CN107881140A - 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 - Google Patents
一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法，涉及细菌，该菌株是肠膜明串珠菌Δdts1∆D‑ldh∆stpk‑mdh ∆fk‑mdh ∆pat‑mdh（LeuconostocmesenteroidesΔdts1∆D‑ldh∆stpk‑mdh ∆fk‑mdh ∆pat‑mdh）菌株,其在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏日期是2017年10月25日，保藏号是CCTCC No：M2017578。将该菌株以重量百分比1%转接到MRS培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，甘露醇浓度可以达到9.73克/升，蔗糖中果糖部分的转化率97.3%。
Description
技术领域
本发明的技术方案涉及细菌，具体地说是一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及 其应用方法。
背景技术
甘露醇(Mannitol)是一种己六醇，在医药领域、食品领域和塑料领域均得到广泛的应 用。
目前，世界上工业生产甘露醇主要有二种工艺。第一种是海藻提取法：提取1吨甘露 醇约需13～15吨干海带，在生产海藻酸盐的同时，将提碘后的海带浸泡液，经多次提取浓 缩、除去杂质、离子交换、蒸发浓缩、冷却结晶而得；生产过程产生大量废水，能耗高， 污染严重，收率低。第二种是催化加氢法：以蔗糖或葡萄糖为原料，通过水解、差向异构 与酶异构，然后加氢而得；原料来源稳定，生产期限不受限制，成本低，但是其产率较低， 且有山梨醇伴生。
实验室生产甘露醇的方法还有二种。一是酶转化法，酶法氢化须要在体系中加入价格 昂贵的辅酶，不经济。二是微生物发酵法，自然界中能合成甘露醇的微生物种类较多，细 菌、酵母和霉菌中都有一些菌株具有产甘露醇的能力。在乳酸细菌转化甘露醇的过程中， 甘露醇为主要产物，同时产乳酸、乙酸、乙醇和二氧化碳，而不产生其它多元醇等副产物， 因而易于纯化分离及精制，并且条件温和、转化率较高。
很多菌株以果糖为底物发酵产生甘露醇，而明串珠菌将果糖和蔗糖都可以作为底物产 生甘露醇。廉价的蔗糖进入明串珠菌胞内后，分解成1-磷酸葡萄糖和果糖，果糖再转化为 甘露醇，反应步骤相对少；而同型乳酸发酵的乳杆菌中葡萄糖经6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果 糖和1-磷酸甘露醇等中间产物最终转化为甘露醇，反应步骤相对多；明串珠菌的染色体基 因组只有2M左右，故发酵周期只有20小时左右；明串珠菌是耐氧的，故发酵过程中不需 要提供氧气；因此明串珠菌实现大规模工业化生产甘露醇的潜力比较大。
CN201710051539.3公开了一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法，该明串 珠菌突变菌株是葡聚糖蔗糖酶、D-乳酸脱氢酶和乙醛脱氢酶基因敲除的明串珠菌突变菌株， 虽然比原始菌株提高了产量，但还是比较低，不足以应用于生产中。
总之，现有的明串珠菌发酵技术中，以蔗糖为底物产甘露醇的产率仍不够高，还需进一 步提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应 用方法，该肠膜明串珠菌突变菌株是以现有的保藏号是CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体––肠膜明串珠 菌Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)为出发菌，采用分子生物学技术 敲除丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶编码基因、果糖激酶编码基因和乙酰磷酸转移酶编码基因并敲 入甘露醇脱氢酶编码基因，构建为葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨 酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶 基因敲入和乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株， 即保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh (Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株，克服了现有 的明串珠菌发酵技术中以蔗糖为底物产甘露醇的产率仍不够高的缺陷。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌 株，是葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除 并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和乙酰磷酸转移酶 基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株，为肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh Δstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh Δpat-mdh)菌株,其在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017年10月 25日，保藏号是CCTCC No：M2017578，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学。
一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的应用方法，在250毫升三角瓶中，将在中 国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017年10月25日，保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株以重量百分比1％转接到MRS 培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，甘露醇浓度可以达到9.73 克/升，蔗糖中果糖部分的转化率97.3％。
上述一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的应用方法，所述MRS培养基的配制方 法是：将酵母浸粉2克、蔗糖20克、柠檬酸铵2克、乙酸钠5克、K2HPO4 2克、MnSO4·H2O0.039克和水1000毫升用乙酸调pH到6.2，在121℃温度下，灭菌20分钟配制得到MRS培 养基。
上述一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的应用方法，所涉及的原料、试剂和仪 器均由商购获得，所涉及的操作工艺是本领域技术人员能够掌握的。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明具有如下突出的实质性特点和显著进 步：
(1)本发明采用分子生物学技术敲除现有的保藏号是CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体––肠膜明串珠 菌Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1lΔD-ldh)中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶编 码基因、果糖激酶编码基因和乙酰磷酸转移酶编码基因并敲入甘露醇脱氢酶编码基因，构 建为葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并 甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、乙酰磷酸转移酶基 因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株，即保藏号是CCTCC No：M2017578 的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat--mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1 ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株，克服了现有的明串珠菌发酵技术中以蔗糖为底 物产甘露醇的产率仍不够高的缺陷。
(2)将在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017年10月25日， 保藏号是CCTCC M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株以重量百分比1％转接到MRS培养基 中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，检测代谢产物，通过对比试验 证明，该明串珠菌突变菌株的甘露醇产率比原始的保藏号是CCTCCM2016638的肠膜明串珠 菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明 串珠菌Δdts1ΔD-ldh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)提高了9.6％，蔗糖中果糖部 分的转化率提高了8.5％。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体中左右同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有α-淀粉酶标记的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体的琼脂糖凝 胶电泳图。
图4为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体 的琼脂糖凝胶电泳图。
图5为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的通过PCR验证丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。
图6为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建果糖激酶基因同源重组载体中左右同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。
图7为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建果糖激酶基因同源重组载体同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。
图8为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有α-淀粉酶标记的果糖激酶基因同源重组载体的琼脂糖凝胶电泳图。
图9为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的果糖激酶基因同源重组载体的琼脂糖凝胶电 泳图。
图10为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的通过PCR验证果糖激酶基因敲除突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。
图11为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体中左右同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。
图12为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。
图13为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有α-淀粉酶标记的乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体的琼脂糖凝胶电泳 图。
图14为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体的琼脂糖 凝胶电泳图。
图15为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的通过PCR验证乙酰磷酸转移酶基因敲除突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
图1为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体中左右同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。图 中显示左右同源臂：1.左同源臂，2.Marker，3.右同源臂。
图2为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示 重组载体酶切产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双酶切条带。
图3为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有α-淀粉酶标记的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体的琼脂糖凝 胶电泳图。图中显示重组载体酶切产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双酶切条带。
图4为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体 的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示重组载体酶切产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双 酶切条带。
图5为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的通过PCR验证丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。图中显 示：1.以肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh菌株为模板，2.肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-amy 为模板，3.Marker，4.肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh菌株为模板。
图6为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建果糖激酶基因同源重组载体中左右同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示左右同 源臂：1.左同源臂，2.Marker，3.右同源臂。
图7为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建果糖激酶基因同源重组载体同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示重组载体酶切 产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双酶切条带。
图8为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有α-淀粉酶标记的果糖激酶基因同源重组载体的琼脂糖凝胶电泳图。图中 显示重组载体酶切产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双酶切条带。
图9为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的果糖激酶基因同源重组载体的琼脂糖凝胶电 泳图。图中显示重组载体酶切产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双酶切条带。
图10为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的通过PCR验证果糖激酶基因敲除突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示：1.以肠膜 明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh菌株为模板，2.肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-amy为模板，3.Marker，4.肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh菌株为模板。
图11为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体中左右同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示 左右同源臂：1.左同源臂，2.Marker，3.右同源臂。
图12为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示重组载 体酶切产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双酶切条带。
图13为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有α-淀粉酶标记的乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体的琼脂糖凝胶电泳 图。图中显示重组载体酶切产生的两条条带：1.重组载体双酶切条带，2.Marker。
图14为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体的琼脂糖 凝胶电泳图。图中显示重组载体酶切产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双酶切条带。
图15为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的通过PCR验证乙酰磷酸转移酶基因敲除突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示：1. 以肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh菌株为模板，2.肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh Δstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-amy为模板，3.Marker，4.肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh菌株为模板。
实施例1
构建葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲 除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和乙酰磷酸转移 酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株，具体步骤如下：
第一步，以现有的保藏号是CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh (Leuconostoc mesenteroidesΔdt1ΔD-ldh)为出发菌，构建葡聚糖蔗糖酶、D-乳酸脱氢酶和 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株：
(1.1)肠膜明串珠菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因部分序列的克隆：
以染色体DNA为模板，克隆编码序列长度为1751bp的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh[保藏日期是2016年11月14日，其在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏 编号为CCTCC M2016638](Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠 膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)的丝氨酸/苏氨酸蛋白激 酶基因部分连续序列，具体操作步骤是：
(1.1.1)保藏号是CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明串珠菌ΔdtsΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)的肠膜明串珠菌总DNA的提取：
将在-80℃冻存的保藏号为CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ld1ΔD-ldh (Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)菌株划线于MRS固体平板上，于30℃过夜培养； 从固体平板上挑取一个单菌落接种到5毫升MRS液体培养基中，于30℃，转速为120转/ 分钟的摇床培养过夜；取2毫升的上述培养的菌液以转速为10000转/分钟离心2分钟，收 集菌体；用1毫升双蒸水洗涤菌体两次；将菌体溶于100微升的双蒸水中，吹打混匀；加入100微升的浓度为100毫克/毫升的溶菌酶，37℃水浴1h；加入500微升提取液，轻轻混 匀；于80℃孵育10分钟后，以14000转/分钟离心10分钟，弃上清；加100微升悬浮液， 使DNA溶解；加入等体积即100微升的酚-氯仿，轻轻摇匀，放入4℃冰箱中静置15分钟， 然后4℃，12500转/分钟离心15分钟，把上清液抽提到新的离心管中；再重复一次酚-氯 仿抽提操作；加入2倍体积即200微升的预冷无水乙醇，于4℃冰箱中静置2h；12000转/ 分钟离心20分钟，倒掉上清液；用体积百分比为70％的乙醇清洗1次，12000转/分钟离心 10分钟，倒掉上清液，晾干；将沉淀溶于20微升的TE(Tris-HCl 100毫摩尔/升、EDTA 10 毫摩尔/升，pH 8.0)中。
上述MRS培养基的组成：酵母浸粉3克、蛋白胨10克、牛肉浸粉8克、葡萄糖20克、 柠檬酸铵2克、乙酸钠5克、K2HPO4 2克、MgSO4·7H2O 2克、MnSO4·H2O 0.039克、吐温 80 1.6毫升和水1000毫升，用乙酸调pH到6.2；121℃灭菌20min。固体培养基加1.5％ 的琼脂。
上述提取液的组成：240毫摩尔/升NaOH、2.7毫摩尔/升EDTA、74％乙醇。
上述悬浮液的组成：0.1毫摩尔/升EDTA、50毫摩尔/升Tris-HCl，1％ TritonX-100(pH8.0)，0.5％吐温20。
上述酚-氯仿溶液为用酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1配制成的溶液。
上述TE溶液为用Tris-HCl 100毫摩尔/升和EDTA 10毫摩尔/升配制，pH为8.0。
(1.1.2)PCR扩增丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因：
设计一对引物stpkl：5'-ACGGAATTCTCCTCACTACTTGTTG-3'和stpkr： 5'-ACGGAATTCATGATGCGTCTTGATA-3'，以保藏编号为CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1 ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)的肠膜明串珠菌总DNA为模板，PCR 扩增得到为1751bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pUC19的EcoRI位点上，重 组质粒命名为pUC19-stpk。
(1.1.3)感受态大肠杆菌DH5α的制备和DNA转化：
将在-80℃冻存的大肠杆菌DH5α菌株划线于LB固体平板上，37℃过夜培养；从固体平板上挑取一个单菌落接种到5毫升LB液体培养基中，于37℃以转速为150转/分钟摇床 过夜培养；取0.2毫升上述培养得到的菌液转接到10毫升液体培养基中，于37℃以转速为 150转/分钟振荡培养2～3h至菌液的OD600为0.6；取上述OD600为0.6的菌液1.0毫升加入 到1.5毫升离心管中，冰浴10分钟；于4℃以转速为10000转/分钟离心30秒，弃上清液； 加入1毫升冰冷的0.1摩尔/升CaCl2溶液悬浮细胞，冰浴30分钟；于4℃以转速为10000 转/分钟离心30秒，弃上清液；加入100微升冰冷的0.1摩尔/升CaCl2溶液悬浮细胞，即 为感受态细胞，也即感受态大肠杆菌DH5α。
将重组质粒10微升加入到在上述感受态细胞中，冰浴30分钟；于42℃准确热激90秒； 立即在冰上放置3分钟；加入400微升LB液体培养基，于37℃振荡培养45分钟；将转化的感受态细胞均匀涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上；将平板放置于37℃温箱30分钟，至液体被吸收；倒置平板，于37℃培养12～16h。
挑去单菌落，在含氨苄青霉素的LB培养基中培养，提取质粒，经过琼脂糖凝胶电泳和 测序鉴定。
上述LB液体培养基：酵母浸粉5克，蛋白胨10克，NaCl 10克，蒸馏水1000毫升， pH7.0，121℃灭菌20分钟。固体培养基加1.5％的琼脂。
(1.2)中间带有α-淀粉酶标记的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体的构建：
(1.2.1)设计一对引物stpkl1：5'-CAGGAATTCTGTTGAACTGCTTGAGG-3'和stpkl2：5'-GTCGGATCCGGTACCAGCGTCAGATAGTGTA-3'(与stpkr1互补配对)，以pUC19-stpk为模板，PCR扩增得到为384bp的片段。
(1.2.2)设计一对引物stpkr1：5'-GCTGGTACCGGATCCGACCCAACATAATCTC-3'和stpkr2： 5'-CGCAAGCTTTGTTGACCGGACACCTA-3'，以pUC19-stpk为模板，PCR扩增得到为384bp的片 段。
(1.2.3)将上述(1.2.1)(1.2.2)中得到的2个PCR产物经纯化后混匀，以PCR产 物混合物为模板，通过8轮PCR循环使2个基因片段重叠延伸，然后利用一对引物stpkl1： 5'-CAGGAATTCTGTTGAACTGCTTGAGG-3'和stpkr2：5'-CGCAAGCTTTGTTGACCGGACACCTA-3'再进 行PCR，扩增得到为753bp的片段。
(1.2.4)将上述(1.2.3)中得到的重叠延伸PCR产物和pUC19用EcoRI和HindⅢ进行双酶切后，两者在T4-DNA连接酶的作用下连接，再将连接的产物转化大肠杆菌DH5α感 受态细胞，筛选重组质粒pUC19-stpkqh，即构建为同源重组载体。
(1.2.5)设计一对引物amyl：5'-TTGGTACCTTTGGCGTGATTATCAG-3'和amyr： 5'-TTGGTACCCGAAGGTGAAGTTATAG-3'，以保藏编号为CGMCC1.3395的食淀粉乳杆菌总DNA为 模板，PCR扩增得到为1963bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到同源重组载体 pUC19-stpkqh同源臂中间的KpnI位点上，重组质粒命名为pUC19-stpkqh-amy，即构建为 中间带有α-淀粉酶标记的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体。
(1.3)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基 因失活的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：
将在-80℃冻存的保藏号为CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh (Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)菌株划线于MRS固体平板上，于30℃过夜培养； 从固体平板上挑取一个单菌落接种到5毫升MRS液体培养基中，于30℃以转速为120转/ 分钟摇床培养过夜；以1％转接到MRS含0.48微克/毫升氨苄青霉素的培养基中继续培养， 初始OD600为0.048的保藏编号为CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh (Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh (Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)菌液的OD600达到0.5时收集菌体，用含溶菌酶浓 度为100U/毫升的LiAc-DTT溶液重新悬浮菌体，于30℃孵育20分钟，用冰冷的PBS溶液 洗涤两次，再用50微升冰冷的PBS溶液悬浮菌体，加入5微升上述的同源重组载体质粒 (pUC19-stpkqh-amy)，冰浴10分钟后进行电转化，所用电转化仪为Bio-Rad GenePulser XCellTM，电击参数为电击杯间距0.1cm、1400V、25μF、300Ω、电击时间为4毫秒，然后加入1毫升MRS培养基，复苏3h后，涂布于含MRS固体平板，培养120h后挑取单菌落验 证，以证明从平板上筛选得到葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏 氨酸蛋白激酶基因失活的肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-amy(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-amy)菌株。
设计一对引物stpkyq：5'-GAACTGCTTGAGGAACTAC-3'和stpkyh： 5'-GACCGGACACCTAATTATG-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，上述肠膜明串 珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-amy(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-amy)菌株得到长度为2731bp的扩增产物，而肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh (Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh，保藏编号为CCTCCM2016638)的中间体— —肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)得到长度为831bp 的扩增产物。
上述LiAc-DTT溶液为用100毫摩尔/升LiAc、10毫摩尔/升DTT、0.6摩尔/升蔗糖、10毫摩尔/升Tris-HCl(pH7.5)的溶液；
上述PBS溶液为K2HPO4-KH2PO4 1毫摩尔/升、MgCl2 1毫摩尔/升和蔗糖0.5摩尔/升配 制的溶液，pH为6.9。
(1.4)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基 因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：
(1.4.1)中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组 载体的构建：设计一对引物mdhl：5'-ATGGTACCATTATGCCTCTTCGCCG-3'和mdhr： 5'-ATGGTACCCACGTGATACTGTTGTC-3'，以保藏号为CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1 ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1lΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)总DNA为模板，PCR扩增得到为1236 bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到同源重组载体pUC19-stpkqh同源臂中间的KpnI 位点上，重组质粒命名为pUC19-stpkqh-mdh，即构建为中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒 的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体。
(1.4.2)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：以电转化法将pUC19-stpkqh-mdh导入到上述(1.3)中得到的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-amy(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-amy)菌株中，筛选获得葡聚糖蔗糖酶基因 敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入 的肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh)菌株。
设计一对引物stpkyq：5'-GAACTGCTTGAGGAACTAC-3'和stpkyh： 5'-GACCGGACACCTAATTATG-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，上述肠膜明串 珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh)菌株得到长度为2004bp的扩增产物，而肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh (Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh，保藏编号为CCTCCM2016638)的中间体— —肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)得到长度为831bp 的扩增产物。
第二步，从肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1 ΔD-ldhΔstpk-mdh)菌株构建葡聚糖蔗糖酶、D-乳酸脱氢酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因 敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠 菌突变菌株，具体步骤如下：
(2.1)肠膜明串珠菌果糖激酶基因部分序列的克隆：
设计一对引物fkq：5'-ACGAAGCTTGAAGCAGGTGGAACGA-3'和fkh： 5'-TGTGAATTCTAGCAACGGGTACGAT-3'，以肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh的染色体为模板，PCR扩增得到为782bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pUC19的HindIII 和EcoRI位点上，重组质粒命名为pUC19-fk。
(2.2)中间带有α-淀粉酶标记的果糖激酶基因同源重组载体的构建
(2.2.1)左同源臂的克隆：设计一对引物fklq：5'-CGGAATTCTTGCGGATCAC-3'和fklh： 5'-TTGGTACCGCGCCATTAACGTCAGT-3'(与fkrq互补配对)，以pUC19-fk为模板，PCR扩增得 到为277bp的片段。
(2.2.2)右同源臂的克隆：设计一对引物fkrq：5'-AATGGCGCGGTACCAAAAGCATCCT-3' 和fkrh：5'-GCAAGCTTCAGCAAAACTT-3'，以pUC19-fk为模板，PCR扩增得到为273bp的片段。
(2.2.3)将上述(2.2.1)(2.2.2)中得到的2个PCR产物经纯化后混匀，以PCR产 物混合物为模板，通过8轮PCR循环使2个基因片段重叠延伸，然后利用一对引物fklq： 5'-CGGAATTCTTGCGGATCAC-3'和fkrh：5'-GCAAGCTTCAGCAAAACTT-3'再进行PCR，扩增得到 为536bp的片段。
(2.2.4)将上述(2.2.3)中得到的重叠延伸PCR产物和pUC19用EcoRI和HindⅢ进行双酶切后，两者在T4-DNA连接酶的作用下连接，再将连接的产物转化大肠杆菌DH5α感 受态细胞，筛选重组质粒pUC19-fkqh，即构建为同源重组载体。
(2.2.5)设计一对引物amyl：5'-TTGGTACCTTTGGCGTGATTATCAG-3'和amyr： 5'-TTGGTACCCGAAGGTGAAGTTATAG-3'，以保藏编号为CGMCC1.3395的食淀粉乳杆菌总DNA为 模板，PCR扩增得到为1963bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到同源重组载体 pUC19-fkqh同源臂中间的KpnI位点上，重组质粒命名为pUC19-fkqh-amy，即构建为中间 带有α-淀粉酶标记的果糖激酶基因同源重组载体。
(2.3)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基 因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因失活的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：
以电击转化法将(2.2.5)中得到的中间带有α-淀粉酶标记的果糖激酶基因同源重组 载体导入到肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh Δstpk-mdh)菌株中，筛选获得葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因失活的肠膜明串珠菌突 变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-amy(LeuconostocmesenteroidesΔdts1 ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-amy)菌株。
设计一对引物fkyq：5'-ACTCAGTAGAGCAAGTCAT-3'和fkyh： 5'-TATCAGGGCGTAAAATCAT-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，上述肠膜明串 珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-amy(Leuconostocmesenteroides Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-amy)菌株得到长度为2513bp的扩增产物，而肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh)菌株得到长度 为743bp的扩增产物。
(2.4)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基 因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串 珠菌突变菌株的构建：
(2.4.1)中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的果糖激酶基因同源重组载体的构建：设 计一对引物mdhl：5'-ATGGTACCATTATGCCTCTTCGCCG-3'和mdhr： 5'-ATGGTACCCACGTGATACTGTTGTC-3'，以保藏号为CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1 ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)总DNA为模板，PCR扩增得到为1236 bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到同源重组载体pUC19-fkqh同源臂中间的KpnI 位点上，重组质粒命名为pUC19-fkqh-mdh，即构建为中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的 果糖激酶基因同源重组载体。
(2.4.2)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明 串珠菌突变菌株的构建建：以电转化法将pUC19-fkqh-mdh导入到上述(2.3)中得到的肠 膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-amy(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh Δstpk-mdhΔfk-amy)菌株中，筛选获得葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝 氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢 酶基因敲入的的肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh (Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh)菌株。
设计一对引物fkyq：5'-ACTCAGTAGAGCAAGTCAT-3'和fkyh： 5'-TATCAGGGCGTAAAATCAT-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，上述肠膜明串 珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh(Leuconostocmesenteroides Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh)菌株得到长度为1786bp的扩增产物，而肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh)菌株得到长度 为743bp的扩增产物。
第三步，从肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh(Leuconostocmesenteroides Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh)菌株构建葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱 氢酶基因敲入、乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌 株，具体步骤如下：
(3.1)肠膜明串珠菌乙酰磷酸转移酶基因部分序列的克隆：
设计一对引物patq：5'-TGTGAATTCTTTTGCTAAGCCTTGT-3'和path： 5'-TGTGAATTCGTGAAGATCCCCGTAT-3'，以肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh的染 色体为模板，PCR扩增得到为995bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pUC19的HindIII和EcoRI位点上，重组质粒命名为pUC19-pat。
(3.2)中间带有α-淀粉酶标记的乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体的构建
(3.2.1)左同源臂的克隆：设计一对引物patlq：5'-CGGAATTCTCGACTTATAATGCTTG-3' 和patlh：5'-TAGGATCCTAGGTACCAAGCGAAGAGCGTTATGT-3'(与patrq互补配对)，以pUC19-pat 为模板，PCR扩增得到为511bp的片段。
(3.2.2)右同源臂的克隆：设计一对引物patrq： 5'-TTGGTACCTAGGATCCTACTTCGCCTTTTTGCAT-3'和patrh： 5'-CGAAGCTTAGGCATTTATGGAACTT-3'，以pUC19-pat为模板，PCR扩增得到为490bp的片段。
(3.2.3)将上述(3.2.1)(3.2.2)中得到的2个PCR产物经纯化后混匀，以PCR产 物混合物为模板，通过8轮PCR循环使2个基因片段重叠延伸，然后利用一对引物patlq： 5'-CGGAATTCTTGCGGATCAC-3'和patrh：5'-GCAAGCTTCAGCAAAACTT-3'再进行PCR，扩增得到 为983bp的片段。
(3.2.4)将上述(3.2.3)中得到的重叠延伸PCR产物和pUC19用EcoRI和HindⅢ进行双酶切后，两者在T4-DNA连接酶的作用下连接，再将连接的产物转化大肠杆菌DH5α感 受态细胞，筛选重组质粒pUC19-patqh，即构建为同源重组载体。
(3.2.5)设计一对引物amyl：5'-TTGGTACCTTTGGCGTGATTATCAG-3'和amyr： 5'-TTGGTACCCGAAGGTGAAGTTATAG-3'，以保藏编号为CGMCC1.3395的食淀粉乳杆菌总DNA为 模板，PCR扩增得到为1963bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到同源重组载体 pUC19-fkqh同源臂中间的KpnI位点上，重组质粒命名为pUC19-patqh-amy，即构建为中间 带有α-淀粉酶标记的乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体。
(3.3)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基 因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、乙酰磷酸 转移酶基因失活的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：
以电击转化法将(3.2.5)中得到的中间带有α-淀粉酶标记的乙酰磷酸转移酶基因同 源重组载体导入到肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh(Leuconostocmesenteroides Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh)菌株中，筛选获得葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶 基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除 并甘露醇脱氢酶基因敲入、乙酰磷酸转移酶基因失活的肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明 串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-amy(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh Δstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-amy)菌株。
设计一对引物patyq：5'-ACATTCTCTTCATTGGCTC-3'和patyh： 5'-GACTTTATGGAACTTTTTG-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，上述肠膜明串 珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-amy(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-amy)菌株得到长度为2964bp的扩增产 物，而肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1 ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh)菌株得到长度为995bp的扩增产物。
(3.4)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基 因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、乙酰磷酸 转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：
(3.4.1)中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体的构 建：设计一对引物mdhl：5'-ATGGTACCATTATGCCTCTTCGCCG-3'和mdhr： 5'-ATGGTACCCACGTGATACTGTTGTC-3'，以保藏号为CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1 ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdt1ΔD-ldh)总DNA为模板，PCR扩增得到为1236 bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到同源重组载体pUC19-fkqh同源臂中间的KpnI 位点上，重组质粒命名为pUC19-patqh-mdh，即构建为中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的 乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体。
(3.4.2)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、乙酰磷 酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株的构建建：以电转化 法将pUC19-patqh-mdh导入到上述(3.3)中得到的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-amy(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-amy)菌 株中，筛选获得葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、乙酰磷 酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的的肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldh Δstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株。
设计一对引物patyq：5'-ACATTCTCTTCATTGGCTC-3'和patyh： 5'-GACTTTATGGAACTTTTTG-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，上述肠膜明串 珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株得到长度为2237bp的扩增产 物，而肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1 ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh)菌株得到长度为995bp的扩增产物。
实施例2
肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostocmesenteroides ΔdtslΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株,其在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保 藏，保藏日期是2017年10月25日，保藏号是CCTCC M2017578)，即本发明的一株高产甘 露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的发酵应用，具体步骤如下：
在250毫升三角瓶中，将在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017 年10月25日，保藏号是CCTCC M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh Δpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株以重量 百分比1％转接到MRS培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，甘 露醇浓度可以达到9.73克/升，蔗糖中果糖部分的转化率97.3％。
上述MRS培养基的配制方法是：将酵母浸粉2克、蔗糖20克、柠檬酸铵2克、乙酸钠 5克、K2HPO4 2克、MnSO4·H2O 0.039克和水1000毫升用乙酸调pH到6.2，在121℃温度下， 灭菌20分钟配制得到MRS培养基。
表1列出了各种明串珠菌发酵产甘露醇的产量，可见本发明的中国典型培养物保藏中 心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017年10月25日，保藏号是CCTCC M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh Δstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株的甘露醇产率比原始的保藏号是CCTCCM2016638的肠膜 明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体—— 肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)提高了9.6％，蔗糖中 果糖部分的转化率提高了8.5％。
表1.肠膜明串珠菌发酵产甘露醇的产量(g/L)
表1中，原始菌为未被改造的原始肠膜明串珠菌，Δdts1为葡聚糖蔗糖酶基因敲除的肠 膜明串珠菌，Δdts1Δldh为葡聚糖蔗糖酶基因敲除和D-乳酸脱氢酶基因敲除的肠膜明串珠 菌，Δdts1ΔldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh为葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因 敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘 露醇脱氢酶基因敲入、乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌 突变菌株，即为肠膜明串珠菌Δdts1ΔldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株,其在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)保藏，保藏日期是2017年10月25日，保藏号是CCTCCM2017578)，即本发明的 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株。
上述实施例中，所涉及的原料、试剂和仪器均由商购获得，所涉及的操作工艺是本领 域技术人员能够掌握的，未注明的具体实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验手册》中所述的方法或厂商提供的的方案进行。
序列表
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因中部分序列缺失并在此插入甘露醇脱氢酶基因表达盒的核苷酸序列
<110> 河北工业大学
<120> 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法
<160> 3119
<210> 1
<211> 3119
<212> DNA
<213> 肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)
<400> 1
ttattgactc gaagagctct cagatgtgga actgtccgat gatgtagtac tagaatcctc 60
actacttgtt gaactgcttg aggaactact gctagaacta gaagacgatg aactactact 120
acttgagctc gattgttctg gtccctgtga aatcgtaatt aataaggtgt tatcttttgt 180
aatctttgat ccgccacgga ttgattgact aataacatgg tccttcttaa cagaattgga 240
gtaagtcgta ttaaaattaa cagtgacatc attttgtgat gcccaatttt gaacatcgct 300
ttgtgtgcta cttttagtga agtcagggac agtaatctta accggtcctg ttgagacagt 360
gaaagtcacc tttgtggctg tagggtctac cttcccattg gcattaatag attgagctat 420
aattatgcct gcagctacac tatctgacgc tggtaccgga tccgacatta tgcctcttcg 480
ccgccaacct tcacaacagc cttagatacg acacctaact taccgttaac aaagtcgtca 540
acagtcttat agtctaattc gtgtgacatc aatgcttcaa cattcaactt accagatgat 600
agcagagcca gtgaatcttc aaaggcgtta gggttgataa atgaaccttg aatagttaac 660
tgcttttgga atacttcata agtgttcatt tggaacttgg cgtcaggacc accaacacca 720
aacatcaata cttgagcgcc acgagctgat gcttcaatag cagcttcttg tgtttgtggt 780
agaccaacgg cttcaataat gacatcatat tcaccttcag ggatcttgtc acccttcatt 840
gtgttgtacg tgttctttac gccaaacttt tctttgttca ttgccaactt ttcgtcaaca 900
ataccagcta agtcaacttg gtgaatacca tatgcttgca agatttgaac gaataattcg 960
cccatgaatc catcaccaat taccaaagcc ttttggtaag gggtaacctt caacaattga 1020
ataccgtgaa cggcacatga aattggttca acaacagcag ctgactttaa tgaaacgtta 1080
tcaggaattg gataaacaac agatgcaggt gcagtgaaga attcttcaaa gccaccatca 1140
cgtgtcacac caacagctga caagttttcg cataattcag ggcgtgcagt acggcagtac 1200
ttgcattgtc cacaataaat gttagggtca acagttacgc ggtcaccaac tttaacgtta 1260
gtaacagcag aaccgatttc tgcaacaaca cctgagttct catgaccaag aacgattgga 1320
ggaacagcat cagctgaacc tggcaaacca gcgtatagtg cgtgatcagt tccacaaata 1380
ccagcaaacg ctgtgtgaat caaaacttca tttggcaaaa cctttggacg gtcaatgtcc 1440
tttacttcta atttcttagt tccggttaga acaagtgctt ccatgattaa ttctcctttt 1500
ttgtgacaaa agtaacttac ggtgactatg ctaaaccttt ggcattataa agtcaagtct 1560
caggccaaat taattttcga ttataaggct gttggtgtga taaaataata taagactatg 1620
gaggtatgta atggttgcaa aattaagtga tgtcgcagcg ctagctggtg tttctgtgac 1680
aacagtatca cggctggtac cggatccgac ccaacataat ctccaaaacg cacttttgcc 1740
ttaccagagg aaataaccaa gttgatactg tccccttttt ttacgtcagt tccttcttta 1800
ggcgttgaac gcacaacact gccctttttg atggttgtcg aagttgtcga agtcacacta 1860
ccaacattca atccagcttc ttgtattttc ttttcagcct tggctcttgt taagttggat 1920
aagctcggca cagtgatttg actagcctga atatgaataa acgcaaaaat agcaataata 1980
gcaacaataa aaagcactgc aaaagccaaa attttaggta atttattttc acgatacttg 2040
atgccattgc cccgaagcac acttctaaca taattaggtg tccggtcaac aatttttgcg 2100
atacttttaa cagcgtaacc ttttttacca tactcaatga tcagatcttt tactgatggt 2160
tcctcaggaa cttcctccgg taaaacatta acagaggaaa caccattctt gagctggtct 2220
tgaatttgtt ccatcggaat aatgcgcgtt tcgttttcaa tatccgcagt tggcgcaaat 2280
cgttgttcat ttgaacgacg tggcgataga actgttttta aatcttcagc cataactgag 2340
acatctaaat aacgatcctg tgggttctta gctgtggctt ttaaaataac attttctagt 2400
gcttggggaa ttcttggatc aaaatcacgt actgaaggca tatcagcagt tgcatgtttt 2460
agtgctactg cgaccggcgt atctccttca tacggcactt gcttcgttag catttcatat 2520
agcataacac caagtgcata gatatcagac tttgctgatg ccatgcctcc acgggtttgt 2580
tctggtgaca aataatgaac tgaaccaatc acggtatgtg tctgcgtcaa atcttgctct 2640
gatttagcaa ttgcaatacc gaaatcggta atcttcactt gatcatttct gtcaattaaa 2700
atattttgtg gctttaaatc acgatgaata atacctgcat tatgtgcagc ctgcactgcg 2760
tttaatattt gcatcataat atcaacaact tgttgatatg caattggaaa atgttcacca 2820
atatatgatt taagatttgt accatcaaca tattccatga caatatattg tgaaccttgg 2880
tactcaccaa cgtcgtatac ttggacaata ttgtcattaa tcagttctgt tactgataag 2940
gcctcacgtt gaaagcgttt tgccaaatct acatcatttt tcatatcaag acgcatcatt 3000
ttaaacgtta catcacgatt aagaaattca tcatgcgcca aataaacatt ggccataccg 3060
ccatcgccaa gcgattttat aatacggtat cgattgtcaa ctagtgtatc tggtaacat
果糖激酶基因中部分序列缺失并在此插入甘露醇脱氢酶基因表达盒的核苷酸序列
<110> 河北工业大学
<120>一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法
<160> 1966
<210> 1
<211> 1966
<212> DNA
<213> 肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)
<400> 1
atgggtttat taggagcaat tgaagcaggt ggaacgaagt ttgtggtcgc tgttgcggat 60
cacgattata atattgttga gagaacatca ttccctacac ttgatggtca aaaaacagta 120
gagcaagtca tcgctttttt tgataagttt gacgacatcg acgcaattgg tattgcagct 180
tttggaccaa ttgacattgt agagggatca acaacatatg gtcacgttct agatacacca 240
aaacgcgggt ggtcaggata tgattttctg ggtgcaatga aagactggcg tgatattcct 300
tactattgga ctactgacgt taatggcgcg gtaccaaatt atgcctcttc gccgccaacc 360
ttcacaacag ccttagatac gacacctaac ttaccgttaa caaagtcgtc aacagtctta 420
tagtctaatt cgtgtgacat caatgcttca acattcaact taccagatga tagcagagcc 480
agtgaatctt caaaggcgtt agggttgata aatgaacctt gaatagttaa ctgcttttgg 540
aatacttcat aagtgttcat ttggaacttg gcgtcaggac caccaacacc aaacatcaat 600
acttgagcgc cacgagctga tgcttcaata gcagcttctt gtgtttgtgg tagaccaacg 660
gcttcaataa tgacatcata ttcaccttca gggatcttgt cacccttcat tgtgttgtac 720
gtgttcttta cgccaaactt ttctttgttc attgccaact tttcgtcaac aataccagct 780
aagtcaactt ggtgaatacc atatgcttgc aagatttgaa cgaataattc gcccatgaat 840
ccatcaccaa ttaccaaagc cttttggtaa ggggtaacct tcaacaattg aataccgtga 900
acggcacatg aaattggttc aacaacagca gctgacttta atgaaacgtt atcaggaatt 960
ggataaacaa cagatgcagg tgcagtgaag aattcttcaa agccaccatc acgtgtcaca 1020
ccaacagctg acaagttttc gcataattca gggcgtgcag tacggcagta cttgcattgt 1080
ccacaataaa tgttagggtc aacagttacg cggtcaccaa ctttaacgtt agtaacagca 1140
gaaccgattt ctgcaacaac acctgagttc tcatgaccaa gaacgattgg aggaacagca 1200
tcagctgaac ctggcaaacc agcgtatagt gcgtgatcag ttccacaaat accagcaaac 1260
gctgtgtgaa tcaaaacttc atttggcaaa acctttggac ggtcaatgtc ctttacttct 1320
aatttcttag ttccggttag aacaagtgct tccatgatta attctccttt tttgtgacaa 1380
aagtaactta cggtgactat gctaaacctt tggcattata aagtcaagtc tcaggccaaa 1440
ttaattttcg attataaggc tgttggtgtg ataaaataat ataagactat ggaggtatgt 1500
aatggttgca aaattaagtg atgtcgcagc gctagctggt gtttctgtga caacagtatc 1560
acgaatggcg cggtaccaaa agcatcctct tgataaatat gaaggtcatt gcccattcca 1620
tggcgataat tgtttggaag gcttagctgc tggtccagca attgaagagc gttggggacg 1680
tagtgcgaag gaaattccag atgatgatgt tgcctggaag attgaagcct tctatcttgc 1740
gcaagcagcc cttgattata caatgatttt acgccctgaa aaaattgttt ttggtggcgg 1800
tgtacctcat cgtgaaatct tattcccatt aattcgcgaa agttttgctg agcaaatgag 1860
tgattattta gcagttcctg atttggatga atacatcgta cccgttgcta atggcgataa 1920
tgccggcatc ttgggttgct tctatttggc aaaaacatta ctttaa
乙酰磷酸转移酶基因中部分序列缺失并在此插入甘露醇脱氢酶基因表达盒的核苷酸序列
<110> 河北工业大学
<120> 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法
<160> 2251
<210> 1
<211> 2251
<212> DNA
<213> 肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)
<400> 1
ttataatgct tgcgcagcag taataatagc tactttataa acatcctctt cattggctcc 60
tcgcgataaa tcagaaacag gttttgctaa gccttgtaaa ataggtccaa tcgcttcaaa 120
cccacccaag cgttgtgcaa ttttatagcc aatattacct gcttctagac ttgggaaaat 180
aaatgtgttc gctttacctg cgacttttga atcaggcgcc tttgcggcag caacagattc 240
aacaaacgca gcatcaaact gtaactctcc atcaattgag tccgccagtt caggtgctaa 300
cttcttagcc aatgcagtgg cagttgccac cttatcgacc aagggtgatt tcgcggagcc 360
cttagttgaa aatgaaagca tcgcaacttt tggttcaata tcaaacactt gagctgtgtg 420
ggctgattgt attgcaattt cagccatcgt gtccgaatca atgtcaatgt taatggcagc 480
gtccgcaaat acataacgct cttcgcttgg tacctaggat cctaatatta tgcctcttcg 540
ccgccaacct tcacaacagc cttagatacg acacctaact taccgttaac aaagtcgtca 600
acagtcttat agtctaattc gtgtgacatc aatgcttcaa cattcaactt accagatgat 660
agcagagcca gtgaatcttc aaaggcgtta gggttgataa atgaaccttg aatagttaac 720
tgcttttgga atacttcata agtgttcatt tggaacttgg cgtcaggacc accaacacca 780
aacatcaata cttgagcgcc acgagctgat gcttcaatag cagcttcttg tgtttgtggt 840
agaccaacgg cttcaataat gacatcatat tcaccttcag ggatcttgtc acccttcatt 900
gtgttgtacg tgttctttac gccaaacttt tctttgttca ttgccaactt ttcgtcaaca 960
ataccagcta agtcaacttg gtgaatacca tatgcttgca agatttgaac gaataattcg 1020
cccatgaatc catcaccaat taccaaagcc ttttggtaag gggtaacctt caacaattga 1080
ataccgtgaa cggcacatga aattggttca acaacagcag ctgactttaa tgaaacgtta 1140
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gtaacagcag aaccgatttc tgcaacaaca cctgagttct catgaccaag aacgattgga 1380
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ccagcaaacg ctgtgtgaat caaaacttca tttggcaaaa cctttggacg gtcaatgtcc 1500
tttacttcta atttcttagt tccggttaga acaagtgctt ccatgattaa ttctcctttt 1560
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aaatacgtga tgagccaggc gccgttttaa tgatctgcaa cgcaggacga actgtatcac 1860
cagttggatg tactgcgcct gacaccatac cgtcagcttt gccagtataa accagcattg 1920
tcccaaaata gttaacattt tgtagccatt tggcagctgt ctcagcgtct gttttccctt 1980
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cctgtgcatc ccccaacaat attggctcga tcaaattatc agctgctaat ctgatagctg 2160
cgccctggat acggggatct tcaccttccg gaaatacaat tgtcttattt tgaccggtaa 2220
ttttattttt taattgctca aaaagttcca t
Claims (3)
1.一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株，其特征在于：是葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株，为肠膜明串珠菌Δdts1∆D-ldh∆stpk-mdh ∆fk-mdh ∆ pat-mdh（LeuconostocmesenteroidesΔdts1∆D-ldh∆stpk-mdh ∆fk-mdh ∆pat-mdh）菌株,其在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏日期是2017年10月25日，保藏号是CCTCC No：M2017578。
2.权利要求1所述一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的应用方法，其特征在于：在250毫升三角瓶中，将在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏日期是2017年10月25日，保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌∆dts1 ∆D-ldh∆stpk-mdh ∆fk-mdh ∆pat-mdh（Leuconostoc mesenteroides Δdts1 ∆D-ldh∆stpk-mdh ∆fk-mdh ∆pat-mdh）菌株以重量百分比1%转接到MRS培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，甘露醇浓度可以达到9.73克/升，蔗糖中果糖部分的转化率97. 3%。
3.根据权利要求2所述一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的应用方法，其特征在于：所述MRS培养基的配制方法是：将酵母浸粉2克、蔗糖20克、柠檬酸铵2克、乙酸钠5克、K2HPO4 2克、MnSO4•H2O 0.039克和水1000毫升用乙酸调pH到6.2，在121℃温度下，灭菌20分钟配制得到MRS培养基。
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