CN104561195B - 一种尿苷二磷酸葡萄糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种尿苷二磷酸葡萄糖的制备方法，通过酵母与基因工程菌的联合作用，简便、经济、合理地大量合成尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)，然后通过树脂分离、醇沉等进行纯化，可以获得非常高纯度的目标化合物，从而完成了本发明。

Description

一种尿苷二磷酸葡萄糖的制备方法

技术领域

本发明属于化学及生物工程领域；更具体地，本发明涉及一种尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的制备方法。

背景技术

糖核苷酸在功能性寡糖合成，蛋白质、抗生素、黄酮类化合物、青蒿素等结构修饰方面起到了很好的作用。

尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)是研究最早的糖核苷酸，其可以作为其他种类糖核苷酸合成前体，比如可在UDPG-4′-差向异构酶作用下生成UDP-Gal，在UDPG脱氢酶作用下生成UDP-GlcA等等；黄酮类化合物的修饰主要是以UDPG为底物，在糖基转移酶作用下进行的，比如木犀草素、槲皮素、柚皮素、儿茶素等[中国天然药物，2010，8(5)，389-400]。

UDPG的合成主要是化学合成[Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.,28307(1973)、J.Org.Chem.，57146(1992)]、发酵法、酶法转化[J.Org.Chem.，55，1834(1990)、特表平7-500248]。化学合成需要对糖基上活性基团进行保护和去保护，催化剂昂贵，反应条件苛刻，有机溶剂用量大，环境污染严重，反应周期长，得率低。发酵法也存在着产率低的缺点。由于酶对底物具有较强的立体选择性和专一性使酶法合成UDPG成为一种简便易行的方式。而且，近年基因重组技术的快速发展，能够以较低的成本大规模生产各种酶，使酶合成法的优势更为显著。

酶法合成糖核苷酸主要是以NTP、葡萄糖-1-磷酸为底物，在相应的焦磷酸化酶作用下生成。如中国科技大学祁超等以UTP、葡萄糖-1-磷酸为底物，通过大肠杆菌表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶合成UDPG，转化率在65～85%[中国科技大学学报，2004，34(5)，624-629]。日本Yamasa公司采用面包酵母生产UDPG，转化率只有28%[US5968783]。日本东京大学研究者Hiroyasu Kawai采用白球拟酵母生产UDPG，转化率在65%，但是会伴随产生部分UDP-Gal，两者很难分离。Agnes W.H.TAN利用纯的己糖激酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDPG焦磷酸化酶、焦磷酸化酶合成UDPG，转化率在85%[Biochimica et Biophysica Acta，582(1979)543-547]，但是用纯酶价格比较高，也限制了其工业化生产使用。

由于UTP价格昂贵，大多数研究者都利用价格便宜的UMP合成UTP。主要是通过表达核苷酸磷酸激酶的大肠杆菌系统来生产UTP。这需要克隆至少四到六个酶，使得UTP的合成途径繁琐，成本下降不明显。日本Yamasa公司利用酵母系统生成UTP与UDPG的混合溶液，再在大肠杆菌表达的UDPG焦磷酸化酶和麦芽糊精磷酸化酶作用下生成UDPG[US6040158]。但其利用酵母系统合成UTP和UDPG的过程中，会产生一定量的UDP-Gal，而UDPG和UDP-Gal之间很难分离，加重了后续分离工艺的负担。

综合以上因素，本领域迫切需要进一步开发高效低成本生产UDPG的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的制备方法。

在本发明的第一方面，提供一种制备尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的方法，所述方法包括：在一个体外(细胞外)反应系统中，以尿苷三磷酸(UTP)或其盐(如钠盐)、麦芽糊精为底物，加入无机离子、dTT和Tris，以大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶和麦芽糊精磷酸化酶作为催化剂，通过生物转化生产尿苷二磷酸葡萄糖。

在一个优选例中，所述的尿苷三磷酸或其盐(如钠盐)如下制备：

将尿苷一磷酸或其盐(如钠盐)、酵母、无机盐和碳源混合、反应，获得尿苷三磷酸或其盐(如钠盐)。

在另一优选例中，所述的酵母经过通透性处理，使得酵母与外界的物质交换更为通畅。

在另一优选例中，所述的无机离子包括阳离子和阴离子；较佳地，所述的阳离子选自：镁离子、钾离子或钠离子；所述的阴离子是磷酸根离子；更佳地，所述的无机离子由磷酸二氢钾、硫酸镁产生；较佳地，所述的磷酸二氢钾的终浓度为15±10g/L(更佳地为15±8g/L；更佳地为15±5g/L)；较佳地，所述的硫酸镁的终浓度是2.5±1g/L(更佳地为2.5±0.5g/L；更佳地为2.5±0.2g/L)；

所述的碳源选自：葡萄糖、果糖或蔗糖；较佳地是葡萄糖；所述的葡萄糖的终浓度是15±10g/L(更佳地为15±8g/L；更佳地为15±5g/L)；

所述的尿苷一磷酸或其盐(如钠盐)的终浓度是30±15g/L(更佳地为30±10g/L；更佳地为30±5g/L)；

所述的酵母的终浓度是180±100g/L(更佳地为180±60g/L；更佳地为180±20g/L)。

在另一优选例中，以大肠杆菌重组表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的方法包括：

(1)提供重组表达载体，其中包括尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶编码基因galU(其与驱动表达的元件如启动子操作性连接)；

(2)将(1)的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌BL21；

(3)培养(2)的重组大肠杆菌BL21，从而表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶；较佳地，重组表达时，当菌株在培养基中OD600达到0.6时，加入IPTG诱导，IPTG终浓度为0.5mM，诱导后继续培养4小时，收集菌体，破碎，分离上清。

在另一优选例中，以大肠杆菌重组表达的麦芽糊精磷酸化酶的方法包括：

(a)提供重组表达载体，其中包括麦芽糊精磷酸化酶编码基因malp(其与驱动表达的元件如启动子操作性连接)；

(b)将(a)的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌BL21；和

(c)培养(b)的重组大肠杆菌BL21，从而表达麦芽糊精磷酸化酶；较佳地，重组表达时，当菌株在培养基中OD600达到0.8时，加入IPTG诱导，IPTG终浓度为0.4mM，诱导后继续培养3小时，收集菌体，破碎，分离上清。

在另一优选例中，所述反应系统中，尿苷三磷酸或其盐(如钠盐)的终浓度为10±5g/L(更佳地为10±3g/L；更佳地为10±2g/L)；或

麦芽糊精的终浓度为22±10g/L(更佳地为22±6g/L；更佳地为22±3g/L)；或

大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的终浓度1～50ml/L(相当于0.5-25g菌体)(更佳地为1～30ml/L(相当于0.5-15g菌体)；更佳地为1～10ml/L(相当于0.5-5g菌体))；

大肠杆菌重组表达的麦芽糊精磷酸化酶的终浓度1～50ml/L(相当于0.5-25g菌体)(更佳地为1～30ml/L(相当于0.5-15g菌体)；更佳地为1～10ml/L(相当于0.5-5g菌体))；

所述的dTT的终浓度为1～5g/L(更佳地为0.5～2g/L；更佳地为0.5～1.5g/L)；

所述的Tris的终浓度为1～10g/L(更佳地为1～5g/L；更佳地为2～3g/L)。

在另一优选例中，所述反应系统中，所述的无机盐包括：磷酸氢二钾，氯化镁；较佳地，所述的磷酸氢二钾的终浓度是12±6g/L(更佳地为12±4g/L；更佳地为12±2g/L)；较佳地，所述的氯化镁的终浓度是2.4±1g/L(更佳地为2.4±0.5g/L；更佳地为2.4±0.2g/L)。

在另一优选例中，所述生物转化生产的温度为20～40℃(较佳地为30-38℃)，pH值为5～8，转化时间为2～40小时。

在另一优选例中，调pH值至2.0～3.0使转化终止，所用终止反应溶剂可以为盐酸、硫酸或磷酸。

在另一优选例中，生物转化反应结束后，还包括从反应系统中分纯化UDPG的步骤；较佳地，所述的分离纯化方法是：应用阴离子交换树脂(较佳地为强碱型阴离子交换树脂)吸附UDPG产物，然后用PH8.0的氯化钠溶液梯度洗脱，收集洗脱液纳滤脱盐后，用95%乙醇进行醇沉，静置，离心，收集沉淀。

在本发明的另一方面，提供一种用于制备尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的试剂盒，所述试剂盒中包括：麦芽糊精、无机盐、dTT、Tris、大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、大肠杆菌重组表达的麦芽糊精磷酸化酶、尿苷一磷酸或其盐(如钠盐)、酵母、碳源。

在本发明的另一方面，提供一种用于制备尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的试剂盒，所述的无机盐包括：磷酸二氢钾、硫酸镁、磷酸氢二钾、氯化镁；

所述的碳源包括：葡萄糖；

所述的大肠杆菌是大肠杆菌BL21。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

具体实施方式

本发明经过深入的研究，揭示了一种新的制备尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的方法，以尿苷三磷酸、麦芽糊精为原料，以表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶和麦芽糊精磷酸化酶的大肠杆菌作为生物催化剂，通过生物转化生产UDPG。利用本发明，可以有效地制备UDPG，生产中不会产生异构物尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)，简化了后续分离工艺，适合于工业化生产。

基本原理

本发明的方法基于以下技术原理：①尿苷一磷酸(III)、酵母、无机盐、碳源等混合，保温反应，获得尿苷三磷酸(II)；②利用大肠杆菌表达麦芽糊精磷酸化酶，其可催化麦芽糊精与碳源(如葡萄糖)反应生成葡萄糖-1-磷酸(IV)；③利用大肠杆菌表达UDPG焦磷酸化酶，其与化合物(II)、(IV)混合反应，可得到如式(I)所示的化合物。其中，②和③可在一个反应系统中进行。

鉴于UTP、葡萄糖-1-磷酸成本高昂，因此本发明人采用价格低廉的废酵母系统的磷酸化体系以UMP为底物合成UTP；采用大肠杆菌表达的麦芽糊精磷酸化酶催化麦芽糊精生成G-1-P。再在大肠杆菌UDPG焦磷酸化酶作用下合成UDPG。表达UDPG焦磷酸化酶、麦芽糊精磷酸化酶的大肠杆菌体系内不含有UDPG-4′-差向异构酶，在UDPG的生产过程中不会产生UDP-Gal，这简化了后续分离工艺，降低了生产成本，适合于工业化规模生产。

制备尿苷三磷酸

本发明的方法中，所述的尿苷三磷酸或其盐如下制备：将尿苷一磷酸(UMP)或其盐(如钠盐)、酵母、无机盐和碳源混合、反应，获得尿苷三磷酸。

本发明反应时所用的酵母是能够将UMP转化到UTP的菌体，任何有该转化机制的酵母菌均可应用。例如，包括但不限于：酵母菌属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、念珠酵母属(Candida)等来源于酵母的菌体。这些酵母菌体可以是活酵母菌体、压榨酵母菌体、干燥酵母菌体、市售酵母粉中的任一种。

作为本发明的优选方式，所述的酵母菌体需要进行通透性处理。酵母菌体的通透处理可使用表面活性剂、有机溶剂。表面活性剂包括Triton-X100、Nymeen S-215、烷基二甲胺等，促进酵母细胞通透性和UDPG生成的物质均可使用，可单独使用或多种混合使用。表面活性剂通常以0.1～50g/Kg的浓度使用，优选以1～20g/Kg的浓度使用。有机溶剂可使用二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯等，通常以1～60ml/Kg的浓度使用，优选以2～10ml/Kg的浓度使用。

本发明中，UTP或其盐的合成反应中添加的UMP或其盐可使用市售商品，终浓度是30±15g/L；更佳地为30±10g/L；更佳地为30±5g/L。

反应体系中同时要添加磷酸化过程所需的无机离子和碳源。无机离子包括磷酸根离子、镁离子、钾离子、钠离子等。磷酸根离子可直接使用磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等，但最好是以磷酸缓冲液的形态使用，例如，应用磷酸二氢钾和硫酸镁；较佳地，所述的磷酸二氢钾的终浓度为15±10g/L；更佳地为15±8g/L；更佳地为15±5g/L。所述的硫酸镁的终浓度是2.5±1g/L；更佳地为2.5±0.5g/L；更佳地为2.5±0.2g/L。

作为碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖等糖类，较佳地应用葡萄糖，所述的葡萄糖的终浓度是15±10g/L；更佳地为15±8g/L；更佳地为15±5g/L

本发明中，利用酵母菌体制备UTP过程中，反应的终止是采用添加酸化剂，调pH2.0～3.0，维持30分钟后，进行过滤。酸化剂为盐酸、硫酸、磷酸、三氯乙酸等。过滤可使用高速离心机或板框过滤机等能将料液分离的设备即可。

制备尿苷二磷酸葡萄糖

所述的制备尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的方法包括：在一个体外(细胞外)反应系统中，以尿苷三磷酸(UTP)或其盐(如钠盐)、麦芽糊精为底物，加入无机离子、dTT和Tris，以大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶和麦芽糊精磷酸化酶作为催化剂，通过生物转化生产尿苷二磷酸葡萄糖。

在UDPG的制备过程中，添加在反应体系中的UDPG焦磷酸化酶和麦芽糊精磷酸化酶可以是来源于动物、植物、微生物等，对其来源没有特别的限定，可使用任何来源的酶。随着基因工程技术的发展，利用大肠杆菌重组表达目的蛋白相比动植物提取简便可行。可使用表达UDPG焦磷酸化酶和麦芽糊精磷酸化酶的大肠杆菌菌体、菌体的处理物等。

在重组表达生产UDPG焦磷酸化酶或麦芽糊精磷酸化酶时，大肠杆菌可选用JM109、BL21DE3、BL21、DH5a以及经过紫外诱变或基因敲除等手段筛选的大肠杆菌作为宿主菌。本发明中应用的大肠杆菌BL21无UDPG差向异构酶活性，其生产中不会产生异构物尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)，简化了后续分离工艺，适合于工业化生产。

大肠杆菌菌体、菌体的处理物可使用经过机械破碎、冻融、自溶、干燥、酶处理、超声波处理、化学处理等方法获得。

UDPG的生成反应是在水性介质中，20～40℃条件下反应2～40小时，反应液的pH在6.0～8.0的范围内，以6.0～7.5为佳。

本发明中，UDPG的合成过程中，麦芽糊精可以采用市售品，终浓度为22±10g/L；更佳地为22±6g/L；更佳地为22±3g/L。反应液中同时要加入UTP，磷酸根离子，镁离子，还原剂，大肠杆菌菌体或菌体处理物。还原剂可使用二硫苏糖醇、巯基乙醇等。

本发明中，UDPG的分离采用离子交换法进行，优选强碱性阴离子交换树脂，比如201×7、201×8、国产717、Dowex1、Amberlite IRA-400或Zerolit FF等。通过吸附、解析的过程得到UDPG溶液。UDPG分离也可依据[J.Org.Chem.1990,55,1834-1841]进行。

然后将溶液调pH值为7～9，然后用2～6倍量的溶剂沉淀，将所得沉淀溶解再重新加入溶剂进行沉淀，冷冻干燥，即得符合要求的尿苷二磷酸葡萄糖。此处所指溶剂为95%乙醇、无水乙醇、甲醇、丙酮等任一种，或是其搭配物。

现有技术的方法中，UDPG的合成所需底物葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)是以葡萄糖、UTP为底物，在己糖激酶、葡萄糖磷酸变位酶作用下合成，还需要利用磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸激酶等参与反应。其步骤繁琐，涉及的酶种类多，导致葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)反应的得率低。并且，该方法所用UTP、酶等都是市售商品，生产成本高；反应底物UTP浓度低，反应得率也较低，而且产品纯度不够高。从经济角度来讲，该方法不适合于产业化生产。

因此，本发明人利用啤酒废酵母系统作为酶源，以价格低廉的尿苷一磷酸(或其钠盐)为底物，转化生成UTP(或其钠盐)；以麦芽糊精为底物，经大肠杆菌重组表达的麦芽糊精磷酸化酶进行催化，生成葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)；UTP(或其钠盐)、葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)在大肠杆菌重组表达的UDPG焦磷酸化酶作用下生成UDPG。采用本发明的方法，UDPG合成简便，过程易于控制，生产过程中无结构类似物UDP-Gal的生成，转化率、产品纯度高，生产成本明显降低。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、制备目标物的原料已大规模工业化，来源广泛，价格低廉。

2、制备过程无需特殊或危险性试剂，对设备，人员素质等无高等级要求。

3、工艺过程简单，便捷，可通过两步或三步反应即可制的目标化合物。

4、提供的纯化方法简便，无需特殊设备，成本低廉。

5、依据该方法制备的UDPG纯度高，无UDP-Gal副产物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

对照例1、UDPG的合成

参照中国科技大学祁超等以UTP、葡萄糖为底物，通过大肠杆菌表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶合成UDPG[中国科技大学学报，2004，34(5)，624-629]。

将UTP·Na₃1.102克、葡萄糖0.648克、氯化镁2.03克、dTT3.08克、三乙醇胺(TEOA，pH8.0)100mM、葡萄糖-1，6二磷酸(G-1,6-PP)0.016克、磷酸烯醇丙酮酸0.336克、1.8KU己糖激酶、6KU丙酮酸激酶、0.6KU UDPG焦磷酸化酶、1.2KU无机焦磷酸化酶，室温搅拌反应，重组表达UDPG焦磷酸化酶粗酶液(2ml)(制备方法参见实施例3)组成的反应液2000ml在37℃，100rpm，反应8小时后生成了UDPG9.79克。

采用上述合成方法，UDPG得率为65.3%；纯度为76.8%。

实施例1、压榨酵母制备UDPG

(1)啤酒废酵母预处理

取啤酒厂新鲜废啤酒酵母20公斤，用板框压滤，吹干，收集滤饼2.5公斤。

(2)压榨酵母通透性处理

按照每公斤滤饼加入5ml二甲苯的量，向2.5公斤酵母滤饼中加入12.5ml二甲苯，高速分散混匀，-20℃保存。

实施例2、UTP的制备

在容量20L的反应釜中配制有UMP·Na₂300克，葡萄糖150克、磷酸二氢钾150克、硫酸镁25克、压榨酵母1.8公斤组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH至7.0，温度为37℃，反应8小时，加入盐酸调节PH=2.5，静止30分钟后，高速冷冻离心（12000rpm，30min），得到了UTP·Na₃358克。

实施例3、重组表达尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)焦磷酸化酶制备

(1)UDPG焦磷酸化酶基因的克隆

采用TianGen试剂盒提取大肠杆菌BL21基因组，以之为模板PCR扩增大肠杆菌UDPG焦磷酸化酶(galU)基因(参见Weissborn et al.，J.Bacteriol，176，2611(1994)，或如SEQID NO:1)。

应用的PCR扩增引物如下：

引物A：5′-GCGAATTCTGATATACTGGGATGCGATAC-3′(SEQ ID NO:3)；

引物B：5′-ACGTCGACACGATACGGATGTATCTT-3′(SEQ ID NO:4)。

反应体系(30μl)：

PCR反应条件：

(2)转化

将PCR产物与PET28b质粒分别进行双酶切，切胶回收，连接，并转化DH5a感受态细胞，抽提质粒，转化BL21感受态细胞。

(3)培养条件

挑取单克隆接种到含卡那霉素(65微克/毫升)的3ml LB液体培养基，37℃，220rpm。当OD600达到0.6时加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导，诱导后继续培养4小时，离心（6000rpm，10min），收集菌体，-20℃保存。

(4)UDPG焦磷酸化酶粗酶液的制备

取离心后的大肠杆菌1g(湿重)，用10倍体积的20mM Tris-HCl(pH=7.0)，漩涡振荡，溶菌酶用量为30毫克/克菌体。37℃保温30～60min，超声波破碎处理，离心（6000rpm，10min），上清4℃保存备用。

实施例4、重组表达麦芽糊精磷酸化酶制备

(1)酶的克隆表达

采用TianGen试剂盒提取大肠杆菌BL21基因组，以之为模板PCR扩增大肠杆菌麦芽糊精磷酸化酶(malp)基因(参见Nature，313(6002)，500-502(1985)，或如SEQ ID NO:2)。

应用的PCR扩增引物如下：

引物(C)：5′-TAGAATTCAACTCCTCCCTGCCTAATCCCCC-3′(SEQ ID NO:5)；

引物(D)：5′-TTGGATCCCGGCATTATCCAGACGTTTGCTT-3′(SEQ ID NO:6)。

PCR过程：循环次数热变性(94℃，1min)、退火(55℃，1.5min)、聚合(72℃，1.5min)，反应体系(30μl)：

PCR反应条件：

(2)转化

将PCR产物与PET28b质粒分别进行双酶切，切胶回收，连接，并转化DH5a感受态细胞，抽提质粒，转化BL21感受态细胞。

(3)培养条件

挑取单克隆接种到含卡那霉素(65微克/毫升)的3ml LB液体培养基，37℃，220rpm。当OD600达到0.8时加入IPTG(终浓度0.4mM)诱导，诱导后继续培养3小时，离心（6000rpm，10min），收集菌体，-20℃保存。

(4)麦芽糊精磷酸化酶粗酶液的制备

取离心后的大肠杆菌1g(湿重)，用10ml的20mM Tris-HCl(pH=7.0)，漩涡振荡，溶菌酶用量为30mg/g菌体。37℃保温30～60min，超声波破碎处理，离心（6000rpm，10min），上清4℃保存备用。

实施例5、UDPG的合成

在1L反应釜中配制由实施例2中制备的UTP5克、磷酸氢二钾6克、氯化镁1.2克、dTT0.46克、Tris1.21克、麦芽糊精11.8克，用5mol/L盐酸调节PH=7.0，然后加入重组表达UDPG焦磷酸化酶的大肠杆菌经超声破碎和离心获得的粗酶液5ml(相当于0.25g菌(湿重))、重组表达麦芽糊精磷酸化酶的大肠杆菌经超声破碎和离心获得的粗酶液2.5ml(相当于0.25g菌(湿重))组成的反应液500ml，在37℃下反应24小时，加入磷酸调节PH=3.0，静止30分钟(终止反应)后，高速冷冻离心（12000rpm，30min），上清中含有UDPG4.1克，转化率78%。

用该方法进行生产，首先原材料价廉易得，生产简单，G-1-P原位生产，大大降低生产成本，纯化后可得到99%以上的高纯度产品。

实施例6、UDPG的放大生产及纯化

(1)UDPG的合成

在10L反应釜中配制由实施例2中制备的UTP50克、磷酸氢二钾60克、氯化镁12克、dTT4.8克、Tris12.1克、麦芽糊精118克，用5mol/L盐酸调节PH=7.0，然后加入大肠杆菌UDPG焦磷酸化酶粗酶液50ml(相当于2.5g菌(湿重))、麦芽糊精磷酸化酶粗酶液50ml(相当于2.5g菌)组成的反应液5L，在37℃下反应30小时，加入盐酸调节PH=2.5，静止30分钟(终止反应)后，高速冷冻离心（12000rpm，30min），得到上清中含有UDPG42.5克。

(2)UDPG的纯化

取前述获得的UDPG上清液3L，用纯化水稀释至浓度为2g/L，上201×7阴离子交换树脂。上样结束用3倍柱体积的纯化水洗杂，然后用PH8.0的氯化钠溶液梯度洗脱，通过HPLC检测流出口的UDPG含量及纯度，确定收集起点和终点。收集液纳滤脱盐后，用95%乙醇进行醇沉，静置3小时后，高速冷冻离心，沉淀用无水乙醇洗涤两遍，进行冷冻干燥结晶，经HPLC检测纯度为99.2%，无UDP-Gal杂质。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (13)

1.一种制备尿苷二磷酸葡萄糖的方法，其特征在于，所述方法包括：

在一个体外反应系统中，以尿苷三磷酸或其盐、麦芽糊精为底物，加入无机离子、dTT和Tris，以大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶粗酶液和麦芽糊精磷酸化酶粗酶液作为催化剂，通过生物转化生产尿苷二磷酸葡萄糖；

利用大肠杆菌表达UDPG焦磷酸化酶和麦芽糊精磷酸化酶，且该大肠杆菌体系内不含有UDPG-4′-差向异构酶，所述大肠杆菌是通过基因敲除的手段制备的。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的尿苷三磷酸或其盐如下制备：将尿苷一磷酸或其盐、酵母、无机盐和碳源混合、反应，获得尿苷三磷酸或其盐。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的无机离子包括阳离子和阴离子；所述的阳离子选自：镁离子、钾离子或钠离子；所述的阴离子是磷酸根离子。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的无机离子由磷酸二氢钾、硫酸镁产生。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的磷酸二氢钾的终浓度为15±10 g/L；

所述的碳源选自：葡萄糖、果糖或蔗糖；

所述的尿苷一磷酸或其盐的终浓度是30±15 g/L；或

所述的酵母的终浓度是180±100 g/L。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的硫酸镁的终浓度是2.5±1g/L；或

所述的碳源是葡萄糖；所述的葡萄糖的终浓度是15±10 g/L。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以大肠杆菌重组表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的方法包括：

(1) 提供重组表达载体，其中包括尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶编码基因galU；

(2) 将(1)的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌BL21；

(3) 培养(2)的重组大肠杆菌BL21，从而表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，重组表达时，当菌株在培养基中OD600达到0.6时，加入IPTG诱导，IPTG终浓度为0.5mM，诱导后继续培养4小时，收集菌体，破碎，分离上清。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以大肠杆菌重组表达的麦芽糊精磷酸化酶的方法包括：

(a) 提供重组表达载体，其中包括麦芽糊精磷酸化酶编码基因malp；

(b) 将(a)的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌BL21；和

(c) 培养(b)的重组大肠杆菌BL21，从而表达麦芽糊精磷酸化酶。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，重组表达时，当菌株在培养基中OD600达到0.8时，加入IPTG诱导，IPTG终浓度为0.4mM，诱导后继续培养3小时，收集菌体，破碎，分离上清。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应系统中，尿苷三磷酸或其盐的终浓度为10±5 g/L；或

麦芽糊精的终浓度为22±10 g/L；或

大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的终浓度1～50ml/L；

大肠杆菌重组表达的麦芽糊精磷酸化酶的终浓度1～50ml/L；

所述的dTT的终浓度为1～5 g/L；

所述的Tris的终浓度为1～10 g/L。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应系统中，所述的无机盐包括：磷酸氢二钾，氯化镁；所述的磷酸氢二钾的终浓度是12±6 g/L；所述的氯化镁的终浓度是2.4±1 g/L。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物转化生产的温度为20～40℃，pH值为5～8，转化时间为2～40小时。