CN104404075A - 一种利用重组Bacillus subtilis分泌γ-谷氨酰转肽酶催化生成L-茶氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用重组Bacillus subtilis分泌γ-谷氨酰转肽酶来催化L-谷氨酰胺和乙胺生成L-茶氨酸的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明扩增枯草芽孢杆菌中γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的基因，并克隆到枯草芽孢杆菌168中的过量表达。首次构建了一株能够分泌γ-谷氨酰转肽酶的枯草芽孢杆菌工程菌株，对菌株的酶活力及酶的发酵性能进行研究：重组菌发酵上清酶活达到49.8U/mg，是出发菌株的20倍；以80mM L-谷氨酰胺为供体，640mM乙胺作为受体，L-茶氨酸转化率达到86％以上。本发明使用的是安全菌株，且具有转化率高，生产方法简单等优点，有利于在工业规模酶法生产L-茶氨酸的生产。

Description

一种利用重组Bacillus subtilis分泌γ-谷氨酰转肽酶催化生成L-茶氨酸的方法

技术领域

一种利用重组Bacillus subtilis分泌的γ-谷氨酰转化酶催化L-谷氨酰胺和乙胺生成L-茶氨酸的方法，属于基因工程和酶工程领域。 

技术背景

L-茶氨酸(N-乙基-L谷氨酸)，是大量存在于茶叶中的一种天然氨基酸，最初是由Sakato于二十世纪四十年代末期从茶叶中提取获得。体外研究结果显示：摄入茶氨酸有助于减缓压力提高认知能力、降低癌症和血管类疾病的发生率、增强机体免疫力等。L-茶氨酸已经被美国食品和药品监督管理局(FAD)认证为一种安全的食品添加剂。鉴于茶氨酸上诉诸多功效，其需求量日益增加。 

L-茶氨酸的生产方法有：直接从自然资源中提取、化学合成和生物合成法。直接提取法消耗大且产量低，并不可取。化学合成法不断改进，近期有学者利用乙酸酐使N-邻苯二甲酰-1-谷氨酸脱水生成环酐，然后再与乙胺进行开环反应，最终茶氨酸产量可以高达700g/kg，但是这类化学反应合成物在消费者看来并不安全，并且反应过程中需要保护和终止反应进程，进一步增加成本。因此利用细菌酶系统合成L-茶氨酸日益受到青睐，此类酶包括谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶和γ-谷氨酰胺转肽酶。有学者利用硝基还原假单胞菌IFO 12694中的谷氨酰胺酶来生产L-茶氨酸,然而该酶的过量表达和简捷纯化体系尚未建立，Abelian等尝试利用固定化细胞来克服上诉缺点。来源腐臭假单胞菌Y-30的谷氨酰胺合成酶可以转化谷氨酸和乙胺生成L-茶氨酸，在24小时内产量可以达到28％，但是过程需要发面酵母提供ATP，并且无法利用更高浓度的底物。由此γ-谷氨酰转肽酶显示出其独特的优越性。 

γ-谷氨酰转肽酶催化γ-谷氨酰类化合物的γ-谷氨酰胺键的水解，同时将水解生成的γ-谷氨酰分子转移给受体分子，当受体分子为氨基酸或者多肽时及发生转肽反应，当受体分子为水分子时，则为水解反应。当以L-谷氨酰胺为供体，乙胺为受体，γ-谷氨酰转肽酶催化转肽反应时，即可生成茶氨酸，该反应过程耗时短，不需要额外添加ATP，具有诸多优势。研究发现多种微生物均可以合成GGT，例如枯草芽孢杆菌，幽门螺杆菌，短小芽孢杆菌，米曲霉等，由以大肠杆菌中的研究为多。已有多种报道利用不同表达载体实现γ-谷氨酰转肽酶基因在大肠中的表达，以及将酶用于L-茶氨酸生产。但是大肠杆菌做为一种条件性致病菌，用于生产食品添加剂存在一些隐患。但是枯草芽孢杆菌作为工业生产菌株却具有诸多优势：枯草芽孢杆菌是一种非致病菌；具有强大的蛋白表达分泌系统，可以将蛋白和代谢物分泌到培养基中而省去细胞破碎的麻烦；枯草芽孢杆菌培养条件简单，发酵周期短；最后枯草芽孢杆菌本身具有γ-谷氨酰转肽酶基因，该基因的再表达具有完整健全的通路。 

本发明通过质粒pMA5，实现了γ-谷氨酰转肽酶在Bacillus subtilis 168中的可溶性分泌表达，酶活达到49.8U/mg。在含有80mM L-谷氨酰胺供体，640mM乙胺受体(pH 10)的混合体系中添加GGT至0.6U/ml，37℃反应5小时即可生成68.9mM的L-茶氨酸，转化率为86％。枯草芽孢杆菌GGT在枯草系统中再次表达即用于茶氨酸合成均为首次报道，且重组子表达的酶活及酶催化茶氨酸转化率均较高。 

发明内容

本发明的目的在于提供：通过基因工程手段来获得具有分泌γ-谷氨酰转肽酶能力的微生物的方法，并利用该微生物分泌纯化得到的酶实现催化底物L-谷氨酰胺和乙胺生成L-茶氨酸。对构建的重组菌株进行酶活力及酶转化性能研究发现γ-谷氨酰转肽酶活力为出发菌的20倍左右，并且得到了较高的底物转化率。为酶法发酵生产L-茶氨酸的工业化应用提供了有益的指导。 

本发明的技术方案：是以基因工程为手段构建一株具有分泌γ-谷氨酰转肽酶能力的B.subtilis，发酵液中纯化得到的酶可以催化L-谷氨酰胺和乙胺生成L-茶氨酸。以比色法和HPLC为方法检测阳性重组子发酵液的酶活以及转化体系中产物的生成，通过酶活力和发酵性能的检测来确定其目标酶的活力及底物转化情况。本发明成功构建了一株可以实现分泌表达γ-谷氨酰转肽酶的枯草芽孢杆菌工程菌株，并成功将酶催化底物L-谷氨酰胺和乙胺高产L-茶氨酸，其γ-谷氨酰转肽酶活力较出发菌株有较大提高，且底物转化率较高。 

主要试剂：L-谷氨酰胺和乙胺购自国药集团化学试剂有限公司,L-茶氨酸购自生工生物工程有限公司 

重组菌株构建方法： 

(1)γ-谷氨酰转肽酶(GGT)基因全序列的克隆 

根据GENBANK网站公布的Bacillus subtilis strain 168的ggt基因序列(NC_000964.3)，以及pMA5质粒上的酶切位点设计ggt基因引物。以制备的枯草芽孢杆菌染色体DNA为模板，分别以ggt F和ggt R为引物，通过PCR扩增出ggt全序列。 

PCR反应体系：10×ExTaq Buffer 5μL，dNTP 4μL，模板DNA 0.5μL，上下游引物各0.5μL，ExTaq酶0.5μL，ddH₂O补齐至总体积50μL。PCR反应条件：94℃5min，94℃30s，58℃100s，72℃2min，循环35次，72℃10min，12℃10min。 

(2)重组表达载体pMA5-ggt的构建 

参照上海捷瑞公司胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，胶回收产物按一定比例与pMD18-T vector过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌，重组质粒BamH I/MluI酶切释放出大小约为1.8kb的基因条带，表明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMD18-T-ggt。 

提取保存于E.coli JM109中的质粒pMA5和pMD18-T-ggt，质粒pMA5、pMD18-T-ggt经BamH I/MluI双酶切，胶回收纯化，T₄DNA连接酶过夜连接两片段，过夜后将连接物热击转化E.coli JM109感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子。提取转化子质粒，重组质粒经BamH I/MluI双酶切后释放出大小约为7.2kb和1.8kb的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMA5-ggt。 

(3)重组质粒pMA5-ggt化学转化法转化模式菌株B.subtilis 168 

将经验证构建成功的重组质粒pMA5-ggt用化学转化法转化至模式菌株B.subtilis 168中表达。转化方法为采用改进的Spizizen法。 

(4)重组菌株B.subtilis 168阳性转化子的筛选； 

挑取在具有卡那霉素抗生素压力平板上长出的菌落，摇瓶发酵,提取质粒进行酶切验证。重组B.subtilis 168培养条件、酶活测定及HPLC分析 

(1)培养条件：种子培养基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L(固体培养基加入2％琼脂粉)。优化培养基：25g蔗糖,5g胰蛋白胨,15g玉米浆,0.5g MgSO₄·7H₂O和1g K₂HPO₄·3H₂O，添加卡那霉素至终浓度为50μg/ml，调节pH为7.2。 

(2)酶活测定方法：采用比色法测定，具体方法如下：取培养60h的菌液50mL，于4℃条件下10,000r/min离心30min收集上清，上清液中即为目的蛋白。酶活测定方法如下：1ml的标准反应体系中包含50mM硼酸盐-氢氧化钠(pH 10)，2.5mMγ-L-谷氨酰基-4-硝基苯胺，60mM双甘二肽,750mM NaCl和10μl适当稀释的酶液。37℃反应10min后添加2ml3.5N的醋酸终止反应，不添加双甘二肽作为对照，410nm处测定吸光度值。实验组和对照组的吸光度差值即为转肽酶活。转肽酶活定义为：在标准反应条件下，一分钟内由γ-L-谷氨酰基-4-硝基苯胺经转肽反应生成生成1μmol对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个单位标准酶活。 

(3)L-茶氨酸转化方法：以80mM L-谷氨酰胺为供体，640mM乙胺作为受体，调节pH10，GGT添加至浓度为0.6U/ml，温度37℃条件下反应5小时，10％三氯乙酸终止反应。HPLC法检测茶氨酸的生成量。 

(4)HPLC分析：L-茶氨酸及在338nm紫外波长下均有特征吸收峰，所以采用HPLC法测定产物浓度。色谱柱条件为：X Bridge^TM C₁₈(5μm 4.6x 250mm)，流动相：缓冲液A(5.2g/L CH₃COONa.3H₂O,0.1mg/L三乙胺和3.8mg/L四氢呋喃，pH 7.0),缓冲液B(18g/L CH₃COONa.3H₂O,乙腈和甲醇(1:2:2v/v)，pH 7.0)，检测器：UV检测器，检测波长：338nm，柱温：40℃，进样量：10μL，流速：1.0ml/min。梯度洗脱程序为：缓冲液A/B梯度洗脱组成为85:15,50:50,0:100,0:100,85:15and 85:15,洗脱时间分别为0,10,20,23,25and 35分钟。样品经过OPA法柱前衍生处理。 

本发明的有益效果：通过基因工程手段扩增本实验已有的具有γ-谷氨酰转肽酶活力的枯草芽孢杆菌的该酶基因，借助本实验室已有的成熟的枯草表达体系，实现了γ-谷氨酰转肽酶基因在模式菌株B.subtilis 168中的过量表达。将该菌株以1％接种量接种于50mL的优化培养基中，60h后离心收集上清，按标准方法测定酶活，结果显示酶活为原始菌株的20倍。将上清酶液纯化后用于茶氨酸转化，以80mM L-谷氨酰胺为供体，640mM乙胺作为受体，GGT添加量为0.6u/ml，在pH 10温度37℃条件下反应5小时,L-茶氨酸生成量为68.9mM，相应的转化率为86％。 

L-茶氨酸具有重要的生理及医学作用，同时是一种安全的食品添加剂；用微生物法生产L-茶氨酸，其较之化学生产法具有反应条件温和、原料利用率高、产品纯度高及工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。 

具体实施方法 

实施例1：重组B.subtilis 168菌株的构建 

以实验室具有γ-谷氨酰转肽酶活力的枯草芽孢杆菌作为出发菌株，以其染色体为模板， 利用PCR手段获得该酶的基因，连接克隆载体，实现基因的大量扩增。将大量扩增的GGT基因片段，纯化后连接到pMA5载体上，验证成功后，转化模式菌株枯草芽孢杆菌168。在抗性平板上筛选阳性转化子，接种摇瓶发酵，用比色法测定发酵液中酶活，并且酶纯化用于L-茶氨酸转化，HPLC检测到有茶氨酸生成，说明构建成功了具有分泌γ-谷氨酰转肽酶能力的重组菌株，最终成功将酶应用与转化L-谷氨酰胺和乙胺生成茶氨酸。 

实施例2：重组菌株的酶活力测定 

以1％的接种量接种于50mL/250mL优化培养基中，取培养60h的菌液，4℃条件下10,000r/min离心30min收集上清，上清液中即为目的蛋白。酶活测定方法如下：1ml的标准反应体系中包含50mM硼酸盐-氢氧化钠(pH 10)，2.5mMγ-L-谷氨酰基-4-硝基苯胺，60mM双甘二肽,750mM NaCl和10μl适当稀释的酶液。37℃反应10min后添加2ml 3.5N的醋酸终止反应，以反应体系中不添加双甘二肽作为对照，410nm处测定吸光度值。实验组和对照组的吸光度差值即为转肽酶活。转肽酶活定义为：在标准反应条件下，一分钟内由γ-L-谷氨酰基-4-硝基苯胺经由转肽反应生成生成1μmol对硝基苯胺所需要的酶量即为一单位标准酶活。检测结果显示，重组菌株分泌酶活约为出发菌株的20倍。 

实施例3：重组菌株分泌酶液的纯化及用于茶氨酸催化生产 

纯化方法：上清液经0.45μm的滤膜过滤，使用Ni–NTA亲和层析实现一步纯化，蛋白的清洗和洗脱程序依照说明书规定进行。 

L-茶氨酸转化方法：以80mM L-谷氨酰胺为供体，640mM乙胺作为受体，调节pH 10，GGT添加至浓度为0.6U/ml，温度37℃条件下反应5小时，10％三氯乙酸终止反应。HPLC法检测茶氨酸的生成量。检测到68.9mM的L-茶氨酸生成，转化率可以达到86％。 

Claims (4)

1.一种重组表达载体pMA5-ggt，其特征是：通过PCR技术获得来源于枯草芽孢杆菌168的ggt基因，与表达载体pMA5连接构建获得。

2.一株具有分泌γ-谷氨酰转肽酶能力的重组枯草芽孢杆菌，其特征是：将权利要求1中所述的重组载体pMA5-ggt，用化学转化法转化菌株Bacillus subtilis 168，获得重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis/pMA5-ggt，重组枯草芽孢杆菌可以分泌γ-谷氨酰转肽酶到发酵液上清中，同时酶活较基因来源菌有较大的提高。

3.将权利要求2中所述的重组枯草芽孢杆菌收集测定γ-谷氨酰转肽酶的方法，其特征是：以1％的接种量接种于50mL/250mL优化培养基中，培养60h的菌液收集菌液，4℃条件下10,000r/min离心30min收集上清，上清液中即为目的蛋白，最终测得酶活为49.8U/mg，约为原始菌20倍。

4.将权利要求3中收集到的粗酶液进行纯化并用于茶氨酸的转化的方法，其特征是：发酵液上清的γ-谷氨酰转肽酶N末端带有6×his标签，可以通过和Ni–NTA亲和层析实现一步纯化，纯化的具体操作步骤按照说明书规定进行，得到纯酶后添加于转化体系中：包含80mM供体L-谷氨酰胺，640mM受体乙胺的混合物中(pH 10)，至浓度0.6U/mL，37℃反应5h后终止反应，检测到68.9mM的L-茶氨酸生成，转化率可以达到86％。