CN103865863B

CN103865863B - 一株明串珠菌突变菌株及其构建方法和应用方法

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Publication number: CN103865863B
Application number: CN201410065372.2A
Authority: CN
Inventors: 金红星; 成文玉; 张舟
Original assignee: Hebei University of Technology
Current assignee: Hebei University of Technology
Priority date: 2014-02-26
Filing date: 2014-02-26
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2034-02-26
Also published as: CN103865863A

Abstract

本发明一株明串珠菌突变菌株及其构建方法和应用方法，涉及细菌，是葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突变菌株，为肠膜明串珠菌Δdtsl（即Leuconostoc？MesenteroidesΔdtsl）菌株,其在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏日期是2013年12月29日，保藏号是CCTCCM2013724；构建方法是通过基因敲除手段使明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因失活而构建成为明串珠菌突变菌株；将该菌株以1%转接到MRS培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20h，该明串珠菌突变菌株的甘露醇产率比原始肠膜明串珠菌提高了15.3%，蔗糖中果糖部分的转化率提高了6.1%。

Description

一株明串珠菌突变菌株及其构建方法和应用方法

技术领域

本发明的技术方案涉及细菌，具体地说是一株明串珠菌突变菌株及其构建方法和应用方法。

背景技术

甘露醇被广泛的应用于医药、食品、化工和电子等行业。全球甘露醇消费量约占多元醇总量的11%，每年约为15万吨。美国是甘露醇的最大消费国。其它如欧洲国家，用于生产口香糖、口含片、嘴嚼片的用量均较大。我国目前甘露醇消费主要是直接用于生产甘露醇注射液、药品辅助添加剂和无糖型食品添加剂等。由于食品行业尤其是口香糖对甘露醇需求量快速增加，甘露醇市场容量迅速扩大。甘露醇在医药行业用量较大，目前我国仅甘露醇注射液每年就要消耗甘露醇4500吨，2003年医药行业消费甘露醇5600吨。近年来我国肥胖和糖尿病较为严重，而且有越来越严重的趋势，因此对无糖并具有营养的甜味剂甘露醇需求潜力巨大，2004年我国食品及其添加剂领域对甘露醇的需求量约3000吨。

目前，虽然有多种生产甘露醇的方法，但其中以微生物发酵法有着明显的优势。很多菌株以果糖为底物发酵产生甘露醇，而明串珠菌将果糖和蔗糖都可以作为底物产生甘露醇。廉价的蔗糖进入明串珠菌胞内后，分解成1-磷酸葡萄糖和果糖，果糖再转化为甘露醇，反应步骤相对少；而同型乳酸发酵的乳杆菌中葡萄糖经6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖和1-磷酸甘露醇等中间产物最终转化为甘露醇，反应步骤相对多；因此明串珠菌实现大规模工业化生产甘露醇的潜力比乳杆菌大。

然而，现有的明串珠菌发酵技术中，蔗糖既可以直接进入胞内转化为甘露醇，又可以在胞外葡聚糖蔗糖酶的作用下产生葡聚糖和果糖，果糖进入胞内参与碳代谢也可以转化为甘露醇，因此在胞外葡聚糖蔗糖酶的作用使甘露醇的产率下降。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一株明串珠菌突变菌株及其构建方法和应用方法，该明串珠菌突变菌株是葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突变菌株，基于同源重组，通过把基因敲除手段使明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因失活，进而阻碍葡聚糖合成途径，从而克服了微生物发酵法生产甘露醇中成本过高的瓶颈问题，结果使甘露醇产率比原始菌株提高了15.3%，蔗糖中果糖部分的转化率提高了6.1%。

本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：一株明串珠菌突变菌株，是葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突变菌株，为肠膜明串珠菌Δdtsl，即LeuconostocMesenteroidesΔdtsl菌株,其在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏日期是2013年12月29日，保藏号是CCTCCM2013724。

一株明串珠菌突变菌株的构建方法，通过基因敲除手段使明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因失活而构建成为明串珠菌突变菌株即肠膜明串珠菌Δdtsl（即LeuconostocMesenteroidesΔdtsl，保藏号是CCTCCM2013724）菌株，步骤如下：

第一步，明串珠菌葡聚糖蔗糖酶基因部分序列的克隆

将基因编码序列长度超过4kb的肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides，保藏日期为2009年12月31日，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏编号为CGMCC1.10327）的葡聚糖蔗糖酶分成2段克隆后拼接成ORF内的部分连续序列，具体操作步骤是：

（1）保藏编号为CGMCC1.10327的肠膜明串珠菌总DNA的提取，

（2）PCR扩增葡聚糖蔗糖酶基因，

（3）感受态大肠杆菌DH5α的制备和DNA转化；

第二步，同源重组载体的构建

（1）设计二对引物Dtsqt1与Dtsqt2和Dtsht1与Dtsht2，分别以其中的一个片段的重组质粒为模板进行PCR扩增，

（2）以纯化的PCR产物混合物为模板，利用一对引物Dtsqt1和Dtsht2再进行PCR扩增，

（3）将重叠延伸PCR产物和pUC19用KpnI和SalI进行双酶切后，两者在T4-DNA连接酶的作用下连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组质粒pUC19-Dtsqh，即构建为同源重组载体；

第三步，葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突变菌株的构建

以电击转化法将第二步得到的同源重组载体导入到肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides，保藏日期为2009年12月31日，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏编号为CGMCC1.10327）中，从平板上筛选葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突变菌株，设计一对引物Dtsy1和Dtsy2，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，验证证明构建得到葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdtsl（LeuconostocMesenteroidesΔdtsl，保藏号是CCTCCM2013724）菌株。

一株明串珠菌突变菌株的应用方法，将明串珠菌突变菌株即肠膜明串珠菌Δdtsl（LeuconostocMesenteroidesΔdtsl，保藏号是CCTCCM2013724）菌株以重量百分比1%转接到MRS培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20h，检测代谢产物，通过对比试验证明，该明串珠菌突变菌株的甘露醇产率比原始肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides，保藏编号为CGMCC1.10327）提高了15.3%，蔗糖中果糖部分的转化率提高了6.1%。

上述一株明串珠菌突变菌株的应用方法，所述MRS培养基的的组成为：酵母浸粉2克、蔗糖20克、柠檬酸铵2克、乙酸钠5克、K₂HPO₄2克、MnSO₄·H₂O0.039克、吐温800.4毫升和水1000毫升，用乙酸调pH到6.2，在121℃，灭菌20分钟。

本发明的有益效果是：本发明与现有技术相比，其突出的实质性特点和显著的进步是，

（1）通过把基因敲除手段使明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因失活，进而阻碍葡聚糖合成途径，从而克服了微生物发酵法生产甘露醇中成本过高的瓶颈问题，因此构建好的肠膜明串珠菌突变菌株可以直接应用于生产中。

（2）葡聚糖蔗糖酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株使甘露醇产率比原始肠膜明串珠菌提高了15.3%，蔗糖中果糖部分的转化率提高了6.1%，即提高了发酵产甘露醇的效率。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1为本发明一株明串珠菌突变菌株的构建方法的构建同源重组载体中同源前臂和同源后臂的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明一株明串珠菌突变菌株的构建方法的构建同源重组载体中重叠延伸PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为本发明一株明串珠菌突变菌株的构建方法的构建同源重组载体中验证重组质粒的琼脂糖凝胶电泳图。

图4为本发明一株明串珠菌突变菌株的构建方法的通过PCR验证突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

图1本发明构建同源重组载体中同源前臂和同源后臂的琼脂糖凝胶电泳图中显示，其中：左边2列表示550bp的同源前臂，中间是Marker，右边2列是460bp的同源后臂。

图2本发明构建同源重组载体中重叠延伸PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图中显示，其中：左边是Marker，右边2列是1000bp的重叠延伸PCR产物，同源前臂和同源后臂通过重叠延伸PCR连接在一起的，就是说与相应的原始序列相比中间少800bp。

图3本发明构建同源重组载体中验证重组质粒的琼脂糖凝胶电泳图中显示，其中：左边是将重叠延伸PCR产物连接到pUC19上的重组质粒，即构建好的同源重组载体，右边是pUC19。

图4通过PCR验证突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图中显示，其中：左边是Marker，中间是原始菌株1500bp的葡聚糖蔗糖酶基因部分序列，右边是突变菌株700bp的对应于原始菌株序列的葡聚糖蔗糖酶基因部分序列。

实施例1

通过基因敲除手段使明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因失活而构建成为明串珠菌突变菌株即肠膜明串珠菌Δdtsl（LeuconostocMesenteroidesΔdtsl）菌株，步骤如下：

第一步，明串珠菌葡聚糖蔗糖酶基因部分序列的克隆

（1）保藏编号为CGMCC1.10327的肠膜明串珠菌总DNA的提取

将在-80℃冻存的保藏编号为CGMCC1.10327的菌株划线于MRS固体平板上，于30℃过夜培养；从固体平板上挑取一个单菌落接种到5毫升MRS液体培养基中，于30℃，转速为120转/分钟的摇床培养过夜；取2毫升的上述培养的菌液以转速为10000转/分钟离心2分钟，收集菌体；用为菌体体积0.1倍的TE，即2毫升TE洗两次菌体；将菌体溶于380微升的TES溶液中；加入100微升的溶菌酶和5微升的浓度为10毫克/毫升的RNA酶A，在37℃的水浴中放置1h；加入30微升的20%的SDS和20微升的浓度为20毫克/毫升的蛋白酶K，在50℃的水浴中放置2h；用酚-氯仿溶液2次，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，在4℃放置2h后，以转速为10000转/分钟离心10分钟；用体积百分比为70%的乙醇清洗1次，于4℃以转速12000转/分钟离心5分钟；将沉淀溶于20微升TE(Tris-HCl100毫摩尔/升、EDTA10毫摩尔/升，pH8.0)溶液中。

上述MRS培养基的组成：酵母浸粉3克、蛋白胨10克、牛肉浸粉8克、葡萄糖20克、柠檬酸铵2克、乙酸钠5克、K₂HPO₄2克、MgSO₄·7H₂O2克、MnSO₄·H₂O0.039克、吐温801.6毫升和水1000毫升，用乙酸调pH到6.2；121℃灭菌20min。固体培养基加1.5%的琼脂。

上述TES溶液为用Tris-HCl50毫摩尔/升、EDTA1毫摩尔/升和蔗糖6.7%配制的溶液。

上述酚-氯仿溶液为用酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1配制成的溶液。

上述TE溶液为用Tris-HCl100毫摩尔/升和EDTA10毫摩尔/升配制，pH为8.0。

（2）PCR扩增葡聚糖蔗糖酶基因

设计一对引物Dtsq1：5'-AGAGTTGGGTAGTTGGTGG-3'和Dtsq2：5'-TGGTATGGTGACTTTGTTG-3'，以上述肠膜明串珠菌总DNA为模板，PCR扩增得到为2200bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pMD19-T上，重组质粒命名为pMD19-T-Dtsq。

设计一对引物Dtsh1：5'-GTTTCCGTTTTGTATCCTG-3'和Dtsh2：5'-GGCTCTATCTTTTGTTTGT-3'，以上述肠膜明串珠菌总DNA为模板，PCR扩增得到为2500bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pMD19-T上，重组质粒命名为pMD19-T-Dtsh。

（3）感受态大肠杆菌DH5α的制备和DNA转化

将在-80℃冻存的大肠杆菌DH5α菌株划线于LB固体平板上，37℃过夜培养；从固体平板上挑取一个单菌落接种到5毫升LB液体培养基中，于37℃以转速为150转/分钟摇床过夜培养；取0.2毫升上述培养得到的菌液转接到10毫升液体培养基中，于37℃以转速为150转/分钟振荡培养2～3h至菌液的OD₆₀₀为0.6；取上述OD₆₀₀为0.6的菌液1.0毫升加入到1.5毫升离心管中，冰浴10分钟；于4℃以转速为10000转/分钟离心30秒，弃上清液；加入1毫升冰冷的0.1摩尔/升CaCl₂溶液悬浮细胞，冰浴30分钟；于4℃以转速为10000转/分钟离心30秒，弃上清液；加入100微升冰冷的0.1摩尔/升CaCl₂溶液悬浮细胞，即为感受态细胞，也即感受态大肠杆菌DH5α。

将重组质粒10微升加入到在上述感受态细胞中，冰浴30分钟；于42℃准确热激90秒；立即在冰上放置3分钟；加入400微升LB液体培养基，于37℃振荡培养45分钟；将转化的感受态细胞均匀涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上；将平板放置于37℃温箱30分钟，至液体被吸收；倒置平板，于37℃培养12～16h。

挑去单菌落，在氨苄青霉素的LB培养基中培养，提取质粒，经过琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定，将2段序列拼接后提交至NCBI并获得接收号，为JF917108。

上述LB液体培养基：酵母浸粉5克，蛋白胨10克，NaCl10克，蒸馏水1000毫升，pH7.0，121℃灭菌20分钟。固体培养基加1.5%的琼脂。

第二步，同源重组载体的构建

（1）设计一对引物Dtsqt1：5'-GGATGGTACCTATGCGATGT-3'和Dtsqt2：5'-GGTATGGTGTGTTTGTTGTTGT-3'(与Dtsht1互补配对)，以pMD19-T-Dtsq为模板，PCR扩增得到为550bp的含有chi位点的片段。

设计一对引物Dtsht1：5'-CAACAAACACACCATACCTACT-3'和Dtsht2：5'-CTTGTCGACCACCTTTACTT-3'，以pMD19-T-Dtsh为模板，PCR扩增得到为460bp的片段。

（2）将上述（1）中得到的2个PCR产物经纯化后混匀，以PCR产物混合物为模板，利用一对引物Dtsqt1：5'-GGATGGTACCTATGCGATGT-3'和Dtsht2：5'-CTTGTCGACCACCTTTACTT-3'再进行PCR，扩增得到为1000bp的片段。进行重叠延伸PCR获得的含有一个chi位点的扩增产物的长度比相应的葡聚糖蔗糖酶基因序列大缩短800bp。

（3）将重叠延伸PCR产物和pUC19用KpnI和SalI进行双酶切后，两者在T4-DNA连接酶的作用下连接，再将连接的产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组质粒pUC19-Dtsqh，即构建为同源重组载体。

第三步，葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突变菌株的构建

将在-80℃冻存的保藏编号为CGMCC1.10327明串珠菌菌株划线于MRS固体平板上，于30℃过夜培养；从固体平板上挑取一个单菌落接种到5毫升MRS液体培养基中，于30℃以转速为120转/分钟摇床培养过夜；以1%转接到MRS含0.48微克/毫升氨苄的培养基中继续培养，初始OD₆₀₀为0.048的保藏编号为CGMCC1.10327的明串珠菌菌液的OD₆₀₀达到0.5时收集菌体，用含溶菌酶浓度为100U/毫升的LiAc-DTT溶液重新悬浮菌体，于30℃孵育20分钟，用冰冷的PBS溶液洗涤两次，再用50微升冰冷的PBS溶液悬浮菌体，加入5微升第二步得到的同源重组载体质粒，冰浴10分钟后进行电转化，所用电转化仪为Bio-RadGenePulserXCell^TM，电击参数为电击杯间距0.1cm、1400V、25μF、300Ω、电击时间为4毫秒，之后加入1毫升MRS培养基，复苏3h后，涂布于含MRS固体平板，培养36～48h后挑取单菌落验证，以证明从平板上筛选得到葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdtsl（LeuconostocMesenteroidesΔdtsl，保藏号是CCTCCM2013724）菌株。

设计一对引物Dtsy1：5'-TACGGCTTCTGACACTGG-3'和Dtsy2：5'-TACGGCTTCTGACACTGG-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，上述明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdtsl（LeuconostocMesenteroidesΔdtsl，保藏号是CCTCCM2013724）菌株得到700bp的扩增产物，而原始肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides，保藏编号为CGMCC1.10327）得到1500bp的扩增产物。

上述MRS液体培养基的组成：酵母浸粉3克、蛋白胨10克、牛肉浸粉8克、葡萄糖20克、柠檬酸铵2克、乙酸钠5克、K₂HPO₄2克、MgSO₄·7H₂O2克、MnSO₄·H₂O0.039克、吐温801.6毫升和水1000毫升，用乙酸调pH到6.2；121℃灭菌20min。固体培养基加1.5%的琼脂。

上述PBS溶液为K₂HPO₄-KH₂PO₄1毫摩尔/升、MgCl₂1毫摩尔/升和蔗糖0.5摩尔/升配制的溶液，pH为6.9。

实施例2

用一株明串珠菌突变菌株即肠膜明串珠菌Δdtsl（LeuconostocMesenteroidesΔdtsl，保藏号是CCTCCM2013724）发酵生产甘露醇。

将明串珠菌突变菌株即肠膜明串珠菌Δdtsl（LeuconostocMesenteroidesΔdtsl，保藏号是CCTCCM2013724）菌株以1%转接到MRS培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20h，检测代谢产物，通过对比试验证明，该明串珠菌突变菌株的甘露醇产率比原始肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides，保藏编号为CGMCC1.10327）提高了15.3%，蔗糖中果糖部分的转化率提高了6.1%。

表1列出了本实施例制得的明串珠菌突变菌株即肠膜明串珠菌Δdtsl（LeuconostocMesenteroidesΔdtsl，保藏号是CCTCCM2013724）菌株和原始肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides，保藏编号为CGMCC1.10327）在生产甘露醇中各种代谢产物的量。

表1.各种代谢产物的量(单位：克/升)

代谢产物	乳酸	乙酸	乙醇	葡聚糖	甘露醇
						突变菌株（保藏号CCTCCM2013724）	8.87	0.395	0.307	7.0	4.59
原始菌株（保藏号CGMCC1.10327）	8.89	0.392	0.308	9.8	3.98

Claims

1.一株肠膜明串珠菌突变菌株，其特征在于：是葡聚糖蔗糖酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株，为肠膜明串珠菌Δdtsl(LeuconostocMesenteroidesΔdtsl)菌株,其在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2013年12月29日，保藏号是CCTCCNo：M2013724。

2.权利要求1所述一株肠膜明串珠菌突变菌株的构建方法，其特征在于：通过基因敲除手段使肠膜明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因失活而构建成为肠膜明串珠菌突变菌株即保藏号是CCTCCNo：M2013724的肠膜明串珠菌Δdtsl(LeuconostocMesenteroidesΔdtsl)，步骤如下：

第一步，肠膜明串珠菌葡聚糖蔗糖酶基因部分序列的克隆

将基因编码序列长度超过4kb的保藏日期为2009年12月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC1.10327的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的葡聚糖蔗糖酶分成2段克隆后拼接成ORF内的部分连续序列，具体操作步骤是：

(1)保藏编号为CGMCC1.10327的肠膜明串珠菌总DNA的提取，

(2)PCR扩增葡聚糖蔗糖酶基因：设计一对引物Dtsq1：5'-AGAGTTGGGTAGTTGGTGG-3'和Dtsq2：5'-TGGTATGGTGACTTTGTTG-3'，以上述肠膜明串珠菌总DNA为模板，PCR扩增得到为2200bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pMD19-T上，重组质粒命名为pMD19-T-Dtsq；设计一对引物Dtsh1：5'-GTTTCCGTTTTGTATCCTG-3'和Dtsh2：5'-GGCTCTATCTTTTGTTTGT-3'，以上述肠膜明串珠菌总DNA为模板，PCR扩增得到为2500bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pMD19-T上，重组质粒命名为pMD19-T-Dtsh，

(3)感受态大肠杆菌DH5α的制备和DNA转化；

第二步，同源重组载体的构建

(1)设计二对引物Dtsqt1：5'-GGATGGTACCTATGCGATGT-3'与Dtsqt2：5'-GGTATGGTGTGTTTGTTGTTGT-3'和Dtsht1：5'-CAACAAACACACCATACCTACT-3'与Dtsht2：5'-CTTGTCGACCACCTTTACTT-3'，分别以上述第一步的步骤(2)操作扩增得到的重组质粒pMD19-T-Dtsq为模板和以重组质粒pMD19-T-Dtsh为模板进行PCR扩增，

(2)以纯化的PCR产物混合物为模板，利用一对引物Dtsqt1和Dtsht2再进行PCR扩增，

(3)将重叠延伸PCR产物和pUC19用KpnI和SalI进行双酶切后，两者在T4-DNA连接酶的作用下连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组质粒pUC19-Dtsqh，即构建为同源重组载体；

第三步，葡聚糖蔗糖酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株的构建

以电击转化法将第二步得到的同源重组载体导入到保藏日期为2009年12月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC1.10327的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)中，从平板上筛选葡聚糖蔗糖酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株，设计一对引物Dtsy1：5'-TACGGCTTCTGACACTGG-3'和Dtsy2：5'-TACGGCTTCTGACACTGG-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，验证证明构建得到葡聚糖蔗糖酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株，即保藏号是CCTCCNo：M2013724的肠膜明串珠菌Δdtsl(LeuconostocMesenteroidesΔdtsl)。