CN112725319A

CN112725319A - polyG底物特异性的褐藻胶裂解酶FaAly7及其应用

Info

Publication number: CN112725319A
Application number: CN202011563537.0A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 姜宏; 慈芳芳; 张朝辉; 薛长湖
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN112725319B

Abstract

本发明公开了一种褐藻胶裂解酶FaAly7，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码褐藻胶裂解酶FaAly7的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。一种降解褐藻胶/制备褐藻寡糖的方法：采用褐藻胶裂解酶FaAly7降解褐藻胶。本发明还公开了包含褐藻胶裂解酶FaAly7基因的重组表达载体和重组宿主。本发明的褐藻胶裂解酶FaAly7，属于PL7家族，能够降解海藻酸钠和polyG，具有较明显的底物特异性(海藻酸钠＝100％，polyG＝312％)。降解polyG产生不饱和2‑8糖，酶解主要产物为不饱和2‑4糖，具有良好的生物催化效率。

Description

polyG底物特异性的褐藻胶裂解酶FaAly7及其应用

技术领域

本发明涉及一种polyG底物特异性的褐藻胶裂解酶FaAly7及其酶制剂与应用，属于功能酶技术领域。

背景技术

褐藻寡糖是褐藻胶降解的产物，聚合度(DP)一般在2～25之间，其分子质量低，水溶性好，具有许多生理活性，如免疫调节、抗菌、抗氧化、抗高血压、抗糖尿病、抗肿瘤、抗凝血、促进植物细胞生长等活性，这使得褐藻寡糖在医药、保健品、食品、农业等领域有了很大的应用价值。寡糖的M/G比例、分子量、单体分布、末端是否有双键等均会影响它的生物活性，因而可控地制备具有特定结构的褐藻寡糖具有重要意义。

目前,褐藻寡糖的制备方法主要有化学法、物理法、生物酶法。化学法、物理法制备褐藻寡糖存在反应条件剧烈难控制、环境污染大、对寡糖结构有破坏等缺点。生物酶法是用特异性或非特异性的褐藻胶裂解酶降解褐藻胶制备寡糖，其具有反应条件温和、反应过程容易控制且产物纯度较高、获得的寡糖具有不饱和双键、具备更好生物活性等优点。底物特异性褐藻胶裂解酶可以特异性地切割特定的糖苷键，可控地产生一定结构的褐藻寡糖，但野生型菌株产酶水平低，难以满足工业生产和应用的要求，可采用异源表达提高产酶水平，制备酶制剂，用于工业化生产。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种polyG底物特异性的褐藻胶裂解酶，可以应用该酶降解polyG产生褐藻寡糖。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种褐藻胶裂解酶FaAly7，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MIINYKTLLQFFTAFIILFNLNNPLWAQKIPSDLMDNCLQWKITYPTGQEEKQLCDEPNNEYFFVNETEDAIVFRTPIRLDNGTTPNSDNIRSELREREADGSVDIYWTTEGSHMLYVEQAITHLPINKPELVASQIHGNKEAGIDDSMVMRLEESHLFLSFNGGKLRKNITIKEDYVLGTKHEVIFLVVNGKHYCYYAEDGKLLEAYNNNDASQYLIRDIENDNDYVMDLNYEDSYFKVGNYTQSNSKEEGYDVNNPENYGEVLVYDFTVVHDEVLVSGVTLTPSHVNLSIGGPFQLTKTITPANATNKSVTYTSSNTAVVEVNENGVLTGIAEGSATVTATTVEGGFTDTITVDVVGNPVGDNLALNKPVTGTGTHDADNVVENLVDGSTSTRWSVSGFPQTAIIDLGQQYSLHRSEVVCYTDRAYQYSIAVSDTENGTYTEIVDRTENVTPGDAANPIVDLFSAVDGRFIKLTVTGAAVYDGPWVSLSEFRIYGESSLSIDDNTSDVTNITLSPNPTSDIVNISGAEMYNTLQVYDQLGKLVMQRTITDGAINISHLSSGLYIFRLSGASQSINKRVIKK。

一种编码上述褐藻胶裂解酶FaAly7的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

5’-ATGATAATAAATTACAAAACACTATTACAATTTTTTACAGCATTCATTATCCTTTTTAACCTTAATAATCCACTGTGGGCACAGAAAATTCCATCCGATTTAATGGATAATTGTTTACAATGGAAAATAACATATCCTACAGGTCAAGAAGAAAAACAATTATGCGATGAACCTAATAACGAATACTTTTTTGTTAATGAAACAGAAGATGCTATCGTTTTTCGTACGCCTATTCGATTAGATAATGGTACAACACCAAATTCAGATAATATACGATCAGAGCTTCGAGAACGTGAAGCAGATGGCAGTGTAGATATTTATTGGACTACCGAAGGGTCGCATATGCTCTATGTAGAACAAGCGATTACTCATTTACCTATAAACAAACCTGAGTTAGTAGCCTCGCAAATACATGGAAATAAAGAAGCAGGTATTGATGATTCTATGGTAATGAGACTAGAAGAATCTCATTTATTTTTATCTTTTAATGGAGGTAAATTAAGAAAAAACATAACCATAAAAGAAGATTATGTTTTAGGAACTAAGCATGAAGTTATTTTCTTGGTAGTTAATGGTAAACACTATTGTTATTATGCTGAAGATGGTAAGCTTTTAGAGGCTTATAATAATAATGATGCTTCGCAATACCTTATTAGAGATATTGAAAATGATAACGATTATGTGATGGATTTGAATTATGAAGATTCTTACTTTAAAGTTGGGAACTATACTCAAAGTAATTCAAAAGAAGAGGGTTATGATGTTAATAATCCTGAAAATTATGGCGAAGTTTTAGTTTATGATTTTACAGTTGTTCACGATGAAGTTTTAGTAAGCGGTGTAACACTTACACCTAGTCATGTTAATCTTTCTATAGGCGGACCTTTTCAATTAACAAAAACTATTACTCCTGCAAACGCAACAAATAAATCTGTAACTTATACGTCTTCAAATACAGCTGTTGTAGAAGTAAATGAAAATGGCGTTTTAACGGGTATTGCAGAAGGAAGTGCTACTGTTACAGCAACCACTGTAGAAGGCGGTTTTACAGACACCATTACAGTAGATGTTGTTGGTAACCCAGTGGGAGATAATTTAGCACTCAATAAACCCGTAACAGGTACAGGAACTCATGATGCAGATAACGTGGTAGAAAATTTGGTTGATGGTTCAACTTCTACAAGATGGTCTGTTTCTGGATTTCCACAAACTGCAATTATAGATTTAGGTCAGCAGTATAGTTTACACCGATCCGAGGTTGTATGTTATACAGATAGAGCATATCAATATTCAATAGCTGTGTCTGATACAGAAAACGGCACTTATACCGAGATTGTAGATAGAACTGAAAATGTAACTCCTGGTGATGCTGCAAATCCAATTGTAGATTTATTTTCAGCTGTAGATGGACGCTTTATTAAATTAACCGTTACAGGAGCTGCTGTTTACGACGGACCTTGGGTTAGTTTATCTGAATTTAGAATCTATGGCGAATCGTCATTAAGTATAGATGATAATACTTCTGATGTAACTAATATTACATTATCTCCTAATCCTACTTCAGATATCGTTAATATAAGCGGGGCAGAAATGTATAACACTTTACAAGTTTACGATCAATTAGGAAAATTGGTTATGCAGCGCACTATTACAGATGGAGCTATAAACATCTCCCATTTAAGTTCTGGCTTATATATCTTTAGATTATCTGGAGCATCACAATCTATTAATAAACGAGTAATTAAAAAATAA-3’。

所述褐藻胶裂解酶FaAly7在降解褐藻胶(如海藻酸钠，polyG)中的应用，在制备褐藻寡糖中的应用。

一种降解褐藻胶、制备褐藻寡糖的方法；采用上述褐藻胶裂解酶FaAly7降解褐藻胶，进一步地，降解条件为：最适温度为40℃，最适pH为6.0。

一种重组表达载体，其携带有上述编码褐藻胶裂解酶FaAly7的基因。

一种表达褐藻胶裂解酶FaAly7的重组宿主，其基因组中包含上述编码褐藻胶裂解酶FaAly7的基因，可通过转化上述重组表达载体制备得到。

一种酶制剂，包含有上述褐藻胶裂解酶FaAly7。该酶制剂在制备褐藻寡糖中的应用。

本发明的褐藻胶裂解酶FaAly7，相较于现有的褐藻胶裂解酶(如CN108018234A，一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用；CN107177612A，一种外切型褐藻胶裂解酶、基因及其应用)，FaAly7具有一定的嗜冷性，其在20～40℃下均具有较高的酶活性，因而其可在较广的温度范围内实现工业应用。此外，FaAly7可以特异性地作用于polyG底物，相较于其它褐藻胶裂解酶(如CN108285900A，一种重组褐藻胶裂解酶及其构建方法及应用)，FaAly7具有明显的底物特异性(海藻酸钠＝100％，polyG＝312％)，因而在制备具有特定组成结构的褐藻寡糖方面可以有所应用。液相结果表明，FaAly7降解polyG产生不饱和2-8糖，最终主要产物为不饱和2-4糖，具有良好的生物催化效率。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：本发明的褐藻胶裂解酶纯化后的纯酶SDS-PAGE电泳图，其中，M为标准蛋白Marker；1为100mM咪唑溶液洗脱下来的目的蛋白；2为200mM咪唑溶液洗脱下来的目的蛋白。

图2：本发明的褐藻胶裂解酶，温度变化对相对酶活的影响示意图。

图3：本发明的褐藻胶裂解酶，pH变化对相对酶活的影响示意图。

图4：本发明的褐藻胶裂解酶在室温下放置不同时间残留酶活变化图。

图5：本发明的褐藻胶裂解酶降解polyG和polyM产物HPLC分析图。

图6：本发明的褐藻胶裂解酶对polyG降解产物HPLC分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1褐藻胶裂解酶基因FaAly7的克隆

本发明的褐藻胶裂解酶FaAly7基因为基因组扩增获得。发明人挖掘到保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture CollectionCenter,CGMCC)菌株编号CGMCC:1.12423的嗜琼脂华美菌Formosa agariphila的褐藻胶裂解酶片段，发明人提取了该菌的基因组，通过基因扩增获得了FaAly7序列，此序列含有1752个碱基序列，如SEQ ID NO.2所示，编码583个氨基酸序列，如SEQ ID NO.1所示。根据进化树比对，发现该褐藻胶裂解酶属于多糖水解酶第7家族(PL7)。

以提取的基因组为模板，在褐藻胶裂解酶基因的上、下游设计用于无缝连接的引物，进行PCR扩增FaAly7基因片段。

引物的序列如下所示：

上游引物：5’-TTCGAGCTCCGTCAGAAAATTCCATCCGATTTAATGG-3’，如SEQ ID NO.3所示；

下游引物：5’-TTTTTTAATTACTCGTTTATTAATAGATTGTGATGC-3’，如SEQ ID NO.4所示。

PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μl，dNTP 10μl，引物各1.5μl，模板1μl，KOD Fx酶1μl，无菌水10μl，总体系50μl。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸120s，反应30个循环，72℃后延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳后回收1752bp的PCR产物片段。

实施例2褐藻胶裂解酶基因的表达载体构建

基因片段与pET-28a克隆载体采用无缝克隆技术进行连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的(LB)培养基固体平板上。37℃恒温箱中培养12-16h后，挑取单克隆至含有50μg/mL卡那霉素LB液体培养基，于220rpm，37℃摇床培养过夜，阳性验证后测序，并命名为pET28a-FaAly7。

实施例3褐藻胶裂解酶基因的重组质粒及工程菌的构建

提取测序正确的重组质粒，并转化至宿主E.coli BL21感受态细胞中，构建好的工程菌在卡那霉素抗性平板上长出。

实施例4利用大肠杆菌工程菌制备重组褐藻胶裂解酶

挑取大肠杆菌重组菌株接种在5ml含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12h后按1％的接种量接入含有卡那霉素的ZYP-5052培养基，20℃，200rpm培养48h，自诱导表达褐藻胶裂解酶。4℃，8000g离心10min，收集菌体，细胞重悬于50mM pH 8.0的Tirs-HCl缓冲液中，超声破碎30min后12000g离心15min，上清液即为粗酶液。粗酶液使用Ni-NTA柱进行亲和层析纯化，使用平衡缓冲液(500mM NaCl,50mM Tris-HCl)平衡柱子，然后用20mM咪唑溶液(20mM咪唑，500mM NaCl,50mM Tris-HCl)洗脱结合力弱的杂蛋白，100mM、200mM咪唑溶液(100mM、200mM咪唑，500mM NaCl,50mM Tris-HCl)洗脱目的蛋白，将得到的溶液进行SDS-PAGE检测(图1)，核对条带是否单一、大小是否准确，同时采用DNS法验证所获蛋白是否具有酶活，使用Bradford法测定蛋白浓度。

实施例5褐藻胶裂解酶比酶活测定

褐藻胶裂解酶FaAly7活性的标准测定方法为：取20μL酶液加入180μL pH 6.00.5％(w/v)海藻酸钠溶液，在40℃下反应10min,煮沸5min终止反应，加入300μL的DNS试剂沸水浴10min进行显色，在OD540下检测其吸光度。酶活力定义为在标准条件下每min产生1μmol还原糖所需要的酶量。经测定，纯化后的褐藻胶裂解酶活力可达41.19U/mg。

实施例6测定重组褐藻胶裂解酶的最适反应条件

反应条件为：选取20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃反应30min测定最适温度；在40℃下，选用pH为3.0～10.0的缓冲液作为酶反应的不同测定pH缓冲液，根据褐藻胶裂解酶的酶活力，确定褐藻胶裂解酶的最适pH。结果如图2，图3所示，重组褐藻胶裂解酶的最适反应温度为40℃，最适pH为6.0，同时其最适温度测定实验结果显示该重组褐藻胶裂解酶在20～40℃酶活均比较高，表明该酶具有一定的嗜冷性。

实施例7测定重组褐藻胶裂解酶室温下的稳定性

反应条件为：取一定量的酶液在室温下放置，于不同时间在最适条件下(温度为40℃，pH为6.0)测定其残留酶活。结果如图4所示，重组褐藻胶裂解酶在室温下放置10天，酶活仍可保留59.43％，酶活稳定性较好。

实施例8测定重组褐藻胶裂解酶的底物特异性

以0.5％(w/v)的polyG和polyM为底物，采用200μL反应体系，加入0.01U褐藻胶裂解酶FaAly7，置于40℃，pH 6.0的条件下反应12h，所得反应产物煮沸5min并于10,000rpm离心10min以除去体系中蛋白等杂质，收集上清过0.22μm滤膜，进行HPLC检测。HPLC条件为：使用SuperdexTM 30Increase 30/100Gel column，以0.2M NH₄HCO₃为流动相，流速0.4mL/min，检测温度为室温(～25℃)，上样量50μL，紫外235nm检测。结果如图5所示，在同样的反应条件下，重组褐藻胶裂解酶降解polyG的作用效果要优于polyM，对polyM降解12h的效果仍差于对polyG降解5min的效果，表明该重组酶是具有polyG底物特异性的褐藻胶裂解酶。

实施例9测定重组褐藻胶裂解酶对polyG的降解产物

以0.5％(w/v)的polyG为底物，采用200μL反应体系，加入0.029U褐藻胶裂解酶FaAly7，置于40℃，pH 6.0的条件下反应12h，所得反应产物煮沸5min并于10,000rpm离心10min以除去体系中蛋白等杂质，收集上清过0.22μm滤膜，进行HPLC检测。HPLC条件为：使用SuperdexTM 30Increase 30/100Gel column，以0.2M NH₄HCO₃为流动相，流速0.4mL/min，检测温度为室温(～25℃)，上样量50μL，紫外235nm检测。结果如图6所示，重组褐藻胶裂解酶降解polyG的最终产物主要是2、3、4糖。

实施例10利用重组褐藻胶裂解酶制备酶制剂

利用实施例4制备的重组褐藻胶裂解酶制备酶制剂：发酵破碎后的溶液纯化后，用缓冲液置换咪唑，冻干后保存酶粉。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> polyG底物特异性的褐藻胶裂解酶FaAly7及其应用

<141> 2020-12-24

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 583

<212> PRT

<213> Formosa agariphila

<400> 1

Met Ile Ile Asn Tyr Lys Thr Leu Leu Gln Phe Phe Thr Ala Phe Ile

1 5 10 15

Ile Leu Phe Asn Leu Asn Asn Pro Leu Trp Ala Gln Lys Ile Pro Ser

20 25 30

Asp Leu Met Asp Asn Cys Leu Gln Trp Lys Ile Thr Tyr Pro Thr Gly

35 40 45

Gln Glu Glu Lys Gln Leu Cys Asp Glu Pro Asn Asn Glu Tyr Phe Phe

50 55 60

Val Asn Glu Thr Glu Asp Ala Ile Val Phe Arg Thr Pro Ile Arg Leu

65 70 75 80

Asp Asn Gly Thr Thr Pro Asn Ser Asp Asn Ile Arg Ser Glu Leu Arg

85 90 95

Glu Arg Glu Ala Asp Gly Ser Val Asp Ile Tyr Trp Thr Thr Glu Gly

100 105 110

Ser His Met Leu Tyr Val Glu Gln Ala Ile Thr His Leu Pro Ile Asn

115 120 125

Lys Pro Glu Leu Val Ala Ser Gln Ile His Gly Asn Lys Glu Ala Gly

130 135 140

Ile Asp Asp Ser Met Val Met Arg Leu Glu Glu Ser His Leu Phe Leu

145 150 155 160

Ser Phe Asn Gly Gly Lys Leu Arg Lys Asn Ile Thr Ile Lys Glu Asp

165 170 175

Tyr Val Leu Gly Thr Lys His Glu Val Ile Phe Leu Val Val Asn Gly

180 185 190

Lys His Tyr Cys Tyr Tyr Ala Glu Asp Gly Lys Leu Leu Glu Ala Tyr

195 200 205

Asn Asn Asn Asp Ala Ser Gln Tyr Leu Ile Arg Asp Ile Glu Asn Asp

210 215 220

Asn Asp Tyr Val Met Asp Leu Asn Tyr Glu Asp Ser Tyr Phe Lys Val

225 230 235 240

Gly Asn Tyr Thr Gln Ser Asn Ser Lys Glu Glu Gly Tyr Asp Val Asn

245 250 255

Asn Pro Glu Asn Tyr Gly Glu Val Leu Val Tyr Asp Phe Thr Val Val

260 265 270

His Asp Glu Val Leu Val Ser Gly Val Thr Leu Thr Pro Ser His Val

275 280 285

Asn Leu Ser Ile Gly Gly Pro Phe Gln Leu Thr Lys Thr Ile Thr Pro

290 295 300

Ala Asn Ala Thr Asn Lys Ser Val Thr Tyr Thr Ser Ser Asn Thr Ala

305 310 315 320

Val Val Glu Val Asn Glu Asn Gly Val Leu Thr Gly Ile Ala Glu Gly

325 330 335

Ser Ala Thr Val Thr Ala Thr Thr Val Glu Gly Gly Phe Thr Asp Thr

340 345 350

Ile Thr Val Asp Val Val Gly Asn Pro Val Gly Asp Asn Leu Ala Leu

355 360 365

Asn Lys Pro Val Thr Gly Thr Gly Thr His Asp Ala Asp Asn Val Val

370 375 380

Glu Asn Leu Val Asp Gly Ser Thr Ser Thr Arg Trp Ser Val Ser Gly

385 390 395 400

Phe Pro Gln Thr Ala Ile Ile Asp Leu Gly Gln Gln Tyr Ser Leu His

405 410 415

Arg Ser Glu Val Val Cys Tyr Thr Asp Arg Ala Tyr Gln Tyr Ser Ile

420 425 430

Ala Val Ser Asp Thr Glu Asn Gly Thr Tyr Thr Glu Ile Val Asp Arg

435 440 445

Thr Glu Asn Val Thr Pro Gly Asp Ala Ala Asn Pro Ile Val Asp Leu

450 455 460

Phe Ser Ala Val Asp Gly Arg Phe Ile Lys Leu Thr Val Thr Gly Ala

465 470 475 480

Ala Val Tyr Asp Gly Pro Trp Val Ser Leu Ser Glu Phe Arg Ile Tyr

485 490 495

Gly Glu Ser Ser Leu Ser Ile Asp Asp Asn Thr Ser Asp Val Thr Asn

500 505 510

Ile Thr Leu Ser Pro Asn Pro Thr Ser Asp Ile Val Asn Ile Ser Gly

515 520 525

Ala Glu Met Tyr Asn Thr Leu Gln Val Tyr Asp Gln Leu Gly Lys Leu

530 535 540

Val Met Gln Arg Thr Ile Thr Asp Gly Ala Ile Asn Ile Ser His Leu

545 550 555 560

Ser Ser Gly Leu Tyr Ile Phe Arg Leu Ser Gly Ala Ser Gln Ser Ile

565 570 575

Asn Lys Arg Val Ile Lys Lys

580

<210> 2

<211> 1752

<212> DNA

<213> Formosa agariphila

<400> 2

atgataataa attacaaaac actattacaa ttttttacag cattcattat cctttttaac 60

cttaataatc cactgtgggc acagaaaatt ccatccgatt taatggataa ttgtttacaa 120

tggaaaataa catatcctac aggtcaagaa gaaaaacaat tatgcgatga acctaataac 180

gaatactttt ttgttaatga aacagaagat gctatcgttt ttcgtacgcc tattcgatta 240

gataatggta caacaccaaa ttcagataat atacgatcag agcttcgaga acgtgaagca 300

gatggcagtg tagatattta ttggactacc gaagggtcgc atatgctcta tgtagaacaa 360

gcgattactc atttacctat aaacaaacct gagttagtag cctcgcaaat acatggaaat 420

aaagaagcag gtattgatga ttctatggta atgagactag aagaatctca tttattttta 480

tcttttaatg gaggtaaatt aagaaaaaac ataaccataa aagaagatta tgttttagga 540

actaagcatg aagttatttt cttggtagtt aatggtaaac actattgtta ttatgctgaa 600

gatggtaagc ttttagaggc ttataataat aatgatgctt cgcaatacct tattagagat 660

attgaaaatg ataacgatta tgtgatggat ttgaattatg aagattctta ctttaaagtt 720

gggaactata ctcaaagtaa ttcaaaagaa gagggttatg atgttaataa tcctgaaaat 780

tatggcgaag ttttagttta tgattttaca gttgttcacg atgaagtttt agtaagcggt 840

gtaacactta cacctagtca tgttaatctt tctataggcg gaccttttca attaacaaaa 900

actattactc ctgcaaacgc aacaaataaa tctgtaactt atacgtcttc aaatacagct 960

gttgtagaag taaatgaaaa tggcgtttta acgggtattg cagaaggaag tgctactgtt 1020

acagcaacca ctgtagaagg cggttttaca gacaccatta cagtagatgt tgttggtaac 1080

ccagtgggag ataatttagc actcaataaa cccgtaacag gtacaggaac tcatgatgca 1140

gataacgtgg tagaaaattt ggttgatggt tcaacttcta caagatggtc tgtttctgga 1200

tttccacaaa ctgcaattat agatttaggt cagcagtata gtttacaccg atccgaggtt 1260

gtatgttata cagatagagc atatcaatat tcaatagctg tgtctgatac agaaaacggc 1320

acttataccg agattgtaga tagaactgaa aatgtaactc ctggtgatgc tgcaaatcca 1380

attgtagatt tattttcagc tgtagatgga cgctttatta aattaaccgt tacaggagct 1440

gctgtttacg acggaccttg ggttagttta tctgaattta gaatctatgg cgaatcgtca 1500

ttaagtatag atgataatac ttctgatgta actaatatta cattatctcc taatcctact 1560

tcagatatcg ttaatataag cggggcagaa atgtataaca ctttacaagt ttacgatcaa 1620

ttaggaaaat tggttatgca gcgcactatt acagatggag ctataaacat ctcccattta 1680

agttctggct tatatatctt tagattatct ggagcatcac aatctattaa taaacgagta 1740

attaaaaaat aa 1752

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ttcgagctcc gtcagaaaat tccatccgat ttaatgg 37

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ttttttaatt actcgtttat taatagattg tgatgc 36

Claims

1.一种褐藻胶裂解酶FaAly7，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述的褐藻胶裂解酶FaAly7的基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的褐藻胶裂解酶FaAly7在降解褐藻胶(海藻酸钠或/和polyG)中的应用；或/和在制备褐藻寡糖中的应用。

4.一种降解褐藻胶/制备褐藻寡糖的方法，其特征在于：采用权利要求1所述的褐藻胶裂解酶FaAly7降解褐藻胶(海藻酸钠或/和polyG)。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：降解条件为：温度20～40℃，pH 6.0。

6.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体携带有权利要求2所述的编码褐藻胶裂解酶FaAly7的基因。

7.一种表达褐藻胶裂解酶FaAly7的重组宿主，其特征在于：基因组中包含权利要求2所述的编码褐藻胶裂解酶FaAly7的基因。

8.权利要求7所述的表达褐藻胶裂解酶FaAly7的重组宿主在制备褐藻胶裂解酶中的应用。

9.一种酶制剂，其特征在于：包含有褐藻胶裂解酶FaAly7，褐藻胶裂解酶FaAly7的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

10.权利要求9所述的酶制剂在降解褐藻胶(海藻酸钠或/和polyG)中的应用；或/和在制备褐藻寡糖中的应用。