JP2009538118A - 2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸の酵素的な製造法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、3−ヒドロキシカルボン酸からの2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸の酵素的な製造法に関し、その際、3−ヒドロキシカルボン酸を、反応水溶液中で製造し、かつ/又は該反応水溶液に添加し、インキュベートする。該反応水溶液は、3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−ムターゼ活性を有し、かつ3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル生成活性と3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル異性化活性との双方を有し、かつ3−ヒドロキシカルボン酸を相応する2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸へ変換させるユニットを含有し、ここで、2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸は酸としてか又はその塩の形で取得される。有利な実施態様において、3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−ムターゼ活性を有するユニットは、単離されたコバラミン依存性ムターゼを含むユニット、及び場合により3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル生成酵素又は酵素系、又はこれらを含有する微生物である。有利に、本発明は2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸の生物工学的な製造法に関し、その際、所望の活性を有する微生物は、水性系中で、単純な天然物を用いて培養され、細胞内で生じる3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステルは相応する2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸に変換される。本発明は同様に、不飽和2−メチルカルボン酸の製造を含み、その際、取得された2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸は脱水により相応する不飽和2−メチルカルボン酸(メタクリル酸及び高級同族体)に変換される。
Description
本発明は、3−ヒドロキシカルボン酸からの2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸の酵素的な製造法に関し、その際、3−ヒドロキシカルボン酸は反応水溶液中で製造され、かつ/又は該反応水溶液に添加され、かつインキュベートされる。反応水溶液は3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−ムターゼ活性を有し、かつ3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル生成活性と3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル異性化活性との双方を有し、かつ3−ヒドロキシカルボン酸を相応する2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸へ変換させるユニットを含有し、ここで、2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸は酸としてか又はその塩の形で取得される。有利な実施態様において、3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−ムターゼ活性を有するユニットは、単離されたコバラミン依存性ムターゼ、及び場合により3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル生成酵素又は酵素系を含むか、又はこれらを含有する微生物である。有利に、本発明は2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸の生物工学的な製造法に関し、その際、所望のムターゼ活性を有する微生物は、水性系中で、単純な天然物を用いて培養され、細胞内で生じる3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステルは相応する2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸に変換される。本発明は同様に、不飽和2−メチルカルボン酸の製造を含み、その際、取得された2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸は脱水により相応する不飽和2−メチルカルボン酸(メタクリル酸及び高級同族体)に変換される。
本発明の有利な実施態様において、3−ヒドロキシカルボニル−CoA−チオエステル生成及び3−ヒドロキシカルボニル−CoA−チオエステル異性化微生物として、株HCM−10(DSM 18028)が使用される。
メタクリル酸並びに同族不飽和2−メチルカルボン酸は、アクリルガラス板、射出成形品、被覆及び他の多数の製品の製造に幅広く使用されている。
メタクリル酸及びその同族体の多数の製造法は公知である。しかしながら、市販品の世界的規模の大部分が、相応する2−ヒドロキシニトリルから製造されるメタクリル酸及びその同族体のアミドスルファートの加水分解法に基づいている(W. Bauer, "Methacrylic acid and derivatives", Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 第5版, 著者: B. Elvers, S. Hawkins, G. Schulz, VCH, New York, 1990, A16巻, 第441-452頁; A. W. Gross, J. C. Dobson, "Methacrylic acid and derivatives", Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 第4版, 著者: J. I, Kroschwitz, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, New York, 1995, 第16巻, 第474-506頁)。前記方法の場合、例えばメタクリル酸1kgの製造のために約1.6kgの硫酸が必要である。前記理由から、硫酸の回収(及びそれと関連する高いエネルギーコスト)なしでメタクリル酸を商業的に製造するための代替的な方法が有利であろう。
2−ヒドロキシイソ酪酸からメタクリル酸への化学的変換は、特許文献US3,666,805及びUS5,225,594により開示されている。ここで、2−ヒドロキシイソ酪酸は、金属酸化物、金属水酸化物、イオン交換体樹脂、アルミナ、二酸化ケイ素、アミン、ホスフィン、アルカリ金属アルコキシド及びアルカリ金属カルボン酸塩の使用により脱水される。通常の反応温度は160℃〜250℃である。前記方法の場合、96%までのメタクリル酸収率が達成可能であった。
メタクリル酸及びその同族体の代替的な製造法は、ニトリル加水分解酵素の使用下での2−ヒドロキシニトリルから相応する2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸への加水分解によりもたらされる。前記のニトリル加水分解酵素は、ニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼとアミダーゼとからの組み合わせ物である(A. Banerjee, R. Sharma, U. C. Banerjee, 2002, "The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects", Appl. Microbiol. Biotechnol., 60:3344)。前記方法は多数の特許により保護されている(US6,582,943B1)。前記方法の重大な欠点は、効率的なニトリル加水分解酵素活性のために必要な中性のpH範囲内におけるニトリルの不安定性である。反応混合物中でのニトリルの分解はケトン及びシアニドの蓄積を招き、これらは共にニトリル加水分解酵素活性を阻害する。
双方の方法、即ち、現在支配的であるアミドスルファートをベースとする方法及び酵素的なニトリル加水分解法の一般的な欠点は、2−ヒドロキシニトリルが必要であることである。2−ヒドロキシニトリルは、まず環境に有害な出発物質、即ちケトン及びシアニドから製造されねばならない。
従って、環境に有害でない出発物質をベースとするメタクリル酸及びその同族体の製造法が有利である。
従って本発明は、2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸を製造するための代替的な可能性を見出し、かつ、出来る限り環境に有害でない出発物質の使用に基づいて、エネルギー消費が少なく、かつ廃棄物が少ない方法を提供するという課題に基づいていた。
前記課題は、3−ヒドロキシカルボン酸からの2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸の酵素的な製造法により解決される。本発明によれば、3−ヒドロキシカルボン酸は、3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−ムターゼ活性を有するユニットを有する反応水溶液中で製造され、かつ/又は該反応水溶液に添加される。3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−ムターゼ活性を有するユニットとは、本発明の範囲内で、コバラミン依存性ムターゼ、及び場合により3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル生成酵素又は酵素系を含むユニット、ないし、これを含むか又は生成し、かつ3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−ムターゼ活性を有し、かつ3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル生成活性と3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル異性化活性との双方を有する生物学的系であると解釈される。インキュベート後、引き続き、相応して変換された2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸は酸としてか又はその塩の形で取得される。
有利に、本発明は微生物の使用下での2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸の生物工学的な製造法に関する。前記微生物は、通常、3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル合成活性を有し、かつ、そのようなコバラミン依存性ムターゼを生成又は含むことができ、かつ、3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−ムターゼ活性により、細胞内で単純な天然物から(出発物質、例えば糖及び/又はアルコール及び/又は有機酸及びその誘導体から)形成された3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステルを、相応する2−ヒドロキシ−2−メチルカルボニル−CoA−エステルに変換することができる。
本発明による方法は、特に、コバラミン依存性ムターゼを生成ないし含有し、かつ3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−ムターゼ活性を有する微生物を、3−ヒドロキシカルボン酸から相応する2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸への変換のために水性系中で使用することを特徴とする。
有利な方法変法において、3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−ムターゼ活性を有し、かつ3−ヒドロキシカルボニル−CoA−チオエステル生成活性と3−ヒドロキシカルボニル−CoA−チオエステル異性化活性との双方を有する微生物は、炭素源及びエネルギー源としての再生原料又は再生原料の利用から生じる廃棄物を含有する水性系中で培養される。この場合、細胞内で形成される3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−チオエステルは、相応する2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸に変換される。有利に、該反応は外部からの3−ヒドロキシカルボン酸の添加下に行われる。引き続き、相応する2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸は酸としてか又はその塩の形で単離される。
単純な天然物からの3−ヒドロキシカルボン酸の製造及びその2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸への異性化を利用するこの新規の生物工学的方法により、上記課題を解決することができる。
本発明の有利な実施態様において、方法は以下の工程
(a)3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル合成活性及びムターゼ活性を有する適当な生物学的系中で、3−ヒドロキシカルボン酸を単純な天然物から製造し、引き続き2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸へ変換する工程、及び
(b)2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸を遊離酸としてか又はその相応する塩として単離する工程
を含む。
(a)3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル合成活性及びムターゼ活性を有する適当な生物学的系中で、3−ヒドロキシカルボン酸を単純な天然物から製造し、引き続き2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸へ変換する工程、及び
(b)2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸を遊離酸としてか又はその相応する塩として単離する工程
を含む。
そのように取得された2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸は、有利に、C2〜C3不飽和イソアルケン酸(メタクリル酸及びその同族体)の製造のために使用されることができ、これは、(a)及び(b)で製造された酸又はその相応する塩の脱水により行われることができる。前記反応を以下に記載する:
− 単純な天然物(例えば再生原料又は再生原料の利用から生じる廃棄物、例えば糖、有機酸又はアルコール)→3−ヒドロキシカルボン酸→2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸(例えば株HCM−10による)
− 2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸→メタクリル酸及びその同族体(例えばNaOHの存在で、かつ185℃の温度で)
反応条件(pH値、イオン濃度、酸素/二酸化炭素の必要性、微量元素、温度等)は、この場合当然のことながら、微生物が3−ヒドロキシカルボン酸から2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸への最適な変換をし得るように選択される。前記の方法条件下で、コバラミン依存性ムターゼは、天然のミクロ環境内で、即ち細胞内で、単離された酵素よりも高い安定性及び有効性を有することができる。更に、適当な条件下で、細胞増殖、ひいてはムターゼ濃度の増加が可能である。従って、微生物を用いた酵素的変換は、場合により、方法の信頼性、オートメーション化及び容易性並びに最終生成物の品質及び収率に関して卓越した利点を有する。
− 単純な天然物(例えば再生原料又は再生原料の利用から生じる廃棄物、例えば糖、有機酸又はアルコール)→3−ヒドロキシカルボン酸→2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸(例えば株HCM−10による)
− 2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸→メタクリル酸及びその同族体(例えばNaOHの存在で、かつ185℃の温度で)
反応条件(pH値、イオン濃度、酸素/二酸化炭素の必要性、微量元素、温度等)は、この場合当然のことながら、微生物が3−ヒドロキシカルボン酸から2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸への最適な変換をし得るように選択される。前記の方法条件下で、コバラミン依存性ムターゼは、天然のミクロ環境内で、即ち細胞内で、単離された酵素よりも高い安定性及び有効性を有することができる。更に、適当な条件下で、細胞増殖、ひいてはムターゼ濃度の増加が可能である。従って、微生物を用いた酵素的変換は、場合により、方法の信頼性、オートメーション化及び容易性並びに最終生成物の品質及び収率に関して卓越した利点を有する。
本発明による3−ヒドロキシカルボン酸から2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸への酵素的変換に関して、3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−ムターゼ活性を有するユニット、即ちコバラミン依存性ムターゼを、有利にCoA−エステル合成活性と組み合わせて、精製された形、濃縮された形及び/又は単離された形で反応溶液に導入することも可能であり、その際、酵素は例えば天然源のものであってよい。当然のことながら、酵素は組換えにより製造された遺伝子組換え生物からの酵素であってよい。
酵素は、本発明による方法において、本発明の範囲内で、触媒として、完全な微生物細胞の形のみならず、透過処理された微生物細胞の形でも使用される。他の使用可能性は、微生物細胞抽出物からの(一種以上の)成分の形であるが、しかしまた、部分的に精製された形、又は精製された形である。場合により、他のCoA−エステル合成酵素、例えばCoA−トランスフェラーゼ又はCoA−シンテターゼが本発明により使用される。酵素触媒は固定化されていてよく、又は溶解した又は溶解していない担持材料上に付着されていてよい。
有利な実施変法において、所定の細胞区画又はその部分が相互に分離されるか又は結合され、即ち、ムターゼ活性を有するユニットにプラス又はマイナスの影響を及ぼし得る炭水化物構造、脂質又はタンパク質及び/又はペプチド並びに核酸が組み合わせられるか又は分離されることができる。そのような影響を意図的に利用するために、微生物から例えば当業界による方法で粗抽出物を生成し、該粗抽出物を場合により遠心分離して、本発明による反応を沈澱物又は上澄み液を用いて実施し得るようにする。
3−ヒドロキシカルボン酸(例えば3−ヒドロキシ酪酸)又はより厳密に言えばその細胞内のCoA−チオエステル 3−ヒドロキシカルボニル−CoAは、多数の細菌株により単純な天然物から容易に製造することができる。前記酸は、一般的な細菌性の炭素及びエネルギーの貯蔵物質であるポリ−3−ヒドロキシアルカノアートのための基本構成単位/モノマーである。カルボン酸の骨格内の炭素の転位は、細菌系内において、また別の生物学的系内においても同様に広範囲に及ぶ。しかしながら従来、3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステルを相応する2−ヒドロキシ−2−メチルカルボニル−CoA−エステルに変換するための生物学的系は検出できなかった。本発明は、コバラミン依存性ムターゼ活性を有する系が双方の特性を有するという驚異的な発見に基づいている。
コバラミン依存性ムターゼを含有する微生物は、例えばMethylibium petroleiphilum PM1、Methylibium sp. R8(株コレクション UFZ、ライプツィヒ在)、β−プロテオバクテリア株HCM−10、Xanthobacter autotrophicus Py2、Rhodobacter sphaeroides(ATCC 17029)又はNocardioides sp. JS614である。
有利に好適な生物学的系が株HCM−10において見出された。該株は、特許手続上の微生物の寄託に関するブダペスト条約により、Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、ブラウンシュヴァイク、ドイツ在に、No. DSM 18028で2006年3月13日に寄託された。
前記の有利な生物学的系を使用して、2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸、特に2−ヒドロキシイソ酪酸の特に良好な収率を達成することが可能となった。しかしながら、微生物による酵素的反応は決して前記株に限定されるものではない。3−ヒドロキシカルボン酸を2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸に変換することのできる全ての生物を本発明により使用することができる。
該生物は、一方では同一の遺伝子ないし遺伝子産物を有するか、又は他方では類似の、又は同様の活性を有する遺伝子産物をもたらす同様の遺伝子を有する微生物であってよい。即ち、別の由来の3−ヒドロキシカルボニル−CoA−ムターゼ活性は、本発明により同様に網羅される。同様に、本発明は、株HCM−10と類似の3−ヒドロキシカルボニル−CoA−ムターゼ活性を有するか又は別の由来を有する形質転換された系も含む。
該系には、突然変異株、微生物の遺伝子組換えされた変異体、並びに単離された変異体、例えば、ムターゼをコードするヌクレオチド配列の挿入に基づき所望のコバラミン依存性ムターゼ活性を有する生物が含まれる。
該系には、突然変異株、微生物の遺伝子組換えされた変異体、並びに単離された変異体、例えば、ムターゼをコードするヌクレオチド配列の挿入に基づき所望のコバラミン依存性ムターゼ活性を有する生物が含まれる。
有利に使用される生物学的系(株HCM−10 DSM 18028)は、3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステルを、チオエステルとして、単純な天然物、例えば糖及び/又は有機酸及び/又はアルコール及びその誘導体から製造する。式1に例示的に(R)−3−ヒドロキシブチリル−CoAの場合に関して示されているように、ここで使用される有利な系において、3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステルは、コバラミン依存性の炭素骨格転位ムターゼにより2−ヒドロキシ−2−メチルカルボニル−CoA−エステルに変換される。CoA−チオエステルは、該系において加水分解され、かつ酸が培地に分泌される。
本発明による方法に関して、有利な酵素触媒として、コバラミン依存性ムターゼを含有する微生物株HCM−10(DSM 18028)、Xanthobacter autotrophicus Py2、Rhodobacter sphaeroides(ATCC 17029)又はNocardioides sp. JS614、その粗抽出物又は部分が使用される。本発明により使用される株は、有利に、配列SEQ ID NO: 2及び/又はSEQ ID NO: 4を有するタンパク質を生成するか、もしくは、核酸配列SEQ ID NO: 1及び/又はSEQ ID NO: 3を含み(HCM−10)、配列SEQ ID NO: 5及び/又はSEQ ID NO: 6を有するタンパク質を生成するか、もしくは、核酸配列SEQ ID NO: 7及び/又はSEQ ID NO: 8を含み(Xanthobacter autotrophicus Py2)、配列SEQ ID NO: 9及び/又はSEQ ID NO: 10を有するタンパク質を生成するか、もしくは、核酸配列SEQ ID NO: 11及び/又はSEQ ID NO: 12を含む(Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029)か、又は、配列SEQ ID NO: 13及び/又はSEQ ID NO: 14を有するタンパク質を生成するか、もしくは、核酸配列SEQ ID NO: 15及び/又はSEQ ID NO: 16を含む(Nocardioides sp. JS614)。本発明の範囲内で、上記のタンパク質は濃縮された形、単離された形、又は合成により製造された形で使用されてよい。
本発明の更に有利な実施変法において、酵素触媒、特に微生物、粗抽出物、その部分及び/又は濃縮されたか又は単離された酵素は固定化されて使用される。固定化により、酵素、細胞内器官及び細胞は、不溶性かつ反応空間に限定された状態となる。酵素は例えばポリマーマトリックス中に固定化されていてよい(例えばアルギナート、ポリビニルアルコール又はポリアクリルアミドゲル)。触媒の回収及び再利用を容易にするために、固定化は溶解したか又は溶解していない担持材料(例えばセライト)上で行われてもよい。ポリマーマトリックス中で、又は溶解したか又は溶解していない担体上での細胞固定化のための方法は当業者に公知であり、既に詳細に記載されている。酵素活性物質は同様に微生物細胞から単離されることができる。その後、該物質は直接触媒として、又はポリマーマトリックス中で、又は溶解したか又は溶解していない担体上で固定化して使用されることができる。このために必要な方法は当業者に公知であり、例えばMethods in Biotechnology, 第1巻: Immobilization of enzymes and cells, G. F. Bickerstaff著, Humana出版, トトワ, ニュージャージー, 1997に記載されている。
3−ヒドロキシカルボン酸から2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸への変換は、有利に連続法の範囲内で行われ、該方法は貫流型反応器中で実施されることができ、該反応器中で微生物増殖が、従って生成物形成が生じる。しかしながら、連続法とは、一方では栄養溶液に添加され、他方では酵素的に形成された2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸を含む培養液がそこから排出される、増殖する細胞及び触媒酵素の全ての系であるとも解釈することができる。本発明によれば、方法は半連続法として、又はバッチ法として実施されることもできる。
既に上記したように、2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸のための出発物質である3−ヒドロキシカルボン酸は、有利に、炭化水素及び/又は有機酸及び/又はアルコールないしその誘導体の酵素的な変換により製造される。本発明と関連して、コバラミン依存性ムターゼの他に、場合により更にCoA−エステル合成酵素が使用され、該酵素は微生物中に存在するか又は添加される。この場合、炭化水素及び/又は炭水化物及び/又は有機酸及び/又はアルコールないしその誘導体から3−ヒドロキシカルボン酸への、及び3−ヒドロキシカルボン酸から2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸への変換は、唯一の方法工程で行われ、即ち、出発基質から3−ヒドロキシカルボン酸までの変換、及び、3−ヒドロキシカルボン酸から相応する2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸への酵素的変換反応は、同時にか又はわずかに時間的にずれて、一つの、又は同一の反応溶液中で進行する。
本発明の極めて特別な実施態様において、培養のために、t−ブチル基を有する基質が炭素源及びエネルギー源として使用され、有利に、t−ブチルアルコールが唯一の炭素源及びエネルギー源として基本培地中で使用される。
本発明による方法は、有利に2−ヒドロキシ−2−メチルプロパン酸(2−ヒドロキシイソ酪酸)の製造のために用いることができる。2−ヒドロキシイソ酪酸の有利な製造は、更に、外部から3−ヒドロキシ酪酸を添加することを特徴とする。
該方法は好気的に、有利に完全な細胞を用いて実施することができ、また、有利に抽出物又は精製された酵素が使用される場合に、嫌気的に、例えば窒素導通下に実施することもできる。
本発明は、以下:
a)配列番号2及び/又は配列番号4に示されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子;
b)配列番号1及び/又は配列番号3に示されたヌクレオチド配列を含む核酸分子
からなる群から選択された、コバラミン依存性ムターゼの活性を有する酵素をコードする核酸分子にも関する。
a)配列番号2及び/又は配列番号4に示されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子;
b)配列番号1及び/又は配列番号3に示されたヌクレオチド配列を含む核酸分子
からなる群から選択された、コバラミン依存性ムターゼの活性を有する酵素をコードする核酸分子にも関する。
本発明による酵素は、有利に、配列番号2及び配列番号4に示されるサブユニットを含むために卓越した酵素活性を有するヘテロ二量体タンパク質であることが判明した。
核酸分子は、DNA分子、有利にcDNA又はゲノムDNA及び/又はRNA分子であってよい。核酸及びタンパク質の双方とも、天然源から、有利にDSM 18028から、しかし例えばMethylibium petroleiphilum PM 1、Methylibium sp. R8(株コレクションUFZ ライプツィヒ在)、Xanthobacter autotrophicus Py2、Rhodobacter sphaeroides(ATCC17029)又はNocardioides sp. JS614からも単離されることができるか、又は公知の方法により合成されることもできる。
本発明により使用される核酸分子において、自体公知の分子生物学的技術を用いて突然変異を生じさせることができ、これにより、同様に本発明による方法において使用される、同様又は類似の特性を有する他の酵素を合成することができるようになる。突然変異は、短い酵素をもたらす欠失型突然変異であってよい。他の分子機序、例えば、挿入、重複、転位、遺伝子融合、ヌクレオチド交換により、又は種々の微生物株間での遺伝子導入によっても、同様に、類似又は同様の特性を有する修飾酵素を生成することができる。
この種の核酸分子の同定及び単離は、核酸分子又はその部分の使用下に行うことができる。核酸分子とハイブリダイゼーションする分子は、本発明により使用可能な酵素をコードする上記の核酸分子の断片、誘導体及び対立変異株も含む。断片とは、この場合、上記の酵素をコードするのに十分な長さの核酸分子の部分であると解釈される。誘導体とは、前記分子の配列であると解釈され、該配列は上記核酸分子の配列と一つ以上の位置で異なっているが、この上記核酸分子の配列に対して高度の相同性を有する。相同性とはこの場合、核酸レベルで少なくとも40%の配列同一性、特に少なくとも60%の、有利に80%を上回る、特に有利に90%、95%、97%又は99%を上回る同一性を意味する。この場合、コードされた酵素は、アミノ酸レベルで、少なくとも60%、有利に少なくとも80%、特に有利に少なくとも95%、極めて特に有利に少なくとも99%の上記のアミノ酸配列に対する配列同一性を有する。この場合、欠失、置換、挿入又は組換えにより相違が生じる。これは、自然発生変異、例えば、別の生物からの配列又は突然変異であってよく、その際、これらの突然変異は自然に生じ得るか、又は意図的な変異誘発(UV線、X線、化学的手段又はその他)により生じ得る。更に、変異体は合成により生成された配列であってよい。前記変異体は所定の共通の特性、例えば酵素活性、活性酵素濃度、サブユニット、官能基、免疫反応性、立体配座及び/又は物理的特性、例えばゲル電気泳動における移動挙動、クロマトグラフィー挙動、溶解性、沈降係数、最適pH、最適温度、分光特性、安定性及び/又はその他を有する。
本発明は更に、配列番号2及び4を有する新規のタンパク質、並びに配列番号2及び配列番号4を含むヘテロ二量体タンパク質、並びにその少なくとも99%の相同体にも関する。
SEQ ID NO: 1は、DSM 18028からのコバラミン依存性ムターゼの大きなサブユニットのための1644 bpを含むヌクレオチド配列を示す。
SEQ ID NO: 2は、DSM 18028からのコバラミン依存性ムターゼの大きなサブユニットの548 aaを含むアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO: 3は、DSM 18028からのコバラミン依存性ムターゼの小さなサブユニットのための部分的なヌクレオチド配列の369 bpを示す。
SEQ ID NO: 4は、DSM 18028からのコバラミン依存性ムターゼのサブユニットの123 aaを含む部分配列を示す。
SEQ ID NO: 5及び6は、Xanthobacter autotrophicus Py2からのコバラミン依存性ムターゼの562ないし135 aaを含むアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO: 7及び8は、Xanthobacter autotrophicus Py2からのコバラミン依存性ムターゼのためのヌクレオチド配列の1689ないし408 bpを示す。
SEQ ID NO: 9及び10は、Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029からのコバラミン依存性ムターゼの563ないし135 aaを含むアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO: 11及び12は、Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029からのコバラミン依存性ムターゼのためのヌクレオチド配列の1692ないし408 bpを示す。
SEQ ID NO: 13及び14は、Nocardoides sp.JS614からのコバラミン依存性ムターゼの569ないし164 aaを含むアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO: 15及び16は、Nocardoides sp. JS614からのコバラミン依存性ムターゼのためのヌクレオチド配列の1710ないし495 bpを示す。
本発明により製造された2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸は、(溶解していない成分、例えば微生物細胞を除去した後に)既に公知である方法を用いた培地の処理により単離されることができる。そのような方法は、特に例えば濃縮、イオン交換、蒸留、電気透析、抽出及び結晶化である。生成物は、塩としてか又は(酸性化後に)プロトン化された2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸として単離されることができる。
2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸(又はその相応する塩)は、多数の方法により脱水され、相応する不飽和2−メチルカルボン酸に変換され得る。C2〜C3不飽和イソアルケン酸の製造のために、製造された2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸は従来技術の公知の方法により脱水される。2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸の脱水は、金属酸化物、金属水酸化物、イオン交換体樹脂、アルミナ、二酸化ケイ素、アミン、ホスフィン、アルカリ金属アルコキシド及びアルカリ金属カルボン酸塩の使用により行われることができる。通常の反応温度は160℃〜250℃である。例えば、メタクリル酸の製造は、NaOHの存在で、約185℃の温度で2−ヒドロキシイソ酪酸を脱水することにより行われる。
前記方法により製造されたメタクリル酸及びその同族体により、多数の工業部門において、例えば添加物として、及び被覆において、目的にかなう利用がなされる。該方法は、従来公知の方法とは対照的に、低温プロセスであり、環境に有害でない出発物質を使用し、かつ廃棄物が少ないという所望の利点を併せ持つ。
引き続き、本発明を実施例をもとに詳説するが、しかしながら本発明はこの実施例に限定されるべきではない。
実施例
材料及び方法
微生物酵素触媒
3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル生成活性及び3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル異性化活性により特徴付けられる株HCM−10(DSM 18028)からの微生物細胞、又は、そこから単離された、配列番号2及び4を有するタンパク質サブユニット。
材料及び方法
微生物酵素触媒
3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル生成活性及び3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル異性化活性により特徴付けられる株HCM−10(DSM 18028)からの微生物細胞、又は、そこから単離された、配列番号2及び4を有するタンパク質サブユニット。
微生物酵素触媒の増殖
2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸の製造のために使用される微生物株を、下記の通り単離した。培養株を液体窒素中の20%グリセリン溶液中で貯蔵する。
株HCM−10を、地下水から、唯一の炭素源及びエネルギー源としてのt−ブチルアルコールを含有する基本培地(第1表)に濃縮した。系統発生的に、該株はRubrivivax-Leptothrix群に属する。
2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸の製造のために使用される微生物株を、下記の通り単離した。培養株を液体窒素中の20%グリセリン溶液中で貯蔵する。
株HCM−10を、地下水から、唯一の炭素源及びエネルギー源としてのt−ブチルアルコールを含有する基本培地(第1表)に濃縮した。系統発生的に、該株はRubrivivax-Leptothrix群に属する。
株HCM−10を好気的に以下の条件(第2表)下で3−ヒドロキシカルボニル−CoA−ムターゼ活性の試験のために増殖させた。
細胞を採収の直後に使用した。完全な細胞を他の予備処理、例えば透過処理なしに使用することができる。更に、細胞内及び細胞外への物質の拡散速度を改善するために、細胞を(例えばトルエン、洗浄剤を用いた処理により、又は凍結融解サイクルにより)透過処理して使用することができる。
培養液中ないし反応混合物中での2−ヒドロキシイソ酪酸及び3−ヒドロキシ酪酸の濃度を、FFAPカラム及びFID検出器を用いた酸性メタノリシスによるガスクロマトグラフィーにより測定した。
実施例1:
株HCM−10による3−ヒドロキシ酪酸から2−ヒドロキシイソ酪酸への変換
基本培地100mL中の株HCM−10の細胞1g(乾燥質量)の懸濁液を120mL血清瓶中に充填した。前記懸濁液に、3−ヒドロキシ酪酸50mlを添加し、該懸濁液を回転式振盪器で30℃でインキュベートした。好気的インキュベートを0.3h行った後、懸濁液に窒素を導通し、振盪下に30℃で更に4時間インキュベートした。種々の時間に試料を採取し、懸濁液の遠心分離後の細胞不含の上澄み液中の2−ヒドロキシイソ酪酸及び3−ヒドロキシ酪酸の含分を測定した。2−ヒドロキシイソ酪酸を唯一の生成物として確認し、これを嫌気相中に放出した。それに対して、初期の好気相中で、3−ヒドロキシ酪酸は明らかに完全に分解された(図1)。2−ヒドロキシイソ酪酸の収率は、この場合5.1%であり、約80%の3−ヒドロキシ酪酸が反応液中に残存していた。
株HCM−10による3−ヒドロキシ酪酸から2−ヒドロキシイソ酪酸への変換
基本培地100mL中の株HCM−10の細胞1g(乾燥質量)の懸濁液を120mL血清瓶中に充填した。前記懸濁液に、3−ヒドロキシ酪酸50mlを添加し、該懸濁液を回転式振盪器で30℃でインキュベートした。好気的インキュベートを0.3h行った後、懸濁液に窒素を導通し、振盪下に30℃で更に4時間インキュベートした。種々の時間に試料を採取し、懸濁液の遠心分離後の細胞不含の上澄み液中の2−ヒドロキシイソ酪酸及び3−ヒドロキシ酪酸の含分を測定した。2−ヒドロキシイソ酪酸を唯一の生成物として確認し、これを嫌気相中に放出した。それに対して、初期の好気相中で、3−ヒドロキシ酪酸は明らかに完全に分解された(図1)。2−ヒドロキシイソ酪酸の収率は、この場合5.1%であり、約80%の3−ヒドロキシ酪酸が反応液中に残存していた。
実施例2:
株HCM−10の粗抽出物による3−ヒドロキシ酪酸から2−ヒドロキシイソ酪酸への変換
株HCM−10の細胞不含の粗抽出物を、ボールミル中での細胞の崩壊により製造し、細胞砕片を引き続き遠心分離により分離した。50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.2で1mM MgCl2を含有)5mL中のタンパク質10mgの濃度の細胞不含の粗抽出物を、密閉可能な10mLガラス容器に入れた。前記抽出物に、更に、0.01mM補酵素B12、1mM補酵素A、1mM ATP及び3−ヒドロキシ酪酸4.25mgを添加した。反応液に窒素を導通し、反応容器を密閉し、振盪下に30℃で2時間インキュベートした。反応生成物を上記の通り分析した。2−ヒドロキシイソ酪酸の収率は、この場合9%であり、約88%の3−ヒドロキシ酪酸が反応液中に残存していた(図2)。
株HCM−10の粗抽出物による3−ヒドロキシ酪酸から2−ヒドロキシイソ酪酸への変換
株HCM−10の細胞不含の粗抽出物を、ボールミル中での細胞の崩壊により製造し、細胞砕片を引き続き遠心分離により分離した。50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.2で1mM MgCl2を含有)5mL中のタンパク質10mgの濃度の細胞不含の粗抽出物を、密閉可能な10mLガラス容器に入れた。前記抽出物に、更に、0.01mM補酵素B12、1mM補酵素A、1mM ATP及び3−ヒドロキシ酪酸4.25mgを添加した。反応液に窒素を導通し、反応容器を密閉し、振盪下に30℃で2時間インキュベートした。反応生成物を上記の通り分析した。2−ヒドロキシイソ酪酸の収率は、この場合9%であり、約88%の3−ヒドロキシ酪酸が反応液中に残存していた(図2)。
実施例3:
2−ヒドロキシイソ酪酸からメタクリラートへの脱水
実施例2に記載された手法に相応して製造された2−ヒドロキシイソ酪酸の溶液(1mg/5mL)を、撹拌下にNaOH(0.06mg)と混合した。溶液を、撹拌及び還流冷却下に185〜195℃で真空下(300トール)にインキュベートした。メタクリラートの重合を阻害するために、5時間の期間にわたり、毎時5mL当たり2−ヒドロキシイソ酪酸0.5mgの更なるアリコートを添加し、ここで、該アリコートは付加的にp−メトキシフェノール0.4質量%を含有していた。24時間のインキュベートの後に反応を終了させた。2−ヒドロキシイソ酪酸からメタクリラートへの変換率は97%であった。反応混合物からのメタクリル酸の分離を蒸留により行った。
2−ヒドロキシイソ酪酸からメタクリラートへの脱水
実施例2に記載された手法に相応して製造された2−ヒドロキシイソ酪酸の溶液(1mg/5mL)を、撹拌下にNaOH(0.06mg)と混合した。溶液を、撹拌及び還流冷却下に185〜195℃で真空下(300トール)にインキュベートした。メタクリラートの重合を阻害するために、5時間の期間にわたり、毎時5mL当たり2−ヒドロキシイソ酪酸0.5mgの更なるアリコートを添加し、ここで、該アリコートは付加的にp−メトキシフェノール0.4質量%を含有していた。24時間のインキュベートの後に反応を終了させた。2−ヒドロキシイソ酪酸からメタクリラートへの変換率は97%であった。反応混合物からのメタクリル酸の分離を蒸留により行った。
Claims (29)
- 3−ヒドロキシカルボン酸からの2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸の酵素的な製造法において、3−ヒドロキシカルボン酸を、3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−ムターゼ活性を有し、かつ3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル生成活性と3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル異性化活性との双方を有するユニットを含有する反応水溶液中で製造し、かつ/又は該反応水溶液に添加し、インキュベートし、引き続き、相応して変換された2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸を酸としてか又はその塩の形で取得することを特徴とする方法。
- 3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−ムターゼ活性を有するユニットが、単離されたコバラミン依存性ムターゼを含有する、請求項1記載の方法。
- 3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−ムターゼ活性を有するユニットが、3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル生成酵素又は酵素系を含む、請求項1又は2記載の方法。
- 3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−ムターゼ活性を有するユニットが、微生物又はその粗抽出物である、請求項1から3までのいずれか1項記載の方法。
- コバラミン依存性ムターゼを生成ないし含有し、3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−ムターゼ活性を有し、かつ3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル生成活性と3−ヒドロキシカルボニル−CoA−エステル異性化活性との双方を有する微生物を、3−ヒドロキシカルボン酸から相応する2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸への変換のために水性系中で使用する、請求項1から4までのいずれか1項記載の方法。
- a)3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−ムターゼ活性を有し、かつ3−ヒドロキシカルボニル−CoA−チオエステル生成活性と3−ヒドロキシカルボニル−CoA−チオエステル異性化活性との双方を有する微生物を、炭素源及びエネルギー源としての再生原料又は再生原料の利用から生じる廃棄物を含有する水性系中で培養し、それにより、細胞内で3−ヒドロキシカルボン酸−CoA−チオエステルを合成し、かつ相応する2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸に変換し、かつ
b)相応する2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸を酸としてか又はその塩の形で単離する、
請求項1から5までのいずれか1項記載の方法。 - 反応を外部からの3−ヒドロキシカルボン酸の添加下に行う、請求項1から6までのいずれか1項記載の方法。
- 微生物が、細菌株HCM-10 DSM 18028、Xanthobacter autotrophicus Py2、Rhodobacter sphaeroides(ATCC17029)又はNocardioides sp. JS614である、請求項1から7までのいずれか1項記載の方法。
- 微生物の完全な細胞を、そのままで、透過処理して、又は担体に固定して使用する、請求項1から8までのいずれか1項記載の方法。
- 細胞抽出物及び/又はコバラミン依存性ムターゼ、及び場合により他の酵素、例えばCoA−エステル合成酵素を、微生物から部分的又は完全に単離した後に、場合により精製された形で使用する、請求項1から8までのいずれか1項記載の方法。
- 微生物の細胞不含の粗抽出物を使用する、請求項10記載の方法。
- 配列SEQ ID NO: 2及び/又はSEQ ID NO: 4を有するタンパク質、配列SEQ ID NO: 5及び/又はSEQ ID NO: 6を有するタンパク質、配列SEQ ID NO: 9及び/又はSEQ ID NO: 10を有するタンパク質、又は配列SEQ ID NO: 13及び/又はSEQ ID NO: 14を有するタンパク質、並びにその少なくとも60%の相同体を使用する、請求項1から11までのいずれか1項記載の方法。
- 酵素的変換のために、培養の間に、糖及び/又はアルコール及び/又は有機酸及び/又は炭化水素又はその誘導体を炭素源及びエネルギー源として使用する、請求項1から12までのいずれか1項記載の方法。
- 培養のために、t−ブチル基を有する基質を炭素源及びエネルギー源として使用する、請求項1から13までのいずれか1項記載の方法。
- 培養のために、t−ブチルアルコールを唯一の炭素源及びエネルギー源として基本培地中で使用する、請求項1から14までのいずれか1項記載の方法。
- 糖及び/又はアルコール及び/又は有機酸及び/又は炭化水素又はその誘導体から3−ヒドロキシカルボン酸への、及び、3−ヒドロキシカルボン酸から2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸への酵素的反応を唯一の方法工程で行う、請求項1から15までのいずれか1項記載の方法。
- 外部からの3−ヒドロキシ酪酸の添加下に2−ヒドロキシイソ酪酸の製造を行う、請求項1から16までのいずれか1項記載の方法。
- C2〜C3不飽和イソアルケン酸の製造法において、請求項1から17までのいずれか1項記載の方法により製造された2−ヒドロキシ−2−メチルカルボン酸を脱水することを特徴とする方法。
- メタクリル酸の製造法において、請求項1から17までのいずれか1項記載の方法により製造された2−ヒドロキシイソ酪酸を脱水することを特徴とする方法。
- 微生物株HCM−10−DSM 18028。
- 以下:
a)配列番号2及び/又は配列番号4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子;
b)配列番号1及び/又は配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子
からなる群から選択された、コバラミン依存性ムターゼの活性を有する酵素をコードする核酸分子。 - 2つの異なるサブユニットから構成されたオリゴマー酵素として、配列番号2及び配列番号4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、請求項21記載の核酸分子。
- DNA分子である、請求項21又は22記載の核酸分子。
- cDNA又はゲノムDNAである、請求項23記載の核酸分子。
- RNA分子である、請求項21又は22記載の核酸分子。
- 請求項21又は22記載の核酸分子によりコードされたコバラミン依存性ムターゼの活性を有するタンパク質。
- 配列番号2を有するタンパク質及びその少なくとも99%の相同体。
- 配列番号4を有するタンパク質及びその少なくとも99%の相同体。
- 配列番号2及び配列番号4を含むヘテロ二量体酵素としてのタンパク質。
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