地转化果糖生成甘露醇。
表3：利用细胞转化得到甘露醇的合成量
甘露醇的检测方法如下：
(1)检测条件
用高效液相色谱分析底物与产物的含量变化。取1mL发酵液12000r/min离心1min，取上清液过0.22μm滤膜处理，加入到液相瓶中待检测。
色谱条件：Prevail Carbohydrate ES色谱柱(4.6mm×250mm)；流动相乙腈∶水＝75∶25；柱温30℃；流量1.0mL/min；进样量20μL；检测器为蒸发光散射检测器。
(2)标准曲线的绘制
精确称取甘露醇、果糖各5.0mg置于5mL的EP管中，加入5mL蒸馏水溶解，精确吸取200、400、600、800、1000μL的溶液到1.5mL的EP管中，加蒸馏水稀释至1mL，然后过0.22μm滤膜处理，加入到液相瓶中进行检测，以溶液浓度为横坐标，峰面积的对数值为纵坐标，绘制标准曲线，并得到回归方程。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种合成甘露醇的基因工程菌及其构建方法与应用
<141> 2018-05-18
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
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<213> 人工合成()
<400> 1
gcgaattcat ggtaaaaatt actgacgatt ac 32
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<212> DNA
<213> 人工合成()
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 13
ctgaccaact tcctcgacag cgg 23
Claims (6)
1.一种合成甘露醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌K-12MG1655为出发菌株，对其基因组上的甘露醇磷酸转移酶基因及其IIA、IIB和IIC元件进行基因敲除，得到大肠杆菌突变体，并通过质粒pTrc99a整合来源于布氏乳杆菌的甘露醇脱氢酶基因，构建重组载体，并实现了其在大肠杆菌突变体中的高效表达，获得重组大肠杆菌。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述甘露醇磷酸转移酶基因及其IIA、IIB和IIC元件包括：Genebank ID：945125的IIA元件、Genebank ID：945256的IIB和IIC元件、以及Genebank ID：948118的甘露醇磷酸转移酶编码基因mtlA。
3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述甘露醇脱氢酶码基因为NADH依赖型的甘露醇脱氢酶基因mdh(NADH)，Genebank ID：34323815。
4.权利要求1或2或3所述基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
1)以大肠杆菌K-12MG1655为出发菌株，利用Crispr/Cas9基因编辑技术敲除其基因组上的甘露醇磷酸转移酶基因的IIA、IIB和IIC元件，获得大肠杆菌突变菌株K-12MG1655(ΔcmtAΔcmtB)；
2)以K-12MG1655(ΔcmtAΔcmtB)为出发菌株，利用Crispr/Cas9基因编辑技术进一步敲除其基因组上的甘露醇磷酸转移酶基因mtlA，获得大肠杆菌突变菌株K-12MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)；
3)以布氏乳杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增NADH依赖型的甘露醇脱氢酶基因mdh(NADH)，与质粒pTrc99a经相同双酶切后连接，构建重组质粒pTrc99a-mdh(NADH)，转入大肠杆菌K-12MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)，即获得合成甘露醇的重组基因工程菌K-12MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)/pTrc99a-mdh(NADH)。
5.权利要求1或2或3所述基因工程菌以果糖为底物合成甘露醇的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述基因工程菌接种于液体LB培养基中，30-37℃、180-220r/min振荡培养过夜，再按2％的接种量接种于液体LB培养基中，30-37℃振荡培养至菌液的OD600值达到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，16℃、160r/min诱导表达10h，离心、收集沉淀，进行超声破碎，向破碎后的细胞破碎液中添加0.8-1.2mol/L果糖作为底物在室温下进行转化合成甘露醇。
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