CN102199644B - 胞苷三磷酸的基因工程制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了一种胞苷三磷酸的制备方法，使用单一基因工程菌的培养物或其处理物作为酶源，催化包括氯化铵、乳清酸等进行反应，使得反应液中生成和积聚胞苷三磷酸，并从所述反应液中提取所述胞苷三磷酸。本发明的有益效果为：(1)采用单一的微生物催化反应，更易于控制反应；(2)底物成本较低，可低成本生产胞苷三磷酸；(3)反应迅速、且转化率较高。本发明能广泛地应用于胞苷三磷酸的制备中。

Description

胞苷三磷酸的基因工程制备方法

技术领域

本发明涉及一种胞苷三磷酸的制备方法，具体地说涉及在大肠杆菌中同时高效表达大肠杆菌嘧啶代谢途径中的乳清苷酸焦磷酸化酶(pyrE)、乳清苷酸脱羧酶(pyrF)、尿甘酸激酶(pyrH)、核苷二磷酸激酶(ndk)和CTP连接酶(pyrG)基因，属于生物技术领域。

背景技术

胞苷三磷酸(cytidine triphosphate，CTP)，又称胞嘧啶核苷三磷酸，CTP经尿苷三磷酸(uridine 5′-triphosphate，UTP)由酶催化合成，是一种在胞苷的核糖-5′-OH基上结合三分子磷酸的核苷酸。胞苷三磷酸是一种高能磷酸化合物，在体内参与核酸和磷脂类的合成代谢，促进蛋白质的合成，并提供能量，是RNA生物合成的直接前体之一，并参与多糖的合成。CTP具有激活和促进受损神经组织再生和修复的功能，可健全和调节神经组织、改善脂肪代谢等作用，还可以调节和促进神经细胞、神经胶质细胞及血管壁细胞膜性结构的合成与构建，能够对抗由兴奋性氨基酸、自由基引起的神经细胞损伤，从而起到抗血管硬化的作用。国外有实验研究已证实了CTP能减轻甚至逆转多种原因所引起的神经系统损伤。CTP也是合成寡聚糖、胞苷二磷酸胆碱(CDP-胆碱)、CMP-NeuAc(CMP-N-乙酰神经氨酸)等多种药物的中间体。

近年来用于临床的药用CTP为三磷酸胞苷二钠(cytidine 5′-triphosphatedisodium)，其化学名称为胞嘧啶核苷-5′-三磷酸二钠盐，其分子式为C₉H₁₄N₃Na₂O₁₄P₃，分子量为527.14，是一种治疗脑血管疾病的核苷酸类药物。目前已有厂家生产注射液制剂，临床上主要用于治疗多种原因引起的神经系统及心血管类疾病，如脑血管意外及其后遗症；脑震荡、外伤性昏迷、颅脑手术后功能障碍；神经官能症；脑血管硬化、老年性痴呆；外周神经损伤；儿童脑发育不全等。

已报道的胞苷三磷酸的合成工艺方法主要包括化学法、生物合成法、光合磷酸法等几种。国内生产CTP的方法主要是通过分离出酵母体内的自身酶系通过对CMP进行转化来生产CTP，生产工艺比较成熟。但该工艺不太可能完全分离出糖酵解系统中的所有酶，酶失活率高，转化率受到影响，且转化时间较长。近年来，CTP需求量的增加，临床用量也显著增加，已无法满足市场需求。

发明内容

本发明的目的在于，克服现有的生产胞苷三磷酸的方法存在的缺陷，而提供一种新的工艺简单、生产周期短、低成本的使用酶工程法生产胞苷三磷酸的方法。

本发明胞苷三磷酸的基因工程制备方法是采取以下技术方案实现的：

胞苷三磷酸的制备方法，使用单一的基因工程菌的培养物或者其处理物作为酶源，催化氯化铵、乳清酸等底物进行反应，使得反应液中生成和积聚胞苷三磷酸，并从所述反应液中提取所述胞苷三磷酸。

前述的基因工程菌具有可诱导表达编码乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶、核苷二磷酸激酶和胞苷三磷酸连接酶的基因。

前述的可诱导表达胞苷三磷酸连接酶的基因位于所述基因工程菌的质粒上。

前述的可诱导表达所述乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因位于所述基因工程菌的染色体上。

前述的可诱导表达所述胞苷三磷酸连接酶、乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段来源于大肠杆菌，是根据大肠杆菌全基因组序列(genebank登录号：ECK3632)设计引物扩增得到的。

更进一步地，所述基因工程菌的制备方法包括如下步骤：

a)将来源于大肠杆菌的可诱导表达胞苷三磷酸连接酶的基因核苷酸片段经酶切后与质粒载体(pUC18)连接形成重组质粒；

b)将来源于大肠杆菌的可诱导表达所述乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段经酶切后插入到宿主细胞的染色体上；

c)将所述重组质粒转入到所述宿主细胞内。

胞苷三磷酸的基因工程制备方法与现有技术相比，有如下优点：

(1)采用单一的微生物工程菌株催化反应，发酵、反应条件更易于控制；

(2)所使用的底物为乳清酸，成本较低，可低成本生产胞苷三磷酸；

(3)反应迅速、且转化率较高。

以下便结合实施例并附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述。

附图说明

图1是实施例中的基因工程菌的部分载体构建的流程图。

具体实施方式

本发明胞苷三磷酸的制备方法是使用单一基因工程菌的培养物或者其处理物作为酶源，催化包括氯化铵、乳清酸等为底物进行反应，使得反应液中生成和积蓄胞苷三磷酸，从所述反应液中提取所述。

实施例1、染色体带有pyrE、pyrF、pyrH、ndk操纵元的大肠杆菌的构建

1.1、pyrE、pyrF、pyrH、ndk基因的扩增及载体的构建

pyrE基因、pyrF基因、pyrH基因、ndk基因和pyrG基因是根据大肠杆菌全基因组序列(genebank登录号：ECK3632)设计引物的。

提取大肠杆菌K12MG1655基因组。

然后，以大肠杆菌K12MG1655基因组为模板分别扩增出pyrE、pyrF、pyrH、ndk基因，测序后，通过EcoRI、SacI酶切位点将pyrE片段连接于质粒pUC18上，得到质粒pUCpyrE；再通过SacI、SmaI位点将pyrF片段连接到质粒pUCpyrE上，得到质粒pUC-pyrEF；接着将pyrH片段经由SmaI和XbaI位点连接到pUC-pyrEF上，得到质粒pUCpyrEFH；最后通过XbaI和HindIII位点将ndk片段连接到pUCpyrEFH上，获得在lac启动子后可诱导表达pyrE、pyrF、pyrH、ndk基因的操纵元的质粒pUCpyrEFHk，具体构建流程如图1所示。

1.2、带有KRT-Km-FRT元件的pyrE、pyrF、pyrH、ndk操纵元质粒的构建

ndk基因引物上设计有XhoI位点，将pUCpyrEFHk用XhoI和ScaI酶切，与同样带有XhoI和ScaI酶切位点的以质粒pKD13为模板扩增出的带有FRT位点的Kan基因片段相连，构建成质粒pUCpyrEFHkKmFRT，如图1所示。

1.3、Red同源重组方法整合pyrE、pyrF、pyrH、ndk操纵元

(1)线性双链DNA打靶分子的制备与处理

用于基因敲除的外源DNA的PCR扩增引物，它们分别由5’端38bps的pyrE、pyrF、pyrH、ndk操纵元同源区和3′端20bps的模板质粒pKD13的卡那霉素抗性基因同源区或质粒pUCpyrEFHkKmFRT上20bp同源区组成。

使用高保真DNA聚合酶(Pfu DNA聚合酶)，经PCR合成了线性双链DNA打靶分子(5’同源臂+筛选标记+3’同源臂)。用Dpn I酶处理PCR产物，回收浓缩后用于重组。

(2)重组酶基因的诱导表达和感受态细胞的制备

将编码Red重组系统的质粒pKD46用CaCl₂法转化至大肠杆菌中，将宿主菌在含有氨苄青霉素的LB培养基中30℃过夜振荡培养，接种1mL菌液于50mL的含有Amp的LB液体培养基中，30℃振荡培养3-4h，在培养终止前1h加入L-阿拉伯糖，使之终浓度为0.1％。冰上预冷10min，离心收集菌体，用10％甘油或超纯水洗3-4次，最后将菌体重悬于500μL冷的无菌10％甘油中，取50μL用于电击转化，其余可存放于-80℃冰箱中备用。以上操作步骤都要在冰上进行。

(3)电击转化

取2μL(20-100ng)纯化后的PCR产物与50μl刚制备的感受态混合，采用BioRad公司Micro-Pulser电穿孔仪进行，0.2cm电转化杯，转化参数为2.5kV，5.8ms。迅速加入LB培养基1ml，置于37℃摇床中培养1-2h，复苏，用含筛选标记的LB平板筛选发生了同源重组的阳性克隆，获得菌株重组菌K1。

(4)验证引物设计及卡那霉素抗性基因的去除

对重组菌K1进行鉴定时，引物设计的一般原则是：一条引物设计在打靶区外围，另外一条则位于线性打靶序列内部。通过测序确认了重组事件发生的位置，获得的菌株K1即可用于下一步抗性去除。

质粒pCP20表达FLP重组酶，作用在重组体染色体上两个FRT靶位点上，使卡那霉素抗性基因丢失。将具有氨苄青霉素抗性的质粒pCP20利用CaCl₂方法转化进入具有Kan抗性的阳性菌株K1中，于30℃培养条件下在含有Amp和Kan的平板上获得阳性转化子。然后转接到没有抗生素的LB培养基中，42℃培养5h，37℃平板划线培养。对所得到的单菌落进行Amp和Kan敏感检测，最后的Amp和Kan敏感的表型菌株就是去除掉Kan基因的重组子，如K1-E。同时使用Kan这对引物对抗性消除进行验证，条件同上。

得到去除抗性的重组子K1-E即为染色体上带有pyrE、pyrF、pyrH、ndk共表达操纵元的大肠杆菌菌株。

实施例2、pyrG基因表达载体构建

根据已知大肠杆菌K12MG1655的pyrG基因核酸序列，以大肠杆菌的染色体作为模板，扩增出全长pyrG基因。

采用常规细菌DNA提取方法提取了本实验室保藏的大肠杆菌菌株DH5α的基因组DNA。

扩增使用的是保真性较好的pfu酶，加A尾后连接于pUC19-T vector，挑取阳性克隆送交测序公司，测序证实序列正确的用于下一步操作。

将连接于pUC19-T vector上的pyrG基因从载体上酶切下来，使用的限制性内切酶为Sma I和BamH I，同时载体pUC18使用限制性内切酶Nru I和BamH I进行酶切，将载体酶切产物回收后，与回收的pyrG基因片段进行酶连反应，通过Sma I和BamH I等限制性酶消化，进行分析，确认片段已经连接成功。最终获得质粒pUCG，pyrG基因此时是由lacZ启动子诱导表达的。

实施例3、产胞苷三磷酸的基因工程菌的构建

将实施例1中获得的所述重组子K1-E制备为感受态细胞，再将实施例2中构建完成的所述质粒pUCG转化入K1-E中，命名为K1-E/pUCG，即为具有催化乳清酸和氯化铵等合成胞苷三磷酸能力的基因工程菌，加甘油保藏于-80℃冰箱中。

实施例4、发酵及催化反应

将固体培养基上的工程菌K1-E/pUCG菌株接入5-20ml含氨苄青霉素(100μg/ml)的种子培养液中，30-37℃以150-280rpm振荡培养8-16小时。按0.1-10％的接种量将该培养液转接至50-200ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的种子LB培养基液的1L三角烧瓶中，在30-37℃以150-280rpm振荡培养2-8小时，然后加入终浓度为0.1-1mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，继续培养4-12小时，培养温度可适当下调。

用冷冻离心机将发酵液于4-20℃下以1000-5000rpm的速度离心5-10min，弃上清，用10-20ml 0.05M，pH 8.0的Tris-HC1重悬菌体细胞。

将重悬后的重约4g大肠杆菌细胞加入三角瓶中，并向其中添加10g葡萄糖、0.6g乳清酸、0.8g氯化铵、1g磷酸氢二钾、1g磷酸二氢钾、1mg硫酸亚铁、0.8mg硫酸锰、20mg硫酸镁和0.4mL二甲苯，再加入蒸馏水定容至100mL。将此混合液装入2L容量的三角瓶中，在28℃、100rpm的条件下进行反应。反应中，在适宜的进程中添加KOH以便保持反应体系pH值为7.2。反应24小时后，用HPLC方法测定反应液中胞苷三磷酸的含量为7.15g/L。

实施例5、分离与纯化

反应终止后，在转化液中加入硅藻土，搅拌，以去掉蛋白质。再将转化液离心，收集上清液。在离心上清液中加入阳离子交换树脂搅拌吸附，调pH为1.2至4.0范围内皆可，静置，过滤，得滤液。在滤液中加入乙醇，至乙醇含量达60％以上，静置。再过滤，收取滤饼。将得到滤饼加水溶解稀释，过滤，得滤液。滤液调pH为2.0-2.5左右，上树脂分离柱，进行吸附。检测从分离柱下口流出的溶液，吸附饱和时停止进样，用氯化钠溶液进行梯度洗脱。

为进一步纯化，在上述7中洗脱下来的溶液中加入药用活性炭，搅拌脱色，过滤，将获得的滤液中按1∶2-1∶20的比例加入药用酒精，收集沉淀，抽滤除去水分，即可得到纯度较高的胞苷三磷酸。

本发明中，作为载体，只要在宿主微生物中能够复制即可；作为宿主微生物，只要能够表达重组DNA，用于胞苷三磷酸生产即可。

培养本发明中基因工程菌的培养基，只要含有本发明中基因工程菌可以用于代谢的碳源、氮源、无机盐类等、可有效地培养本发明微生物，不管是天然培养基，还是合成培养基均可。其中：

碳源，只要是本实施例中基因工程菌可以用于代谢者即可，如葡萄糖、果糖、蔗糖；含有上述糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解产物等碳水化合物；醋酸、丙酸等有机酸；乙醇和丙醇等醇类。

氮源，可以用氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵和磷酸铵等含氮化合物；以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浸渍液、酪蛋白水解物、大豆粕和大豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化产物等。

无机盐，可以用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙等。

培养本实施例中基因工程菌的最适温度为25-37℃，培养中培养基的pH值最好维持在中性范围，培养时间是6-24小时。本发明能广泛地应用于胞苷三磷酸的制备中。

本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本实用新型的保护范围之内。

Claims (4)

1.胞苷三磷酸的制备方法，其特征在于：使用可表达来源于大肠杆菌(Escherichia.coli)的编码胞苷三磷酸连接酶、乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶序列的基因工程菌的培养物或者其处理物作为酶源，以乳清酸和磷酸根离子为底物进行反应，在反应液中生成和积累胞苷三磷酸，并从所述反应液中提取胞苷三磷酸；可诱导表达的胞苷三磷酸连接酶的基因位于所述基因工程菌的质粒上；可诱导表达的乳清苷酸焦磷酸化酶、核苷二磷酸激酶、尿甘酸激酶和乳清苷酸脱羧酶的基因通过同源重组整合于所述基因工程菌的染色体上；所述基因工程菌为大肠杆菌。

2.根据权利要求1中所述的胞苷三磷酸的制备方法，其特征在于：所述基因工程菌的制备方法包括如下步骤：

a)将位于可诱导表达启动子后，来源于大肠杆菌的编码乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段整合到宿主细胞的染色体上；

b)将来源于大肠杆菌的可诱导表达胞苷三磷酸连接酶的基因片段酶切后与质粒载体连接形成重组质粒；

c)将所述重组质粒转入到所述宿主细胞内。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述质粒载体为质粒pUC18。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。