WO2017069267A1 - メチルメタクリレートの生物生産 - Google Patents

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ケビン ソロモン
渉 水無
不二夫 湯
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    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01084—Alcohol O-acetyltransferase (2.3.1.84)

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant eukaryotic microorganism into which a gene encoding acyl CoA dehydrogenase has been introduced, and a method for producing a methacrylic acid ester and a precursor thereof using the microorganism.
  • Methyl methacrylate is an important raw material in the production of acrylic polymers. MMA is traditionally produced from non-sustainable “raw raw materials” such as acetone and hydrogen cyanide that affect the environment. Therefore, there is a need in the art for MMA manufacturing methods that rely on sustainable, non-toxic manufacturing methods.
  • Patent Documents 3 to 5 exemplifies various biocatalysts having general ester-forming activity (hydrolyzing enzyme, wax ester synthase, alcohol acetyltransferase), and the biocatalyst is synthesizing methacrylate ester. Is not shown to have.
  • Patent Document 6 The inventors have so far made a method for producing methacrylic acid ester from methacrylyl CoA using a biocatalyst (Patent Document 6), and by adding the action of AAT to a microorganism having methacrylic acid-producing ability from biomass in the presence of alcohol.
  • a method for producing a methacrylic acid ester (Patent Document 7) is reported.
  • a method for synthesizing methacrylyl CoA from 3-hydroxyisobutyryl CoA using Escherichia coli introduced with a dehydratase gene has been reported (Patent Document 8).
  • An object of the present invention is to provide a novel biological production method for methacrylic acid esters such as MMA.
  • MAA-CoA is not produced even when a gene involved in exogenous methacrylyl CoA (MAA-CoA) biosynthesis is introduced. This was presumed to be due to the absence of an electron acceptor of acyl CoA dehydrogenase, one of the enzymes involved in the biosynthesis of MAA-CoA, in E. coli.
  • the inventors succeeded in biological production of MAA-CoA by introducing an exogenous acyl CoA dehydrogenase gene into yeast cells.
  • the present invention relates to the following (1) to (10).
  • the gene encoding acyl-CoA dehydrogenase is selected from the genera Pseudomonas, Bacillus, Sphingobacterium, Comamonas, Brevundimonas, Sphingomonas.
  • Genus Ochrobactrum genus, Pedobacter genus, Paenibacillus genus, Achromobacter genus, Acinetobacter genus, Shewanella genus, Listonella genus, Listonella Agrobacterium genus, Mesorhizobium genus, Rhizobium genus, Paracoccus genus, Xanthobacter genus, Streptomyces genus, Geobacillus genus, Rhodococcus genus (R)
  • the eukaryotic microorganism according to (1) which is a gene derived from at least one selected from the genus hodococcus, the genus Saccharomyces, the genus Candida, and the genus Aspergillus.
  • the gene is selected from a gene encoding a branched chain keto acid dehydrogenase, a gene encoding enoyl CoA hydratase, a gene encoding hydroxyacyl CoA hydrolase, a gene encoding thioesterase, and a gene encoding alcohol acyltransferase.
  • the eukaryotic microorganism according to any one of (1) to (4), comprising at least one exogenous gene.
  • MMA and MMA precursors by recombinant microorganisms in which one or more enzyme genes, including acyl CoA dehydrogenase genes, have been introduced into eukaryotic microorganisms, enabling the production of MMA or MMA precursors.
  • a novel method for providing is provided.
  • one or more enzyme genes, including an acyl CoA dehydrogenase gene, which enable the production of MMA or MMA precursors are introduced into the microorganism, optionally one or more enzymes are targeted to the mitochondria .
  • Enzymatic mitochondrial targeting allows MMA or MMA precursors to take advantage of mitochondrial energetic, enzymatic and other favorable characteristics to enable high yield biosynthetic processes.
  • various enzyme genes involved in valine biosynthesis and degradation are introduced into the host eukaryotic microorganism, and one or more enzymes are optionally targeted to the mitochondria, where a series of reactions are performed. These are produced from MMA precursors or MMA from valine.
  • the object of the present invention is to provide a novel gene vector for host transformation, a novel eukaryotic microbial strain expressing an MMA precursor or an enzyme enabling the synthesis of MMA and the MMA produced by the recombinant microorganism of the present invention. including.
  • methacrylic acid ester precursors such as methacrylyl CoA (MAA-CoA).
  • the MAA precursor is biologically converted to methacrylic acid esters including MAA, enabling bio-consistent production of methacrylic acid esters.
  • the method of the present invention is biological production using an organic raw material such as biomass, a methacrylic acid ester can be produced non-toxicly without destroying the environment.
  • the resulting methacrylic acid ester is insoluble in water, it can be easily recovered and purified from the fermentation product, thereby enabling low-cost production of the methacrylic acid ester.
  • FIG. 1 is an overview of a synthetic route for producing MMA precursors or MMA from valine.
  • FIG. 2 shows the synthesis pathway and experimental results in the embodiment of the invention described in Example 1. Colorimetric analysis of ACD activity. The progress of the reaction was monitored in real time by the rate of decrease in absorption at 600 nm.
  • FIG. 3 shows the synthesis pathway and experimental results in the embodiment of the invention described in Example 1. The vertical axis represents S. cerevisiae after 48 hours expression / induction in cytoplasm (MMA) and mitochondria (mtMMA). The activity of recombinant ACD (acd1) expressed in S. cerevisiae is shown.
  • FIG. 4 shows the synthesis pathway and experimental results in the embodiment of the invention described in Example 1.
  • FIG. 5 shows the synthesis pathway and experimental results in the embodiment of the invention described in Example 1.
  • the vertical axis represents S. cerevisiae after 48 hours expression / induction in cytoplasm (MMA) and mitochondria (mtMMA).
  • the activity of recombinant BDKAD (bkdA1, bkdA2, IpdV, bkdB) expressed in S. cerevisiae is shown.
  • Part 1 Microorganisms capable of producing MMA and MMA precursors
  • the present invention relates to methacrylic esters such as methyl methacrylate (MMA) or its precursor methacrylyl CoA (MAA-CoA) by various biosynthetic pathways and Recombinant microorganisms that produce 3-hydroxyisobutyric acid (3-HIB) and the like are included.
  • Methacrylic acid esters and their precursors eg, MMA and MMA precursors
  • the biosynthetic pathway includes a number of enzymatic steps that work with recombinant microorganisms to possess an appropriate set of enzyme capabilities, as described below.
  • methacrylic acid (IUPAC name: 2-methyl-2-propenoic acid) includes any salt or ionized form thereof.
  • methacrylic acid salts include sodium salts, potassium salts, calcium salts, and magnesium salts.
  • the “methacrylic acid ester” is a compound represented by the formula 1.
  • R represents a linear or branched hydrocarbon group having 1 to 20 carbon atoms.
  • the hydrocarbon group may be saturated or unsaturated acyclic and may be saturated or unsaturated cyclic.
  • a straight chain or branched chain unsubstituted alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, an aralkyl group or an aryl group is preferred.
  • methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, tert-pentyl, n- A hexyl group, an isohexyl group, a 2-hexyl group, a dimethylbutyl group, an ethylbutyl group, a heptyl group, an octyl group, and a 2-ethylhexyl group are alkyl groups having 1 to 8 carbon atoms, a benzyl group, or a phenyl group.
  • CH 2 C (CH 3 ) COO-R (Formula 1)
  • methacrylic acid ester precursor examples include methacrylyl CoA, 3-hydroxyisobutyryl CoA, 3-hydroxyisobutyric acid, and isobutyryl CoA.
  • Recombinant microorganisms The present invention includes various recombinant eukaryotic microorganisms that produce methacrylic acid esters and their precursors as end products.
  • the recombinant eukaryotic microorganism of the present invention may comprise a eukaryotic microorganism that directly produces methacrylic acid esters.
  • the recombinant eukaryotic microorganisms of the present invention include cells referred to as “hosts” or “host cells” to provide as hosts for the various enzyme functions described below.
  • the host cell can be any species. Examples of host systems include yeast, filamentous fungi, algae and the like. Examples of species that can be provided as hosts include Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Aspergillus niger, and the like.
  • a preferred microorganism is yeast.
  • yeast include, for example, Saccharomyces genus bacteria such as Saccharomyces cerevisiae, Shizosaccharomyces genus bacteria, Pichia genus Pichia bacterium such as Pichia pastoris, Candida genus such as Candidatropicalis, Candida lypolitica, Candida utilis, Candida sake, Kluyveromyces, Willi Willopsis spp, Debaryomyces spp, Galactomyces spp, Torulaspora spp, Rhodotorula spp, Yarrowia spp, Zygosaccharomyces spp Fungus It is below.
  • Saccharomyces is preferable, and Saccharomyces cerevisiae is more preferable.
  • Preferred host species are capable of cell culture or are compatible with biological production so that the final products can be synthesized on a large scale production, recovered at low cost, and separated from the cells from which they were produced. There must be.
  • the host cells of the present invention can be transformed to express any number of different enzyme proteins, regulatory sequences and other genes and gene products. Transformation can be performed by any means known in the art that is available with the selected host microorganism. For example, in yeast, alkaline cationic transformation protocols such as lithium acetate combined with single stranded carrier DNA and polyethylene glycol can be used.
  • chemical transformation methods eg, DEAE-dextran, polyethyleneimine, dendrimers, polybrene, calcium phosphate, lipofectin, DOTOP, Lipofectamine or CTAB / DOPE, DOTMA
  • physical transformation methods eg, injection, gene bombardment, or laser assisted transduction, microneedles, gene guns, etc.
  • the recombinant microorganism of the present invention may be transiently transformed or stably transformed.
  • Enzyme genes and / or associated regulatory sequences introduced into a host microorganism can be arranged in various ways. It is understood that heterologous expression of a foreign gene in a host microorganism requires codon optimization and other sequence modifications so that the gene is properly transcribed and translated in the host, as is known in the art. . Also, localization elements, promoters and other elements that can be combined with the enzyme gene sequence must be effectively screened and modified in the host microorganism, as is known in the art.
  • the enzyme gene introduced into the host microorganism is generally linked downstream of the promoter sequence.
  • a constitutive promoter is used with the enzyme gene to ensure a consistently high level of expression.
  • constitutive promoters include TEF1 and GDS promoters for yeast.
  • the enzyme gene may be placed under the control of an inducible promoter.
  • each enzyme step can be placed under the control of a known inducible promoter that works in the host microorganism to operate each enzyme step in chronological order.
  • GAL10 and GAL1 galactose inducible promoters can be used in yeast.
  • the enzyme gene introduced into the host microorganism can also contain a trafficking signal that directs localization to a specific cellular compartment.
  • a signal that localizes the enzyme to the mitochondrial compartment, cell membrane or chloroplast can be linked to the coding gene sequence of the enzyme protein.
  • the scope of the present invention includes hosts that have been genetically engineered such that one or more enzymes introduced into the host are targeted to the mitochondria, eg, the mitochondrial matrix. Examples of signal sequences that can achieve such targeting in yeast include the pre-sequence of subunit 9 (Su9) of yeast mitochondrial ATPase (SEQ ID NO: 1) or the pre-sequence of subunit IV (Cox1) of yeast cytochrome C oxidase.
  • mitochondrial targeting sequences include human NADH dehydrogenase (ubiquinone) flavin protein 2 (NDUFV2) pre-sequence (residues 19-40); influenza virus protein (PB2) pre-sequence (Residues 1-20), yeast tryptophanyl tRNA-synthetase (MSW) presequence and literature [Omura, "Mitochondria-Targetin g Sequence, a Multi-Role Sorting Sequence Recognized at All Steps of Protein Import into Mitochondria, “Journal of Biochemistry.
  • the gene for the enzyme functions in the cytoplasm and no signal sequence is used.
  • one or more expressed enzyme proteins are designed to be secreted from the cell, and thus The gene sequence encoding the protein is linked to a secretion signal so that the translated protein is directed outside the cell.
  • a termination sequence is used.
  • the CYCT transcription termination sequence can be ligated downstream of an enzyme protein coding sequence that enhances proper expression in yeast cells.
  • examples of other regulatory elements that can be used include the rrnB (T1) element from E. coli, the AdhT element from yeast, and the TEF1 element from yeast.
  • nucleic acid constructs of the present invention include plasmids and linear nucleic acids, which can include cloning vectors, expression cassettes and other DNA constructs known in the art.
  • such two or more enzyme genes can be introduced into the microorganism as a single nucleic acid construct or separately.
  • nucleic acid constructs When two or more separate nucleic acid constructs are used, the transformation of the microorganism can be accomplished by transforming two or more nucleic acid constructs simultaneously or by transforming two or more nucleic acid constructs sequentially. .
  • genes introduced into host microorganisms can be under the control of different promoters. For example, if the relative proportions of the enzymes must be adjusted, the desired activity of the enzyme activity within the cell is such that some are under the control of a weak promoter and some are under the control of a stronger promoter. Can be balanced. Similarly, enzyme activity can be balanced by diversifying the number of copies of various enzyme genes introduced into the host microorganism. For example, a gene can be introduced as a single copy or as two, three, four or more copies, eg, as end-to-end copies on a single nucleic acid construct.
  • nucleic acid sequence variants and peptide sequence variants.
  • nucleotide and / or amino acid substitutions including one or several, eg 1-10, 1-6, 1-4, 1-3, 1 or 2 substitutions, additions, insertions and deletions. It can be introduced into the listed sequences.
  • a gene or protein having a nucleic acid sequence or amino acid sequence having 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more of the sequence mentioned is included.
  • equivalent genes of the present invention include genes that have 90% or more sequence identity or similarity between the wild-type sequence and the variant. It should be noted that functional equivalents of the listed gene sequences may be used, but such functional equivalents have the same enzymatic function as the enzyme or regulatory signal and are not necessarily sequence similarity, identity or It does not have homology.
  • Enzyme Function The recombinant microorganism of the present invention is referred to herein as including a specific “enzyme function”. Having a specific enzyme function means that the microorganism has the ability to produce a specific product from a specific reactant, such ability being directed to convert the reactant into a product. It may be possible by the expression of the above enzymes.
  • one or more enzyme functions possessed by the microorganism are essential for such enzyme functions (such as multimeric BCKAD enzymes including enzyme function 2 as described below).
  • all of the enzyme functions possessed by the recombinant microorganism of the invention are conferred by the introduction of essential proteins by gene transformation.
  • the one or more enzyme functions possessed by the recombinant microorganisms of the invention include native enzyme functions, i.e., the native enzyme functions of the host microorganism are not supplemented by the introduced gene. , Can impart activity.
  • enzyme function 2 is retained by the microorganism through the action of the original BCKAD gene.
  • one or more proteins introduced by transformation are targeted to a cell compartment or organelle. In one embodiment, one or more or all of the proteins introduced by transformation into a microorganism are targeted to the mitochondria. In one embodiment, the mitochondrial-targeting protein is targeted to the mitochondrial matrix. In one embodiment, the host cell is a yeast cell and the mitochondrial targeting protein comprises a targeting moiety that includes a Su9 or Cox1 mitochondrial targeting sequence.
  • three enzyme steps convert valine into MAA-CoA, which can be recovered and further processed in vitro to provide MMA.
  • the MAA-CoA producing microorganism may include additional enzyme functions that allow MAA-CoA to be directly converted to 3-HIB or MMA.
  • 3-HIB formed by microorganisms can be recovered and processed in vitro to form MMA.
  • MMA and 3-HIB Efficient formation of MMA and 3-HIB is not observed in natural microorganisms, and these synthetic pathways in recombinant microorganisms are based on valine synthesis and catabolic pathways common in a wide range of microorganisms.
  • enzyme sets available to those skilled in the art to impart the desired enzyme function. Specific enzyme functions that enable the formation of MMA and 3-HIB are described in detail below.
  • Enzyme function 1 Production of 2-oxoisovaleric acid from valine
  • the first enzymatic step in the conversion of valine to the MAA precursor is the formation of 2-oxoisovaleric acid from valine. This can be performed by the action of a branched chain aminotransferase enzyme (BCAT).
  • BCAT branched chain aminotransferase enzyme
  • endogenous BCAT activity or equivalent enzymatic activity is present and sufficient to produce the appropriate 2-oxoisovaleric acid from valine for synthesis of the MMA precursor.
  • the host microorganism can be transformed for expression of one or more BCAT or equivalent genes. Examples of the BCAT gene include Saccharomyces cerevisiae BAT1 and BAT2 genes. Additional BCAT genes that can be used include those listed in Table 1.
  • Enzyme function 2 Decarboxylation of 2-oxoisovaleric acid to isobutyryl CoA
  • the second step in the biological production of MAA precursor from valine is the decarboxylation of 2-oxoisovaleric acid to isobutyryl CoA.
  • Such a step can be performed by a branched chain ⁇ -keto acid dehydrogenase (BCKAD) complex.
  • the BCKAD complex includes four subunits, E1 subunit, E2 subunit, E3 subunit and dihydrolipoamide dehydrogenase.
  • sufficient BCKAD or equivalent activity is present in the host microorganism to convert 2-oxoisovaleric acid to isobutyryl CoA.
  • yeast cells produce sufficient MMA precursors without introduction of the BCKAD gene, indicating that sufficient intrinsic activity exists in the host.
  • the host can be transformed to express one or more enzymes that decarboxylate 2-oxoisovaleric acid to isobutyryl CoA.
  • the host microorganism can be genetically engineered to express the four contents of the BCKAD complex.
  • four genes encoding the Pseudomonas aeruginosa BCKAD complex can be introduced into the host to confer or amplify native BCKAD activity.
  • bkdA1 gene encoding E1 (Genbank accession number NP250937), bkdA2 gene encoding E3 (Genbank accession number NP — 250938), bkdB gene encoding E2 (Genbank accession number NP250939)
  • the IpdV gene coding for dihydrolipoamide dehydrogenase (Genbank accession number NP250940).
  • the host can be transformed to express a bkdA1 gene selected from Table 2, a bkdA2 gene selected from Table 3, a bkdB gene selected from Table 4, and an IpdV gene selected from Table 5. .
  • Enzyme function 3 Oxidation of isobutyryl CoA to methacrylyl CoA
  • MAA-CoA isobutyryl CoA to methacrylyl CoA
  • Such a step can be performed with a suitable enzyme, such as isobutyryl CoA dehydrogenase.
  • the host microorganism can be transformed to express one or more isobutyryl CoA dehydrogenase or equivalent enzyme.
  • the host microorganism can be engineered to express a Pseudomonas aeruginosa ACD1 gene (Genbank accession number NP — 249437) or an equivalent gene.
  • Other isobutyryl CoA dehydrogenases that can be used are listed in Table 6.
  • Enzyme function 4 MAA-CoA to 3-hydroxyisobutyryl CoA
  • one step is the conversion of MAA-CoA to 3-hydroxyisobutyryl CoA.
  • This can be performed with a suitable enzyme, such as enoyl CoA hydratase.
  • the host microorganism can be transformed to express one or more enoyl CoA hydratases (ECH) or equivalent enzymes.
  • ECH enoyl CoA hydratases
  • the host microorganism can be engineered to express a Pseudomonas aeruginosa echA gene (Genbank accession number NP — 249436) or an equivalent gene.
  • a Pseudomonas aeruginosa echA gene Genebank accession number NP — 249436
  • an ECH gene selected from Table 6 can be used.
  • Enzyme function 5 3-hydroxyisobutyryl CoA to 3-HIB
  • the final enzymatic step is the conversion of 3-hydroxyisobutyryl CoA to 3-HIB by removing CoA from 3-hydroxyisobutyryl. This can be performed with a suitable enzyme, such as a thioesterase.
  • the host microorganism can be transformed to express one or more enzymes that remove CoA from 3-hydroxyisobutyryl CoA.
  • a host microorganism can be transformed to express one or more thioesterase enzymes (HCH gene) that cleave CoA from 3-hydroxyisobutyryl CoA.
  • HCH gene thioesterase enzymes
  • the host microorganism can be engineered to express a Pseudomonas aeruginosa hchA gene (Genbank accession number NP — 249435) or an equivalent gene.
  • an HCH gene selected from Table 7 can be used.
  • Enzyme function 6 includes the ability to cleave CoA from MAA-CoA and convert MAA-CoA to MMA. Such activity can be conferred by an alcohol acyltransferase (AAT) enzyme.
  • AAT enzyme is encoded by the Malus pumila AAT gene.
  • the host microorganism is a yeast.
  • the host microorganism is yeast, and the AAT gene is a Malspmira AAT gene that is codon-optimized for expression in yeast, eg, an AAT gene comprising SEQ ID NO: 2.
  • an AAT gene selected from Table 8 can be used.
  • the above-mentioned enzymes are derived from the genus Pseudomonas, Bacillus, Sphingobacterium, Comamonas, Brebandimonas.
  • Pseudomonas for example, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas agarici, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas ⁇ ⁇ seumonse, Pseudomonas amys Pseudomonas ⁇ antimicrobica, Pseudomonas aspenni, Pseudomonas aurantiaca, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas aureo azodo Pseudomonas Balearica (Pseudomonas balearica), Shu Pseudomonas Bay GETS rinsing Kii (Pseudomonas beijerinsckii), Pseudomonas Beteri (Pseudomonas beteli), Pse
  • Rhodococcus examples include Rhodococcus rhodocrous, Rhodococcus ethroth, Rhodococcus equis, and Rhodococcus opacus. (Rhodococcus pyridinovorans), Rhodococcus rhodnii, Rhodococcus allcorallinus, Rhodococcus corallinus, Rhodococcus rubropertoctus, Rhodococcus rubropococco chlorophenolicus), Rhodococcus luteus, Examples include Rhodococcus aichiensis, Rhodococcus bubuensis, Rhodococcus maris, Rhodococcus fascines, and the like.
  • RNA is extracted from the above-mentioned microbial cells according to a conventional method, and the amino acid sequence or gene sequence of the enzyme (of the microorganism or a related species) published in public databases such as NCBI
  • a primer based on the above and performing PCR using the primer, a gene encoding the target enzyme can be isolated and amplified.
  • the present invention includes a recombinant microorganism capable of producing MAA-CoA from valine.
  • Such recombinant microorganisms of the present invention include microorganisms having enzyme function 1, enzyme function 2, and enzyme function 3 as described above.
  • Enzymes can be produced in the cytoplasm or targeted to any other cell compartment.
  • an enzyme introduced by transformation and expressed by a MAA-CoA producing microorganism is targeted to the mitochondria.
  • the mitochondrial-targeting enzyme is targeted to the mitochondrial matrix.
  • the mitochondrial-targeting protein comprises a targeting moiety comprising a Su9 or Cox1 presequence.
  • the recombinant microorganism is a yeast.
  • the yeast is Saccharomyces cerevisiae.
  • the recombinant microorganism is transformed to express one or more acyl CoA dehydrogenases (isobutyryl CoA dehydrogenase).
  • the MAA-CoA producing microorganism is transformed to express Pseudomonas aeruginosa ACD1 gene.
  • the MAA-CoA producing microorganism is transformed to express one or more enzymes that catalyze the decarboxylase of 2-oxoisovaleric acid to isobutyryl CoA.
  • the MAA-CoA producing microorganism is transformed to express one, some or all of the components of the BCKAD complex.
  • the MAA-CoA producing microorganism of the invention is transformed to express one or more enzymes that catalyze the production of 2-oxoisovaleric acid from valine, such as the BCAT1 or BCAT2 gene from yeast. Microorganisms.
  • 3-HIB-producing microorganisms The scope of the present invention includes host microorganisms genetically engineered to produce (S) -3-hydroxyisobutyric acid (3-HIB) from valine.
  • 3-HIB is a MMA precursor that can be easily converted to MMA using a variety of methods known in the art.
  • the 3-HIB-producing microorganism of the present invention is a microorganism having enzyme function 1, enzyme function 2, enzyme function 3, enzyme function 4, and enzyme function 5.
  • the 3-HIB-producing microorganism of the present invention is a host cell transformed to express an ECH gene, eg, an echA gene derived from Pseudomonas aeruginosa.
  • the 3-HIB producing microorganism of the present invention is a host cell transformed to express one or more HCH enzymes that cleave CoA from 3-hydroxyisobutyryl CoA.
  • the 3-HIB-producing microorganism may include a microorganism that expresses the hchA gene derived from Pseudomonas aeruginosa.
  • the recombinant microorganism is a yeast.
  • the yeast is Saccharomyces cerevisiae.
  • the enzyme introduced by transformation and expressed by the MAA-CoA producing microorganism is targeted to the mitochondria.
  • the mitochondrial-targeting enzyme is targeted to the mitochondrial matrix.
  • the mitochondrial-targeting protein comprises a targeting moiety comprising a Su9 or Cox1 matrix-targeting presequence.
  • the recombinant microorganisms of the invention are capable of producing MMA.
  • the MMA-producing microorganism of the present invention includes microorganisms having enzyme function 1, enzyme function 2, enzyme function 3, and enzyme function 6.
  • the MMA-producing microorganism of the present invention is transformed to express an alcohol acyltransferase (AAT), for example, to express an AAT gene of apple (Malus pumila).
  • AAT gene is encoded by SEQ ID NO: 2.
  • the MMA-producing microorganism is yeast.
  • the yeast is Saccharomyces cerevisiae.
  • the mitochondrial-targeting enzyme is targeted to the mitochondrial matrix.
  • the mitochondrial-targeting protein comprises a targeting moiety that includes a Su9 presequence.
  • the recombinant microorganisms of the present invention may further comprise genetic modifications to promote the formation of the final product.
  • the starting material for biological production of the final product is valine.
  • the microorganisms of the invention are genetically engineered to express one or more enzymes that enhance the formation of valine beyond wild-type levels.
  • biosynthetic pathways such as the Erich pathway reaction
  • the recombinant microorganisms of the invention are further genetically engineered to down-regulate or eliminate competing biosynthetic pathways.
  • the biorecombinant microorganism of the invention expresses miRNA or other sequences that down-regulate or target an enzyme that competes with any of enzyme functions 1-6. Genetically manipulated.
  • the microorganisms of the invention are genetically engineered with enzymes or regulatory genes that reduce the Erich pathway response.
  • the enzyme or regulatory gene that is co-introduced into the host species comprises a gene that inhibits valine catabolism, such as the reaction of forming succinyl-CoA from 3-HIB CoA.
  • a gene that inhibits valine catabolism such as the reaction of forming succinyl-CoA from 3-HIB CoA.
  • Such genes can be under the control of an inducible promoter so that down-regulation can be induced after the culture has been grown and switched to bioproduction mode.
  • the recombinant microorganisms of the invention are further genetically engineered to express an enzyme or regulatory sequence that enhances the reproduction of cofactors such as NADH or FADH.
  • the recombinant microorganism of the invention is transformed to express high levels of alcohol dehydrogenase and promotes NADH formation from NADPH, an essential cofactor for the action of the BCKAD complex.
  • genetic modifications can be introduced from FADH2 that increase the rate of reproduction of the cofactor FAD by the action of ACD.
  • the scope of the present invention includes the recombinant microorganisms described above and further includes methods for using such recombinant microorganisms for the production of end products such as MMA.
  • Recombinant microorganisms are cultivated to grow the microorganisms themselves and produce the final product of methacrylate esters or precursors thereof.
  • Recombinant microorganisms can be cultured under continuous culture conditions for continuous growth of the culture and simultaneous recovery of the final product.
  • the microorganisms can be processed after batch culture from a careful culture (eg, a single vessel or bioreactor) for final product formation and then processed for final product recovery.
  • the cultivation of recombinant microorganisms proceeds step by step to a biological production step that follows the first step of growth and / or growth.
  • Various steps can be performed while changing the culture conditions, where the initial growth and growth step follows the use of media and / or culture conditions that favor rapid growth and growth of the recombinant microorganism, followed by the production of the MMA end product. This can be done by changing the culture conditions that favor the formation.
  • the recombinant microorganism of the present invention is a yeast, and culture conditions that favor rapid growth and growth of yeast cultures, such as under high aeration conditions with high levels of nutrients in the growth medium.
  • culture conditions that favor rapid growth and growth of yeast cultures, such as under high aeration conditions with high levels of nutrients in the growth medium.
  • the growth step is followed by a biological production step, where the culture is less aerated or not at all, and the culture medium includes one or more nutrients (eg, trace nutrients or carbon that promotes growth).
  • the supply source is lacking.
  • the reaction may be performed at 5 to 80 ° C. for 1 minute to 1 week. .
  • it is 10 to 70 ° C. and 1 minute to 120 hours, and more preferably 10 minutes or more.
  • the pH of the reaction solution is not particularly limited as long as the reaction proceeds efficiently, but it is, for example, in the range of pH 4 to 10, preferably pH 5.5 to 8.5.
  • organic solvent for example, linear, branched or cyclic, saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon, saturated or unsaturated aromatic hydrocarbon, etc. can be used alone or in admixture of two or more.
  • hydrocarbon solvents eg, pentane, hexane, cyclohexane, benzene, toluene, xylene, etc.
  • halogenated hydrocarbon solvents eg, methylene chloride, chloroform, etc.
  • ether solvents eg, diethyl ether, Dipropyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, t-butyl methyl ether, dimethoxyethane and the like
  • ester solvents for example, methyl formate, methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, methyl propionate
  • the cells are collected and placed in a culture vessel with conditions that favor higher biological production.
  • yeast cells can be separated from growth and growth cultures by centrifugation, then washed in buffer and resuspended in fresh culture medium.
  • a microorganism that is under the control of a promoter capable of inducing one or more proteins having an enzyme function, and an inducer is added at the start or start of the biological production.
  • microorganisms have been engineered such that these genes are under the control of an inducible promoter to reduce or suppress the activity of metabolic pathways that compete with or reduce the formation of the MMA end product. These cultured cells are exposed to the inducer during the transition from the growth step to the biological production step.
  • valine is added to the culture medium to enhance the formation of the final product from valine.
  • valine is added to the culture medium upon conversion to the biological production culture step.
  • a valine precursor is included in the growth medium to improve valine formation and promote increased rate of final product formation.
  • the derivative is introduced at or near the start of the biological production process and the final product Increase the amount of precursor for formation.
  • the recombinant microorganisms of the present invention are co-cultured with other strains or microorganisms that produce valine to increase the concentration of valine in the culture medium.
  • the final product is recovered from the culture upon completion of the biological production step.
  • This can be performed by any means.
  • enzymes and / or physical treatments are applied to lyse cells and release the final product.
  • the MMA end product can be separated from the cell culture by centrifugation, distillation, column separation, chromatography and other means known in the art.
  • the methodology described in US Pat. No. 8,907,121 Johnson and Morris, title of the invention is “Methyl methacrylate methacrylate purification process”) can be employed.
  • the precursor recovered from the culture can be further processed to convert the precursor to a methacrylic ester.
  • 3-HIB can be converted to MMA by treatment with an enzyme.
  • the dehydration of 3-HIB to MMA can be accomplished, for example, as described in the literature [Nagai, “New Developments, in the production, Methyl, Methacrylate,“ Applied, Catalysis, A: General, 221 (2001), 367-377].
  • the method of the present invention can also be used for the production of methacrylic acid esters or precursors thereof from biomass.
  • metabolic engineering transformation
  • transfer can be performed from biomass by using a transformant introduced with an enzyme gene group capable of synthesizing a target methacrylate ester or its precursor from biomass. Therefore, it is possible to directly synthesize methacrylic acid or methacrylic acid ester.
  • Mitochondrial expression of pathway genes Expressing heterologous genes in the cytoplasm as they are, or adding the first 69 residues of subunit 9 (Su9) of yeast mitochondrial ATPase encoded by SEQ ID NO: 1 to each gene To target and expressed.
  • plasmid pYES leader peptide, plasmid, GAL1 promoter, CYCT terminator and GFP, all provided by the following paper: Westermann, B. and Neupert, W. (2000) Yeast 16: 1421-1427
  • a construct was transformed into Saccharomyces cerevisiae (CKY263) and grown overnight in uracil-deficient glucose supplemented synthetic defined medium (SD-CAA). At 24 hours, cultures were diluted 100-fold and these were grown in galactose supplemented SD-CAA for 24 hours.
  • MMA enzyme expression cassettes BCKAD, ACD, ECH, HCH targeted to mitochondria (mtMMA) or cytoplasm (MMA), pBCKAD4-pRS315 backbone (LEU) containing pRS-based vectors (bkdA1, bkdA2, bkdB, IpdV; pACD1-pRS316 backbone (URA) with acd1; and pCoA2-pRS314 backbone (TRP) containing echA and hchA).
  • plasmids were transformed into vacuolar protease-deficient Saccharomyces cerevisiae strain BJ5464. After an induction period of 48 hours with SD-CAA supplemented with uracil, leucine and tryptophan deficient galactose, cells were harvested, physically disrupted with Tris buffer, and the lysate was centrifuged. Subsequently, the enzyme activity was measured in real time as described below for the lysate.
  • ACD assay 100 mM potassium phosphate pH 8.0 1.0 mM N-ethylmaleimide 0.03 mM isobutyryl CoA 0.4 mM flavin adenine dinucleotide (FAD) 1. 6 mM phenazine methosulfate (PMS) 0.035 mM 2,6-dichlorophenolindophenol (DCPIP) + Samples at room temperature culture activity ACD reduces the DCPIP, reduce A 600
  • BCKAD assay 100mM potassium phosphate pH7.0 1 mM MgCl 2 0.2 mM thiamine pyrophosphate (TPP) 4 mM 2-oxoisovaleric acid 0.2 mM CoASH / 2 mM DTT 2 mM NAD + 2 mM L-valine + sample room temperature culture Active BCKAD decreases NAD + and increases A 340
  • the present invention is useful for synthesizing methacrylic acid esters including MMA and acrylic resins which are polymers thereof.

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Abstract

本発明は、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入された組換え真核微生物、及び前記微生物を用いたＭＭＡ及びＭＭＡ－ＣｏＡ等のメタクリル酸エステル及びその前駆体の製造方法に関する。

Description

メチルメタクリレートの生物生産
［関連出願］
　本出願は、米国仮出願６２／２４５９８０号（２０１５年１０月２３日出願）に基づく優先権を主張しており、この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
［技術分野］
　本発明は、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入された組換え真核微生物、及び前記微生物を用いたメタクリル酸エステル及びその前駆体の製造方法に関する。
　メチルメタクリレート（ＭＭＡ）は、アクリルポリマーの製造において重要な原料である。ＭＭＡは、伝統的には環境に影響を与える危険原料（non-sustainable hazardous raw materials）、例えばアセトン及びシアン化水素から製造される。従って、環境にやさしい（sustainable）、無毒性の（non-toxic）製造方法に依存するＭＭＡ製造方法が、当該分野で必要とされている。
　そのような製造方法として、天然に存在する微生物を利用し、糖などの天然物からメタクリル酸の前駆体となる２－ヒドロキシイソ酪酸及び３－ヒドロキシイソ酪酸を生産する方法が提案されている（特許文献１、２及び非特許文献１参照）。しかし、これらの方法は、前駆体を脱水してメタクリル酸を生成する工程を依然として化学的な手法に依存するものである。
　また、複数の酵素遺伝子を導入した、天然に存在しない組換え微生物を用いてグルコースからメタクリル酸を生成する方法が提案されているが、これらは既知の酵素反応及びそれから類推される仮想の酵素反応を組み合わせたものであり、実証されたものではない（特許文献３～５参照）。特に特許文献５には、一般的なエステル生成活性を有する多種の生体触媒（加水分解酵素、ワックスエステル合成酵素、アルコールアセチルトランスフェラーゼ）が例示されているが、当該生体触媒がメタクリル酸エステルの合成活性を有することは示されていない。
　発明者らは、これまで生体触媒によるメタクリリルＣｏＡからのメタクリル酸エステルの製造方法（特許文献６）、及びメタクリル酸生産能を有する微生物にＡＡＴの作用を追加することにより、アルコール存在下でバイオマスからメタクリル酸エステルを製造する方法（特許文献７）を報告している。また、デヒドラターゼ遺伝子を導入した大腸菌を用いて３－ヒドロキシイソブチリルＣｏＡからメタクリリルＣｏＡを合成する方法（特許文献８）を報告している。
ＷＯ２００７／１１０３９４号 ＷＯ２００８／１４５７３７号 ＷＯ２００９／１３５０７４号 ＷＯ２０１１／０３１８９７号 ＷＯ２０１２／１３５７８９号 ＷＯ２０１４／０３８２１４号 ＷＯ２０１４／０３８２１６号 ＷＯ２０１５／０１５７８４号
Ｇｒｅｅｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２０１２，　１４，　１９４２－１９４８
　本発明の課題は、ＭＭＡなどのメタクリル酸エステルの新規な生物学的製造方法を提供することにある。
　大腸菌等の工業的に利用されている宿主では、外来性のメタクリリルＣｏＡ（ＭＡＡ－ＣｏＡ）生合成に関わる遺伝子を導入してもＭＡＡ－ＣｏＡを生成しない。これはＭＡＡ－ＣｏＡの生合成に関わる酵素のひとつであるアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼの電子受容体が大腸菌には存在しないことによると推定された。発明者らは、酵母細胞に外来性のアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することで、ＭＡＡ－ＣｏＡの生物学的製造に成功した。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（１０）に関する。
（１）アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ）をコードする遺伝子が導入された真核微生物。
（２）アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、シュードモナス（Pseudomonas）属、バシラス（Bacillus）属、スフィンゴバクテリウム(Sphingobacterium）属、コマモナス（Comamonas）属、ブレバンディモナス（Brevundimonas）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、オクロバクテリウム（Ochrobactrum）属、ペドバクター（Pedobacter）属、パエニバシラス（Paenibacillus）属、アクロモバクター（Achromobacter）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、シュワネラ（Shewanella）属、リストネラ（Listonella）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、メソリゾビウム（Mesorhizobium）属、リゾビウム（Rhizobium）属、パラコッカス（Paracoccus）属、キサントバクター（Xanthobacter）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、ゲオバシラス（Geobacillus）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、カンディダ（Candida）属又はアスペルギルス（Aspergillus）属から選ばれる少なくとも１種に由来する遺伝子である、（１）記載の真核微生物。
（３）アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼがミトコンドリアにて機能を発現するように、シグナル配列を付加されたアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された（１）又は（２）に記載の真核微生物。
（４）シグナル配列が配列番号１で示される配列を含む、（３）に記載の真核微生物。
（５）真核微生物が酵母である、（１）～（４）のいずれかに記載の真核微生物。
（６）さらに、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子、ヒドロキシアシルＣｏＡヒドロラーゼをコードする遺伝子、チオエステラーゼをコードする遺伝子、及びアルコールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子から選ばれる少なくとも一種の外因性遺伝子を含む、（１）～（４）のいずれかに記載の真核微生物。
（７）（６）に記載の真核微生物を用いて、バリンからメタクリリルＣｏＡを製造する方法。
（８）（６）に記載の真核微生物を用いて、バリンから３－ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを製造する方法。
（９）（６）に記載の真核微生物を用いて、バリンから３－ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法。
（１０）（６）に記載の真核微生物を用いて、バリンからメタクリル酸エステルを製造する方法。
　本願では、ＭＭＡ又はＭＭＡ前駆体の製造を可能にする、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む一つ以上の酵素遺伝子が真核微生物に導入された組換え微生物によるＭＭＡ及びＭＭＡ前駆体の生物学的製造のための新規な方法が提供される。ここで、ＭＭＡ又はＭＭＡ前駆体の製造を可能にするアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む一つ以上の酵素遺伝子が微生物に導入されるが、任意には、一つ以上の酵素がミトコンドリアに標的化される。酵素のミトコンドリア標的化は、ＭＭＡ又はＭＭＡ前駆体がミトコンドリアのエネルギー的、酵素的及びその他の好適な特徴を生かし、収率の高い生合成プロセスを可能にする。本発明の一実施形態において、バリン生合成及び分解に関わる様々な酵素遺伝子が、宿主真核微生物に導入され、一つ以上の酵素が任意にはミトコンドリアに標的化され、ここで一連の反応を通じてこれらがＭＭＡ前駆体又はＭＭＡをバリンから生産される。本発明の目的は、宿主の形質転換用の新規な遺伝子ベクター、ＭＭＡ前駆体又はＭＭＡの合成を可能にする酵素を発現する新規な真核微生物菌株及び本発明の組換え微生物により生産されるＭＭＡを含む。
　本発明によれば、メタクリリルＣｏＡ（ＭＡＡ－ＣｏＡ）などのメタクリル酸エステル前駆体の生物学的製造が提供される。ＭＡＡ前駆体はＭＡＡをはじめとするメタクリル酸エステルに生物学的に変換され、メタクリル酸エステルのバイオ一貫製造が可能になる。本発明の方法は、バイオマスなどの有機原料を用いた生物学的生産であるため、環境を破壊することなく無毒にメタクリル酸エステルを製造することができる。また、得られるメタクリル酸エステルは水に不溶性であるため、発酵生産物から容易に回収・精製でき、メタクリル酸エステルの低コスト製造を可能にする。
図１は、バリンからＭＭＡ前駆体又はＭＭＡを生産するための合成経路の概要である。 図２は、実施例1に記載された発明の実施形態における合成経路及び実験結果を示す。ＡＣＤ活性の比色分析。反応の進行は６００ｎｍにおける吸収の減少率でリアルタイムにモニターした。 図３は、実施例1に記載された発明の実施形態における合成経路及び実験結果を示す。縦軸は、細胞質（ＭＭＡ）とミトコンドリア（ｍｔＭＭＡ）における４８時間発現／誘導後のＳ．セレビシエで発現させた組換えＡＣＤ（ａｃｄ１）の活性を示す。 図４は、実施例1に記載された発明の実施形態における合成経路及び実験結果を示す。ＢＣＫＡＤ活性の分光学的分析。反応の進行は３４０ｎｍにおける吸収の減少率でリアルタイムにモニターした。 図５は、実施例1に記載された発明の実施形態における合成経路及び実験結果を示す。縦軸は、細胞質（ＭＭＡ）とミトコンドリア（ｍｔＭＭＡ）における４８時間発現／誘導後のＳ．セレビシエで発現させた組換えＢＤＫＡＤ（ｂｋｄＡ１、ｂｋｄＡ２、ＩｐｄＶ、ｂｋｄＢ）の活性を示す。
第1部：ＭＭＡ及びＭＭＡ前駆体を生産することができる微生物
　本発明は、様々な生合成経路によりメチルメタクリレート（ＭＭＡ）などのメタクリル酸エステル又はその前駆体であるメタクリリルＣｏＡ（ＭＡＡ－ＣｏＡ）及び３－ヒドロキシイソ酪酸（３－ＨＩＢ）等を生産する、組換え微生物を含む。メタクリル酸エステル及びその前駆体（例えば、ＭＭＡ及びＭＭＡ前駆体）は、本願において“最終産物”と総称される。上記生合成経路は、下記に記載されるように、酵素機能（enzyme capabilities）の適切なセットを保有するように組換え微生物ではたらく数多くの酵素工程を含む。
　本発明において、「メタクリル酸」（ＩＵＰＡＣ名：２－メチル－２－プロペン酸）は、その任意の塩あるいはイオン化した形態をも含む。メタクリル酸の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩などが挙げられる。
　「メタクリル酸エステル」とは、式１で示される化合物である。式１において、Ｒは直鎖あるいは分岐の炭素数１～２０の炭化水素基を表す。炭化水素基は、飽和又は不飽和の非環式であってもよく、飽和又は不飽和の環式であってもよい。好ましくは直鎖あるいは分岐鎖の炭素数１～１０の無置換のアルキル基、アラルキル基又はアリール基である。特に好ましくはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、２－ヘキシル基、ジメチルブチル基、エチルブチル基、ヘプチル基、オクチル基及び２－エチルヘキシル基の炭素数１～８のアルキル基、ベンジル基又はフェニル基である。
　ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ－Ｒ　　（式１）
　「メタクリル酸エステル前駆体」としては、メタクリリルＣｏＡ、３－ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ、３－ヒドロキシイソ酪酸、イソブチリルＣｏＡを挙げることができる。
　組換え微生物
　本発明は、最終産物であるメタクリル酸エステルやその前駆体を生産する様々な組換え真核微生物を含む。あるいは、本発明の組換え真核微生物は、メタクリル酸エステルを直接生産する真核微生物を含み得る。
　微生物（宿主細胞）
　本発明の組換え真核微生物は、下記に記載された様々な酵素機能に対する宿主として提供するための、“宿主”又は“宿主細胞”と称される細胞を含む。宿主細胞は、任意の種であり得る。宿主系の例には、酵母、糸状菌、藻類等を含む。宿主として提供され得る種の例には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）、アスペルギルス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）などが含まれる。
　好ましい微生物（宿主細胞）は酵母である。酵母としては、たとえば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などのサッカロマイセス（Saccharomyces）属菌、シゾサッカロマイセス（Shizosaccharomyces）属菌、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などのピキア（Pichia）属菌、キャンディダ・トロピカリス（Candidatropicalis）、キャンディダ・リポリティカ（Candida lypolitica）、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）、キャンディダ・サケ（Candida sake）などのキャンディダ（Candida）属菌、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属菌、ウィリオプシス（Williopsis）属菌、デバリオマイセス（Debaryomyces）属菌、ガラクトマイセス（Galactomyces）属菌、トルラスポラ（Torulaspora）属菌、ロドトルラ（Rhodotorula）属菌、ヤロウィア（Yarrowia）属菌、ジゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属菌などが挙げられる。これらのなかでも、サッカロマイセス属菌が好ましく、サッカロマイセス・セレビシエがより好ましい。
　好ましい宿主種は、最終産物は大規模生産で合成でき、低費用で回収でき、それらの最終産物が生産された細胞から分離できるように、細胞培養が可能であるか、又は生物生産に適合しなければならない。
　形質転換方法
　本発明の宿主細胞は、任意の個数の異なる酵素タンパク質、調節配列及びその他の遺伝子及び遺伝子産物を発現するように形質転換され得る。形質転換は、選別された宿主微生物で利用可能な当該分野で公知の任意の手段により実行しうる。例えば酵母では、アルカリ性カチオン性形質転換プロトコル、例えば一本鎖の担体ＤＮＡ及びポリエチレングリコールと組み合せたリチウムアセテートを用いることができる。宿主細胞形質転換のために採用できるその他の形質転換技法の例としては、当該分野で公知の化学的形質転換方法（例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリエチレンイミン、デンドリマー、ポリブレン、カルシウムホスフェート、リポフェクチン、ＤＯＴＯＰ、リポフェクタミン又はＣＴＡＢ／ＤＯＰＥ、ＤＯＴＭＡ）；又は物理的形質転換方法（例えば、注入、遺伝子衝撃、又はレーザー補助形質誘導、微細針、遺伝子銃など）が挙げられる。本発明の組換え微生物は一過性に形質転換されてもよいし、安定的に形質転換されてもよい。
　遺伝子構築物
　宿主微生物に導入される酵素遺伝子及び／又は付随する調節配列は様々な方法で配置できる。宿主微生物における外来遺伝子の異種発現は、当該分野で公知のとおり、該当遺伝子が宿主で適切に転写及び翻訳されるようにコドン最適化及びその他の配列改変がなされる必要があることが理解される。また、局在シグナル、プロモータ及び酵素遺伝子配列と組み合わせられ得るその他の要素が、当該分野で公知のとおり、宿主微生物で有効に選別及び変更されなければならない。
　宿主微生物に導入される酵素遺伝子は、一般的にプロモータ配列の下流に連結される。一部の実施形態では、一定に高い水準の発現を保障するために、構成的プロモータが酵素遺伝子と共に用いられる。構成的プロモータの例としては、酵母に対するＴＥＦ1及びＧＤＳプロモータ等が含まれる。あるいは、酵素遺伝子は、誘導可能なプロモータの制御下に配置してもよい。例えば、一部の実施形態では、最終産物製造において各酵素ステップを時系列的に作動させるために、宿主微生物で働く既知の誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。例えば、ＧＡＬ１０及びＧＡＬ１ガラクトース誘導性プロモータが酵母で使用され得る。
　局在シグナル
　また、宿主微生物に導入された酵素遺伝子は、特定の細胞区画への局在を指令するトラフィッキングシグナルを含み得る。例えば、酵素をミトコンドリア区画、細胞膜又は葉緑体に局在させるシグナルが、酵素タンパク質のコーディング遺伝子配列に連結され得る。本発明の範囲は、宿主に導入された一つ以上の酵素がミトコンドリア、例えばミトコンドリアのマトリックスに標的化されるように遺伝子操作された宿主を含む。酵母でこのような標的化を達成できるシグナル配列の例には、酵母ミトコンドリアＡＴＰａｓｅのサブユニット９（Ｓｕ９）のプレ配列（配列番号１）又は酵母シトクロムＣオキシダーゼのサブユニットＩＶ（Ｃｏｘ１）のプレ配列（文献［Avalos et al., Compartmentalization of metabolic pathways in yeast mitochondria improves the production of branched-chain alcohols. Nature Biotechnol. 2013, pr;31 (4 ):335-41．2013，pr；31(4)：335－41］が含まれる。また、ミトコンドリア標的化配列の例には、ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）フラビンタンパク質２（ＮＤＵＦＶ２）のプレ配列（残基19－40）；インフルエンザウイルスタンパク質（ＰＢ２）のプレ配列（残基1－20）、酵母トリプトファニルｔＲＮＡ－シンテターゼ（ＭＳＷ）のプレ配列及び文献［Omura, "Mitochondria-Targeting Sequence, a Multi-Role Sorting Sequence Recognized at All Steps of Protein Import into Mitochondria," Journal of Biochemistry. 1998, Vol. 123 Issue 6, p1010-1016. 7p］に記載された配列が含まれる。一部の実施形態において、酵素の遺伝子は、細胞質において機能し、シグナル配列は用いられない。他の実施形態において、一つ以上の発現された酵素タンパク質は、細胞から分泌されるように設計され、このようなタンパク質をコードする遺伝子配列は、翻訳されたタンパク質が細胞外に向かうように分泌シグナルに連結されている。
　一部の実施形態において、終結配列が用いられる。例えば、酵母で、ＣＹＣＴ転写終結配列は、酵母細胞における適切な発現を強化する酵素タンパク質コーディング配列の下流に連結され得る。使用され得るその他の調節エレメントの例には大腸菌由来のｒｒｎＢ（Ｔ１）エレメント、酵母由来のＡｄｈＴエレメント、及び酵母由来のＴＥＦ１エレメントが含まれる。
　下記に記載された酵素機能は、様々な核酸構築物を用いた宿主微生物の形質転換により導入され得ることが理解される。本発明の核酸構築物の例には、プラスミド及び直鎖状核酸が含まれ、これはクローニングベクター、発現カセット及び当該分野で公知のその他のＤＮＡ構築物を含み得る。
　二つ以上の酵素遺伝子の発現のために形質転換される、与えられた宿主微生物に対して、このような二つ以上の酵素遺伝子は、単一核酸構築物として微生物に導入され得るか、又は別々の核酸構築物で導入され得る。二つ以上の別々の核酸構築物が用いられる場合、微生物の形質転換は、二つ以上の核酸構築物を同時に形質転換する方法、又は二つ以上の核酸構築物を連続的に形質転換する方法が取られる。
　宿主微生物に導入される遺伝子は、異なるプロモータの制御下にあり得ることが理解される。例えば、酵素の相対的な割合が調整されなければならない場合、一部は弱いプロモータの制御下にあり、一部はさらに強力なプロモータの制御下にあるようにして、細胞内で酵素活性の所望のバランスをなすことができる。同様に、酵素活性は宿主微生物に導入される様々な酵素遺伝子のコピーの数を多様化して、バランスを取ることができる。例えば、遺伝子は、単一コピーとして、又は二、三、四又はそれ以上のコピーとして、例えば単一核酸構築物上の末端－対－末端コピーとして導入され得る。
　遺伝子等価物
　本願では、様々な酵素遺伝子、タンパク質及びその他の遺伝性／タンパク性因子が用いられる。当業者は、本願に列挙又は言及された遺伝子及びタンパク質配列の代わりに、それらの等価物を用いることができる。例えば、核酸配列変異体及びペプチド配列変異体を含む、言及された配列の変異体が使用され得る。
　例えば、１又は数個、たとえば１～１０個、１～６個、１～４個、１～３個、１又は２個の置換、付加、挿入及び欠失を含むヌクレオチド及び／又はアミノ酸置換が列挙された配列に導入され得る。
　あるいは、言及された配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の配列同一性を有する核酸配列又はアミノ酸配列を有する遺伝子やタンパク質が含まれる。
　本来配列のこのような変更は、ニュートラルでも、又は標的遺伝子の所望の酵素活性を変更（例えば、強化）するものであってもよい。また、遺伝子等価物には、その他の種由来の列挙された配列のオルトログ、パラログ及びホモログが含まれる。一実施形態において、本発明の等価遺伝子は、野生型類型配列及び変異体の間に９０％以上の配列同一性又は類似性を有した遺伝子を含む。なお、列挙された遺伝子配列の機能的等価物が使用され得るが、そのような機能的等価物は酵素又は調節シグナルと同一の酵素機能を有するものであって、必ずしも配列類似性、同一性又は相同性を有するものではない。
　酵素機能
　本発明の組換え微生物は、特定の“酵素機能”を含むものと本願に言及される。特定の酵素機能を有することは、微生物が特定の反応物から特定の産物を生産する能力を有することを意味し、このような能力は反応物を生成物に変換するように指令される一つ以上の酵素の発現により可能になり得る。
　一部の実施形態において、微生物により保有される一つ以上の酵素機能は、このような酵素機能に対する（例えば下記に記載されたような酵素機能2を含むマルチマーＢＣＫＡＤ酵素のような）必須的なタンパク質又は多重タンパク質を発現するように形質転換された微生物の結果である。一部の実施形態において、本発明の組換え微生物により保有される酵素機能全部が、遺伝子形質転換による必須タンパク質の導入により付与される。一部の実施形態において、本発明の組換え微生物により保有される一つ以上の酵素機能は、本来の酵素機能を含み、即ち、宿主微生物の本来の酵素機能は、導入される遺伝子による補充なく、活性を付与することができる。例えば、一部の微生物で、酵素機能2は、本来のＢＣＫＡＤ遺伝子の作用を通じて微生物により保有される。
　一実施形態において、形質転換により導入される一つ以上のタンパク質が、細胞区画又は細胞小器官に標的化される。一実施形態において、微生物への形質転換により導入されるタンパク質の一つ以上又は全部は、ミトコンドリアに標的化される。一実施形態において、ミトコンドリア－標的化タンパク質は、ミトコンドリアマトリックスに標的化される。一実施形態において、宿主細胞は酵母細胞であり、ミトコンドリア－標的化タンパク質は、Ｓｕ９又はＣｏｘ１ミトコンドリア標的化配列を含む標的化部分を含む。
　最終産物の形成のための経路は、図1に図示されるように大幅に重複する。
　例えば、三つの酵素ステップがバリンをＭＡＡ－ＣｏＡに変換させ、これは生体外で回収及び追加加工されてＭＭＡを提供することができる。あるいは、ＭＡＡ－ＣｏＡ生産微生物は、ＭＡＡ－ＣｏＡが３－ＨＩＢ又はＭＭＡに直接変換されるようにする追加的な酵素機能を含み得る。微生物により形成された3－ＨＩＢは、生体外で回収及び加工され、ＭＭＡを形成することができる。
　ＭＭＡ及び３－ＨＩＢの効率的形成は、自然界の微生物では認められず、組換え微生物におけるこれらの合成経路は、広範囲な微生物で共通的なバリン合成及び異化経路を基盤とする。従って、所望の酵素機能を付与するために当業者が利用可能な様々な酵素セットがある。ＭＭＡ及び３－ＨＩＢの形成を可能にする特異的酵素機能は、以後に詳細に記載される。
　酵素機能１：バリンから2－オキソイソ吉草酸の生産
　バリンのＭＡＡ前駆体への変換における第1の酵素ステップは、バリンから2－オキソイソ吉草酸の形成である。これは分枝鎖アミノトランスフェラーゼ酵素（ＢＣＡＴ）の作用により実行され得る。一部の場合、内因性ＢＣＡＴ活性又は等価の酵素活性が存在し、ＭＭＡ前駆体の合成のためにバリンから適切な2－オキソイソ吉草酸を生産するのに十分である。あるいは、宿主微生物は、一つ以上のＢＣＡＴ又は同等な遺伝子の発現のために形質変換され得る。ＢＣＡＴ遺伝子の例には、サッカロマイセス・セレビシエのＢＡＴ１及びＢＡＴ２遺伝子が含まれる。使用され得る追加的なＢＣＡＴ遺伝子には、表１に収録されたものが含まれる。
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　酵素機能２：2－オキソイソ吉草酸のイソブチリルＣｏＡへの脱カルボキシル化
　バリンからＭＡＡ前駆体の生物生産における第2のステップは、2－オキソイソ吉草酸のイソブチリルＣｏＡへの脱カルボキシル化である。このようなステップは、分枝鎖α－ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＡＤ）複合体により実行され得る。ＢＣＫＡＤ複合体は、４つのサブユニット、Ｅ１サブユニット、Ｅ２サブユニット、Ｅ３サブユニット及びジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼを含む。
　一部の実施形態において、2－オキソイソ吉草酸をイソブチリルＣｏＡに変換するのに、十分なＢＣＫＡＤ又は同等な活性が宿主微生物に存在する。例えば、実施例1に記載された通り、遺伝子操作された酵母細胞はＢＣＫＡＤ遺伝子の導入なしでも十分なＭＭＡ前駆体を生産し、十分な本来の活性が宿主に存在することを示している。
　あるいは、宿主は、2－オキソイソ吉草酸のイソブチリルＣｏＡへの脱カルボキシル化を行う１以上の酵素を発現するように形質転換され得る。例えば、宿主微生物は、ＢＣＫＡＤ複合体の４つの内容物を発現するように遺伝子操作され得る。例えば、シュードモナス・アエルギノーザＢＣＫＡＤ複合体をコードする４つの遺伝子が本来のＢＣＫＡＤ活性を付与するか、又は増幅するために宿主に導入され得る。これには下記のものが含まれる：Ｅ１をコードするｂｋｄＡ1遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ250937）、Ｅ３をコードするｂｋｄＡ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿250938）、Ｅ２をコードするｂｋｄＢ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ250939）及びジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼをコードするＩｐｄＶ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ250940）。あるいは、宿主は、表２から選択されるｂｋｄＡ1遺伝子、表３から選択されるｂｋｄＡ２遺伝子、表４から選択されるｂｋｄＢ遺伝子、及び表５から選択されるＩｐｄＶ遺伝子を発現するように形質転換され得る。
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　酵素機能３：イソブチリルＣｏＡのメタクリリルＣｏＡへの酸化
　ＭＭＡ前駆体生物生産プロセスにおける第3のステップは、イソブチリルＣｏＡのメタクリリルＣｏＡ（ＭＡＡ－ＣｏＡ）への酸化である。このようなステップは適合した酵素、例えばイソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼにより実行され得る。
　宿主微生物は、一つ以上のイソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ又は同等な酵素を発現するように形質転換され得る。例えば、宿主微生物は、シュードモナス・アエルギノーザＡＣＤ1遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿249437）又は同等な遺伝子を発現するように遺伝子操作され得る。使用され得るその他のイソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼは、表６に収録されている。
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　酵素機能４：ＭＡＡ－ＣｏＡから3－ヒドロキシイソブチリルＣｏＡ
　バリンから３－ＨＩＢの生物生産で、一つのステップは、ＭＡＡ－ＣｏＡから3－ヒドロキシイソブチリルＣｏＡへの変換である。これは、適合した酵素、例えばエノイルＣｏＡヒドラターゼにより実行され得る。
　宿主微生物は、一つ以上のエノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣＨ）又は同等な酵素を発現するように形質転換され得る。例えば、宿主微生物は、シュードモナス・アエルギノーザｅｃｈＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿249436）又は同等な遺伝子を発現するように遺伝子操作され得る。あるいは、表６から選択されるＥＣＨ遺伝子が使用され得る。
　酵素機能５：３－ヒドロキシイソブチリルＣｏＡから３－ＨＩＢ
　バリンから３－ＨＩＢの生物生産で、最終酵素ステップは、３－ヒドロキシイソブチリルからＣｏＡを除去することによる３－ヒドロキシイソブチリルＣｏＡから３－ＨＩＢへの変換である。これは適合した酵素、例えばチオエステラーゼにより実行され得る。
　宿主微生物は、３－ヒドロキシイソブチリルＣｏＡからＣｏＡを除去する一つ以上の酵素を発現するように形質転換され得る。例えば、宿主微生物は、ＣｏＡを3－ヒドロキシイソブチリルＣｏＡから切断する一つ以上のチオエステラーゼ酵素（ＨＣＨ遺伝子）を発現するように形質転換され得る。例えば、宿主微生物は、シュードモナス・アエルギノーザｈｃｈＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿249435）又は同等な遺伝子を発現するように遺伝子操作され得る。あるいは、表７から選択されるＨＣＨ遺伝子が使用され得る。
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　酵素機能６：ＭＡＡ－ＣｏＡからＭＭＡ
　酵素機能６は、ＣｏＡをＭＡＡ－ＣｏＡから切断してＭＡＡ－ＣｏＡをＭＭＡに変換する能力を含む。このような活性は、アルコールアシルトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）酵素により付与され得る。一実施形態において、ＡＡＴ酵素はマルスプミラ（Ｍａｌｕｓ　ｐｕｍｉｌａ）ＡＡＴ遺伝子によりコーディングされる。一実施形態において、宿主微生物は、酵母である。他の実施形態において、宿主微生物は、酵母であり、ＡＡＴ遺伝子は、酵母における発現にコドン－最適化されたマルスプミラＡＡＴ遺伝子、例えば配列番号２を含むＡＡＴ遺伝子である。あるいは、表８から選択されるＡＡＴ遺伝子が使用され得る。
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　酵素機能
　本発明において、上記した酵素（酵素をコードする遺伝子）の由来としては、シュードモナス（Pseudomonas）属、バシラス（Bacillus）属、スフィンゴバクテリウム(Sphingobacterium）属、コマモナス（Comamonas）属、ブレバンディモナス（Brevundimonas）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、オクロバクテリウム（Ochrobactrum）属、ペドバクター（Pedobacter）属、パエニバシラス（Paenibacillus）属、アクロモバクター（Achromobacter）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、シュワネラ（Shewanella）属、リストネラ（Listonella）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、メソリゾビウム（Mesorhizobium）属、リゾビウム（Rhizobium）属、パラコッカス（Paracoccus）属、キサントバクター（Xanthobacter）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、ゲオバシラス（Geobacillus）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、カンディダ（Candida）属又はアスペルギルス（Aspergillus）が挙げられる。なかでも、シュードモナス属及びロドコッカス属微生物が好ましい。
　シュードモナス属に分類される微生物として、例えば、シュードモナス　エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス　アガリシ（Pseudomonas agarici）、シュードモナス　アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes）、シュードモナス　アミグダレ（Pseudomonas amygdale）、シュードモナス　アングイリセプチカ（Pseudomonas anguiliseptica）、シュードモナス　アンチミクロビカ（Pseudomonas antimicrobica）、シュードモナス　アスプレニ（Pseudomonas aspleni）、シュードモナス　オーランチアカ（Pseudomonas aurantiaca）、シュードモナス　オーレオファシエンス（Pseudomonas aureofaciens）、シュードモナス　アベラナエ（Pseudomonas avellanae）、シュードモナス　アゾトフォルマンス（Pseudomonas azotoformans）、シュードモナス　バレアリカ（Pseudomonas balearica）、シュードモナス　ベイジェリンスキイ（Pseudomonas beijerinsckii）、シュードモナス　ベテリ（Pseudomonas beteli）、シュードモナス　ボレオポリス（Pseudomonas boreopolis）、シュードモナス　カルボキシヒドロゲナ（Pseudomonas carboxyhydrogena）、シュードモナス　カリカパパヤエ（Pseudomonas caricapapayae）、シュードモナス　シコリイ（Pseudomonas cichorii）、シュードモナス　シッシコラ（Pseudomonas cissicola）、シュードモナス　シトロネロリス（Pseudomonas citronellolis）、シュードモナス　コロナファシエンス（Pseudomonas coronafaciens）、シュードモナス　コルガテ（Pseudomonas corrugate）、シュードモナス　ドゥードロフィイ（Pseudomonas doudoroffii）、シュードモナス　エキノイズス（Pseudomonas echinoids）、シュードモナス　エロンガテ（Pseudomonas elongate）、シュードモナス　フィクセレクタエ（Pseudomonas ficuserectae）、シュードモナス　フラベッセンス（Pseudomonas flavescens）、シュードモナス　フレクテンス（Pseudomonas flectens）、シュードモナス　フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス　フラギ（Pseudomonas fragi）、シュードモナス　フルバ（Pseudomonas fulva）、シュードモナス　フスコバギナエ（Pseudomonas fuscovaginae）、シュードモナス　ゲリディコラ（Pseudomonas gelidicola）、シュードモナス　ゲニクラタ（Pseudomonas geniculata）、シュードモナス　グラテイ（Pseudomonas glathei）、シュードモナス　ハロフィラ（Pseudomonas halophila）、シュードモナス　ヒビシコラ（Pseudomonas hibiscicola）、シュードモナス　フッチエンシス（Pseudomonas huttiensis）、シュードモナス　イネルス（Pseudomonas iners）、シュードモナス　ランセロタ（Pseudomonas lancelota）、シュードモナス　レモイグネイ（Pseudomonas lemoignei）、シュードモナス　ルンデンシス（Pseudomonas lundensis）、シュードモナス　ルテオラ（Pseudomonas luteola）、シュードモナス　マルギナリス（Pseudomonas marginalis）、シュードモナス　メリアエ（Pseudomonas meliae）、シュードモナス　メンドシナ（Pseudomonas mendocina）、シュードモナス　ムシドレンス（Pseudomonas mucidolens）、シュードモナス　モンテイリ（Pseudomonas monteilli）、シュードモナス　ナウチカ（Pseudomonas nautica）、シュードモナス　ニトロレデュセンス（Pseudomonas nitroreducens）、シュードモナス　オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）、シュードモナス　オリジハビタンス（Pseudomonas oryzihabitans）、シュードモナス　パーツシノゲナ（Pseudomonas pertucinogena）、シュードモナス　フェナジニウム（Pseudomonas phenazinium）、シュードモナス　ピクトルム（Pseudomonas pictorum）、シュードモナス　シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）、シュードモナス　プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス　ピロシニア（Pseudomonas pyrrocinia）、シュードモナス　レシノボランス（Pseudomonas resinovorans）、シュードモナス　ローデシアエ（Pseudomonas rhodesiae）、シュードモナス　サッカロフィラ（Pseudomonas saccharophila）、シュードモナス　サバスタノイ（Pseudomonas savastanoi）、シュードモナス　スピノサ（Pseudomonas spinosa）、シュードモナス　スタニエリ（Pseudomonas stanieri）、シュードモナス　ストラミナエ（Pseudomonas straminae）、シュードモナス　スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）、シュードモナス　シンキサンタ（Pseudomonas synxantha）、シュードモナス　シリンガエ（Pseudomonas syringae）、シュードモナス　シジギイ（Pseudomonas syzygii）、シュードモナス　タエロレンス（Pseudomonas taetrolens）、シュードモナス　トラアシイ（Pseudomonas tolaasii）、シュードモナス　ベロニイ（Pseudomonas veronii）、シュードモナス　ビリディフラバ（Pseudomonas viridiflava）、シュードモナス　ブルガリス（Pseudomonas vulgaris）、シュードモナス　ウィスコンシエンシス（Pseudomonas wisconsinensis）等が挙げられる。
　ロドコッカス属に分類される微生物としては、例えば、ロドコッカス　ロドクロウス（Rhodococcus rhodocrous）、ロドコッカス　エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、ロドコッカス　エクイ（Rhodococcus equi）、ロドコッカス　オパカス（Rhodococcus opacus）、ロドコッカス　ジョスティイ（Rhodococcus jostii）、　ロドコッカス ピリジノボランス（Rhodococcus pyridinovorans）、ロドコッカス　ロドニ（Rhodococcus rhodnii）、ロドコッカス　コラリヌス（Rhodococcus corallinus）、ロドコッカス　ルブロペルチンクタス（Rhodococcus rubropertinctus）、ロドコッカス　コプロフィラス（Rhodococcus coprophilus）、ロドコッカス　グロベルルス（Rhodococcus globerulus）、ロドコッカス　クロロフェノリカス（Rhodococcus chlorophenolicus）、ロドコッカス　ルテウス（Rhodococcus luteus）、ロドコッカス　アイシェンシス（Rhodococcus aichiensis）、ロドコッカス　チュブエンシス（Rhodococcus chubuensis）、ロドコッカス　マリス（Rhodococcus maris）、ロドコッカス　ファシエンス（Rhodococcus fascines）等が挙げられる。
　酵素をコードする遺伝子は、上記した微生物細胞より常法にしたがいＲＮＡを抽出し、ＮＣＢＩ等の公共のデータベース等に公開されている（当該微生物又は近縁種の）前記酵素のアミノ酸配列や遺伝子配列に基づいてプライマーを設計し、これを用いてＰＣＲを行うことで、目的とする酵素をコードする遺伝子を単離・増幅することができる。
　メタクリリルＣｏＡ生産微生物
　本発明は、バリンからＭＡＡ－ＣｏＡを生産することができる組換え微生物を含む。本発明のこのような組換え微生物は、上記のような酵素機能１、酵素機能２、酵素機能３を保有する微生物を含む。
　酵素は、細胞質で生産され得るか、又は任意のその他の細胞区画に標的化され得る。一実施形態において、形質転換により導入されてＭＡＡ－ＣｏＡ生産微生物により発現される酵素がミトコンドリアに標的化される。一実施形態において、ミトコンドリア－標的化酵素は、ミトコンドリアマトリックスに標的化される。一実施形態において、ミトコンドリア－標的化タンパク質はＳｕ9又はＣｏｘ1プレ配列を含む標的化部分を含む。一実施形態において、組換え微生物は、酵母である。一実施形態において、酵母はサッカロマイセス・セレビシエである。
　一実施形態において、組換え微生物は、一つ以上のアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ）を発現するように形質転換される。例えば、ＭＡＡ－ＣｏＡ生産微生物は、シュードモナス・アエルギノーザＡＣＤ１遺伝子を発現するように形質転換される。他の実施形態において、ＭＡＡ－ＣｏＡ生産微生物は、2－オキソイソ吉草酸のイソブチリルＣｏＡへの脱カルボキシラーゼを触媒する一つ以上の酵素を発現するように形質転換される。例えば、ＭＡＡ－ＣｏＡ生産微生物は、ＢＣＫＡＤ複合体の構成要素のうち一つ、一部又は全部を発現するように形質転換される。他の実施形態において、本発明のＭＡＡ－ＣｏＡ生産微生物は、バリンから2－オキソイソ吉草酸の生成を触媒する一つ以上の酵素、例えば酵母由来のＢＣＡＴ１又はＢＣＡＴ２遺伝子を発現するように形質転換された微生物である。
　３－ＨＩＢ－生産微生物
　本発明の範囲はバリンから（Ｓ）－3－ヒドロキシイソ酪酸（３－ＨＩＢ）を生産するように遺伝子操作された宿主微生物を含む。３－ＨＩＢは、当該分野で公知となった様々な方法を用いてＭＭＡに容易に変換され得るＭＭＡ前駆体である。
　本発明の３－ＨＩＢ生産微生物は、酵素機能１、酵素機能２、酵素機能３、酵素機能４、及び酵素機能５を保有する微生物である。
　一実施形態において、本発明の３－ＨＩＢ－生産微生物は、ＥＣＨ遺伝子、例えばシュードモナス・アエルギノーザ由来のｅｃｈＡ遺伝子を発現するように形質転換された宿主細胞である。他の実施形態において、本発明の３－ＨＩＢ生産微生物は、3－ヒドロキシイソブチリルＣｏＡからＣｏＡを切断する一つ以上のＨＣＨ酵素を発現するように形質転換された宿主細胞である。例えば、３－ＨＩＢ生産微生物は、シュードモナス・アエルギノーザ由来のｈｃｈＡ遺伝子を発現する微生物を含み得る。一実施形態において、組換え微生物は、酵母である。一実施形態において、酵母はサッカロマイセス・セレビシエである。一実施形態において、形質転換により導入されてＭＡＡ－ＣｏＡ生産微生物により発現された酵素はミトコンドリアに標的化される。一実施形態において、ミトコンドリア－標的化酵素は、ミトコンドリアマトリックスに標的化される。一実施形態において、ミトコンドリア－標的化タンパク質は、Ｓｕ９又はＣｏｘ１マトリックス－標的化プレ配列を含む標的化部分を含む。
　ＭＭＡ生産微生物
　一実施形態において、本発明の組換え微生物は、ＭＭＡを生産することができる。本発明のＭＭＡ生産微生物は、酵素機能１、酵素機能２、酵素機能３、及び酵素機能６を保有する微生物を含む。一実施形態において、本発明のＭＭＡ生産微生物は、アルコールアシルトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）を発現するように、例えばリンゴ（Ｍａｌｕｓ　ｐｕｍｉｌａ）のＡＡＴ遺伝子を発現するように形質転換される。一実施形態において、ＡＡＴ遺伝子は、配列番号２によりコードされる。一実施形態において、ＭＭＡ生産微生物は、酵母である。一実施形態において、酵母はサッカロマイセス・セレビシエである。一実施形態において、ミトコンドリア－標的化酵素は、ミトコンドリアマトリックスに標的化される。一実施形態において、ミトコンドリア－標的化タンパク質は、Ｓｕ９プレ配列を含む標的化部分を含む。
　追加的な遺伝子改変
　上記の酵素機能の様々な組み合わせに加え、本発明の組換え微生物は、最終産物の形成促進のための遺伝子改変をさらに含み得る。例えば、最終産物の生物生産のための出発材料はバリンである。従って、一実施形態において、本発明の微生物は、野生型水準を超えて、バリンの形成を増強する一つ以上の酵素を発現するように遺伝子操作される。例えば、文献［Wada et al.,2008, Enhanced Valine Production in Corynebacterium glutamicum with Defective H+ -ATPase and C-Terminal Truncated Acetohydroxyacid Synthase,Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 72 (11):2959-65, 2008; Hasegawa et aI., 2013, Engineering of Corynebacterium glutamicum for high-yield L-valine production under oxygen deprivation conditions, Appl Environ Microbiol, 79(4 ):1250-7; and Park et al.,2007, Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of L-valine based on transcriptome analysis and in silico gene knockout simulation, PNAS 104 (19) 7799-7802］に記載された通り、様々な微生物でバリンの形成を増強するための様々な遺伝子改変が当該分野で公知となっている。バリンの形成を増強するために微生物に挿入された酵素又は調節遺伝子は、構成的プロモータ又は誘導プロモータの制御下にあり得る。
　一部の培養条件、例えば高度に通気させた酵母培養と同じ条件で、生合成経路、例えばエーリッヒ経路（Ｅｒｌｉｃｈ　ｐａｔｈｗａｙ）反応がＭＭＡ最終形成物の形成と競合する。一部の実施形態において、本発明の組換え微生物は、競合する生合成経路をダウンレギュレーション又は抹消するためにさらに遺伝子操作される。例えば、一実施形態において、本発明の生物組換え微生物が酵素機能1乃至6のうち任意のものと競合する酵素をダウンレギュレーションするか、又は標的化するｍｉＲＮＡ、又はその他の配列を発現するように遺伝子操作される。例えば、一実施形態において、本発明の微生物は、エーリッヒ経路反応を減少させる酵素又は調節遺伝子を用いて遺伝子操作される。他の実施形態において、宿主種に共に導入される酵素又は調節遺伝子は、バリン異化、例えばスクシニルＣｏＡを3－ＨＩＢ　ＣｏＡから形成する反応を阻害する遺伝子を含む。このような遺伝子は、誘導可能なプロモータの制御下にあるようになり、培養が増殖され生物生産モードに転換された後、ダウンレギュレーションが誘導されるようにすることができる。
　他の実施形態において、本発明の組換え微生物は、ＮＡＤＨ又はＦＡＤＨのような補助因子の再生産を強化する酵素又は調節配列を発現するようにさらに遺伝子操作される。例えば、一実施形態において、本発明の組換え微生物は、高い水準のアルコールデヒドロゲナーゼを発現するように形質転換され、ＮＡＤＰＨから、ＢＣＫＡＤ複合体の作用に必須的な補助因子であるＮＡＤＨ形成を促進する。同様に、ＦＡＤＨ２からＡＣＤの作用で補助因子であるＦＡＤの再生産速度を増加させる遺伝子改変が導入され得る。補助因子の取扱技法の例は、文献［Wang et al., "Engineering of cofactor regeneration enhances (2S,3S)-2,3-butanediol production from diacetyl," Sci Rep. 2013;3:2643. doi: 10.1 038/srep02643; Nikel et ai., "Elimination of D-Iactate synthesis increases poly(3-hydroxybutyrate) and ethanol synthesis from glycerol and affects cofactor distribution in recombinant Escherichia coli," Appl Environ Microbiol. 2010 Nov;76 (22):7400-6; Tseng and Prather, "Controlled biosynthesis of odd-chain fuels and chemicals via engineered modular metabolic pathways," Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Oct 30;109(44 ):17925-30; and Lopez de Felipe et ai., "Cofactor Engineering: a Novel Approach to Metabolic Engineering in Lactococcus /actis by Controlled Expression of NADH Oxidase," J Bacteriol. 1998 Aug; 180(15): 3804-3808］に記載されている。
　メタクリル酸エステル及びその前駆体の製造
　本発明の範囲は上記の組換え微生物を含み、ＭＭＡなどの最終産物生産のための、このような組換え微生物の使用方法をさらに含む。
　組換え微生物は、それらの微生物自体を増殖させ、メタクリル酸エステル又はその前駆体の最終産物を生産するように培養される。組換え微生物は、培養の持続的な増殖及び最終産物の同時回収のために連続培養条件下で培養できる。あるいは、微生物は、最終産物の形成のために慎重な培養（例えば、単一容器又は生物反応器）から回分式で培養後、最終産物回収のために加工できる。
　一部の実施形態において、組換え微生物の培養は、生長及び／又は増殖の第１ステップに続く生物生産ステップに、ステップ別に進行される。培養条件を変更しながら様々なステップが実行され得、ここで最初の生長及び増殖ステップは、組換え微生物の迅速な増殖及び生長を好む培地及び／又は培養条件の利用に続き、ＭＭＡ最終産物の形成を好む培養条件における変化により実施できる。
　例えば、一実施形態において、本発明の組換え微生物は、酵母であり、酵母培養の迅速な増殖及び生長を好む培養条件、例えば増殖培地のうち高い水準の栄養と共に、通気性の良い条件下で、まず増殖させる。前記増殖ステップには、生物生産ステップが後続し、ここで培養には通気をあまりしないか、又は全くせず、培養培地には、１以上の栄養素（例えば、微量の栄養素又は増殖を促進する炭素供給源）が欠乏している。
　培養温度又は培養時間等の各種条件は原料、用いる微生物、目的とする最終産物に応じて適宜決定され、特に制限はないが、通常５～８０℃で、１分～１週間反応させればよい。好ましくは、１０～７０℃で、１分～１２０時間であり、１０分以上がより好ましい。このような条件で反応が終了する条件を選択することが好ましい。反応液のｐＨについても反応が効率良く進行すれば特に限定されないが、例えば、ｐＨ４～１０の範囲、好ましくはｐＨ５．５～８．５である。
　効率的に反応を進行させる目的で、あらかじめ、有機溶剤を添加した系で培養することも可能である。有機溶媒としては、例えば直鎖状、分岐状又は環状の、飽和又は不飽和脂肪族炭化水素、飽和又は不飽和芳香族炭化水素等を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。具体的には、例えば、炭化水素系溶媒（例えばペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレンなど）、ハロゲン化炭化水素系溶媒（例えば塩化メチレン、クロロホルムなど）、エーテル系溶媒（例えばジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタンなど）、エステル系溶媒（例えばギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル）などが挙げられる。
　一実施形態において、生長及び増殖ステップに続いて、細胞が収集され、さらに高い生物生産を好む条件を有した培養容器に配置される。例えば、酵母細胞を遠心分離により生長及び増殖培養から分離した後、緩衝液中で洗浄し、新しい培養培地で再懸濁することができる。
　酵素機能を有する１以上のタンパク質が誘導可能なプロモータの制御下にある微生物で、誘導剤が生物生産ステップ時又は開始時に添加される。同様に、ＭＭＡ最終産物の形成と競合するか又は減少させる代謝経路の活性を減少又は抑制するために、こうした遺伝子が誘導性プロモーター制御下にあるように遺伝子操作された微生物が作製される。これらの培養された細胞は増殖ステップから生物生産ステップへの転換時に誘導剤に曝される。
　一部の実施形態において、バリンから最終産物の形成を増強するために、バリンが培養培地に添加される。他の実施形態において、生物生産培養ステップへの転換時、バリンが培養培地に添加される。他の実施形態において、バリン前駆体が増殖培地に含まれてバリンの形成を改善し、最終産物の形成速度の増加を促進する。同様に、遺伝子導入によりバリン生成が増加するように組換えられ、このような遺伝子が誘導可能なプロモータの制御下にある微生物で、誘導体は、生物生産ステップ頃又は開始時に導入され、最終産物の形成のための前駆体の量を増加させる。一部の実施形態において、本発明の組換え微生物は、バリンを生産するその他の菌株又は微生物と共同培養され、培養培地中のバリンの濃度を増加させる。
　培養の間、連続製造システムの場合、又は回分式培養の場合において、生物生産ステップの完了時、最終産物が培養から回収される。これは、任意の手段により実行され得る。例えば、一実施形態において、酵素及び／又は物理的処理が適用されて細胞を溶解し、最終産物を遊離する。ＭＭＡ最終産物は、遠心分離、蒸留、カラム分離、クロマトグラフィー及び当該分野で公知のその他の手段により細胞培養から分離できる。例えば、米国特許第8,907,121号（Johnson及びMorris、発明の名称は“Methyl methacrylate purification process”）に記載された方法論が採用できる。
　メタクリル酸エステル前駆体の場合、培養から回収された前駆体は、該前駆体をメタクリル酸エステルに変換するために、さらに処理され得る。３－ＨＩＢは、酵素で処理して、ＭＭＡに変換され得る。例えば、3－ＨＩＢのＭＭＡへの脱水は、例えば文献［Nagai, "New Developments in the Production of Methyl Methacrylate," Applied Catalysis A: General 221 (2001) 367-377］に記載された通り達成できる。
　本発明の方法は、バイオマスからのメタクリル酸エステル又はその前駆体の製造にも利用できる。アシルＣｏＡデヒドラターゼをコードする遺伝子に加えて、バイオマス等から目的とするメタクリル酸エステル又はその前駆体を合成しうる酵素遺伝子群を導入された形質転換体を用いることで、バイオマス等から代謝工学（発酵）的にメタクリル酸あるいはメタクリル酸エステルの直接合成が可能となる。
　本発明及び実施例１に記載された実験方法に関する追加的な詳細事項は、図２乃至５に提供されている。
　経路遺伝子のミトコンドリア発現
　異種起源遺伝子をそのまま細胞質において発現させるか、又は配列番号１でコードされる酵母ミトコンドリアＡＴＰａｓｅのサブユニット９（Ｓｕ９）の最初の69個の残基を各遺伝子に付加し、ミトコンドリアに標的化して発現させた。
　続いて、このような遺伝子の発現及び正しい標的化は、プラスミドｐＹＥＳ（リーダペプチド、プラスミド、ＧＡＬ1プロモータ、ＣＹＣＴターミネータ及びＧＦＰ、全て以下の論文から提供：Westermann, B. and Neupert, W. (2000). Yeast 16: 1421-1427）内部のＧＡＬ1プロモータから発現されるＣ－末端ＧＦＰ融合体を構築することによって評価した。このような構築物をサッカロマイセス・セレビシエ（ＣＫＹ263）に形質転換し、ウラシル欠乏グルコース補充合成規定培地（ＳＤ－ＣＡＡ）で一晩増殖させた。24時間目に、培養を100倍に希釈し、これらをガラクトース補充ＳＤ－ＣＡＡで24時間増殖させた。細胞を回収して、赤色蛍光ミトコンドリア－選別染料（Ｍｉｔｏ－ＩＤ　Ｒｅｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ－Ｃａｔ＃　ＥＮＺ－51007－500，Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ，　Ｍｌ）を用いて染色した。続いて、共焦点顕微鏡を用いて蛍光を検出した－ミトコンドリア特異的赤色蛍光とオーバーラップする非拡散性緑色蛍光を観察する。
　標的化ＭＭＡ経路遺伝子の組換え活性
　最初の二つの酵素ステップ（ＢＣＫＡＡＤ及びＡＣＤ）の活性を、ＧＦＰのない構築物を発現する細胞由来の粗酵素液を用いてインビトロの反応により確認した。ミトコンドリア（ｍｔＭＭＡ）又は細胞質に（ＭＭＡ）標的化されたＭＭＡ酵素発現カセット（ＢＣＫＡＤ、ＡＣＤ、ＥＣＨ、ＨＣＨ）を、ｐＲＳ系ベクター（ｂｋｄＡ1、ｂｋｄＡ2、ｂｋｄＢ、ＩｐｄＶを含むｐＢＣＫＡＤ4－ｐＲＳ315骨格（ＬＥＵ）；ａｃｄ1があるｐＡＣＤ1－ｐＲＳ316骨格（ＵＲＡ）；及びｅｃｈＡ及びｈｃｈＡを含むｐＣｏＡ2－ｐＲＳ314骨格（ＴＲＰ））を用いてクローニングした。これらのプラスミドを液胞プロテアーゼ－欠乏サッカロマイセス・セレビシエ菌株ＢＪ5464に形質転換した。ウラシル、ロイシン及びトリプトファン欠乏ガラクトース補充ＳＤ－ＣＡＡで48時間の誘導期間後、細胞を回収し、トリス緩衝液で物理的に破砕し、溶菌液を遠心分離した。続いて、溶菌液を以下に記載されたように、リアルタイムに酵素活性を測定した。
　ＡＣＤ検定法
　100ｍＭ　カリウムホスフェートｐＨ8．0
　1．0ｍＭ　Ｎ－エチルマレイミド
　0．03ｍＭ　イソブチリルＣｏＡ
　0．4ｍＭ　フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）
　1．6ｍＭ　フェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）
　0．035ｍＭ　2，6－ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）
　＋試料
　室温培養
　活性ＡＣＤがＤＣＰＩＰを減少させ、Ａ600を減少させる
　ＢＣＫＡＤ検定法
　100ｍＭ　カリウムホスフェートｐＨ7．0
　1ｍＭ　ＭｇＣｌ2
　0．2ｍＭ　チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）
　4ｍＭ　2－オキソイソ吉草酸
　0．2ｍＭ　ＣｏＡＳＨ／2ｍＭ　ＤＴＴ
　2ｍＭ　ＮＡＤ＋
　2ｍＭ　Ｌ－バリン
　＋試料
　室温培養
　活性ＢＣＫＡＤはＮＡＤ＋を減少させ、Ａ３４０を増加させる
　３－ヒドロキシイソブチレートの製造
　（ｍｔ）ＭＭＡ経路からの生産性は、高圧液体クロマトグラフィーを用いて評価した。前記経路のミトコンドリア又は細胞質変異体を含むＢＪ5464細胞を、一晩非誘導条件下で増殖させた。続いて、前記培養を誘導ＳＤ－ＣＡＡ培地中に約100倍に希釈し、48乃至72時間の間増殖させた。続いて、前記培養由来の上清を0．01　Ｎ　Ｈ2ＳＯ4移動相を用いてＩＣｓｅｐ　ＵＳＰ　Ｌ－17があるＡｇｉｌｅｎｔ　1100　ｓｅｒｉｅｓ　ＨＰＬＣ上で分析した。３－ＨＩＢ産物をＤＡＤ検出器を用いて210ｍｍで検出し、標準曲線を通じて定量した。これらの研究はミトコンドリア経路変異体を用いることで、72時間内にｇ／Ｌ力価（5．1±2．9ｇ／Ｌ）の３－ＨＩＢの製造が可能であることを示唆する。
　本願に引用された全ての特許、特許出願及び公報は、各独立的特許、特許出願又は公報が参考文献として含まれるものであって、具体的かつ個別的に表示されたものと同一の程度で、本願にその全体が参考文献として含まれる。開示された実施例は、制限ではなく説明を目的に提示される。本発明が、その記載された実施例を参照にして説明される一方、当業者であれば全体として本発明の真意及び範囲を外れることなく、本発明の構造及び要素に改変が加えられ得ることを理解できる。
　本発明は、ＭＭＡをはじめとするメタクリル酸エステル、及びその重合体であるアクリル樹脂の合成に有用である。

Claims (10)

  1. 　アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（イソブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ）をコードする遺伝子が導入された真核微生物。
  2. 　アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、シュードモナス（Pseudomonas）属、バシラス（Bacillus）属、スフィンゴバクテリウム(Sphingobacterium）属、コマモナス（Comamonas）属、ブレバンディモナス（Brevundimonas）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、オクロバクテリウム（Ochrobactrum）属、ペドバクター（Pedobacter）属、パエニバシラス（Paenibacillus）属、アクロモバクター（Achromobacter）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、シュワネラ（Shewanella）属、リストネラ（Listonella）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、メソリゾビウム（Mesorhizobium）属、リゾビウム（Rhizobium）属、パラコッカス（Paracoccus）属、キサントバクター（Xanthobacter）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、ゲオバシラス（Geobacillus）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、カンディダ（Candida）属又はアスペルギルス（Aspergillus）属から選ばれる少なくとも１種に由来する遺伝子である、請求項１記載の真核微生物。
  3. 　アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼがミトコンドリアにて機能を発現するように、シグナル配列を付加されたアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された請求項１又は２に記載の真核微生物。
  4. 　シグナル配列が配列番号１で示される配列を含む、請求項３に記載の真核微生物。
  5. 　真核微生物が酵母である、請求項１～４のいずれかに記載の真核微生物。
  6. 　さらに、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子、ヒドロキシアシルＣｏＡヒドロラーゼをコードする遺伝子、チオエステラーゼをコードする遺伝子、及びアルコールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子から選ばれる少なくとも一種の外因性遺伝子を含む、請求項１～４のいずれかに記載の真核微生物。
  7. 　請求項６に記載の真核微生物を用いて、バリンからメタクリリルＣｏＡを製造する方法。
  8. 　請求項６に記載の真核微生物を用いて、バリンから３－ヒドロキシイソブチリルＣｏＡを製造する方法。
  9. 　請求項６に記載の真核微生物を用いて、バリンから３－ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法。
  10. 　請求項６に記載の真核微生物を用いて、バリンからメタクリル酸エステルを製造する方法。

     
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