CN114854717B - 一种脂肪酶及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脂肪酶及其编码基因与应用。本发明公开的脂肪酶是如下a)或b)的蛋白质：a)SEQ ID NO:1所示的蛋白质；b)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明提供的脂肪酶可以通过其转酯活性或酯交换活性一步法高效催化维生素A棕榈酸酯的合成。

Description

一种脂肪酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于功能酶筛选技术领域，涉及一种脂肪酶及其编码基因与应用。
背景技术
维生素A，又名视黄醇，是人体所必须的一类微量元素，它在儿童生长发育过程中发挥了重要作用，具有维持视觉功能、促进骨骼生长发育、参与组织细胞分裂、抗炎、抗氧化、免疫调节以及抗衰老等功能。目前，维生素A已经被广泛应用于食品、药物、饲料和化妆品等领域。由于维生素A具有不饱和双键结构，使其在高温、氧化物、酸性环境或紫外照射下容易遭到破坏，形成较多的副产物。因此，商品化的维生素A往往以更加稳定的酯类形式存在，主要包括维生素A醋酸酯和维生素A棕榈酸酯两种。相较于维生素A醋酸酯，维生素A棕榈酸酯具有更好的稳定性和更佳的药理功能，可用于食品和医药等领域，而维生素A醋酸酯则主要应用于饲料领域，与此同时，维生素A棕榈酸酯的市场价格也更高。因此，开发维生素A棕榈酸酯的合成工艺具有较好的市场前景。
目前生产维生素A棕榈酸酯的工艺主要采用酰氯化合成，但该方法会产生较多的有毒物质和副反应，影响了最终产品的安全性；与此同时，化学法合成维生素A棕榈酸酯需要在高温下进行，这不仅会破坏维生素的结构，而且会大大提高设备使用成本。与之相比，脂肪酶催化合成的工艺具有反应条件温和、安全性高、绿色和无污染等优势，是目前化学法的一种良好替代，国内外相关厂家也在开发酶催化的工艺。开发具有优良催化性能的脂肪酶，将有望降低酶的使用成本提高维生素A棕榈酸酯市场竞争力。
发明内容
本发明的目的是提供一种脂肪酶，以及利用该脂肪酶的转酯和酯交换活性高效催化维生素A棕榈酸酯的合成，从而弥补现有的酶催化技术中存在的酶催化效率低的问题。
具体地，本发明从蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)中获得脂肪酶WH-Bc240，其属于脂类水解酶第III家族，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，优化后的核苷酸序列如SEQID NO:2所示，利用该脂肪酶WH-Bc240的转酯或酯交换活性，可以实现一步法高效催化制备维生素A棕榈酸酯；进一步对脂肪酶WH-Bc240进行突变后，得到了在酶活性和转化率方面都可比的脂肪酶突变体，这些突变体的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17所示，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18所示。
在第一方面，本发明提供一种脂肪酶，是如下a)或b)的蛋白质：
a)SEQ ID NO:1所示的蛋白质；
b)将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
在一些实施方案中，上述脂肪酶中，b)所述的蛋白质是SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17所示的蛋白质。
本发明提供的上述脂肪酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到，例如使用重组技术从原核宿主(例如大肠杆菌)或真核宿主(例如酵母、高等植物)中表达获得。
在一些实施方案中，上述脂肪酶是通过将含有其编码基因的重组载体导入大肠杆菌(例如E.coli M15)得到重组工程菌，然后将该重组工程菌进行诱导表达得到脂肪酶。
在第二方面，本发明提供一种编码上述任一所述的脂肪酶的核酸分子。
在一些实施方案中，上述核酸分子具有如下1)-9)的核苷酸序列：
1)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
2)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
3)SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
4)SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
5)SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；
6)SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；
7)SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；
8)SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；
9)SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。
本发明提供的上述核酸分子通常可以通过PCR扩增或人工合成的方法获得。
在第三方面，本发明提供一种重组载体，其包含上述任一所述的核酸分子。
所述重组载体包括克隆载体和表达载体，所述克隆载体用于复制相关序列，所述表达载体用于表达相关基因，其中构建表达载体时用到的载体可以为pET-21a(+)、pET-22b(+)、pET-28a(+)、pET-32a(+)、pQE30或pLLP-OmpA中的一种。
在一些实施方案中，上述重组载体为将编码上述脂肪酶的核酸分子替换pQE30的BamHI和EcoRV酶切位点间序列，其余序列保持不变得到的。
在第四方面，本发明提供一种重组细胞，其包含上述任一所述的重组载体。
在一些实施方案中，所述重组细胞诱导(如IPTG诱导)产生上述任一所述的脂肪酶。
在一些实施方案中，所述重组细胞的构建方法包括如下：
将所述重组载体转化到宿主细胞中，经诱导，得到表达上述任一所述的脂肪酶。
进一步地，所述重组载体为上述任一所述的重组载体，所述宿主细胞为原核生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等，比如大肠杆菌BL21(DE3)，Rosetta(DE3)，BL21(DE3)plysS，M15或Top10f’，优选大肠杆菌M15。
在第五方面，本发明提供一种脂肪酶的制备方法，包括：
对上述任一所述的重组细胞进行诱导培养，得到培养物；
从所述培养物中分离上述任一所述的脂肪酶。
其中，对重组细胞进行诱导培养的方法、从培养物中分离脂肪酶的方法均为本领域的常规方法。重组细胞表达脂肪酶时使用的培养基可以是本领域可使该重组细胞生长并产生本发明的脂肪酶的培养基，优选LB培养基。
培养方法与培养条件没有特殊要求，只要能够使重组细胞正常生长，并表达脂肪酶即可。
在第六方面，本发明提供上述任一所述的脂肪酶、上述任一所述的核酸分子、上述重组载体、上述重组细胞和/或上述方法制备得到的脂肪酶在制备维生素A棕榈酸酯中的应用，具体地，利用脂肪酶的转酯或酯交换活性，以维生素A醋酸酯为底物，合成维生素A棕榈酸酯，另外的，含有脂肪酶的全细胞催化剂可重复使用。
在第七方面，本发明提供一种维生素A棕榈酸酯的制备方法，包括：以上述任一所述的脂肪酶、上述重组细胞和/或上述方法制备得到的脂肪酶作为催化剂，催化维生素A醋酸酯和棕榈酸发生转酯反应，得到维生素A棕榈酸酯。
在一些实施方案中，上述转酯反应中，温度为20-50℃，例如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选35℃。
在一些实施方案中，上述转酯反应中，包括以上述任一所述的重组细胞催化维生素A醋酸酯和棕榈酸发生转酯反应，得到维生素A棕榈酸酯；
催化剂的用量为0.3-3.0g/L，例如0.3g/L、0.6g/L、0.9g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.8g/L、2.1g/L、2.4g/L、2.7g/L、3.0g/L，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选为1.5g/L。
在第八方面，本发明提供一种维生素A棕榈酸酯的制备方法，包括：以上述任一所述的脂肪酶、上述重组细胞和/或上述方法制备得到的脂肪酶作为催化剂，催化维生素A醋酸酯和棕榈酸甲酯发生酯交换反应，得到维生素A棕榈酸酯。
在一些实施方案中，上述酯交换反应中，温度为20-50℃，例如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选35℃。
在一些实施方案中，上述酯交换反应中，包括以上述任一所述的重组细胞催化维生素A醋酸酯和棕榈酸甲酯发生酯交换反应，得到维生素A棕榈酸酯；
催化剂的用量为0.3-3.0g/L，例如0.3g/L、0.6g/L、0.9g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.8g/L、2.1g/L、2.4g/L、2.7g/L、3.0g/L，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围，优选为1.5g/L。
应当理解的是，本发明所述的脂肪酶可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的脂肪酶制成固定化酶或固定化细胞形式的催化剂。
本发明的优点在于，本发明提供的脂肪酶可以通过其转酯活性或酯交换活性一步法高效催化维生素A棕榈酸酯的合成。对于脂肪酶WH-Bc240，在维生素A醋酸酯浓度为150g/L的条件下，以棕榈酸作底物，转化率为92.5％，回收率为89.1％，以棕榈酸甲酯为底物，转化率为99.2％，回收率为97.1％；对于其突变体来说，发酵液中的脂肪酶活性与突变前相比，并未发生明显改变，各突变体全细胞催化剂催化维生素A棕榈酸酯的合成的转化率都在98％以上。
附图说明
图1为本发明的脂肪酶WH-Bc240进化树分析。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。如非特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域常规操作，或按照试剂盒及仪器设备厂商所建议的实验方法。实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
pQE30质粒为武汉淼灵生物科技有限公司产品，产品目录号为P0067。
实施例1：脂肪酶WH-Bc240氨基酸序列分析
利用文献报道的方法，对脂肪酶WH-Bc240(序列如SEQ ID NO:1所示)进行家族分类，该过程使用MEGA 6.0软件构建WH-Bc240与其他脂类水解酶的进化树，从而确定WH-Bc240的分类信息。如图1所示，通过进化树分析，确定WH-Bc240属于脂类水解酶第III家族。该酶与GenBank中已报道蛋白的序列最高相似度为95.83％(Bacillus，WP_001260120.1)，该酶被预测为脂肪酶，但未被研究。
实施例2：表达脂肪酶WH-Bc240的重组工程菌的构建
根据GenBank中WH-Bc240的核酸序列，设计特异性引物，以蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株的基因组DNA为模板，扩增脂肪酶WH-Bc240基因。前期实验证明，扩增后的脂肪酶WH-Bc240基因难以在大肠杆菌中顺利表达。因此，为了实现WH-Bc240在大肠杆菌中的异源表达，对其核苷酸序列进行了优化，优化后的序列如SEQ ID NO:2所示。
以SEQ ID NO:2所示的DNA分子为模板，以引物1(5’-CCCGGATCCATGCGCACCCCGCTATCGTTT-3’,SEQ ID NO:19)和引物2(5’-CCCGATATCTTAAAAATGACTCGTCAGACACG-3’,SEQ ID NO:20)为引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；BamHI和EcoRV双酶切该PCR扩增产物得到基因片段；BamHI和EcoRV双酶切pQE30质粒，得到载体片段；将基因片段和载体片段连接，得到重组质粒pQE30-WH-Bc240。
将重组质粒pQE30-WH-Bc240转化到E.coli M15感受态细胞中，并使用含有氨苄青霉素(Amp)的LB固体平板进行筛选，得到阳性克隆。将阳性克隆接种到含有Amp(100μg/mL)的LB液体培养基中，于37℃下振荡培养，并将菌液进行保种，即为表达脂肪酶WH-Bc240的重组工程菌M15-pQE30-WH-Bc240。
实施例3：全细胞催化剂的制备
将保存的M15-pQE30-WH-Bc240菌液接种到含有100μg/mL Amp的液体LB培养基中，并置于37℃下振荡培养过夜，得到种子液。接下来，将种子液按照1％(v/v)的接种量接种到含有100mL LB液体培养基(+100μg/mL Amp)的三角瓶中，于37℃下振荡培养2-3h，至OD600在0.3-0.7之间。然后，向三角瓶中添加终浓度为100μM的IPTG诱导脂肪酶WH-Bc240的表达，并将诱导温度设置为16℃，诱导时间为20h。诱导表达结束后，利用对硝基苯基丁酸酯(pNPB)为底物，检测细胞中的脂肪酶活性，单位脂肪酶酶活(U)定义为每分钟催化pNPB生成1μmolpNP所需的酶量。结果显示，发酵液中的脂肪酶活性为15.7U/mL。接下来，离心收集诱导表达后的全细胞，并置于-80℃的超低温冰箱中进行冷冻，并最终于冷冻干燥机中进行冻干，得到全细胞催化剂。
实施例4：利用脂肪酶转酯活性一步法制备维生素A棕榈酸酯
准确称取15g维生素A醋酸酯和12g棕榈酸溶解于100mL正庚烷中，然后向其中添加150mg的全细胞催化剂，于磁力搅拌下进行催化反应，反应温度控制在35℃，反应时间为10h。反应结束后，吸取反应液进行离心，离心上清液使用HPLC法进行维生素A棕榈酸酯和维生素A醋酸酯含量的测定。结果表明，维生素A醋酸酯的转化率为92.5％，维生素A棕榈酸酯的回收率为89.1％。
HPLC检测条件：Agilent液相系统，C18柱(250mm×4.6mm,4.5μm)，UV检测器，波长为327nm，流动相为甲醇，流速为1mL/min，温度为30℃。
实施例5：利用脂肪酶酯交换活性一步法制备维生素A棕榈酸酯
准确称取15g维生素A醋酸酯和12.35g棕榈酸甲酯溶解于100mL正庚烷中，然后向其中添加150mg的全细胞催化剂，于磁力搅拌下进行催化反应，反应温度控制在35℃，反应时间为10h。反应结束后，吸取反应液进行离心，离心上清液使用HPLC法进行维生素A棕榈酸酯和维生素A醋酸酯含量的测定(HPLC检测条件同实施例4)。结果表明，维生素A醋酸酯的转化率为99.2％，维生素A棕榈酸酯的回收率为97.1％。
实施例6：全细胞催化剂的批次使用效率
在实施例5的基础上，将反应后的全细胞催化剂进行回收，再次投入到实施例5的反应中，验证制备的全细胞催化剂批次制备维生素A棕榈酸酯的效率，结果如表1所示。
表1：全细胞催化剂的批次使用效率
结果表明，制备的全细胞催化剂具有较好的重复利用性，反应5个批次后，转化率仍可到97％以上。
实施例7：脂肪酶WH-Bc240的氨基酸突变研究
在实施例2的基础上，研究氨基酸突变对WH-Bc240活性的影响。本实施例中，我们利用点突变技术，使用丙氨酸(密码子GCA)分别替代脂肪酶WH-Bc240氨基酸序列中的L15(突变后的氨基酸序列SEQ ID NO:3&核苷酸序列SEQ ID NO:4)，Q39(突变后的氨基酸序列SEQID NO:5&核苷酸序列SEQ ID NO:6)，F55(突变后的氨基酸序列SEQ ID NO:7&核苷酸序列SEQID NO:8)，R110(突变后的氨基酸序列SEQ ID NO:9&核苷酸序列SEQ ID NO:10)，R170(突变后的氨基酸序列SEQ ID NO:11&核苷酸序列SEQ ID NO:12)，M214(突变后的氨基酸序列SEQ IDNO:13&核苷酸序列SEQ ID NO:14)，N225(突变后的氨基酸序列SEQ ID NO:15&核苷酸序列SEQ ID NO:16)，K233(突变后的氨基酸序列SEQ ID NO:17&核苷酸序列SEQ ID NO:18)。将突变后的重组质粒导入大肠杆菌M15细胞后，按照实施例2的方法构建8个可表达脂肪酶WH-Bc240突变体的基因工程菌株。
进一步按照实施例3的方法测得上述各突变体的发酵液中的脂肪酶活性为14，16.2，14.9，15.2，15.1，15.9，13.6，15.4U/mL，与突变前相比，脂肪酶活性并未发生明显改变，并进一步制备得到突变体全细胞催化剂。按照实施例5的方法检测各突变体全细胞催化剂催化维生素A棕榈酸酯的合成，结果显示最终的转化率都在98％以上，即催化合成维生素A棕榈酸酯的能力并未发生明显的改变。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列
SEQ ID NO:1
MRTPLSFDKETAILLASCCELCSEQYKQNAIFEIPDGFQYVQGFQGKTIQTTEWFAFILESEDTIIVAFRGTQTDTDWIIDSLVNQKPYPYGLNSGNVHNGFLSIYESCRDSIMDMLVSLPAHKKLLATGHSLGGALATLHILDARINTAFAQYGLYTFASPKVGDIAFRNWYKLQVASSFRFVNLFDVVPLLPPRTVHFNEQDWEYAHVHHNMTITKNTKSIANNHAMTAYKTCLTSHF
SEQ ID NO:2
ATGCGCACCCCGCTATCGTTTGATAAAGAAACCGCGATCCTGTTAGCCTCTTGTTGCGAACTGTGCTCTGAACAGTATAAACAGAATGCTATCTTTGAAATTCCAGATGGCTTTCAGTATGTGCAGGGTTTTCAGGGCAAAACGATCCAGACAACGGAATGGTTTGCTTTTATCCTGGAAAGCGAAGATACGATCATCGTGGCGTTTCGCGGTACACAGACCGATACCGATTGGATTATCGATTCACTGGTGAATCAGAAACCTTATCCGTATGGCCTGAATAGCGGTAATGTGCATAATGGCTTTCTGAGCATCTATGAAAGTTGTCGTGATTCAATCATGGATATGTTAGTGTCACTGCCGGCACATAAAAAACTGTTAGCTACGGGCCATAGCTTAGGCGGCGCCCTGGCGACCTTACATATTCTGGATGCTCGTATCAATACGGCCTTTGCTCAGTATGGTCTGTATACATTTGCGTCTCCGAAAGTGGGTGATATTGCATTTCGCAATTGGTATAAATTACAGGTTGCTAGTAGTTTTCGCTTTGTTAATCTGTTTGATGTGGTTCCGCTGCTGCCTCCACGCACCGTGCATTTTAATGAACAGGATTGGGAATATGCCCATGTGCATCATAATATGACGATCACCAAAAATACCAAATCTATTGCCAATAATCATGCCATGACAGCTTACAAAACGTGTCTGACGAGTCATTTTTAA
SEQ ID NO:3
MRTPLSFDKETAILAASCCELCSEQYKQNAIFEIPDGFQYVQGFQGKTIQTTEWFAFILESEDTIIVAFRGTQTDTDWIIDSLVNQKPYPYGLNSGNVHNGFLSIYESCRDSIMDMLVSLPAHKKLLATGHSLGGALATLHILDARINTAFAQYGLYTFASPKVGDIAFRNWYKLQVASSFRFVNLFDVVPLLPPRTVHFNEQDWEYAHVHHNMTITKNTKSIANNHAMTAYKTCLTSHF
SEQ ID NO:4
ATGCGCACCCCGCTATCGTTTGATAAAGAAACCGCGATCCTGGCAGCCTCTTGTTGCGAACTGTGCTCTGAACAGTATAAACAGAATGCTATCTTTGAAATTCCAGATGGCTTTCAGTATGTGCAGGGTTTTCAGGGCAAAACGATCCAGACAACGGAATGGTTTGCTTTTATCCTGGAAAGCGAAGATACGATCATCGTGGCGTTTCGCGGTACACAGACCGATACCGATTGGATTATCGATTCACTGGTGAATCAGAAACCTTATCCGTATGGCCTGAATAGCGGTAATGTGCATAATGGCTTTCTGAGCATCTATGAAAGTTGTCGTGATTCAATCATGGATATGTTAGTGTCACTGCCGGCACATAAAAAACTGTTAGCTACGGGCCATAGCTTAGGCGGCGCCCTGGCGACCTTACATATTCTGGATGCTCGTATCAATACGGCCTTTGCTCAGTATGGTCTGTATACATTTGCGTCTCCGAAAGTGGGTGATATTGCATTTCGCAATTGGTATAAATTACAGGTTGCTAGTAGTTTTCGCTTTGTTAATCTGTTTGATGTGGTTCCGCTGCTGCCTCCACGCACCGTGCATTTTAATGAACAGGATTGGGAATATGCCCATGTGCATCATAATATGACGATCACCAAAAATACCAAATCTATTGCCAATAATCATGCCATGACAGCTTACAAAACGTGTCTGACGAGTCATTTTTAA
SEQ ID NO:5
MRTPLSFDKETAILLASCCELCSEQYKQNAIFEIPDGFAYVQGFQGKTIQTTEWFAFILESEDTIIVAFRGTQTDTDWIIDSLVNQKPYPYGLNSGNVHNGFLSIYESCRDSIMDMLVSLPAHKKLLATGHSLGGALATLHILDARINTAFAQYGLYTFASPKVGDIAFRNWYKLQVASSFRFVNLFDVVPLLPPRTVHFNEQDWEYAHVHHNMTITKNTKSIANNHAMTAYKTCLTSHF
SEQ ID NO:6
ATGCGCACCCCGCTATCGTTTGATAAAGAAACCGCGATCCTGGCAGCCTCTTGTTGCGAACTGTGCTCTGAACAGTATAAACAGAATGCTATCTTTGAAATTCCAGATGGCTTTGCATATGTGCAGGGTTTTCAGGGCAAAACGATCCAGACAACGGAATGGTTTGCTTTTATCCTGGAAAGCGAAGATACGATCATCGTGGCGTTTCGCGGTACACAGACCGATACCGATTGGATTATCGATTCACTGGTGAATCAGAAACCTTATCCGTATGGCCTGAATAGCGGTAATGTGCATAATGGCTTTCTGAGCATCTATGAAAGTTGTCGTGATTCAATCATGGATATGTTAGTGTCACTGCCGGCACATAAAAAACTGTTAGCTACGGGCCATAGCTTAGGCGGCGCCCTGGCGACCTTACATATTCTGGATGCTCGTATCAATACGGCCTTTGCTCAGTATGGTCTGTATACATTTGCGTCTCCGAAAGTGGGTGATATTGCATTTCGCAATTGGTATAAATTACAGGTTGCTAGTAGTTTTCGCTTTGTTAATCTGTTTGATGTGGTTCCGCTGCTGCCTCCACGCACCGTGCATTTTAATGAACAGGATTGGGAATATGCCCATGTGCATCATAATATGACGATCACCAAAAATACCAAATCTATTGCCAATAATCATGCCATGACAGCTTACAAAACGTGTCTGACGAGTCATTTTTAA
SEQ ID NO:7
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序列表
<110> 万华化学集团股份有限公司
万华化学（四川）有限公司
<120> 一种脂肪酶及其编码基因与应用
<130> DSP1F223049ZX
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Ile Ile Val Ala Phe Arg Gly Thr Gln Thr Asp Thr Asp Trp Ile Ile
65 70 75 80
Asp Ser Leu Val Asn Gln Lys Pro Tyr Pro Tyr Gly Leu Asn Ser Gly
85 90 95
Asn Val His Asn Gly Phe Leu Ser Ile Tyr Glu Ser Cys Arg Asp Ser
100 105 110
Ile Met Asp Met Leu Val Ser Leu Pro Ala His Lys Lys Leu Leu Ala
115 120 125
Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu His Ile Leu Asp
130 135 140
Ala Arg Ile Asn Thr Ala Phe Ala Gln Tyr Gly Leu Tyr Thr Phe Ala
145 150 155 160
Ser Pro Lys Val Gly Asp Ile Ala Phe Ala Asn Trp Tyr Lys Leu Gln
165 170 175
Val Ala Ser Ser Phe Arg Phe Val Asn Leu Phe Asp Val Val Pro Leu
180 185 190
Leu Pro Pro Arg Thr Val His Phe Asn Glu Gln Asp Trp Glu Tyr Ala
195 200 205
His Val His His Asn Met Thr Ile Thr Lys Asn Thr Lys Ser Ile Ala
210 215 220
Asn Asn His Ala Met Thr Ala Tyr Lys Thr Cys Leu Thr Ser His Phe
225 230 235 240
<210> 12
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgcgcaccc cgctatcgtt tgataaagaa accgcgatcc tggcagcctc ttgttgcgaa 60
ctgtgctctg aacagtataa acagaatgct atctttgaaa ttccagatgg ctttgcatat 120
gtgcagggtt ttcagggcaa aacgatccag acaacggaat ggtttgcttt tatcctggaa 180
agcgaagata cgatcatcgt ggcgtttcgc ggtacacaga ccgataccga ttggattatc 240
gattcactgg tgaatcagaa accttatccg tatggcctga atagcggtaa tgtgcataat 300
ggctttctga gcatctatga aagttgtcgt gattcaatca tggatatgtt agtgtcactg 360
ccggcacata aaaaactgtt agctacgggc catagcttag gcggcgccct ggcgacctta 420
catattctgg atgctcgtat caatacggcc tttgctcagt atggtctgta tacatttgcg 480
tctccgaaag tgggtgatat tgcatttgca aattggtata aattacaggt tgctagtagt 540
tttcgctttg ttaatctgtt tgatgtggtt ccgctgctgc ctccacgcac cgtgcatttt 600
aatgaacagg attgggaata tgcccatgtg catcataata tgacgatcac caaaaatacc 660
aaatctattg ccaataatca tgccatgaca gcttacaaaa cgtgtctgac gagtcatttt 720
taa 723
<210> 13
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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1 5 10 15
Ser Cys Cys Glu Leu Cys Ser Glu Gln Tyr Lys Gln Asn Ala Ile Phe
20 25 30
Glu Ile Pro Asp Gly Phe Ala Tyr Val Gln Gly Phe Gln Gly Lys Thr
35 40 45
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50 55 60
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130 135 140
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
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1 5 10 15
Ser Cys Cys Glu Leu Cys Ser Glu Gln Tyr Lys Gln Asn Ala Ile Phe
20 25 30
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Ile Met Asp Met Leu Val Ser Leu Pro Ala His Lys Lys Leu Leu Ala
115 120 125
Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Leu His Ile Leu Asp
130 135 140
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<400> 16
atgcgcaccc cgctatcgtt tgataaagaa accgcgatcc tggcagcctc ttgttgcgaa 60
ctgtgctctg aacagtataa acagaatgct atctttgaaa ttccagatgg ctttgcatat 120
gtgcagggtt ttcagggcaa aacgatccag acaacggaat ggtttgcttt tatcctggaa 180
agcgaagata cgatcatcgt ggcgtttcgc ggtacacaga ccgataccga ttggattatc 240
gattcactgg tgaatcagaa accttatccg tatggcctga atagcggtaa tgtgcataat 300
ggctttctga gcatctatga aagttgtcgt gattcaatca tggatatgtt agtgtcactg 360
ccggcacata aaaaactgtt agctacgggc catagcttag gcggcgccct ggcgacctta 420
catattctgg atgctcgtat caatacggcc tttgctcagt atggtctgta tacatttgcg 480
tctccgaaag tgggtgatat tgcatttcgc aattggtata aattacaggt tgctagtagt 540
tttcgctttg ttaatctgtt tgatgtggtt ccgctgctgc ctccacgcac cgtgcatttt 600
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130 135 140
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180 185 190
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195 200 205
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<400> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cccgatatct taaaaatgac tcgtcagaca cg 32

Claims (9)

1.一种脂肪酶，是如下a)或b)的蛋白质：
a)SEQ ID NO:1所示的蛋白质；
b)SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17所示的蛋白质。
2.编码权利要求1所述的脂肪酶的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子的核苷酸序列如下1)-9)所示：
1)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
2)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
3)SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
4)SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
5)SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；
6)SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；
7)SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；
8)SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；
9)SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。
4.一种重组载体，其包含权利要求2或3所述的核酸分子。
5.一种重组细胞，其包含权利要求4所述的重组载体。
6.一种脂肪酶的制备方法，其包括如下步骤：
对权利要求5所述的重组细胞进行诱导培养，得到培养物；
从所述培养物中分离权利要求1所述的脂肪酶。
7.权利要求1所述的脂肪酶、权利要求2或3所述的核酸分子、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的重组细胞和/或权利要求6所述的方法制备得到的脂肪酶在制备维生素A棕榈酸酯中的应用。
8.一种维生素A棕榈酸酯的制备方法，其包括如下步骤：以权利要求1所述的脂肪酶、权利要求5所述的重组细胞和/或权利要求6所述的方法制备得到的脂肪酶作为催化剂，催化维生素A醋酸酯和棕榈酸发生转酯反应，得到维生素A棕榈酸酯。
9.一种维生素A棕榈酸酯的制备方法，其包括如下步骤：以权利要求1所述的脂肪酶、权利要求5所述的重组细胞和/或权利要求6所述的方法制备得到的脂肪酶作为催化剂，催化维生素A醋酸酯和棕榈酸甲酯发生酯交换反应，得到维生素A棕榈酸酯。
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