CN112899177A

CN112899177A - 表达黑芥子酶tgg4的重组解脂耶氏酵母菌及其应用

Info

Publication number: CN112899177A
Application number: CN202110143184.7A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 姜宏; 王丽丽; 薛长湖
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2041-02-02
Also published as: CN112899177B

Abstract

本发明公开了一种表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌，其基因组中包含有编码黑芥子酶TGG4的基因。编码黑芥子酶TGG4的基因如SEQ ID NO.1所示；黑芥子酶TGG4如SEQID NO.2所示。该重组解脂耶氏酵母菌在制备黑芥子酶TGG4中的应用，在制备莱菔素中的应用，在降解莱菔苷中的应用。本发明还公开了一种酶制剂，通过培养该重组解脂耶氏酵母菌并收集菌体制得。本发明的食品级解脂耶氏酵母菌，能够高效表达黑芥子酶TGG4，可以在体外催化萝卜种子中的莱菔苷水解产生莱菔素。黑芥子酶TGG4是附着或镶嵌在细胞表面的，可以通过回收细胞实现黑芥子酶的重复利用，进行高效率、多批次的重复制备。

Description

表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌及其应用

技术领域

本发明涉及表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌，及酶制剂，以及在制备莱菔素中的应用，属于功能酶技术领域。

背景技术

莱菔素是自然界中抗癌活性最强的物质之一，在抗炎、抗氧化、抑制肥胖等方面也具有很强的功效，有望成为一种新型的抗癌特效药。莱菔素在自然界的十字花科植物中含量非常少，需要黑芥子酶催化底物莱菔苷水解生成且极其不稳定，在提取纯化过程中步骤繁琐且损失非常大、成本高，因此寻求一种高效的制备莱菔素的方法至关重要。

目前莱菔素的制备主要利用十字花科植物，例如萝卜种子、西兰花等，通过粉碎等破坏手段使黑芥子酶释放出来，与底物莱菔苷接触，催化其水解产生莱菔素，再利用树脂吸附等手段进行纯化，获得粗品。这个方法的成本高、步骤繁琐、莱菔素损失大。此外，也可以利用外源酶进行莱菔素制备，但是这些外源酶一般是从植物中纯化出来的，价格昂贵。所以总的来说，莱菔素的制备成本是比较高的，故而开发一种简单高效的莱菔素制备方法具有重要的意义，可以简化莱菔素的制备工艺，降低其成本。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌，及酶制剂，以及在制备莱菔素中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌，其基因组中包含有编码黑芥子酶TGG4的基因，该菌能够表达黑芥子酶TGG4。可通过转化/转染重组表达载体制备得到。

所述编码黑芥子酶TGG4的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述黑芥子酶TGG4的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码黑芥子酶TGG4的基因的核苷酸序列如下所示：

SEQ ID NO.1：

5’-TCCCAGAAGGTTTGTAACCCAGAATGTAAGGCTAAGGAACCATTCCACTGTGACAACACCCACGCTTTCAACAGAACCGGCTTCCCAAGAAACTTCACCTTCGGCGCTGCCACCTCTGCTTACCAAATCGAAGGCGCTGCTCACAGAGCTCTTAACGGCTGGGACTACTTCACCCACCGATACCCAGAAAAGGTTCCCGACAGATCTTCTGGCGACCTTGCTTGCGACTCTTACGACCTTTACAAGGACGACGTTAAGTTGTTGAAGCGAATGAACGTTCAAGCTTACAGACTCTCTATCGCCTGGTCTAGAGTCCTTCCAAAGGGCAGACTCACTGGCGGAGTTGACGAAAACGGCATCACCTACTACAACAACTTGATCAACGAACTCAAGGCTAACGGCATCGAACCATACGTCACCATCTTCCACTGGGACGTTCCTCAAACCCTCGAAGACGAATACGGCGGCTTCCTGTCTACCAGAATCGTTGAAGACTACACCAACTACGCCGAATTGCTTTTCCAAAGATTCGGCGACAGAGTGAAGTTCTGGATCACCCTCAACCAACCATTCTCTCTTGCTACCAAGGGCTATGGCGACGGCTCTTACCCACCTGGAAGATGCACCGGCTGTGAATTGGGAGGAGACTCTGGCGTGGAACCATACACCGTTGCTCACAACCAACTTTTGGCTCACGCCAAGACCGTGTCTCTTTACAGAAAGCGGTATCAAAAGTTCCAAGGCGGCAAGATCGGCACTACCTTGATCGGCAGATGGTTCGCTCCATTGAACGAATTCTCTGAATTGGACAAGGCTGCTGCTAAGAGAGCTTTCGACTTCTTCGTCGGCTGGTTCTTGGACCCACTCGTTTACGGCAAGTACCCAACCATCATGAGAGAAATGGTTGGCGACAGACTTCCAGAGTTCACCCCAGAACAATCTGCTTTGGTTAAGGGCTCTCTGGACTTCCTCGGCCTTAACTACTACGTTACCCAATACGCCACCGATGCTCCTCCACCAACCCAATTGAACGCTATCACCGACGCTAGAGTTACCCTCGGCTTCTACAGAAACGGCGTCCCAATCGGCGTTGTTGCTCCATCTTTCGTCTACTACCCCCCAGGCTTCAGACAAATCCTTAACTACATCAAGGACAACTACAAGAACCCACTCACCTACATCACCGAAAACGGCGTTGCTGACTTGGACCTTGGCAACGTTACCTTGGCTACCGCCTTGGCTGACAACGGCAGAATCCAAAACCACTGTTCTCACCTCTCTTGTCTTAAGTGTGCTATGAAGGACGGCTGTAACGTTGCCGGCTACTTCGCTTGGTCCCTCATGGACAACTACGAGTTCGGCAACGGCTACACCCTCAGATTCGGCATGAACTGGGTTAACTTCACCAACCCTGCTGACCGAAAGGAAAAGGCTTCTGGCAAGTGGTTCTCTAAGTTCCTTGCGAAG-3’。

黑芥子酶TGG4的氨基酸序列如下所示：

SEQ ID NO.2：

SQKVCNPECKAKEPFHCDNTHAFNRTGFPRNFTFGAATSAYQIEGAAHRALNGWDYFTHRYPEKVPDRSSGDLACDSYDLYKDDVKLLKRMNVQAYRLSIAWSRVLPKGRLTGGVDENGITYYNNLINELKANGIEPYVTIFHWDVPQTLEDEYGGFLSTRIVEDYTNYAELLFQRFGDRVKFWITLNQPFSLATKGYGDGSYPPGRCTGCELGGDSGVEPYTVAHNQLLAHAKTVSLYRKRYQKFQGGKIGTTLIGRWFAPLNEFSELDKAAAKRAFDFFVGWFLDPLVYGKYPTIMREMVGDRLPEFTPEQSALVKGSLDFLGLNYYVTQYATDAPPPTQLNAITDARVTLGFYRNGVPIGVVAPSFVYYPPGFRQILNYIKDNYKNPLTYITENGVADLDLGNVTLATALADNGRIQNHCSHLSCLKCAMKDGCNVAGYFAWSLMDNYEFGNGYTLRFGMNWVNFTNPADRKEKASGKWFSKFLAK。

进一步地，所述编码黑芥子酶TGG4的基因后连接有编码绿色荧光蛋白GFP的基因。

所述表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌，在制备黑芥子酶TGG4中的应用，在制备莱菔素中的应用，在降解莱菔苷(如萝卜种子中的莱菔苷)中的应用。

一种酶制剂，通过以下方法制备得到：培养上述表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌，收集菌体，冻干，即得。

进一步地，通过以下方法制备得到：挑取酵母重组菌株，接种在10ml YPD液体培养基中，30℃，200rpm培养16h后按1％的接种量接入250ml PPB培养基，30℃，200rpm发酵5d；将发酵液离心收集菌体，冻干，即得含黑芥子酶的酶粉制剂。

所述酶制剂在降解莱菔苷/制备莱菔素中的应用。

一种降解莱菔苷/制备莱菔素的方法：采用上述表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌或酶制剂降解莱菔苷(如萝卜种子中的莱菔苷)，制得莱菔素。

进一步地，降解条件为：室温，最适pH为5.0。

本发明的表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌，无需加甲醇诱导，能够高效表达黑芥子酶TGG4，可以在体外催化萝卜种子中的莱菔苷水解产生莱菔素。TGG4是一个耐高温的酶，属于糖苷水解酶Ⅰ家族，在很宽的温度范围内(65℃～80℃)均具有较高的酶活性，更利于其工业化生产。本发明所采用的编码黑芥子酶TGG4的基因，是在已知序列的基础上进行密码子优化得到的。在进行表达时，本发明的发明人发现，黑芥子酶TGG4是附着或镶嵌在细胞表面的(这一现象是出乎意料的)，所以可以通过回收细胞实现黑芥子酶的重复利用(相当于利用其自身序列的糖基化作用，实现了酶的固定化，可以循环利用)，进行高效率、多批次的重复制备，极大地降低其制备成本。通过液相对其产物进行检测，TGG4水解产生的产物是莱菔素，在循环利用10次后，莱菔素产率仍能达到92％以上。

虽然TGG4已经在大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒表达系统中进行过表达，但是在用莱菔素作为保健品或药品时不能直接添加，因为这些表达系统不是食品级的；而本发明的宿主解脂耶氏酵母菌为食品级，在制备莱菔素时可直接添加。虽然毕赤酵母是食品级的，但是在蛋白的表达时需要加甲醇诱导，所以也不能直接添加；而本发明在表达黑芥子酶TGG4时无需加甲醇诱导。

此外，以往的黑芥子酶的最适条件都是以产物葡萄糖来判断，但是这个产率与莱菔素不能直接对等过去，所以本发明通过实验优化确定了莱菔素生产的最适pH，加酶量和反应时间，实现了莱菔素制备的小试。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：温度变化对相对酶活的影响示意图。

图2：pH变化对相对酶活的影响示意图。

图3：本发明的黑芥子酶在重组菌株中的定位结果图，其中，位于上方的图为野生型PO1g，位于下方的图为重组菌株。

图4：本发明的黑芥子酶在10L发酵罐中产酶活力的变化示意图。

图5：本发明的黑芥子酶在莱菔素制备过程中pH变化对产物产量的影响示意图。

图6：本发明的黑芥子酶在不同加酶量、不同反应时间下的产物产量变化示意图。

图7：本发明的黑芥子酶在进行多批次、重复制备产物中的循环利用示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

本发明所用解脂耶氏酵母菌，为现有技术中的常见菌种，比如以下文献中有记载：

[1]赵禹,刘士琦,李建,李圣龙,赵雅坤,肖冬光,于爱群.解脂耶氏酵母作为微生物细胞工厂的应用研究进展[J/OL].食品科学:1-20[2021-01-28].

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20201120.1502.075.html.

[2]Madzak C,Tréton B,Blanchin-Roland S.Strong hybrid promoters andintegrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression ofheterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.J Mol MicrobiolBiotechnol.2000Apr；2(2):207-16.PMID:10939246.

实施例1黑芥子酶基因TGG4的克隆

本发明的黑芥子酶基因TGG4为全基因合成所得，合成单位是生工生物集团(上海)股份有限公司，合成地址为青岛分厂。发明人获得了基因片段后，此序列含有1467个碱基序列，如SEQ ID NO.1所示，编码489个氨基酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

以合成的基因片段为模板，在黑芥子酶基因的上、下游设计用于无缝连接的引物，进行PCR扩增TGG4基因片段。

引物的序列如下所示：

上游引物：5’-CGGCCGTTCTGGCCTCCCAGAAGGTTTGTAACCCAG-3’，如SEQ ID NO.3所示；

下游引物：5’-CTCTAAGTTCCTTGCGAAGATGAGCAAAG-3’，如SEQ ID NO.4所示。

在TGG4基因后面连接绿色荧光蛋白GFP，在其上、下游设计用于无缝连接的引物，进行PCR扩增GFP基因片段。

引物的序列如下所示：

上游引物：5’-TGCGAAGATGAGCAAAGGCGAAG-3’，如SEQ ID NO.5所示；

下游引物：5’-GATGATGATGCTTATACAGTTCATCCA-3’，如SEQ ID NO.6所示。

PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μl，dNTP 10μl，引物各1.5μl，模板1μl，KOD Fx酶1μl，无菌水10μl，总体系50μl。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸分别为120s和60s，反应30个循环，72℃后延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳后分别回收1467bp和714bp的PCR产物片段。

实施例2黑芥子酶基因的表达载体构建

基因片段与pINA1314克隆载体采用无缝克隆技术进行连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有50μg/m L卡那霉素的(LB)培养基固体平板上。37℃温箱中培养12-16h后，挑取单克隆至含有50μg/m L卡那霉素LB液体培养基，转速220rpm的37℃摇床培养过夜，阳性验证后测序，并命名为pINA1314-TGG4-GFP。

实施例3黑芥子酶基因的重组质粒及工程菌的构建

提取测序正确的重组质粒，设计引物将质粒线性化，并转化至宿主Y.lipolyticaPO1g感受态细胞中，构建好的工程菌在尿嘧啶缺陷型的平板上长出。

引物的序列如下所示：

上游引物：5’-TCTACTGAACGGTGATCCCCACCGGA-3’，如SEQ ID NO.7所示；

下游引物：5’-ATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCAC-3’，如SEQ ID NO.8所示。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸300s，反应30个循环，72℃后延伸10min。

实施例4利用酵母工程菌制备黑芥子酶

挑取酵母重组菌株接种在10mlYPD液体培养基中，30℃，200rpm培养16h后按1％的接种量接入250ml PPB培养基，30℃，200rpm发酵5d。将发酵液离心收集菌体冻干获得黑芥子酶的酶粉制剂。

实施例5黑芥子酶的比酶活测定

黑芥子酶TGG4活性的测定方法为：取80μl发酵液加到120μl的萝卜硫苷底物中，75℃反应20min，离心取100μl反应液上清加入300μl的3,5-二硝基水杨酸(DNS)，沸水浴反应5分钟。冷却后，将样品用800μl水稀释，并在540nm下测量吸光度，灭活的酶用作空白对照。一个黑芥子酶TGG4活力单位(U)定义为在单位时间(min)内单位质量的菌体(g)产生葡萄糖的量(μmol)。

实施例6测定重组黑芥子酶的最适反应条件

反应条件为：选取25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃反应测定最适温度；在75℃下，选用pH为4.0～10.0的缓冲液作为酶反应的不同测定pH缓冲液，根据黑芥子酶的酶活力，确定黑芥子酶的最适pH。结果如图1，图2所示，重组黑芥子酶的最适反应温度为75℃，最适pH为5，同时其最适温度测定实验结果显示该重组黑芥子酶在65～80℃酶活均比较高，表明该酶是一种比较耐高温的酶。

实施例7重组黑芥子酶在酵母细胞中的定位

利用连接在TGG4基因后面的绿色荧光蛋白GFP对黑芥子酶在解脂耶氏酵母中的位置进行定位，在PPB培养基中发酵5d后，在激光共聚焦显微镜下进行观察，设置野生型菌株作为对照。结果如图3所示，黑芥子酶在发酵过程中在信号肽的控制下会向胞外分泌，但是由于糖基化的作用，没有办法完全分泌出去，最后就附着或镶嵌在了细胞表面。

实施例8黑芥子酶在10L发酵罐中的产酶发酵

在YPD培养基中活化重组酵母菌，按照10％的接种量接种到10L的发酵罐中，通气量600L/h，发酵温度30℃，转速350rpm。每隔12h取样，进行生物量、酶活、还原糖和总糖的测定。取30ml发酵液离心获得菌体沉淀，用蒸馏水洗涤干净后在85℃烘干至恒重测生物量。离心获得发酵液上清，进行还原糖和总糖的测定：还原糖用DNS法测定，总糖用硫酸蒽酮法测定：取100μl的上清加入到500μl的硫酸-蒽酮溶液中，沸水浴10min，冷却后在620nm下测吸光值。酶活力的测定在最适温度75℃和最适pH 5下进行，反应时间20min。结果如图4所示，在108h酶活达到最高，此时达到了44.84U/g，此时，生物量、总糖、还原糖分别为13.44g/L、0.32g/L、0.13g/L，之后酶活出现下降的趋势。

实施例9测定产物莱菔素制备的最适pH

以纯化的萝卜种子中的莱菔苷为底物探究莱菔素制备过程中的最适pH，分别调节其pH至3、4、5、6，在75℃下反应2h，用高效液相色谱法(HPLC)检测乙腈溶液中莱菔素的浓度：流速0.8ml/min，检测波长245nm，柱温箱35℃，结果如图5所示。根据液相检测结果莱菔素制备的最适pH为5。

实施例10测定产物莱菔素制备最佳加酶量和反应时间

由于莱菔素对温度敏感，在较高温度和较低温度下都不利于产物的获得，最终参考Kim等人的数据选择25℃作为反应温度。在25℃、pH5的条件下进行加酶量和反应时间的优化：选择不同加酶量加入到10ml的底物中，在140rpm条件下反应，分时段取样，每次取样1ml，用2ml的乙酸乙酯萃取后氮吹浓缩，最后用1ml的乙腈溶解，用HPLC分析莱菔素制备的最佳加酶量和反应时间。结果如图6所示，当10ml的反应体系中，加酶量达到4.95U时，加酶量达到饱和，此时最佳反应时间是1.5h。

实施例11利用重组菌株进行多批次、高效率制备莱菔素

利用实施例4制备的黑芥子酶制剂，按照实施例10的反应体系催化底物水解，离心后收集菌体进行下一次的反应，重复利用10次，探究黑芥子酶的循环使用效果。结果如图7所示，重复利用10次，莱菔素的产率仍能达到92％以上，说明黑芥子酶很稳定，可以实现循环利用。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌及其应用

<141> 2021-02-02

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1467

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tcccagaagg tttgtaaccc agaatgtaag gctaaggaac cattccactg tgacaacacc 60

cacgctttca acagaaccgg cttcccaaga aacttcacct tcggcgctgc cacctctgct 120

taccaaatcg aaggcgctgc tcacagagct cttaacggct gggactactt cacccaccga 180

tacccagaaa aggttcccga cagatcttct ggcgaccttg cttgcgactc ttacgacctt 240

tacaaggacg acgttaagtt gttgaagcga atgaacgttc aagcttacag actctctatc 300

gcctggtcta gagtccttcc aaagggcaga ctcactggcg gagttgacga aaacggcatc 360

acctactaca acaacttgat caacgaactc aaggctaacg gcatcgaacc atacgtcacc 420

atcttccact gggacgttcc tcaaaccctc gaagacgaat acggcggctt cctgtctacc 480

agaatcgttg aagactacac caactacgcc gaattgcttt tccaaagatt cggcgacaga 540

gtgaagttct ggatcaccct caaccaacca ttctctcttg ctaccaaggg ctatggcgac 600

ggctcttacc cacctggaag atgcaccggc tgtgaattgg gaggagactc tggcgtggaa 660

ccatacaccg ttgctcacaa ccaacttttg gctcacgcca agaccgtgtc tctttacaga 720

aagcggtatc aaaagttcca aggcggcaag atcggcacta ccttgatcgg cagatggttc 780

gctccattga acgaattctc tgaattggac aaggctgctg ctaagagagc tttcgacttc 840

ttcgtcggct ggttcttgga cccactcgtt tacggcaagt acccaaccat catgagagaa 900

atggttggcg acagacttcc agagttcacc ccagaacaat ctgctttggt taagggctct 960

ctggacttcc tcggccttaa ctactacgtt acccaatacg ccaccgatgc tcctccacca 1020

acccaattga acgctatcac cgacgctaga gttaccctcg gcttctacag aaacggcgtc 1080

ccaatcggcg ttgttgctcc atctttcgtc tactaccccc caggcttcag acaaatcctt 1140

aactacatca aggacaacta caagaaccca ctcacctaca tcaccgaaaa cggcgttgct 1200

gacttggacc ttggcaacgt taccttggct accgccttgg ctgacaacgg cagaatccaa 1260

aaccactgtt ctcacctctc ttgtcttaag tgtgctatga aggacggctg taacgttgcc 1320

ggctacttcg cttggtccct catggacaac tacgagttcg gcaacggcta caccctcaga 1380

ttcggcatga actgggttaa cttcaccaac cctgctgacc gaaaggaaaa ggcttctggc 1440

aagtggttct ctaagttcct tgcgaag 1467

<210> 2

<211> 489

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Ser Gln Lys Val Cys Asn Pro Glu Cys Lys Ala Lys Glu Pro Phe His

1 5 10 15

Cys Asp Asn Thr His Ala Phe Asn Arg Thr Gly Phe Pro Arg Asn Phe

20 25 30

Thr Phe Gly Ala Ala Thr Ser Ala Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Ala His

35 40 45

Arg Ala Leu Asn Gly Trp Asp Tyr Phe Thr His Arg Tyr Pro Glu Lys

50 55 60

Val Pro Asp Arg Ser Ser Gly Asp Leu Ala Cys Asp Ser Tyr Asp Leu

65 70 75 80

Tyr Lys Asp Asp Val Lys Leu Leu Lys Arg Met Asn Val Gln Ala Tyr

85 90 95

Arg Leu Ser Ile Ala Trp Ser Arg Val Leu Pro Lys Gly Arg Leu Thr

100 105 110

Gly Gly Val Asp Glu Asn Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Asn Leu Ile Asn

115 120 125

Glu Leu Lys Ala Asn Gly Ile Glu Pro Tyr Val Thr Ile Phe His Trp

130 135 140

Asp Val Pro Gln Thr Leu Glu Asp Glu Tyr Gly Gly Phe Leu Ser Thr

145 150 155 160

Arg Ile Val Glu Asp Tyr Thr Asn Tyr Ala Glu Leu Leu Phe Gln Arg

165 170 175

Phe Gly Asp Arg Val Lys Phe Trp Ile Thr Leu Asn Gln Pro Phe Ser

180 185 190

Leu Ala Thr Lys Gly Tyr Gly Asp Gly Ser Tyr Pro Pro Gly Arg Cys

195 200 205

Thr Gly Cys Glu Leu Gly Gly Asp Ser Gly Val Glu Pro Tyr Thr Val

210 215 220

Ala His Asn Gln Leu Leu Ala His Ala Lys Thr Val Ser Leu Tyr Arg

225 230 235 240

Lys Arg Tyr Gln Lys Phe Gln Gly Gly Lys Ile Gly Thr Thr Leu Ile

245 250 255

Gly Arg Trp Phe Ala Pro Leu Asn Glu Phe Ser Glu Leu Asp Lys Ala

260 265 270

Ala Ala Lys Arg Ala Phe Asp Phe Phe Val Gly Trp Phe Leu Asp Pro

275 280 285

Leu Val Tyr Gly Lys Tyr Pro Thr Ile Met Arg Glu Met Val Gly Asp

290 295 300

Arg Leu Pro Glu Phe Thr Pro Glu Gln Ser Ala Leu Val Lys Gly Ser

305 310 315 320

Leu Asp Phe Leu Gly Leu Asn Tyr Tyr Val Thr Gln Tyr Ala Thr Asp

325 330 335

Ala Pro Pro Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile Thr Asp Ala Arg Val Thr

340 345 350

Leu Gly Phe Tyr Arg Asn Gly Val Pro Ile Gly Val Val Ala Pro Ser

355 360 365

Phe Val Tyr Tyr Pro Pro Gly Phe Arg Gln Ile Leu Asn Tyr Ile Lys

370 375 380

Asp Asn Tyr Lys Asn Pro Leu Thr Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Val Ala

385 390 395 400

Asp Leu Asp Leu Gly Asn Val Thr Leu Ala Thr Ala Leu Ala Asp Asn

405 410 415

Gly Arg Ile Gln Asn His Cys Ser His Leu Ser Cys Leu Lys Cys Ala

420 425 430

Met Lys Asp Gly Cys Asn Val Ala Gly Tyr Phe Ala Trp Ser Leu Met

435 440 445

Asp Asn Tyr Glu Phe Gly Asn Gly Tyr Thr Leu Arg Phe Gly Met Asn

450 455 460

Trp Val Asn Phe Thr Asn Pro Ala Asp Arg Lys Glu Lys Ala Ser Gly

465 470 475 480

Lys Trp Phe Ser Lys Phe Leu Ala Lys

485

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cggccgttct ggcctcccag aaggtttgta acccag 36

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ctctaagttc cttgcgaaga tgagcaaag 29

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tgcgaagatg agcaaaggcg aag 23

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gatgatgatg cttatacagt tcatcca 27

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tctactgaac ggtgatcccc accgga 26

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

atctcatgct ggagttcttc gcccac 26

Claims

1.一种表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于：其基因组中包含有编码黑芥子酶TGG4的基因。

2.根据权利要求1所述的表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于：所述编码黑芥子酶TGG4的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述黑芥子酶TGG4的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌，其特征在于：所述编码黑芥子酶TGG4的基因后连接有编码绿色荧光蛋白GFP的基因。

4.权利要求1或2或3所述的表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌，在制备黑芥子酶TGG4中的应用，或/和：在制备莱菔素中的应用，或/和：在降解莱菔苷中的应用。

5.一种酶制剂，其特征在于：通过以下方法制备得到：培养权利要求1或2或3所述的表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌，收集菌体，即得。

6.根据权利要求5所述的酶制剂，其特征在于：通过以下方法制备得到：挑取重组菌株，接种在10ml YPD液体培养基中，30℃，200rpm培养16h后按1％的接种量接入250ml PPB培养基，30℃，200rpm发酵5d；将发酵液离心收集菌体，冻干，即得含黑芥子酶的酶粉制剂。

7.权利要求5或6所述的酶制剂在降解莱菔苷/制备莱菔素中的应用。

8.一种降解莱菔苷/制备莱菔素的方法，其特征在于：采用权利要求1或2或3所述的表达黑芥子酶TGG4的重组解脂耶氏酵母菌或权利要求4或5所述的酶制剂降解莱菔苷，制得莱菔素。

9.根据权利要求8所述的降解莱菔苷/制备莱菔素的方法，其特征在于：降解条件为：室温，pH为5.0。

10.根据权利要求7所述的降解莱菔苷/制备莱菔素的方法，其特征在于：所述莱菔苷存在于萝卜种子中。