CN104789538A - 一种提高γ-谷氨酰转肽酶催化合成L-茶氨酸的补料策略 - Google Patents

一种提高γ-谷氨酰转肽酶催化合成L-茶氨酸的补料策略 Download PDF

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Abstract

一种利用分批添加双底物的方法对重组pMA5-ggt/Bacillus.subtilis分泌的γ-谷氨酰转肽酶催化L-谷氨酰胺和乙胺生成L-茶氨酸的工艺进一步优化，属于发酵工程和酶工程领域。本发明采用前期工作构建的分泌γ-谷氨酰转肽酶的枯草芽孢杆菌，对菌株进行发酵罐培养。浓缩上清粗酶液，应用于茶氨酸的转化。在此基础上，通过分批添加底物实现对转化过程的进一步调控，在含60U/mL酶液的反应体系中，每隔2个小时向其中添加底物谷氨酰胺和乙胺，谷氨酰胺的添加量固定在20mM，供体受体比例控制在1：12时，pH调整为10，18小时后可得到茶氨酸164.2mM，谷氨酰胺转化率达到91.2％。该方法具有操作简单，成本低，茶氨酸产量高，底物转化率高等优点，有利于工业放大生产。

Description

一种提高γ-谷氨酰转肽酶催化合成L-茶氨酸的补料策略
技术领域
采用分批补料策略提高利用枯草芽孢杆菌分泌表达的γ-谷氨酰转肽酶转化生产L-茶氨酸的产量，属于酶工程和发酵工程领域。
技术背景
L-茶氨酸(N-乙基-L谷氨酸)，是最初由茶叶中提取获得的一种天然氨基酸，对机体具有多种健康疗效。L-茶氨酸已经被美国食品和药品监督管理局(FAD)认证为一种安全的食品添加剂。鉴于茶氨酸上诉诸多功效，其需求量日益增加。
γ-谷氨酰转肽酶广泛应用于茶氨酸的酶法生产，该酶催化γ-谷氨酰类化合物的γ-谷氨酰胺键的水解，同时将水解生成的γ-谷氨酰分子转移给受体分子。当选用L-谷氨酰胺作为供体，乙胺为受体，γ-谷氨酰转肽酶催化转肽反应时，即可生成茶氨酸。
发明人前期公开了一株能够高效分泌表达可溶性γ-谷氨酰转肽酶的重组Bacillus subtilis/pMA5-ggt(专利号：201410747714.9)，但是批次催化合成L-茶氨酸的产量还比较低，不能满足工业化需求，因此本发明通过在前期利用γ-谷氨酰转肽酶批次转化生产L-茶氨酸的基础上，采用分批补料添加双底物的方法，不仅可以解决供体L-谷氨酰胺的低溶解度和其对酶的抑制作用，同时可以解决其他学者仅流加供体L-谷氨酰胺时出现的过高浓度的乙胺受体引发的过低的供体受体比例问题和pH难以控制对反应的不利影响。实验结果显示，取浓缩酶液作为反应体系，每隔两个小时向其中添加底物谷氨酰胺和乙胺，谷氨酰胺的添加量固定在20mM，供体受体比例控制在1：12时，每次均将pH调整为10，18小时后可得到茶氨酸164.2mM，谷氨酰胺转化率达到91.2％。是目前报道的提高酶法合成L-茶氨酸产量和底物转化率最有效高的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供：对γ-谷氨酰转肽酶催化底物供体L-谷氨酰胺和受体乙胺生成茶氨酸的催化流加工艺进行优化，在已经实践的单纯分批添加谷氨酰胺的基础上，提出同时流加谷氨酰胺和乙胺的思路。该思路可以在解决谷氨酰胺低溶解度和对酶的抑制作用的基础上，同时有效避免过高的乙胺浓度造成的底物比例失调以及对反应体系pH的不利影响。实验取得较好的茶氨酸产量和高供体浓度条件下的最好的谷氨酰胺转化率，为茶氨酸的高效工业生化产提供很好的思路和基础。
本发明的技术方案：在发酵罐水平上培养前期构建的具有高效分泌γ-谷氨酰转肽酶能力的Bacillus subtilis/pMA5-ggt，发酵液中粗酶液经浓缩去盐后，将酶初步应用于催化L-谷氨酰胺和乙胺生成L-茶氨酸。HPLC方法检测转化体系中产物的生成量，并通过质谱分析进一步对反应体系中生成物进行鉴定。在此基础上，通过分批添加双底物L-谷氨酰胺和乙胺，对反应进程进行更好的控制，获得较高的茶氨酸产量和高供体浓度下的最好的底物转化率。
主要试剂：L-谷氨酰胺和乙胺购自国药集团化学试剂有限公司,L-茶氨酸购自生工生物工程有限公司
重组菌株的发酵罐培养：
(1)种子培养及配方及培养条件
200mL的培养基中含有：100g/L蔗糖,20g/L胰蛋白胨,60g/L玉米浆,2g/LMgSO4·7H2O和4g/L K2HPO4·3H2O，添加卡那霉素至终浓度为50μg/ml，调节pH为7.2，37℃，200rpm条件下培养16h作为种子接种。
(2)发酵培养基
5L的发酵罐中装液量为1.8L，培养基成分和种子培养基类似，控制发酵条件为：pH7.2-7.5，培养温度为37℃，转速和通气速率分别为：350rpm，0.67vvm。培养48h后收获上清粗酶液，70％的硫酸铵沉淀蛋白，透析袋过夜透析除盐，溶解于50mM Tris-HCl缓冲液中(pH 8.0)，即得酶浓缩液。
浓缩酶液(BsGGT)合成茶氨酸能力的初步鉴定及进一步底物流加优化
(1)最小的转化体系为：10mL的反应液中包含：谷氨酰胺(20mM)，乙胺(20mM)，GGT(60U/ml),不加酶液的混合体系作为对照，37℃孵育5h后添加同体积的10％三氯乙胺终止反应。所得到的反应混合物过滤膜(0.45μm；Millipore)进行HPLC分析。同时对生成的茶氨酸进行质谱分析。
(2)反应体系的流加策略：
取浓缩后的酶液40mL，每隔两个小时向其中添加底物谷氨酰胺和乙胺，谷氨酰胺的添加量固定在20mM，供体受体比例在(1:1-1:20)波动以寻找最合适的底物比例，每次底物添加前取样分析，添加后用稀释的HCl调节pH为10，茶氨酸产量不再增加时即终止反应。
本发明的有益效果：在γ-谷氨酰转肽酶催化供体L-谷氨酰胺和受体乙胺发生转肽反应生成L-茶氨酸的工艺过程中，提出同时添加谷氨酰胺和乙胺的思路，可以同时解决谷氨酰胺低溶解度和对酶的抑制作用，以及过高的乙胺浓度造成的底物比例失调以及对引起反应体系pH的改变。以浓缩酶液作为反应体系，每隔两个小时向其中添加底物谷氨酰胺和乙胺，谷氨酰胺的添加量固定在20mM，供体受体比例控制在1：12时，pH调整为10，18小时后可得到茶氨酸164.2mM，谷氨酰胺转化率达到91.2％。获得较高的茶氨酸产量以及高浓度供体L-谷氨酰胺条件下的最高转化率。为茶氨酸的工业化生产提供很好的基础和理论指导。
L-茶氨酸具有重要的生理及医学作用，同时是一种安全的食品添加剂；酶法高效催化谷氨酰胺合成茶氨酸，具有很高的应用价值。
具体实施方法
实施例1：重组枯草芽孢杆菌的发酵罐培养以及粗酶液浓缩
将重组菌枯草芽孢杆菌B.subtilis/pMA5-ggt在种子培养基中培养16h后，按6-10％(体积比)的接种量接种于含有1.8L发酵液的发酵罐中，培养48h后离心获得上清酶液，加入70％的硫酸铵沉淀后，透析袋过夜透析除盐，溶解于50mM Tris-HCl缓冲液中(pH 8.0)，即得酶浓缩液。
实施例2：浓缩酶液(BsGGT)合成茶氨酸能力的初步鉴定
最小的转化体系为：10mL的反应液中包含：谷氨酰胺(20mM)，乙胺(20mM)，GGT(60U/ml)，不加酶液的混合体系作为对照，37℃催化反应5h后添加同体积的10％三氯乙胺终止反应。所得到的反应混合物过滤膜(0.45μm；Millipore)进行HPLC分析。同时对生成的茶氨酸进行质谱分析
实施例3：进一步通过底物流加策略优化酶催化体系
取浓缩后的酶液，酶含量60U/mL，每隔两个小时向其中添加底物谷氨酰胺和乙胺，谷氨酰胺的添加量固定在20mM，供体受体比例在(1:4-1:12)波动以寻找最合适的底物比例，每次底物添加前取样分析，添加后用稀释的HCl调节pH为10，茶氨酸产量不再增加时即终止反应。

Claims (5)

1.一种γ-谷氨酰转肽酶酶液及其浓缩液，其特征是：将重组枯草芽孢杆菌B.subtilis/pMA5-ggt发酵培养后，即获得含有γ-谷氨酰转肽酶的酶液，在酶液中加入1-100％(w/v)硫酸铵进行沉淀，优选70％的硫酸铵进行沉淀；随后将沉淀转入透析袋中过夜透析除盐后，加入适量体积的40-80mM pH 6-9的Tris-HCl缓冲液中，优选50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液；使上清酶液γ-谷氨酰转肽酶活力浓缩至5U/mL以上，优选γ-谷氨酰转肽酶活力20-100U/mL的酶液，最优选酶活力50-60U/mL的酶液。
2.一种催化合成L-茶氨酸的补料策略，其特征是，利权利要求1所述的γ-谷氨酰转肽酶酶液或其浓缩液或浓缩液的稀释液作为反应体系，每隔一段时间同时补料添加底物L-谷氨酰胺和乙胺，补料后用盐酸调节反应体系pH至9-11，优选pH10，在200rpm的摇床中反应，当茶氨酸产量开始降低时，停止底物添加。
3.根据权利要求2所述的方法，谷氨酰胺每次添加量为5-50mM，优选20mM，乙胺的添加浓度与谷氨酰胺添加浓度比例为1:1-1:20，优选1:10–1:13。
4.根据权利要求2所述的方法，补料流加间隔为1-5h，优选2h。
5.权利要求1至权利要求2所述的催化合成L-茶氨酸的方法，同样适用于利用其它来源的或通过基因工程改造的γ-谷氨酰转肽酶催化合成L-茶氨酸。
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