CN104395455B - 重组微生物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于通过微生物发酵产生化学化合物(特别是但不限于乙醇)的方法。还描述了经遗传修饰的微生物，所述微生物能够使用一氧化碳产生一种或多种产物(特别是但不限于乙醇)作为主要产物，并且能够产生少量的或不产生2,3‑丁二醇和/或其前体。

Description

重组微生物及其使用方法
技术领域
本发明涉及用于通过微生物发酵产生化学化合物，尤其是但不仅限于是乙醇的方法，以及用于这些方法的经遗传修饰的微生物。
背景技术
已知产乙酸的微生物可用于通过底物(包括例如一氧化碳、二氧化碳、氢气和甲醇)发酵来生产燃料(例如乙醇或丁醇)和其它化学物质。很多这些微生物天然产生至少两种-如果不是更多的话-产物。但是，当将微生物用于产生产物时，尤其是用在工业规模上时，不总是需要微生物产生多种产物。例如，多种产物的产生可能是以生产效率和特殊价值的产品的产率为代价，因为副产物可能从参与产生主要需要产物的途径中转移出碳。另外，副产物可能对微生物有毒，产生多种产物会使所需产物的回收和分离变得困难，并且难以控制发酵条件以有利于使得一种产品的产生优于另一种产品。副产物也可能是发酵罐中的潜在污染源，因为它们可能是有害生物的底物。
在通过含一氧化碳的底物的微生物发酵来产生乙醇时，2,3-丁二醇通常作为副产物产生。这可能降低乙醇的生产效率和产率以及造成如上所述的其它问题。
本发明的目的是克服现有技术的一种或多种缺陷，或者至少为公众提供有用的选择。
发明内容
本发明涉及，尤其是，新的经遗传修饰的微生物，和亲代微生物相比，所述微生物能够使用一氧化碳来产生一种或多种产物并且能够产生降低量的2,3-丁二醇和/或其前体。在一个实施方案中，和亲代微生物相比，所述经遗传修饰的微生物基本不产生2,3-丁二醇和/或其前体。在一个具体实施方案中，所述微生物产生乙醇作为主要产物。
在第一方面，本发明提供了一氧化碳营养型产乙酸微生物，所述微生物被改造为适于在发酵含一氧化碳的底物时产生一种或多种产物以及降低量的或基本不产生2,3-丁二醇和/或其前体，和亲代微生物相比，所述微生物包括破坏了2,3-丁二醇生物合成途径的一种或多种遗传修饰。
在一个具体实施方案中，本发明提供了一氧化碳营养型产乙酸微生物，所述微生物被改造为适于在发酵含一氧化碳的底物时产生乙醇作为主要产物以及降低量的或基本不产生2,3-丁二醇和/或其前体，和亲代微生物相比，所述微生物包括破坏了2,3-丁二醇生物合成途径的一种或多种遗传修饰。
在一个实施方案中，所述微生物被改造为适于进一步产生甲酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乙酰乳酸、苹果酸、延胡索酸(fumerate)、2-酮戊二酸(2-oxogluterate)、柠檬酸中的一种或多种。
在一个实施方案中，与亲代微生物相比，所述微生物被改造为适于产生增加量的乙醇、甲酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乙酰乳酸、苹果酸、延胡索酸、2-酮戊二酸、柠檬酸中的一种或多种。
在一个实施方案中，所述微生物包括至少一种遗传修饰，所述遗传修饰破坏了一种或多种能将丙酮酸转化成乙酰乳酸的酶的表达和/或活性。
在一个实施方案中，所述一种或多种能将丙酮酸转化成乙酰乳酸的酶是乙酰乳酸合酶(alsS)。
在一个实施方案中，所述微生物包括至少一种遗传修饰，所述遗传修饰破坏了一种或多种能将乙酰乳酸转化成乙偶姻的酶的表达和/或活性。
在一个实施方案中，所述一种或多种能将乙酰乳酸转化成乙偶姻的酶是乙酰乳酸脱羧酶(budA)。
在一个实施方案中，所述微生物包括至少一种遗传修饰，所述遗传修饰破坏了一种或多种能将乙偶姻转化成2,3-丁二醇的酶的表达和/或活性。
在一个实施方案中，所述一种或多种能将乙偶姻转化成2,3-丁二醇的酶选自2,3-丁二醇脱氢酶(2,3bdh)、乙偶姻还原酶、伯醇:仲醇脱氢酶。
在一个实施方案中，所述微生物包括至少一种遗传修饰，所述遗传修饰破坏了两种或多种酶的组合的表达和/或活性，所述酶能将丙酮酸转化成乙酰乳酸、将乙酰乳酸转化成乙偶姻、和/或将乙偶姻转化成2,3-丁二醇。
在一个实施方案中，所述遗传修饰破坏了一种或多种以下酶的表达和/或活性:
乙酰乳酸合酶(alsS)；
乙酰乳酸脱羧酶(BudA)；
2,3-丁二醇脱氢酶(2,3bdh)；
乙偶姻还原酶；和
伯醇:仲醇脱氢酶。。
在一个实施方案中，所述遗传修饰破坏了一种或多种以下酶的表达和/或活性:
乙酰乳酸合酶(alsS)；
乙酰乳酸脱羧酶(BudA)；和
2,3-丁二醇脱氢酶(2,3bdh)。
在一个实施方案中，所述一种或多种遗传修饰破坏了一种或多种编码一种或多种上述酶的基因。在一个实施方案中，所述一种或多种遗传修饰破坏了一种或多种上述酶的表达和/或活性所需的化合物的活性。在一个实施方案中，所述一种或多种遗传修饰增强了一种或多种化合物的表达或活性，所述化合物抑制了一种或多种上述酶的表达或活性。
在一个具体实施方案中，所述微生物选自自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、和拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)以及相关分离株。在另一个实施方案中，所述组也包括科斯卡塔梭菌(Clostridium coskatii)。
在一个具体实施方案中，所述微生物是自产乙醇梭菌DSM23693。
在第二方面，本发明提供了用于产生一氧化碳营养型产乙酸微生物的方法，所述微生物被改造为适于在发酵含一氧化碳的底物时产生一种或多种产物以及降低量的或基本不产生2,3-丁二醇和/或其前体，所述方法包括遗传修饰一氧化碳营养型产乙酸亲代微生物以破坏2,3-丁二醇生物合成途径。
在一个实施方案中，和亲代微生物相比，所述方法导致了一种或多种产物的产生增加。
在一个具体实施方案中，本发明提供了用于产生一氧化碳营养型产乙酸微生物的方法，所述微生物被改造为适于在发酵含一氧化碳的底物时产生乙醇作为主要产物以及降低量的或基本不产生2,3-丁二醇和/或其前体，所述方法包括遗传修饰一氧化碳营养型产乙酸亲代微生物以破坏2,3-丁二醇生物合成途径。
本发明也提供了通过所述第二方面的方法产生的微生物。
在一个实施方案中，所述方法包括将一种或多种遗传修饰引入到亲代微生物中，所述遗传修饰破坏了编码能将丙酮酸转化成乙酰乳酸的一种或多种酶的一种或多种基因。在一个实施方案中，所述一种或多种能将丙酮酸转化成乙酰乳酸的酶是乙酰乳酸合酶(alsS)。
在一个实施方案中，所述方法包括将一种或多种遗传修饰引入到亲代微生物中，所述遗传修饰破坏了编码能将乙酰乳酸转化成乙偶姻的一种或多种酶的一种或多种基因。在一个实施方案中，所述一种或多种能将乙酰乳酸转化成乙偶姻的酶是乙酰乳酸脱羧酶(budA)。
在一个实施方案中，所述方法包括将一种或多种遗传修饰引入到亲代微生物中，所述遗传修饰破坏了编码能将乙偶姻转化成2,3-丁二醇的一种或多种酶的一种或多种基因。在一个实施方案中，所述一种或多种能将乙偶姻转化成2,3-丁二醇的酶选自2,3-丁二醇脱氢酶(2,3bdh)、乙偶姻还原酶、伯醇:仲醇脱氢酶。
在一个实施方案中，所述方法包括将一种或多种遗传修饰引入到亲代微生物中，所述遗传修饰破坏了两种或多种基因的组合，所述基因编码能将丙酮酸转化成乙酰乳酸、将乙酰乳酸转化成乙偶姻、和/或将乙偶姻转化成2,3-丁二醇的酶。
在一个实施方案中，所述方法包括将一种或多种遗传修饰引入到亲代微生物中，所述遗传修饰破坏了一种或多种基因，所述基因编码乙酰乳酸合酶(alsS)、乙酰乳酸脱羧酶(BudA)和2,3-丁二醇脱氢酶(2,3bdh)中的一种或多种。
在一个实施方案中，所述方法包括引入遗传修饰，所述遗传修饰破坏了一种或多种上述酶的表达或活性所需的化合物的活性。
在一个实施方案中，所述方法包括引入增强了一种或多种化合物的表达或活性的遗传修饰，所述化合物抑制了一种或多种上述酶的表达或活性。
在第三方面，本发明提供了用于产生一种或多种产物的方法。在一个实施方案中，所述方法为用于产生乙醇、甲酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乙酰乳酸、苹果酸、延胡索酸、2-酮戊二酸、柠檬酸中的一种或多种。
在一个具体实施方案中，本发明提供了用于通过微生物发酵产生一种或多种产物(在一个实施方案中包括乙醇以及一种或多种其它产物)的方法，所述微生物发酵包括使用本发明第一方面的和/或通过本发明第二方面的方法产生的一种或多种微生物发酵含CO的底物。在一个实施方案中，所述一种或多种其他产物选自琥珀酸、乳酸、甲酸、缬氨酸、亮氨酸、丙酮酸、异亮氨酸、乙酰乳酸、苹果酸、延胡索酸、2-酮戊二酸、柠檬酸。
本发明也提供了用于降低来自工业过程的总的大气碳排放的方法。
在一个实施方案中，所述方法包括如下步骤：
(a)将含CO的底物提供给生物反应器，所述生物反应器含有本发明第一方面的和/或通过本发明第二方面的方法产生的一种或多种微生物的培养物；和
(b)在所述生物反应器中厌氧发酵所述培养物以产生一种或多种上述产物，优选包括乙醇。
在另一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
在由工业生产过程产生的含CO的气体释放到大气中之前，将所述气体捕获；
通过培养物厌氧发酵所述含CO的气体以产生一种或多种上述产物，优选包括乙醇，所述培养物含有一种或多种本发明第一方面的微生物和/或通过本发明第二方面的方法产生的微生物。
在所述方法方面的具体实施方案中，将所述微生物维持在水性培养基中。
在所述方法方面的具体实施方案中，对所述底物的发酵发生在生物反应器中。
优选地，所述含CO的底物是含CO的气态底物。在一个实施方案中，所述底物包含工业废气。在某些实施方案中，所述气体是钢铁厂废气或合成气。
在一个实施方案中，所述底物通常会含有大比例的CO，例如至少约20体积％至约100体积％的CO、20体积％至70体积％的CO、30体积％至60体积％的CO和40体积％至55体积％的CO。在具体实施方案中，所述底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％的CO、或约55体积％的CO、或约60体积％的CO。
虽然所述底物不必需含有任何氢气，但是存在H2应该不会对依据本发明方法的产物形成不利。在具体实施方案中，存在氢气可获得提高的醇产生的整体效率。例如，在具体实施方案中，所述底物可包含约2:1、或1:1或1:2比例的H2:CO。在一个实施方案中，所述底物包含约30体积％或更低的H2、20体积％或更低的H2、约15体积％或更低的H2、或者约10体积％或更低的H2。在其他实施方案中，所述底物流包含低浓度的H2，例如小于5体积％、或小于4体积％、或小于3体积％、或小于2体积％、或小于1体积％或者基本上不含氢气。例如，所述底物还可含有一些CO2，例如约1体积％至约80体积％的CO2或1体积％至约30体积％的CO2。
在某些实施方案中，所述方法还包括从发酵液中回收一种或多种产物的步骤。在一个实施方案中，从发酵液中回收乙醇。在一个实施方案中，从发酵液中回收一种或多种产物，所述产物包括甲酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乙酰乳酸、苹果酸、延胡索酸、柠檬酸和2-酮戊二酸。
在第四方面，本发明提供了通过第三方面的方法产生的一种或多种产物。在一个实施方案中，所述一种或多种产物选自乙醇、甲酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乙酰乳酸、苹果酸、延胡索酸、柠檬酸和2-酮戊二酸。在一个实施方案中，所述一种或多种产物至少包括乙醇。
在第五方面，本发明提供了一氧化碳营养型产乙酸微生物，和亲代微生物相比，所述一氧化碳营养型产乙酸微生物中的一种或多种非必需基因已被破坏。
在第六方面，本发明提供了产生其中一种或多种非必需基因已被破坏的一氧化碳营养型产乙酸微生物的方法，所述方法包括遗传修饰亲代微生物中的一种或多种非必需基因。
本发明也提供了通过第六方面的方法产生的微生物。
在一个实施方案中，一种或多种非必需基因是编码将乙酰乳酸转化成乙偶姻的酶、和/或编码将乙偶姻转化成2,3-丁二醇的酶的基因。在一个实施方案中，所述酶是如本文所述的酶。
在某些实施方案中，所述微生物选自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、科斯卡塔梭菌、淤泥丁酸杆菌(Butyribacterium limosum)、甲基营养丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculum bacchii)、Blautia producta、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermautotrophica)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。
在一些实施方案中，所述微生物选自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌。在另一个实施方案中，所述组也包括科斯卡塔梭菌。
在一个具体实施方案中，所述微生物是自产乙醇梭菌DSM23693。
在第七方面，本发明提供了用于通过微生物发酵产生一种或多种产物的方法，所述微生物发酵使用了一种或多种第五方面的微生物和/或通过第六方面的方法产生的微生物。
在一个具体实施方案中，本发明提供了用于通过微生物发酵产生乙醇和一种或多种其他产物的方法，所述微生物发酵包括使用第五方面的和/或通过第六方面的方法产生的一种或多种微生物对含CO的底物发酵。
在一个实施方案中，所述方法包括如下步骤：
(a)将含CO的底物提供给生物反应器，所述生物反应器含有第五方面的和/或通过第六方面的方法产生的一种或多种微生物的培养物；和
(b)在所述生物反应器中厌氧发酵所述培养物以产生一种或多种产物。
在另一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(a)在由工业生产过程产生的含CO的气体释放到大气中之前，将所述气体捕获；
(b)通过培养物厌氧发酵所述含CO的气体以产生一种或多种产物，所述培养物含有第五方面的和/或通过第六方面的方法产生的一种或多种微生物。
在一个实施方案中，所述一种或多种产物是如本文所述的产物。
在一个实施方案中，所述含CO的底物是如本文所述的底物。
广义上说，本发明还可单独或综合地包括本申请说明书中提及或指出的部分、要素和特征，包括两个或多个所述部分、要素或特征的任意或所有组合，并且当本文提及的具体整数在本发明所涉及的领域具有已知的等价物时，所述已知的等价物如同单独被提出一样纳入本文。
附图说明
本发明的这些方面和其他方面——应该以其所有新的方面考虑——将通过后文描述(仅作为示例)并参考附图而变得清楚，其中：
图1示出了产生2,3-丁二醇的一氧化碳营养型产乙酸菌(例如，自产乙酸梭菌DSM23693)中的CO的代谢途径。
图1b表明了在具有向乙醇的碳通量再分配的产生2,3-丁二醇的一氧化碳营养型产乙酸菌中敲除2,3-丁二醇生物合成途径的影响并且显示了来自CO的新产物(例如，琥珀酸、2-酮戊二酸、甲酸、缬氨酸、亮氨酸)的产生。
图2示出了自产乙酸梭菌DSM23693基因组上的budA基因和其5’和3’侧翼区。也显示了用于pMTL85141质粒的侧翼片段的PCR扩增和随后的克隆的引物。
图3示出了用于自产乙酸梭菌DSM23693中budA基因敲除的含有位于由lacZ基因分开的DNA片段侧翼的5’和3’budA基因的示例性pMTL85141-budA-ko质粒。
图4示出了用于本发明的示例性甲基化质粒。
图5示出了(A)：budA基因敲除后自产乙酸梭菌DSM23693的基因组区域的图形说明并且也显示了用于筛选自产乙酸梭菌DSM23693 budA基因敲除的引物位置以及来自野生型自产乙酸梭菌DSM23693和其相应的budA基因敲除菌株的PCR产物的预期大小。(B)：自产乙酸梭菌DSM23693 budA基因敲除的PCR筛选的琼脂糖凝胶电泳图像。泳道1和9表示GeneRulerTM 1kb Plus DNA Ladder。泳道2-6显示了使用引物Og09和Og12r对从野生型自产乙酸梭菌DSM23693(+ve,2.7kb)和6个潜在的自产乙酸梭菌DSM23693 budA基因敲除(1-6,2.2kb)中分离的基因组DNA的budA靶区域进行的PCR扩增。泳道10-16显示了使用对budA基因273bp的内部区域特异的引物Og44f和Og45r对从野生型(+ve)自产乙酸梭菌DSM23693和6个潜在的自产乙酸梭菌DSM23693 budA基因敲除中分离的基因组DNA进行的PCR(*)。
图6：使用引物Og44f/Og45r和Og42f/Og43r对自产乙酸梭菌DSM23693 budA和2,3bdh基因中RAM插入进行的PCR确认。
图7示出了自产乙酸梭菌DSM23693和Δ2,3bdh ClosTron突变体在发酵过程中将乙偶姻转化为丁二醇的速率。
序列表的简单描述
该说明书附带序列表，其中列出下面的序列：
Seq.ID 1:自产乙醇梭菌DSM23693 budA基因的核苷酸序列。
Seq.ID 2:自产乙醇梭菌DSM23693 budA蛋白的氨基酸序列。
Seq.ID 3:自产乙醇梭菌DSM23693 budA基因的5’侧翼区的核苷酸序列。
Seq.ID 4:budA基因的3’侧翼序列的核苷酸序列。
Seq ID 5-8和10和11:如下文表1中描述的。
Seq.ID 9:大肠杆菌-梭菌穿梭载体-质粒pMTL85141的核苷酸序列。
Seq.ID.12:pMTL85141-budA-ko的核苷酸测序结果，其表明该质粒上存在的侧翼DNA片段不含有突变。
Seq ID 13:自产乙醇梭菌(Y18178,GI:7271109)的16s rRNA基因。
Seq ID 14:自产乙醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆1的16s rRNA基因：(93％)的同一性。
Seq.ID 15:自产乙醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆2的16s rRNA基因：(94％)。
Seq.ID 16:自产乙醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆3的16s rRNA基因：(95％)。
Seq.ID 17:自产乙醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆4的16s rRNA基因：(93％)。
Seq.ID 18:自产乙醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆5的16s rRNA基因：(94％)。
Seq.ID 19:自产乙醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆6的16s rRNA基因：(92％)。
Seq ID 20.使用引物Og09f得到的自产乙醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆1的PCR产物的核苷酸测序结果(92％)。
Seq ID 21.使用引物Og12r得到的自产乙醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆1的PCR产物的核苷酸测序结果(92％)。
Seq ID 22.使用引物Og12r得到的自产乙醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆3的PCR产物的核苷酸测序结果(92％)。
Seq ID 23.使用引物Og12r得到的自产乙醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆4的PCR产物的核苷酸测序结果(92％)。
Seq ID 24.使用引物Og12r得到的自产乙醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆5的PCR产物的核苷酸测序结果。
Seq ID 25.使用引物Og09f得到的自产乙醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆6的PCR产物的核苷酸测序结果。
Seq ID 26.使用引物Og12r得到的克隆6的自产乙醇梭菌DSM23693 budA靶区域的核苷酸测序结果。
Seq ID 27和28：在下文的表4中描述。
Seq 29和30:在下文的表4中描述。
SEQ ID 31:和诱导型lac启动子融合的新的甲基转移酶基因的核苷酸序列。
SEQ ID 32:新的甲基转移酶的蛋白序列。
SEQ ID 33:质粒pGS20的核苷酸序列。
SEQ_ID NO 34:自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌的新的醇脱氢酶的氨基酸序列。
SEQ_ID NO 35:自产乙醇梭菌的新的醇脱氢酶的核酸序列。
SEQ_ID NO 36:扬氏梭菌的新的醇脱氢酶的核酸序列。
SEQ_ID NO 37:拉氏梭菌的新的醇脱氢酶的核酸序列。
Seq.ID.38:自产乙醇梭菌的苹果酸酶1的核苷酸序列。
Seq.ID.39:自产乙醇梭菌的苹果酸酶1的氨基酸序列。
Seq.ID.40:自产乙醇梭菌的苹果酸酶2的核苷酸序列。
Seq.ID.41:自产乙醇梭菌的苹果酸酶2的氨基酸序列。
Seq.ID.42:自产乙醇梭菌的苹果酸脱氢酶的核苷酸序列。
Seq.ID.43:自产乙醇梭菌的苹果酸脱氢酶的氨基酸序列。
Seq.ID.44:自产乙醇梭菌的丙酮酸磷酸双激酶的核苷酸序列。
Seq.ID.45:自产乙醇梭菌的丙酮酸磷酸双激酶的氨基酸序列。
Seq.ID.46:自产乙醇梭菌的丙酮酸羧化酶的核苷酸序列。
Seq.ID.47:自产乙醇梭菌的丙酮酸羧化酶的氨基酸序列。
Seq.ID.48:自产乙醇梭菌的丙酮酸羧激酶的核苷酸序列。
Seq.ID.49:自产乙醇梭菌的丙酮酸羧激酶的氨基酸序列。
Seq.ID.50:自产乙醇梭菌的延胡索酸水合酶亚基A的核苷酸序列。
Seq.ID.51:自产乙醇梭菌的延胡索酸水合酶亚基A的氨基酸序列。
Seq.ID.52:自产乙醇梭菌的延胡索酸水合酶亚基B的核苷酸序列。
Seq.ID.53:自产乙醇梭菌的延胡索酸水合酶亚基B的氨基酸序列。
Seq.ID.54:自产乙醇梭菌的延胡索酸还原酶1的核苷酸序列。
Seq.ID.55:自产乙醇梭菌的延胡索酸还原酶1的氨基酸序列。
Seq.ID.56:自产乙醇梭菌的延胡索酸还原酶2的核苷酸序列。
Seq.ID.57:自产乙醇梭菌的延胡索酸还原酶2的氨基酸序列。
Seq.ID.58:自产乙醇梭菌的延胡索酸还原酶3的核苷酸序列。
Seq.ID.59:自产乙醇梭菌的延胡索酸还原酶3的氨基酸序列。
Seq.ID.60:拉氏梭菌的苹果酸酶1的核苷酸序列。
Seq.ID.61:拉氏梭菌的苹果酸酶1的氨基酸序列。
Seq.ID.62:拉氏梭菌的苹果酸脱氢酶的核苷酸序列。
Seq.ID.63:拉氏梭菌的苹果酸脱氢酶的氨基酸序列。
Seq.ID.64:拉氏梭菌的丙酮酸磷酸双激酶的核苷酸序列。
Seq.ID.65:拉氏梭菌的丙酮酸磷酸双激酶的氨基酸序列。
Seq.ID.66:拉氏梭菌的丙酮酸羧化酶的核苷酸序列。
Seq.ID.67:拉氏梭菌的丙酮酸羧化酶的氨基酸序列。
Seq.ID.68:拉氏梭菌的丙酮酸羧激酶的核苷酸序列。
Seq.ID.69:拉氏梭菌的丙酮酸羧激酶的氨基酸序列。
Seq.ID.70:拉氏梭菌的延胡索酸水合酶亚基A的核苷酸序列。
Seq.ID.71:拉氏梭菌的延胡索酸水合酶亚基A的氨基酸序列。
Seq.ID.72:拉氏梭菌的延胡索酸水合酶亚基B的核苷酸序列。
Seq.ID.73:拉氏梭菌的延胡索酸水合酶亚基B的氨基酸序列。
Seq.ID.74:拉氏梭菌的延胡索酸还原酶1的核苷酸序列。
Seq.ID.75:拉氏梭菌的延胡索酸还原酶1的氨基酸序列。
Seq.ID.76:拉氏梭菌的延胡索酸还原酶2的核苷酸序列。
Seq.ID.77:拉氏梭菌的延胡索酸还原酶2的氨基酸序列。
Seq.ID 78:扬氏梭菌budA基因的5’上游序列或同源臂。
Seq.ID 79:扬氏梭菌budA基因的3’下游序列或同源臂。
Seq.ID 80:拉氏梭菌budA基因的5’上游序列或同源臂。
Seq.ID 81:拉氏梭菌budA基因的3’下游序列或同源臂。
Seq ID 82:自产乙醇梭菌DSM23693 budA上ClosTron靶向区域的核苷酸序列。
Seq ID 83：自产乙醇梭菌DSM23693 2,3bdh上ClosTron靶向区域的核苷酸序列。
Seq ID 84:用于筛选Δ2,3bdh ClosTron突变体的寡核苷酸Og42f。
Seq ID 85:用于筛选Δ2,3bdh ClosTron突变体的寡核苷酸Og43r。
Seq.ID 86:使用引物fD1得到的从自产乙醇梭菌DSM23693 Δ2,3bdh ClosTron克隆2扩增的16s rRNA PCR产物的核苷酸序列。
Seq ID 87:使用引物rP2得到的从自产乙醇梭菌DSM23693 Δ2,3bdh ClosTron克隆2扩增的16s rRNA PCR产物的核苷酸序列。
Seq.ID 88:使用引物fD1得到的自产乙醇梭菌DSM23693 Δ2,3bdh ClosTron克隆4的16s rRNA PCR产物的核苷酸序列。
Seq ID 89:使用引物rP2得到的自产乙醇梭菌DSM23693 Δ2,3bdh ClosTron克隆4的16s rRNA PCR产物的核苷酸序列。
Seq.ID 90:使用引物fD1得到的自产乙醇梭菌DSM23693 ΔbudAClosTron克隆1的16s rRNA PCR产物的核苷酸序列。
Seq ID 91:使用引物rP2得到的自产乙醇梭菌DSM23693 ΔbudA ClosTron克隆1的16s rRNA PCR产物的核苷酸序列。
Seq.ID 92:使用引物fD1得到的自产乙醇梭菌DSM23693 ΔbudA ClosTron克隆3的16s rRNA PCR产物的核苷酸序列。
Seq ID and 93:使用引物rP2得到的自产乙醇梭菌DSM23693 ΔbudA ClosTron克隆3的16s rRNA PCR产物的核苷酸序列。
Seq ID 94：自产乙醇梭菌DSM23693 2,3bdh基因的5’同源臂的核苷酸序列。
Seq ID 95:自产乙醇梭菌DSM23693 2,3bdh基因的3’同源臂的核苷酸序列。
Seq.ID 96和97:用于扩增自产乙醇梭菌DSM23693 2,3bdh基因的5’同源臂的引物和。
Seq.ID 98和99:用于扩增自产乙醇梭菌DSM23693 2,3bdh基因的3’同源臂的引物。
Seq.ID 100和101:可用于确认自产乙醇梭菌DSM23693 2,3bdh基因敲除的侧翼引物。
Seq ID 102:自产乙醇梭菌DSM23693 SecAdh基因的5’同源臂的核苷酸序列。
Seq ID 103:自产乙醇梭菌DSM23693 SecAdh基因的3’同源臂的核苷酸序列。
Seq.ID 104和105:用于扩增自产乙醇梭菌DSM23693 2,3bdh基因的5’同源臂的引物。
Seq.ID 106和107：用于扩增自产乙醇梭菌DSM23693 2,3bdh基因的3’同源臂的引物。
Seq.ID 108和109:可用于确认自产乙醇梭菌DSM23693 SecAdh基因敲除的侧翼引物。
Seq ID 110:自产乙醇梭菌DSM23693 SecAdh基因的II类内含子靶向盒的核苷酸序列。
Seq.ID 111和112:可用于确认自产乙醇梭菌DSM23693 SecAdh基因插入失活的侧翼引物。
Seq ID 113:自产乙醇梭菌DSM23693 alsS基因的5’同源臂的核苷酸序列。
Seq ID 114:自产乙醇梭菌DSM23693 alsS基因的3’同源臂的核苷酸序列。
Seq.ID 115和116:用于扩增自产乙醇梭菌DSM23693 alsS基因的5’同源臂的引物序列。
Seq.ID 117和118:用于扩增自产乙醇梭菌DSM23693 alsS基因的3’同源臂的引物序列。
Seq.ID 119和120:可用于确认自产乙醇梭菌DSM23693 alsS基因敲除的侧翼引物的序列。
Seq ID 120:自产乙醇梭菌DSM23693 ilvC基因的5’同源臂的核苷酸序列。
Seq ID 121:自产乙醇梭菌DSM23693 ilvC基因的3’同源臂的核苷酸序列。
Seq.ID 123和124:用于扩增自产乙醇梭菌DSM23693 ilvC基因的5’同源臂的引物序列。
Seq.ID 125和126:用于扩增自产乙醇梭菌DSM23693 ilvC基因的3’同源臂的引物序列。
Seq.ID 127和128:可用于确认自产乙醇梭菌DSM23693 ilvC基因敲除的侧翼引物的序列。
Seq ID 129:自产乙醇梭菌DSM23693 ilvI基因的5’同源臂的核苷酸序列。
Seq ID 130:自产乙醇梭菌DSM23693 ilvI基因的3’(Seq.ID 130)同源臂的核苷酸序列。
Seq.ID 131和132:用于扩增自产乙醇梭菌DSM23693 ilvI基因的5’同源臂的引物序列。
Seq.ID 133和134:用于扩增自产乙醇梭菌DSM23693 ilvI基因的3’同源臂的引物序列。
Seq.ID 135和136:可用于确认自产乙醇梭菌DSM23693 ilvI基因敲除的侧翼引物的序列。
Seq ID 137:自产乙醇梭菌DSM23693 ilvB基因的5’同源臂的核苷酸序列。
Seq ID 138:自产乙醇梭菌DSM23693 ilvB基因的3’同源臂的核苷酸序列。
Seq.ID 139和140:用于扩增自产乙醇梭菌DSM23693 ilvB基因的5’同源臂的引物序列。
Seq.ID 141和142:用于扩增自产乙醇梭菌DSM23693 ilvB基因的3’同源臂的引物序列。
Seq.ID 143和144:可用于确认自产乙醇梭菌DSM23693 ilvB基因敲除的侧翼引物的序列。
Seq ID 145:alsS的ClosTron内含子靶向核苷酸序列的实例。
Seq ID 146:ilvC的ClosTron内含子靶向核苷酸序列的实例。
Seq ID 147:ilvI的ClosTron内含子靶向核苷酸序列的实例。
Seq ID 148:ilvB的ClosTron内含子靶向核苷酸序列的实例。
Seq ID 149和150:可用于筛选alsS ClosTron突变体的寡核苷酸。
Seq ID 151和152:可用于筛选ilvC ClosTron突变体的寡核苷酸。
Seq ID 153和154:可用于筛选ilvI ClosTron突变体的寡核苷酸。
Seq ID 155和156:可用于筛选ilvB ClosTron突变体的寡核苷酸。
所有的序列都使用标准的IUPAC缩写，参见http://en.m.wikipedia.org/wiki/Nucleic_acid_notation#section_1。例如：
A 腺嘌呤核苷
C 胞嘧啶核苷
G 鸟嘌呤核苷
T 胸腺嘧啶
W A or T
S C或G
M A或C
K G或T
R A或G
Y C或T
B C、G或T
D A、G或T
H A、C或T
V A、C或G
N或- 任何碱基(不是缺口)、A、C、G、T
具体实施方式
以下是在广义上给出的对本发明(包括其优选的实施方案)的说明。下文在标题“实施例”下给出的公开内容进一步解释本发明，其提供了支持本发明的实验数据、本发明多个方面的具体实例以及实施本发明的方法。
本发明提供了能够通过发酵含CO的底物产生一种或多种产物的微生物。在一个具体实施方案中，本发明提供了能够通过发酵含CO的底物产生乙醇，或乙醇和一种或多种其他产物的微生物。和亲代微生物相比，所述重组微生物至少产生减少量的2,3-丁二醇和/或其前体。在一种实施方案中，和亲代微生物相比，所述微生物基本不产生2,3-丁二醇或其前体。
通过多种基因敲除研究，本发明人意外地鉴定出如果在一氧化碳营养型产乙酸微生物中破坏2,3-丁二醇生物合成途径，则与亲代微生物相比，所述微生物能够产生增加水平的甲酸、乳酸、琥珀酸、2-酮戊二酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和乙醇。本发明人也认为所述微生物产生了增加水平的丙酮酸和TCA循环中间体化合物乙酰乳酸、苹果酸、延胡索酸、柠檬酸，因为它们是琥珀酸、2-酮戊二酸和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生产的前体。这有很多显著的优势。一个主要的优势是乙醇生产的效率的提高，包括产生的更高水平的乙醇。不希望囿于任何具体理论，本发明人认为缬氨酸、亮氨酸、甲酸、乳酸和丙酮酸的水平的增加使得微生物可用更多这些化学物质来供给乙醇产生。另外，必须经常用氨基酸和其他化学物质补充发酵液以确保发酵过程中微生物的生存能力和生产效率。通过本发明重组微生物产生缬氨酸、亮氨酸、甲酸、乳酸和丙酮酸可以不再需要用这些化学物质补充发酵液，节约了成本。另外，本发明的微生物中降低或去除2,3-丁二醇产生也具有优势。2,3-丁二醇可能对微生物有毒并因此可对发酵和生长产生负面影响。降低或去除发酵液中的2,3-丁二醇也使得更容易从发酵液中回收乙醇；通常必须一起回收乙醇和2,3-丁二醇并且接着将它们在随后的步骤中分离。因为2,3-丁二醇是很多有害生物的底物，因此它也是发酵罐中的潜在的微生物污染源。另外，由于琥珀酸、2-酮戊二酸、甲酸、乳酸、丙酮酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸可用于很多商业过程并且可在下游化学产物生产中用作中间体化合物，因此它们具有独立的经济价值。
本发明人已经首次证明了在一氧化碳营养型产乙酸微生物中非必需基因的破坏或敲除。相应地，在另一方面，本发明也提供了一氧化碳营养型产乙酸微生物以及产生这些微生物的方法和使用这些微生物的方法，其中和亲代微生物相比，所述微生物的一种或多种非必需基因已被破坏。“非必需基因”是编码这样一种蛋白的基因，所述蛋白不是微生物生存所必需的，因此不补充该蛋白微生物也能生存。非必需基因的实例包括编码乙酰乳酸脱羧酶和2,3-丁二醇脱氢酶的那些基因。技术人员能够使用本领域的标准技术(包括破坏基因(如本文所述)的重组技术以及测试这些遗传修饰是否对微生物的生存产生影响的标准测定法)鉴定非必需基因。
虽然下文本发明的描述将重点放在通过遗传修饰对2,3-丁二醇生物合成途径的破坏上，应理解如果需要的话本发明的微生物也可包括一种或多种其他的遗传修饰(包括破坏一种或多种与2,3-丁二醇生物合成途径无关的非必需基因)。对于涉及破坏非必需基因的本发明方面，应理解包括对编码不是2,3-丁二醇途径中的酶的基因的遗传修饰。
另外，尽管下文的描述可能将重点放在作为主产物的乙醇的产生和回收上，应理解本发明可用于提高一种或多种非乙醇的产物的产生水平或者除了乙醇之外还同时提高一种或多种产物的产生水平。
定义
本文中提到的“发酵液”是包含至少一种营养培养基和细菌细胞的培养基。
本文中提到的穿梭微生物是其中表达甲基转移酶的微生物，并且其不同于目标微生物。
本文中提到的目标微生物是其中表达包括在表达构建体/载体上的基因的微生物，并且其不同于所述穿梭微生物。
术语“主要发酵产物”意指以最高的浓度和/或产率产生的那种发酵产物。
当用于发酵过程时，术语“提高效率”、“提高的效率”等包括但不限于提高如下中的一个或多个：催化所述发酵的微生物的生长速率、生长和/或产物产生速率、产生的所需产物(例如醇)的体积/消耗的底物的体积、所需产物的产生速率或产生水平、以及产生的所需产物与所述发酵的其他副产物相比的相对比例。
短语“含一氧化碳的底物”及类似术语应被理解为包括任意底物，其中一氧化碳可被一种或多种细菌菌株用于例如生长和/或发酵。
短语“含一氧化碳的气态底物”及类似短语和术语包括含有某一水平一氧化碳的任意气体。在某些实施方案中，所述底物含有至少约20体积％至约100体积％的CO、20体积％至70体积％的CO、30体积％至60体积％的CO、和40体积％至55体积％的CO。在具体实施方案中，所述底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％的CO、或约55体积％的CO、或约60体积％的CO。
虽然所述底物不必需含有任何氢气，但是存在H2应该不会对本发明方法的产物不利。在具体实施方案中，存在氢气可获得提高的醇产生的整体效率。例如，在具体实施方案中，所述底物可包含约2:1、或1:1或1:2比例的H2:CO。在一个实施方案中，所述底物包含约30体积％或更低的H2、20体积％或更低的H2、约15体积％或更低的H2、或者约10体积％或更低的H2。在其他实施方案中，所述底物流包含低浓度的H2，例如小于5体积％、或小于4体积％、或小于3体积％、或小于2体积％、或小于1体积％或者基本上不含氢气。例如，所述底物还可含有一些CO2，例如约1体积％至约80体积％的CO2、或1体积％至约30体积％的CO2。在一个实施方案中，所述底物包含小于或等于约20体积％的CO2。在具体的实施方案中，所述底物包含小于或等于约15体积％的CO2、小于或等于约10体积％的CO2、小于或等于约5体积％的CO2或者基本上不含CO2。
在以下的说明书中，从递送和发酵“含CO的气态底物”的方面描述本发明的实施方案。但是，应理解，所述气态底物可以其他形式提供。例如，所述含CO的气态底物可以溶解于液体中的形式提供。实质上，将液体用含一氧化碳的气体饱和，然后将所述液体加入生物反应器中。这可使用标准的方法学实现。例如，可使用微泡分散发生器(Hensirisaket.al.Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation；Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101,Number 3/October,2002)。又例如，可将所述含CO的气态底物吸附到固态支持物上。这些替代方法被术语“含CO的底物”等所涵盖。
在本发明的具体实施方案中，所述含CO的气态底物是工业排气或废气。“工业废气或工业排气”应被广义地认为包括工业过程产生的任何含CO的气体，并且包括铁金属产品生产、有色金属产品生产、石油精炼过程、煤的气化、生物质的气化、电力生产、炭黑生产和焦炭生产所产生的气体。本文其他部分还提供了另外的实例。
除非另有说明，否则本文所用的短语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等意图包括所述过程的生长阶段和产物生物合成阶段。如下所述，在一些实施方案中，所述生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，向发酵反应中加入金属或组合物应被理解为包括加入到这些反应器之一或两个中。
术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道排布组成的发酵装置，其包括连续搅拌釜反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、鼓泡塔、气升式发酵罐、静态混合器或适用于气-液接触的其他容器或其他装置。如下所述，在一些实施方案中，所述生物反应器可包含第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，当提到向所述生物反应器或发酵反应中加入底物时，如果合适，应该理解为加入到这些反应器之一或两个中。
当用于依据本发明的发酵产物时，“一种或多种产物”等类似的短语意指包括例如乙醇、琥珀酸、丙酮酸、乳酸、缬氨酸、甲酸、异亮氨酸和亮氨酸。在一个实施方案中，“一种或多种产物”也可包括乙酰乳酸、苹果酸、延胡索酸、柠檬酸、和2-酮戊二酸中的一种或多种。应理解本发明的方法适用于意在用于乙醇(单独或与其他产物结合)的产生和回收或除了乙醇之外的产物的产生和回收的方法。
所述术语“乙酸盐”包括单独的乙酸盐，以及分子或游离乙酸与乙酸盐的混合物，例如存在于如本文可能描述的所述发酵液中的乙酸盐和游离乙酸的混合物。所述发酵液中的分子乙酸与乙酸盐的比例取决于所述系统的pH。术语琥珀酸、丙酮酸、乳酸、甲酸、乙酰乳酸、苹果酸、延胡索酸、柠檬酸、和2-酮戊二酸应被相似地理解。
除非另有说明，提到本文任何可以一种或多种异构形式(例如，D、L、内消旋、S、R、顺式或反式形式)的化合物，应通常被认为包括提到所述化合物的任何一种或多种这样的异构体。例如，提到“乙偶姻”应被认为包括提到其D和L异构体之一或两者。
“外源核酸”是源自待引入其的微生物之外的核酸。外源核酸可源自任意适合的来源，包括但不限于待引入它们的微生物、与待引入它们的生物不同的微生物菌株或种，或者它们可通过人工或重组方法形成。所述外源核酸可被改造为适于整合到待引入其的微生物的基因组中，或者保持染色体外状态。
所述“2,3-丁二醇生物合成途径”是一种反应途径，所述反应包括将丙酮酸转化成乙酰乳酸、将乙酰乳酸转化成乙偶姻、和将乙偶姻转化成2,3-丁二醇。
如本文使用的，“破坏所述2,3-丁二醇生物合成途径”等类似的短语意指降低2,3-丁二醇的产生，或在一种实施方案中基本消除(eliminated)2,3-丁二醇的产生。
“2,3-丁二醇的前体”意指涵盖乙偶姻和乙酰乳酸。
酶“能够转化”第一化合物或底物为第二化合物或产物，如果以其活性形式存在，酶能够催化其中至少一部分第一化合物被转化为第二化合物的反应。
提到“醇脱氢酶”应被认为包括能够催化酮(例如乙偶姻)转化为仲醇(例如2,3-丁二醇)的醇脱氢酶，或者反之亦然。这样的醇脱氢酶包括仲醇脱氢酶和伯醇脱氢酶。“仲醇脱氢酶”是可将酮(例如乙偶姻)转化为仲醇(例如2,3-丁二醇)的醇脱氢酶，或反之亦然。“伯醇脱氢酶”是可将醛转化为伯醇的醇脱氢酶，或反之亦然；但是，许多伯醇脱氢酶也能够催化酮转化为仲醇，或反之亦然。这些醇脱氢酶也可称为“伯醇-仲醇脱氢酶”。因此，在本发明的某些实施方案中，提到“2,3-丁二醇脱氢酶”应被认为包括提到可能被归类为伯醇、仲醇或伯醇-仲醇脱氢酶的2,3-丁二醇脱氢酶。
“遗传修饰”——所述遗传修饰破坏了2,3-丁二醇生物合成途径或破坏了依据本发明的一种或多种酶的表达或活性——应被广义地认为包括任何这样的遗传修饰，所述遗传修饰至少降低了2,3-丁二醇的生物合成、一种或多种酶的表达或活性或者在一些实施方案中基本抑制了一种或多种酶的表达或活性或基本阻止了2,3-丁二醇的产生。所述短语应被认为包括，例如：对编码一种或多种所述酶的基因的修饰(包括对参与基因表达的基因调节元件的修饰)；核酸的引入，所述核酸产生降低或抑制了一种或多种所述酶活性的蛋白、或者降低或阻止了一种或多种所述酶表达的蛋白；核酸的引入，所述核酸表达被改造为适于阻断基因表达的核酸(例如，反义RNA、siRNA(小干扰RNA)、CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列))；通过将修饰引入到编码蛋白的基因中来降低或抑制所述蛋白，所述蛋白是一种或多种所述酶的表达或活性所必需。应理解一种或多种所述酶的表达或活性所需的蛋白可直接作用于一种基因或一种或多种酶，或可间接通过其他化合物起作用。相似地，降低或抑制一种或多种所述酶的活性或表达的蛋白可直接作用于所述基因或所述一种或多种酶，或可间接通过其他化合物起作用。
“基因修饰”应被广义地认为并且意指包括，例如，将一种或多种外源核酸引入到微生物中、将突变引入基因位点上、添加或从基因组中移除一种或多种核苷酸、用不同的核苷酸置换一种或多种核苷酸、置换基因、移除基因、添加基因等等。
“亲代微生物”是用于产生本发明的重组微生物的微生物。在一种实施方案中，所述亲代微生物可以是天然存在的微生物(即野生型微生物)或之前曾被修饰过的微生物(遗传修饰的或重组微生物)。在本发明涉及产生降低量的或基本不产生2,3-丁二醇的微生物的实施方案中，所述亲代微生物是含有功能性的2,3-丁二醇途径的微生物(包括天然存在的微生物或之前曾被修饰过的微生物)。含有功能性的2,3-丁二醇生物合成途径的亲代微生物的实例包括自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、科斯卡塔梭菌以及相关分离株。
“功能性”的2,3-丁二醇生物合成途径是其中微生物能将丙酮酸转化成2,3-丁二醇的途径。在一个具体实施方案中，所述途径包括将丙酮酸转化成乙酰乳酸、将乙酰乳酸转化成乙偶姻、和将乙偶姻转化成2,3-丁二醇。在一个具体实施方案中，丙酮酸转化成乙酰乳酸是由乙酰乳酸合酶催化的、乙酰乳酸转化成乙偶姻是由乙酰乳酸脱羧酶催化的、乙偶姻转化成2,3-丁二醇是由2,3-丁二醇脱氢酶或乙偶姻还原酶催化的。
术语核酸“构建体”或“载体”及类似术语应被广义地认为包括适合用作载体将遗传物质转移到细胞中的任意核酸(包括DNA和RNA)。该术语应被认为包括质粒、病毒(包括噬菌体)、粘粒和人工染色体。构建体或载体可包括一种或多种调节元件、复制起点、多克隆位点和/或选择标记。在具体的实施方案中，所述构建体或载体被改造为适于破坏亲代微生物中天然存在的基因。在另一个实施方案中，所述构建体或载体被改造为适于使得由所述构建体或载体编码的一种或多种基因表达。核酸构建体或载体包括裸露核酸，以及用一种或多种可帮助向细胞递送中的试剂配制的核酸(例如脂质体缀合的核酸、其中含有所述核酸的有机体)。
在说明书通篇中，提供了适用于本发明的酶的示例性序列信息(例如，乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸脱羧酶、2,3-丁二醇脱氢酶、乙偶姻还原酶)。提供该信息用来鉴定适用于本发明的示例性酶并且使得技术人员能够实施本发明的具体实施方案而无需过多实验。应理解酶的核酸序列和氨基酸序列可根据微生物的不同而不同。因此，本发明不应被理解为仅限于这些具体的实施方案，而是应被理解为延伸到对这样的酶的破坏，即所述酶具有不同的序列但是能够催化丙酮酸转化成乙酰乳酸、乙酰乳酸转化成乙偶姻和/或乙偶姻转化成2,3-丁二醇。通常，所述酶具有和本文示例性的酶至少约75％的氨基酸序列同一性。在具体实施方案中，所述酶具有和本文示例性的酶至少约80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。在所述核酸水平上，编码这些变体酶的基因具有和编码本文示例性的酶的核酸至少约75％的序列同源性。在具体实施方案中，这些核酸具有和编码本文示例性的酶的核酸至少约80％、85％、90％、95％或99％的序列同源性。
也应理解所述变体酶不需要具有和本文具体示例性的酶相同的活性水平。只需要所述酶在催化目的转化时具有某些活性水平。技术人员会容易理解其他这样的酶，尤其是考虑到本文所包含的信息。用于评估所述2,3-丁二醇途径的酶的活性的酶测定法包括例如由Speckman and Collins(Specificity of the Westerfeld Adaptation of the Voges-Proskauer Test,1982,Appl.Environ.Microbiol.44:40-43)或Dulieu and Poncelet(Spectrophotometric assay of a acetolactate decarboxylase,1999,Enzy andMicrobiol Technol,25,537-42)记载的Voges-Proskauer test测定法。
微生物
如上文所述，本发明提供了重组微生物，所述重组微生物能够使用一氧化碳产生一种或多种产物(在一个具体实施方案中，乙醇作为主要产物)并且与亲代微生物相比能够产生减少量的或基本不产生2,3-丁二醇和/或其前体。所述微生物包含破坏了2,3-丁二醇生物合成途径的一种或多种遗传修饰(和亲代微生物相比)。
如上所述，在一个实施方案中，所述微生物产生乙醇作为主要产物。在一个实施方案中，所述微生物也产生甲酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的一种或多种。在一个实施方案中，所述微生物被改造为适于产生与亲代微生物相比的增加量的乙醇、甲酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的一种或多种。在某些实施方案中，所述微生物产生乙酰乳酸、苹果酸、柠檬酸、延胡索酸、2-酮戊二酸中的一种或多种。在一个具体实施方案中，所述微生物被改造为适于产生增加量的乙酰乳酸、苹果酸、延胡索酸、2-酮戊二酸中的一种或多种。
所述一种或多种遗传修饰优选破坏能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸、将乙酰乳酸转化成乙偶姻、将乙偶姻转化成2,3-丁二醇的一种或多种酶的表达和/或活性。在某些实施方案中，所述一种或多种遗传修饰仅破坏丙酮酸到乙酰乳酸的转化、仅破坏乙酰乳酸到乙偶姻的转化或仅破坏乙偶姻到2,3-丁二醇的转化。在其他实施方案中，所述一种或多种遗传修饰破坏了这些转化中的两种或三种。
在一个实施方案中，所述一种或多种能将丙酮酸转化为乙酰乳酸的酶是乙酰乳酸合酶(alsS)。
乙酰乳酸合酶活性能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸并且是支链氨基酸(包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)产生所必需的(图1)。可在亲代微生物中表达具有乙酰乳酸合酶活性的一种或多种酶。可从GenBank中获得自产乙醇梭菌(AEI90719.1、AEI90730.1、AEI90731.1、AEI90713.1、AEI90714.1)、扬氏梭菌(ADK15104.1、ADK15104.1、ADK15105.1、ADK15400.1、ADK15400.1)和拉氏梭菌(AEI90734.1、AEI90734.1、AEI90735.1、AEI90727.1、AEI90727.1)的示例性氨基酸序列以及自产乙醇梭菌(HQ876013.1、HQ876023.1、HQ876021.1)、扬氏梭菌(CP001666.1-CLJU_c38920、CLJU_c32420、CLJU_c20420-30)和拉氏梭菌(HQ876014.1、HQ876024.1、HQ876022.1)的各自核酸序列。但是，如上文所述，编码所述酶的基因的序列和所述酶的氨基酸序列可根据微生物的不同而变化。
在某些实施方案中，亲代微生物可包含一种以上能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的酶。当亲代微生物含有一种以上能够将丙酮酸转化成乙酰乳酸的酶时，可引入一种或多种基因修饰以使得破坏两种或多种所述酶的表达和/或活性。当亲代微生物中存在一种以上酶时，破坏一种以上所述酶可能产生以下作用：将琥珀酸、一种或多种TCA循环中间体和/或乙醇的产生增加到高于仅破坏单个酶时可达到的水平。可通过破坏存在于所述亲代微生物中的每一个额外的酶来进一步提高产生水平。虽然破坏所有所述酶的表达和/或活性可在所需产物的产生方面提供一些优势，本发明人认为不必破坏所有所述酶的表达和/或活性即可获得本发明的有益效果。
在一个实施方案中，至少两种、三种、四种或五种能够将丙酮酸转化为乙酰乳酸的酶被破坏。
在本发明的实施方案中，当丙酮酸到乙酰乳酸的转化基本或全部被阻断时，微生物的生长和通过微生物的发酵可能需要补充一种或多种氨基酸(包括，例如，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)。这可通过任何使氨基酸能够被微生物利用的方法来实现。例如，可将一种或多种氨基酸加入到培养、生长或发酵培养基中、微生物的培养物中、和/或发酵液中。在某些实施方案中，可将氨基酸直接加入到培养基或发酵液中或以提取物(例如酵母提取物)的形式加入。
在一个实施方案中，所述一种或多种能将乙酰乳酸转化为乙偶姻的酶是乙酰乳酸脱羧酶(budA)。
乙酰乳酸脱羧酶活性能够将乙酰乳酸转化为乙偶姻(图1)。可在亲代微生物中表达具有乙酰乳酸脱羧酶活性的一种或多种酶。可从GenBank中获得自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌的乙酰乳酸脱羧酶的示例性氨基酸(AEI90717.1、ADK13906.1、AEI90718.1)和核酸(HQ876011.1、CP001666.1-CLJU_c08380、HQ876012.1)序列信息。但是，如上文所述，编码所述酶的基因的序列和所述酶的氨基酸序列可根据微生物的不同而变化。
在某些实施方案中，亲代微生物可包含一种以上能够将乙酰乳酸转化为乙偶姻的酶。当亲代微生物含有一种以上这类酶时，可引入一种或多种基因修饰以使得破坏两种或多种所述酶的表达和/或活性。当亲代微生物中存在一种以上所述酶时，破坏一种以上所述酶可能产生以下作用：将缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乙醇、乳酸、甲酸和琥珀酸、和/或一种或多种TCA循环中间体的产生增加到高于仅破坏单个酶时可达到的水平。可通过破坏存在于所述亲代微生物中的每一个额外的酶来进一步提高产生水平。虽然破坏所有所述酶的表达和/或活性可在所需产物的产生方面提供一些优势，本发明人认为不必破坏所有所述酶的表达和/或活性即可获得本发明的有益效果。
在一个实施方案中，所述一种或多种能将乙偶姻转化为2,3-丁二醇的酶选自2,3-丁二醇脱氢酶(2,3-bdh)和乙偶姻还原酶。
2,3-丁二醇脱氢酶活性是能够将乙偶姻转化为2,3-丁二醇(图1)。可从GenBank中获得自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌的乙酰乳酸脱羧酶的示例性氨基酸(AEI90715.1、ADK15380.1、AEI90716.1)和核酸(HQ876009.1、CP001666.1-CLJU_c23220、HQ876010.1)序列信息。可在亲代微生物中表达具有乙酰乳酸合酶活性的一种或多种酶。例如，本发明人已经鉴定出自产乙醇梭菌、拉氏梭菌和扬氏梭菌含有其他能够将乙偶姻转化为2,3-丁二醇的伯醇：仲醇脱氢酶。SEQ ID nos34、35、36和37中提供了该酶的示例性序列信息。但是，如上文所述，编码所述酶的基因的序列和所述酶的氨基酸序列可根据微生物的不同而变化。
在某些实施方案中，亲代微生物可包括一种以上能够将乙偶姻转化为2,3-丁二醇的酶。当亲代微生物含有一种这类酶时，可引入一种或多种基因修饰以使得破坏两种或多种所述酶的表达和/或活性。当亲代微生物中存在一种以上这类酶时，破坏一种以上这类酶可能具有以下作用：将缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乙醇、乳酸、甲酸和琥珀酸、和/或一种或多种TCA循环中间体的产生增加到高于仅破坏单个酶时可达到的水平。可通过破坏存在于所述亲代微生物中的每一个额外的酶来进一步提高产生水平。虽然破坏所有所述酶的表达和/或活性可在所需产物的产生方面提供一些优势，本发明人认为不必破坏所有所述酶的表达和/或活性即可获得本发明的有益效果。
在一个实施方案中，至少两种或三种能够将乙偶姻转化为2,3-丁二醇的酶被破坏。
在一个实施方案中，所述微生物选自产乙酸一氧化碳营养型生物，包括自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德氏梭菌(Clostridium drakei)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、醋酸梭菌(Clostridiumaceticum)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、大梭菌(Clostridiummagnum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculumbacchii)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovate)、甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、Blautia producta、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)、凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。
这些一氧化碳营养型产乙酸菌由它们在形成乙酰-CoA、乙酸盐和其他产物的厌氧条件下利用并以气态一碳(C1)来源(例如一氧化碳(CO)和含有CO和/或氢气(H2)的二氧化碳(CO2))作为能源而进行化能自养生长的能力定义。所述一氧化碳营养型产乙酸菌具有相同的发酵模式，Wood-Ljungdahl或还原性乙酰-CoA途径，并且由以下酶组的存在定义，所述酶组包括一氧化碳脱氢酶(CODH)、氢化酶、甲酸脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶、甲酰四氢叶酸环水解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶和一氧化碳脱氢酶/乙酰-CoA合酶(CODH/ACS)，该组合是这类细菌特征性的和特有的(Drake,Küsel,Matthies,Wood,&Ljungdahl,2006)。与糖发酵细菌的化能自养生长相比——所述糖发酵细菌能将底物转化为生物质、次级代谢产物和从其形成产物(通过乙酰-CoA或直接形成)的丙酮酸，在产乙酸菌中底物被直接输送(channel)转化为乙酰-CoA，从乙酰-CoA形成产物、生物质和次级代谢产物。
在一个实施方案中，所述微生物选自一组一氧化碳营养型梭菌，所述梭菌包括自产乙醇梭菌、扬氏梭菌、和拉氏梭菌以及相关分离株。这些包括但不限于自产乙醇梭菌JAI-1T(DSM10061)(Abrini,Naveau,& Nyns,1994)、自产乙醇梭菌LBS1560(DSM19630)(WO/2009/064200)、自产乙醇梭菌LBS1561(DSM23693)、扬氏梭菌PETCT(DSM13528＝ATCC55383)(Tanner,Miller,& Yang,1993)、扬氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)(美国专利5,593,886)、扬氏梭菌C-01(ATCC 55988)(美国专利6,368,819)、扬氏梭菌O-52(ATCC 55989)(美国专利6,368,819)、或“拉氏梭菌P11T”(ATCC BAA-622)(WO 2008/028055)、和相关分离株例如“科斯卡塔梭菌”(US专利2011/0229947)、以及其突变株(例如，扬氏梭菌OTA-1)(Tirado-Acevedo O.Production of Bioethanol from Synthesis Gas UsingClostridium ljungdahlii.PhD thesis,North Carolina State University,2010)。
这些菌株形成梭菌rRNA I群内的亚群(Collins et al.,1994)，尽管如DNA-DNA再结合和DNA指纹印迹实验所测定的，所述菌株是不同的种属，但是它们在16S rRNA基因水平上具有至少99％的同一性(WO 2008/028055,美国专利2011/02299470)。
该群的菌株由共有的特征定义，它们有着类似的基因型和表型，同时它们均具有相同的保存能量的模式和发酵代谢模式。该群菌株缺少细胞色素并通过Rnf复合体保存能量。
该组的所有菌株的基因组大小为约4.2MBp(
Figure GDA0000651664670000271
et al.,2010)和GC组成为约32％mol(Abrini et al.,1994；
Figure GDA0000651664670000272
et al.,2010；Tanner et al.,1993)(WO 2008/028055；美国专利2011/0229947)并具有保守的必要关键基因操纵子，所述操纵子编码Wood-Ljungdahl途径的酶(一氧化碳脱氢酶、甲酰-四氢叶酸合成酶、亚甲基-四氢叶酸脱氢酶、甲酰-四氢叶酸环水解酶、亚甲基-四氢叶酸还原酶和一氧化碳脱氢酶/乙酰-CoA合酶)、氢化酶、甲酸脱氢酶、Rnf复合体(rnfCDGEAB)、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、醛:铁氧还蛋白氧化还原酶(
Figure GDA0000651664670000273
et al.,2010，2011)。已经发现所述Wood-Ljungdahl途径基因(负责气体摄取)的结构和数目在所有种属中都是一样的，尽管在核酸和氨基酸序列上不同(
Figure GDA0000651664670000274
et al.,2011)。
所述菌株都有着类似的形态和大小(对数生长细胞为0.5-0.7×3-510μm)，是嗜温的(最适生长温度为30-37℃)并且为严格厌氧菌(Abrini et al.,1994；Tanner et al.,1993)(WO 2008/028055)。而且，它们都具有相同的主要系统发育特征，例如相同的pH范围(pH 4-7.5，最适的初始pH为5.5-6)、依赖含CO的气体以类似的生长速率进行强的自养生长、以及代谢谱—以乙醇和乙酸作为主要发酵终产物并且在某些条件下形成的少量2,3-丁二醇和乳酸(Abrini et al.,1994；
Figure GDA0000651664670000275
et al.,2010；Tanner et al.,1993)(WO2008/028055)。所有的种都发现有吲哚产生。但是，所述种在对不同糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡萄糖酸、柠檬酸)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)、或其它底物(例如甜菜碱、丁醇)的底物利用上是不同的。发现一些种是某些维生素(例如硫胺素、生物素)的营养缺陷型而其它种则不是。在这些生物范围内已经显示出羧酸被还原成它们对应的醇(Perez,Richter,Loftus,& Angenent,2012)。
因此所述特征不是一种生物(如自产乙醇梭菌或扬氏梭菌)所特有的，而是一氧化碳营养型的且能够合成乙醇的梭菌属的一般特征。因此，可预期本发明可用于这些菌株，尽管表现上可能会有不同。
在某些实施方案中，所述亲代微生物选自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌。在一个实施方案中，该组也包括科斯卡塔梭菌。在一个具体实施方案中，所述亲代微生物是自产乙醇梭菌DSM23693。
可使用任意数量的已知的转化和重组核酸技术修饰亲代微生物以得到本发明的微生物。这些技术记载于例如Sambrook et al,(Molecular Cloning:A laboratorymanual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)中。又例如，可使用下文实施例部分描述的方法。
一般举例来说，在将突变引入基因、或破坏或敲除基因的情况下，可设计合适的核酸构建体或载体以整合到亲代微生物的基因组中以破坏所述基因。这些构建体通常包括和待破坏的基因内区域或侧翼区域同源的核酸序列(同源臂)，这样使得能够发生同源重组，并且能够发生突变的引入、该基因的一个核酸区域的切除、或用不同的核酸对一个基因区域的置换。虽然优选的是所述构建体的同源臂和他们靶向的基因组上的区域具有100％的互补性，但是这也不是必须的，只要序列足够互补以使得能够和目的基因区域靶向重组。通常，如Sambrook et al 1989中所定义的，同源臂具有能够使得在严格条件下与靶向区域杂交的同源性水平。
考虑到参与2,3-丁二醇生物合成途径的酶的可用序列信息，技术人员会了解足以允许将外源基因靶向同源重组和整合到亲代微生物基因组中的核酸序列。但是，例如，在budA的例子中，可使用本文描述的侧翼同源臂(例如，Seq ID 3、4和78-81)，或者在扬氏梭菌的例子中，可从GenBank上的核酸序列信息设计本文描述的侧翼同源臂(CP000166.1)。又例如，可从相关微生物的基因组序列信息中确定依据本发明的待破坏的编码酶的基因的侧翼序列。具体举例来说，可从GenBank CP001666.1上的信息中确定扬氏梭菌中的侧翼序列。
以其他一般实例来说，当将核酸引入到亲代微生物以用来表达抑制2,3-丁二醇生物合成途径的酶的表达和/活性的蛋白或核酸时、或用来表达提高抑制2,3-丁二醇生物合成途径的酶的表达和/活性的化合物表达的蛋白时，可设计构建体以使得所述蛋白在微生物中表达。通常，构建体包括合适的调节元件(包括启动子)。可使用组成型或诱导型启动子。
当本发明采用通过引入突变等对基因的直接破坏时，如上所述，用于转化所述亲代微生物的构建体或载体会被改造为适于整合到微生物的基因组中。在表达蛋白或核酸的情况下——所述蛋白或核酸被改造为适于破坏2,3-丁二醇生物合成途径的酶的表达或活性、或者适于提高参与该途径的酶的抑制剂的表达或活性，所述构建体在转化亲代微生物时可保持染色体外状态或可被改造为适于整合到所述微生物的基因组中。因此，用于本发明的构建体可包括核苷酸序列，所述核苷酸序列被改造为适于帮助整合(例如可允许同源重组并靶向整合到宿主基因组中的区域)或帮助染色体外构建体的表达和复制(例如复制起点、启动子和其他调节元件或序列)。
可使用任意数量的本领域的标准技术构建用于本发明的核酸构建体。例如，可使用化学合成或重组技术。这类技术记载于例如，Sambrook et al(Molecular Cloning:Alaboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)。其他示例性技术记载于下文的实施例部分。实质上，所述个体基因、调节元件、同源臂等等将被可操作地相互连接以使得它们能够执行它们的所需功能。本领域普通技术人员会了解用于本发明的适当载体。但是，举例来说，下述载体可能是适合的：pMTL、pIMP、pJIR和下文实施例部分所示例的质粒。
应理解，用于产生本发明的微生物的核酸可以是任何适合的形式，包括DNA、RNA或cDNA(包括双链和单链核酸)。
可将所述一种或多种外源核酸以裸露核酸形式递送到亲代微生物或可将其用一种或多种可促进转化过程的试剂配制(例如脂质体缀合的核酸、其中含有所述核酸的有机体)。合适时，所述一种或多种核酸可以是DNA、RNA或其组合。
可使用任意数量的本领域中已知用于产生重组微生物的技术由亲代微生物和一种或多种外源核酸制备本发明的微生物。仅举例来说，转化(包括转导或转染)可通过电穿孔、接合(conjugation)、原噬菌体诱导、或化学感受态或天然感受态来实现。适合的转化技术记载于例如Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratoryManual,Cold Spring Harbour Labrotary Press,Cold Spring Harbour,1989。
又例如，可使用记载于Koepke et al.2010,Poc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.107:13087-92；PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905；Straetz et al.,1994,Appl.Environ.Microbiol.60:1033-37；Mermelstein et al.,1992,Biotechnology,10,190-195；Jennert et al.,2000,Microbiology,146:3071-3080；Tyurin et al.,2004,Appl.Environ.Microbiol.70:883-890中的电穿孔技术。又例如，可使用记载于PrasannaTamarapu Parthasarathy,2010,Development of a Genetic Modification System inClostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants,Masters ProjectWestern Kentucky University中的原噬菌体诱导技术。又例如，可使用记载于Herbert etal.,2003,FEMS Microbiol.Lett.229:103-110或Williams et al.,1990,J.Gen.Microbiol.136:819-826中的接合方法。
在某些实施方案中，由于在要转化的微生物中具有活性的限制性系统，必须将要引入所述微生物的核酸甲基化。这可使用多种技术进行，所述技术包括下文描述的那些，其在下文实施例部分进一步示例说明。
举例来说，在一个实施方案中，通过包括如下步骤的方法产生本发明的重组微生物：
将(i)本文描述的待引入到亲代微生物的构建体/载体和(ii)包含甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体引入穿梭微生物；
表达所述甲基转移酶基因；
从所述穿梭微生物分离一种或多种构建体/载体；和，
将所述一种或多种表达构建体/载体引入目标微生物。
在一个实施方案中，步骤B的甲基转移酶基因是组成型表达的。在另一个实施方案中，步骤B的甲基转移酶基因的表达是诱导的。
所述穿梭微生物是可促进组成所述表达构建体/载体的核酸序列的甲基化的微生物，优选限制性酶阴性(restriction negative)的微生物。在具体实施方案中，所述穿梭微生物是限制性酶阴性的大肠杆菌、枯草杆菌(Bacillus subtillis)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
所述甲基化构建体/载体包含编码甲基转移酶的核酸序列。
一旦所述表达构建体/载体和甲基化构建体/载体被引入所述穿梭微生物，存在于所述甲基化构建体/载体上的甲基转移酶基因就被诱导。可通过任意适合的启动子系统进行诱导，但在本发明一个具体的实施方案中，所述甲基化构建体/载体包含诱导型lac启动子(例如，在SEQ_ID NO 31中)并且可通过加入乳糖或其类似物，更优选异丙基-β-D-硫代-半乳糖苷(IPTG)来诱导。其他适合的启动子包括ara、tet或T7系统。在本发明另一个实施方案中，所述甲基化构建体/载体启动子是组成型启动子。
在一个具体的实施方案中，所述甲基化构建体/载体具有对所述穿梭微生物的种类特异性的复制起点，以使存在于所述甲基化构建体/载体上的任意基因均可在所述穿梭微生物中表达。优选地，所述待引入到亲代微生物的构建体/载体具有对所述目标微生物的种类特异性的复制起点。
所述甲基转移酶的表达可导致存在于所述待引入到亲代微生物的构建体/载体上的基因的甲基化。然后，可根据许多已知方法中的任一种将所述构建体/载体从所述穿梭微生物中分离。仅举例来说，可使用下文实施例部分描述的方法分离所述构建体/载体。
在一个具体的实施方案中，两种构建体/载体被共分离。
可使用任意数量的已知方法，将所述靶向(destined for)亲代微生物的构建体/载体引入所述微生物。但是，举例来说，可使用下文实施例部分描述的方法。
可以想到，可将甲基转移酶基因引入穿梭微生物并过表达。因此在一个实施方案中，可以使用已知方法收集所得的甲基转移酶并在体外用于甲基化所述待引入亲代微生物中的构建体。然后，可将所述构建体/载体引入所述目标(亲代)微生物。在另一个实施方案中，将甲基转移酶基因引入所述穿梭微生物的基因组，然后将所述靶向(destined for)亲代微生物的构建体/载体引入所述穿梭微生物，从所述穿梭微生物中分离一种或多种构建体/载体，然后将所述构建体/载体引入目标(亲代)微生物。
可以想到，可将如上文所定义的靶向(destined for)亲代微生物的构建体/载体和甲基化构建体/载体结合以提供一种目标组合物。这种组合物在绕过限制性屏障机制以产生本发明的重组微生物方面特别有用。
在一个具体实施方案中，上文所述的构建体/载体是质粒。
本领域普通技术人员会了解用于产生本发明的微生物的许多适合的甲基转移酶。但是，可以使用例如枯草杆菌噬菌体ΦT1甲基转移酶和下文实施例中描述的甲基转移酶。考虑到所需甲基转移酶的序列和遗传密码，应容易地了解编码适合的甲基转移酶的核酸。在一个实施方案中，编码甲基转移酶的核酸如下文实施例所述(例如SEQ_ID NO31的核酸)。
可以使用任意数量的被改造为适于使甲基转移酶基因表达的构建体/载体来产生所述甲基化构建体/载体。但是，举例来说，可使用下文实施例部分描述的质粒。
根据本文包含的信息，会理解可改造(tailor)亲代微生物的遗传修饰以利于使得一种或多种产物的产生优于一种或多种其他产物。例如，破环丙酮酸到乙酰乳酸的转化有利于使得乳酸、甲酸、苹果酸、延胡索酸、柠檬酸、琥珀酸和2-酮戊二酸的产生优于缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的产生。
产生方法
本发明提供了一种用于通过微生物发酵产生一种或多种产物的方法，所述方法包括使用本发明的微生物发酵含CO的底物。在一种具体的实施方案中，所述方法用于通过微生物发酵产生乙醇或一种或多种其他产物，其包括使用本发明的微生物发酵含CO的底物。本发明的方法可用于减少来自工业过程的总的大气碳排放。
优选地，所述发酵包括使用本发明的重组微生物在生物反应器中厌氧发酵底物以产生所述一种或多种产物(在一种具体的实施方案中，乙醇、或乙醇和一种或多种其他产物)的步骤。
在一个实施方案中，所述方法包括如下步骤：
(a)将含CO的底物提供给生物反应器，所述生物反应器含有本发明第一方面的一种或多种微生物的培养物；和
(b)在所述生物反应器中厌氧发酵所述培养物以产生一种或多种产物(在一个实施方案中包括乙醇)。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
i.在由工业生产过程产生的含CO的气体释放到大气中之前，将所述气体捕获；
ii.通过培养物厌氧发酵含CO的气体以产生一种或多种产物(在一个实施方案中包括乙醇)，所述培养物含有本发明第一方面的一种或多种微生物。
在本发明的一个实施方案中，被所述微生物发酵的气态底物是含CO的气态底物。所述气态底物可以是作为工业过程副产物或者从某些其他来源(例如汽车废气)获得的含CO的废气。在某些实施方案中，所述工业过程选自铁金属产品生产例如钢铁厂、有色金属产品生产、石油精炼过程、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、天然气精炼、甲醇生产和焦炭生产。在这些实施方案中，可在所述含CO的气体被排放到大气中之前使用任意方便的方法从所述工业过程中将其捕获。所述CO可以是合成气(含一氧化碳和氢气的气体)的组分。从工业过程产生的CO通常被燃烧掉来产生CO2，因此本发明在减少CO2温室气体排放和产生用作生物燃料的丁醇方面尤其有用。根据所述含CO的气态底物的组成，还可能需要对其进行处理，以在将其引入所述发酵之前除去任何不需要的杂质例如尘粒。例如，可使用已知的方法过滤或洗涤所述气态底物。
应理解，为使所述细菌生长并发生CO到乙醇(和/或其他产物)的转化，除所述含CO的底物气体外，需要将适合的液体营养培养基进料至所述生物反应器。所述底物和培养基可以以连续、分批或分批补料方式进料至所述生物反应器。营养培养基会含有足以允许所使用的微生物生长的维生素和矿物质。适合用于使用CO进行发酵以产生乙醇(和任选的一种或多种其他产物)的厌氧培养基是本领域中已知的。例如，Biebel(Journal ofIndustrial Microbiology & Biotechnology(2001)27,18-26)记载了适合的培养基。所述底物和培养基可以以连续、分批或分批补料方式进料至所述生物反应器。在本发明的一个实施方案中，所述培养基如下文实施例部分所述。
合乎需要地，所述发酵应在用于发生CO到乙醇(和/或其他产物)的发酵的合适条件下进行。应考虑的反应条件包括：压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电势、搅拌速率(如果使用连续搅拌釜反应器的话)、接种物水平、确保所述液相中的CO不成为限制的最大气体底物浓度以及避免产物抑制的最大产物浓度。
此外，通常需要增加底物流中的CO浓度(或气态底物中的CO分压)，从而提高CO作为底物时发酵反应的效率。在增加的压力下操作可显著增加CO从气相转移到液相的速率，在液相中CO可被所述微生物作为碳源摄取用于产生所述乙醇(和/或其他产物)。这进而意味着，当生物反应器保持在升高的压力而非大气压力下时，可减少保留时间(定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流速)。最佳反应条件将部分地取决于本发明所使用的具体微生物。但是，一般来说，优选的是所述发酵在高于环境压力的压力下进行。并且，因为给定的CO到乙醇(和/或其他产物)的转化率部分地是所述底物保留时间的函数，并且实现所需保留时间进而限定了生物反应器的所需体积，所以使用增压系统可大大地减少所需的生物反应器的体积，从而减少所述发酵设备的资金成本。依据美国专利no.5,593,886中给出的实例，反应器体积的减少与反应器操作压力的增加成线性比例，即在10个大气压下操作的生物反应器仅需要是在1个大气压下操作的生物反应器体积的十分之一。
已经在别处描述了在升高的压力下进行气体到乙醇发酵的益处。例如，WO 02/08438描述了在30psig和75psig压力下进行的气体到乙醇的发酵，获得的乙醇产率分别为150g/l/天和369g/l/天。但是，发现在大气压下使用相似的培养基和输入气体组成进行的示例性发酵产生1/20到1/10的乙醇/升/天。
还合乎需要的是，含CO的气态底物的引入速率是这样的，即确保液相中的CO浓度不成为限制。这是因为CO受限的条件的结果可能是乙醇产物被所述培养物消耗。
用于进料至发酵反应的气流组成可对所述反应的效率和/或成本有显著影响。例如，O2可降低厌氧发酵过程的效率。在发酵之前或之后的发酵过程各阶段中，对不需要或不必要的气体的处理会增加这些阶段的负担(例如，当在气体流进入生物反应器之前将气体流压缩时，不必要的能量可能被用于压缩发酵中不需要的气体)。因此，可能需要处理底物流(尤其是来自工业来源的底物流)以除去不需要的组分并增加需要的组分的浓度。
在某些实施方案中，将本发明的细菌培养物维持在水性培养基中。优选地，所述水性培养基是基本厌氧微生物生长培养基。合适的培养基是本领域中已知的，记载于例如美国专利no.5,173,429和5,593,886和WO 02/08438，并且如下文实施例部分所述的。
可通过本领域中已知的方法从发酵液中回收本发明方法产生的一种或多种产物(在一个实施方案中，产生乙醇、或含有乙醇和/或一种或多种其他产物的混合醇流)，所述方法例如分馏或蒸发、渗透蒸发、以及萃取发酵(包括例如液-液萃取)。也可通过本领域中已知的方法从发酵液中回收副产物，例如酸(包括乙酸盐)。例如，可使用含有活性炭过滤器的吸附系统或电渗析。或者，也可使用连续气提。
在本发明某些优选实施方案中，可通过以下方式从所述发酵液中回收乙醇和/或一种或多种其他产物：从所述生物反应器连续移出部分发酵液，从所述发酵液中分离微生物细胞(方便地通过过滤)，并从所述发酵液中回收一种或多种产物。醇可通过例如蒸馏方便地回收，酸可通过例如吸附到活性炭上来回收。优选地将分离的微生物细胞返回至所述发酵生物反应器。优选地将已除去任何的醇和酸后剩余的无细胞渗透物返回至所述发酵生物反应器。可将另外的营养物(例如B族维生素)加入到所述无细胞渗透物中以在将其返回至所述生物反应器之前补充所述营养培养基。
同样地，如果如上所述调整所述发酵液的pH以增强乙酸到活性炭的吸附，那么应在将其返回至所述生物反应器之前将pH重新调整到与所述发酵生物反应器中发酵液类似的pH。
可使用以下很多技术从发酵液中回收琥珀酸，例如，酸化、与离子交换层析结合的电渗析(Song and Lee,2006,Enzyme Microb Technol 39,352-361)、Ca(OH)沉淀与过滤和添加硫酸(Lee et al 2008,Appl Microbiol Biotechnol 79,11-22)、或使用基于胺的萃取剂(例如三正辛胺)的化学萃取(Huhet al,2006,Proc Biochem 41,1461-1465)。对于所有的方法，具有游离酸形式而非盐形式是至关重要的。但是大多数琥珀酸的生物技术产生过程都在pH6-7的中性或微酸范围内操作。考虑到琥珀酸的pKa(pKa＝4.16和5.61)，在这些情况下，大部分琥珀酸都以盐而非游离酸的形式存在。但是已知自产乙醇梭菌和一氧化碳营养型产乙酸菌在所需要的pH4-6的低pH范围下耐受和生长。
可相对容易地通过以下方法从发酵液中回收支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸：浓缩(例如反渗透)、生物质的结晶或去除(例如超滤或离心)和离子交换层析(Ikeda,A.,2003,Amino Acid Production Processes,in R.Faurie and J.Thommel(eds.)Microbial production of L-amin acids,1-35)。
可通过任何已知的方法从发酵液中回收乳酸、甲酸、2-酮戊二酸和其他产物。但是，例如，在乳酸的情况下，传统的发酵过程产生可被收集和再酸化的乳酸钙沉淀。或者，可使用膜技术(例如电渗析)来分离乳酸。可通过在选择性离子渗透膜上应用适合的电势从发酵液中分离低浓度的乳酸。其他适合的技术包括纳米过滤，其中单价离子可在压力下选择性地穿过膜。
应理解，在一些情况下，可使用所述方法产生和回收除了乙醇之外的产物(例如，包括缬氨酸、亮氨酸、琥珀酸、丙酮酸、乳酸和甲酸的一种或多种产物)。因此，本发明应被理解为包括用于产生这些产物中的一种或多种的方法。
实施例：
现将参照如下非限制性实施例更详细地描述本发明。
实施例1：
通过同源重组删除自产乙醇梭菌budA基因
使用包含自产乙醇梭菌DSM23693的budA基因的5’和3’同源臂的质粒进行遗传修饰(图1-2)。使用新的甲基转移酶将所述质粒在体内甲基化，接着将其转化到自产乙醇梭菌DSM23693(DSMZ，德国)中。已经通过PCR和通过抑制自产乙醇梭菌DSM23693 ΔbudA菌株中的2,3-丁二醇的产生表明了所述budA基因的敲除。
表达质粒的构建：
本发明使用了标准重组DNA和分子克隆技术，这些技术由Sambrook et al,1989和Ausubel et al,1987记载。从NCBI中获得了自产乙醇梭菌DSM23693的5’上游侧翼同源臂(Seq.ID 3)和3’下游侧翼同源臂(Seq.ID 4)的DNA序列。
根据制造商的说明书，使用Invitrogen的Purelink Genomic DNA mini kit分离来自自产乙醇梭菌DSM23693的基因组DNA。
以自产乙醇梭菌DSM23693基因组DNA作模板、iProof高保真DNA聚合酶(Bio-RadLabratories)和表1中的寡核苷酸通过PCR扩增所述5’(Seq.ID 3)和3’侧翼同源臂(Seq.ID4)，并且PCR所用程序如下：98℃初始变性30s，然后25个循环的变性(98℃，10s)、退火(60℃，15s)和延伸(72℃，30s)，然后是最后延伸步骤(72℃，7min)。
表1：用于克隆的寡核苷酸
Figure GDA0000651664670000371
用Sbf1和Not1限制酶切割扩增的budA基因的964bp的5’侧翼同源臂(5’HA)并使用Sbf1和Not1限制性位点和E.coli XL1-Blue MRF’Kan菌株(Stratagene)将其克隆到大肠杆菌-梭菌穿梭载体pMTL 85141中(Seq.ID 9；FJ797651.1；Nigel Minton,University ofNottingham；Heap et al.,2009)中。用NheI和AscI切割所构建的质粒pMTL85141-budA-5’HA和所述budA基因的3’同源臂的977bp的PCR产物。将这些消化的DNA片段的连接物转化到E.coli XL1-Blue MRF’Kan(Stratagene)中，得到质粒pMTL85141-budA-ko。使用表1中给出的寡核苷酸将所得到的质粒pMTL85141-budA-ko(SEQ_ID No.12)的插入片段完全测序，测序结果确认了5’和3’同源臂都不含突变。
DNA的甲基化：
如美国专利申请13/049,263中记载的，通过比对来自自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌的甲基转移酶基因设计了和诱导型lac启动子融合的杂交甲基转移酶基因(SEQID No.31)。所述甲基转移酶的表达产生了具有SEQ ID No.32序列的蛋白。化学合成所述杂交甲基转移酶基因并使用EcoRI将其克隆到载体pGS20(ATG:biosynthetics GmbH,Merzhausen,Germany-SEQ ID No.33)中。将所得到的甲基化质粒pGS20-甲基转移酶和质粒pMTL85141-budA-ko双转化到限制性酶阴性的E.coli XL1-Blue MRF’Kan(Stratagene)中。通过加入1mM IPTG诱导体内甲基化，并使用Zymo mini prep Kit(Zymo)分离甲基化的质粒。将所得到的甲基化质粒组合物用于转化自产乙醇梭菌DSM23693。
转化：
在完全转化实验过程中，在还原剂的存在下并使用由Hungate(1969)和Wolfe(1971)记载的标准厌氧技术，在37℃下用30psi钢铁厂废气(收集自New Zealand Steelsite in Glenbrook，NZ；组成：44％ CO、32％ N2、22％ CO2、2％ H2)使自产乙醇梭菌DSM23693在YTF培养基(表2)中生长。
表2：YTF培养基
培养基组分 每升储液
酵母提取物 10g
胰蛋白胨 16g
氯化钠 0.2g
果糖 10g
蒸馏水 To1L
还原剂储液 每100mL储液
NaOH 0.9g
Cystein.HCl 4g
Na2S 4g
蒸馏水 To100mL
为制备感受态细胞，将50ml自产乙醇梭菌DSM23693的培养物继代培养到新鲜YTF培养基中，持续培养5天。使用这些细胞以0.05的OD600nm接种含40mM DL-苏氨酸的50ml YTF培养基。当所述培养物的OD600nm达到0.5时，将所述细胞在冰上孵育30分钟接着将其转移到厌氧培养室中，并在4℃下以4,700×g收集。将所得培养物用冰冷的电穿孔缓冲液(270mM蔗糖、1mM MgCl2、7mM磷酸钠，pH 7.4)洗涤2次，最后重悬于600μl体积的新鲜电穿孔缓冲液。将所得混合物转移到预冷的电穿孔杯(电极间隙为0.4cm，含有2μg甲基化的质粒混合物和1μl I型限制性抑制剂(Epicentre Biotechnologies))中，并立即用Gene pulser Xcellelectroporation system(Bio-Rad)进行冲击，其设置如下：2.5kV、600Ω和25μF。时间常数达到3.7-4.0ms。将所述培养物转移到5ml新鲜YTF培养基中。使用配备有管支架的Spectronic Helios Epsilon分光光度计(Thermo)在600nm波长下监测细胞的再生。生物质的初始降低后，细胞开始再次生长。一旦生物质从该点开始倍增，约200μl培养物在YTF琼脂平板和含有5g/l果糖的PETC琼脂平板(两个平板都含有1.2％BactoTM Agar(BD)和15μg/ml甲砜霉素)上铺展开来。在37℃下用30psi钢铁厂气体孵育3-4天后，可清楚看见500个克隆/板。
表3：PETC培养基(ATCC培养基1754；
atcc.org/Attachments/2940.pdf)
培养基组分 每1.0L培养基浓度
NH<sub>4</sub>Cl 1g
KCl 0.1g
MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 0.2g
NaCl 0.8g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.1g
CaCl<sub>2</sub> 0.02g
微量金属溶液 10ml
Wolf’s维生素溶液 10ml
酵母提取物 1g
刃天青(2g/l储液) 0.5ml
MES 2g
还原剂 0.006-0.008％(v/v)
蒸馏水 最高达1L，pH5.5(用HCl调节)
Wolf’s维生素溶液 每升储液
生物素 2mg
叶酸 2mg
盐酸吡哆醇 10mg
Thiamine.HCl 5mg
核黄素 5mg
烟酸 5mg
钙D-(+)泛酸盐 5mg
维生素B<sub>12</sub> 0.1mg
对氨基苯甲酸 5mg
硫辛酸 5mg
蒸馏水 至1L
微量金属溶液 每升储液
次氮基三乙酸 2g
MnSO<sub>4</sub>.H<sub>2</sub>O 1g
Fe(SO<sub>4</sub>)<sub>2</sub>(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O 0.8g
CoCl<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O 0.2g
ZnSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O 0.2mg
CuCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O 0.02g
NaMoO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O 0.02g
Na<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub> 0.02g
NiCl<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O 0.02g
Na<sub>2</sub>WO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O 0.02g
蒸馏水 至1L
还原剂储液 每100mL储液
NaOH 0.9g
Cystein.HCl 4g
Na2S 4g
蒸馏水 至100mL
将所述克隆在也含有5g/l果糖和15μg/ml甲砜霉素的新鲜PETC琼脂平板上划线。在37℃下用30psi钢铁厂气体孵育2天后，将来自这些平板的单克隆在新鲜的非选择性的仅含有5g/l果糖的PETC琼脂平板上再划线。再重复一次在含有5g/l果糖的PETC琼脂平板上的划线并在37℃下用30psi钢铁厂气体孵育平板。3天以后，将生长在非选择性培养基上的6个单克隆接种到含有5g/l果糖的2ml PETC液态培养基中。当出现生长时，将所述培养物连续放大到5ml、25ml和然后放大到50ml PETC培养基，所述培养基都含有5g/l果糖且30psi钢铁厂气体作为碳源。
成功转化的确认：
自产乙醇梭菌：为验证所述6个克隆的同一性和所述DNA转化，根据制造商的说明书，使用PurelinkTM Genomic DNA mini kit(Invitrogen)从PETC液态培养基里的所有6个克隆中分离基因组DNA。在PCR中用这些基因组DNA和自产乙醇梭菌DSM23693野生型中的基因组DNA作模板。用iProof高保真DNA聚合酶(Bio-Rad Labratories和表4中列出的引物进行PCR，所用程序如下：98℃初始变性2分钟，然后25个循环的变性(98℃，10s)、退火(61℃，15s)和延伸(72℃，90s)，然后是最后延伸步骤(72℃，7min)。在对照PCR中用野生型自产乙醇梭菌DSM23693的基因组DNA做模板。
表4：用于质粒和种的PCR确认的寡核苷酸
Figure GDA0000651664670000411
为了确认所述6个克隆的同一性，使用引物fD1(Seq.ID.27)和rP2(Seq.ID 28)以及使用如上所述的PCR条件针对16s rRNA基因进行PCR。使用Zymo Clean和ConcentratorTMkit纯化PCR产物并使用引物rP2(Seq.ID 28)测序。所有6个克隆的序列(Seq.ID.13-19)显示与自产乙醇梭菌的16s rRNA基因(Seq.ID 15；Y18178,GI:7271109)至少90％的同一性。
使用引物Og09f(Seq.ID.5)和Og12r(Seq.ID.8)对具有特异性针对budA目标区域的引物的6个分析克隆进行的PCR从6个克隆中的5个扩增出2.2kb DNA片段。用野生型自产乙醇梭菌DSM23693基因组DNA扩增2.7kb的PCR产物。通过使用表5中列出的引物进行测序(Seq ID 20-26)确认了来自潜在的budA敲除克隆的2.2kb PCR产物的同一性并且在这些片段中没有检测到budA基因的序列。所述lacZDNA片段已经取代了所述budA基因。通过使用特异性针对自产乙醇梭菌DSM23693 budA基因(其仅能从野生型自产乙醇梭菌DSM23693中被扩增出来)的275bp内部区域的引物Og44f(Seq.ID.29)和Og45r(Seq.ID.30)进行PCR再次确认了这6个克隆中budA基因的缺失。
2,3-丁二醇产生的缺失和乙醇产率的增加：
为说明乙偶姻和随后的2,3-丁二醇产生的缺失，使用上文所述的钢铁厂废气(组成：44％ CO、32％ N2、22％ CO2、2％ H2；收集自Steel site in Glenbrook,New Zealand)和PETC培养基用克隆1进行了三次平行血清瓶试验。未修饰的自产乙醇梭菌DSM23693野生型菌株作为对照在相同的条件下生长。
使用装备有在35℃下操作的RID(折射率检测器，Refractive Index Detector)和保持在32℃下的Alltech IOA-2000Organic acid column(150x6.5mm,颗粒大小5μm)的Agilent 1100Series HPLC系统进行了代谢物的分析。使用微酸化的水(0.005M H2SO4)作为流动相，流速为0.25ml/min。为去除蛋白和其他细胞残渣，将400μl样品与100μl 2％(w/v)5-磺基水杨酸混合并以14,000xg离心3分钟以分离沉淀的残渣。接着将10μl上清液注射到HPLC中用于分析。
使用ΔbudA自产乙醇梭菌DSM23693克隆1和未修饰的野生型自产乙醇梭菌DSM23693进行的血清瓶试验的结果示出于表5中。ΔbudA自产乙醇梭菌DSM23693菌株的最大生物质具有比所述未修饰的野生型(生长到0.58的OD600nm)相对较低的0.32的OD600nm。和野生型相比，在ΔbudA自产乙醇梭菌DSM23693克隆1的培养物中检测不到2,3-丁二醇，而且所述ΔbudA自产乙醇梭菌DSM23693克隆1的乙醇产率显著高于未修饰的自产乙醇梭菌DSM23693(表5)。
表5：由ΔbudA自产乙醇梭菌DSM23693克隆1和未修饰的野生型自产乙醇梭菌DSM23693产生的代谢物(与生物质相比)
Figure GDA0000651664670000431
其他代谢物的产生-乳酸、甲酸、琥珀酸、2-酮戊二酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸：
同时，令人感兴趣的是，当所述未修饰的自产乙醇梭菌DSM23693仅产生0.02g/l乳酸作为其他副产物，ΔbudA自产乙醇梭菌DSM23693产生了显著更高量的0.07g/l乙酸(标准化为生物质0.197g/l)以及0.53g/l甲酸(标准化为生物质1.647g/l)和0.13g/l琥珀酸(标准化为0.344g/l生物质)(表5)。这种提高可能来自丙酮酸——2,3-丁二醇的早前体(图1)的累积，所述累积是因为budA基因敲除阻碍了2,3-丁二醇产生。
也通过气相色谱-质谱法(GC-MS)确认了ΔbudA自产乙醇梭菌DSM23693的琥珀酸和乳酸的产生。于此，对约2.5ml ΔbudA自产乙醇梭菌DSM23693克隆1的培养物离心——所述克隆1在0.32的光密度下在钢铁厂废气(组成：44％ CO、32％ N2、22％ CO2、2％ H2；收集自Steel site in Glenbrook,New Zealand)下生长，并通过0.2μm的过滤器过滤上清液(Smart KF,Aggio RB,Van Houtte JR,Villas-
Figure GDA0000651664670000432
SG,Analytical platform formetabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformatederivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry,NatProtoc.2010 Sep；5(10):1709-29.2010)。将约0.65ml野生型自产乙醇梭菌DSM23693的培养物和2.5ml空白培养基进行类似的处理。在奥克兰大学将样品冻干并用GC-MS平行分析3次。如表6所示，和未修饰的自产乙醇梭菌DSM23693和对照空白培养基相比，ΔbudA自产乙醇梭菌DSM23693克隆1中琥珀酸和乳酸信号的峰值强度更强。琥珀酸和乳酸的GC-MS结果与HPLC结果一致。
GC-MS结果(表6)不仅确认了ΔbudA自产乙醇梭菌DSM23693克隆1产生了乳酸和琥珀酸，还显示产生了产生自丙酮酸和乙酰乳酸的2-酮戊二酸、除了琥珀酸之外的其他不完全TCA循环终产物、和支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，所述丙酮酸和乙酰乳酸(即2,3-丁二醇的前体)可能在ΔbudA自产乙醇梭菌中以升高的水平存在。还没有检测TCA循环中间体例如苹果酸、延胡索酸、柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸，但是它们可能被提高，因为已经发现产生了终产物琥珀酸和2-酮戊二酸(图1b)。
表6：通过GC-MS对ΔbudA自产乙醇梭菌DSM23693克隆1(ΔbudA)和未修饰的野生型自产乙醇梭菌DSM23693(野生型)的代谢物分析。培养基作为对照包括在分析中。表中给出的值对应从每次重复(R)中得到的标准化的峰值强度。ND表示未检测。
Figure GDA0000651664670000451
乙偶姻和2,3-丁二醇的产生通常和强丙酮酸的去酸化相关(Xiao,Z.,andP.Xu.2007.Acetoin metabolism in bacteria.Crit.Rev.Biochem.Microbiol.33:127–140)，所述强丙酮酸的脱酸化可通过破坏能量保存所需的内部pH和质子梯度对细胞造成严重威胁。乙偶姻和2,3-丁二醇都是pH中性的化合物。2,3-丁二醇的产生还充当电子冷阱(electron sink)以去除在发酵过程中产生的过剩的还原当量。
不希望囿于任何具体理论，本发明人认为通过敲除乙偶姻和2,3-丁二醇的产生，细胞需要找到其他方式去酸化丙酮酸(pKa＝2.50)和去除还原当量，并因此将其代谢转换到其他(新的)产物的产生上，所述其他产物为例如支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，琥珀酸(pKa1＝4.20,pKa2＝5.60)，乳酸(pKa＝3.86)，和甲酸(pKa＝3.77)。琥珀酸的产生也可能有机会去除4种还原当量，同时乳酸的产生可去除2个还原当量。
实施例2：琥珀酸途径
琥珀酸产生的途径描述于图1b中。在自产乙醇梭菌中鉴定出各个基因并证明了酶活力。
在第一步骤中，将丙酮酸转化为苹果酸，通过苹果酸酶直接催化或通过由苹果酸脱氢酶催化的草酰乙酸。可通过丙酮酸羧化酶的作用从丙酮酸中产生草酰乙酸(OAA)、或通过由丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)和PEP羧激酶(PCK)催化的两步转化中的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)产生草酰乙酸(OAA)。随后在由延胡索酸水合酶和延胡索酸还原酶催化的两步过程中将苹果酸转化为琥珀酸。在自产乙醇梭菌中鉴定出各个基因并且同源基因存在于其他一氧化碳营养型产乙酸菌如扬氏梭菌和拉氏梭菌中(表7)。
表7：鉴定出的参与琥珀酸产生的基因和酶
Figure GDA0000651664670000471
酶活力测定：
在厌氧生长的指数生长期收集细胞(自产乙醇梭菌)。培养物(A600～0.45)，并以8000xg在4℃下沉淀10分钟。弃去上清液，并将片状沉淀物在洗涤缓冲液(0.1M Tris-HCl,10mM二硫苏糖醇(DTT)，pH6.5,4℃)中洗涤2次。最后，将片状沉淀物重悬于含有蛋白酶抑制剂的洗涤缓冲液中并用1.44g氧化锆小珠(beads)(Ambion RiboPure Bacteria Kit)混合。将试管在冰上冷却5分钟后，在带有涡旋适配器的旋涡混合器(Vortex Genie 2,Scientific Industries,Inc.)中通过5个以下循环将细胞破碎：以3200rpm击打1分钟然后在循环间于冰上静置1分钟。细胞溶解以后，将样品离心(13,000×g，4℃ 10分钟)，并将上清液等份分装并储存在-80℃直至进行分析。
所有的测定都基于在厌氧条件下在路径长度为1cm的比色杯中进行的NADH到NAD的氧化(ε＝6.2mM-1cm-1)。从至少两个独立的细胞提取物的三次重复中得到酶活力。使用商业试剂盒(
Figure GDA0000651664670000481
Microplate BCA Protein Assay Kit-Reducing AgentCompatible,Thermo Scientific)测定提取物的蛋白质含量。酶活力单位定义为每分钟内每mg总蛋白中能将1纳摩底物转化为产物的酶的量。
通过用草酰乙酸(OAA)对还原性的吡啶核苷酸进行氧化后使用分光光度法测定苹果酸脱氢酶活力(Sridhar J.et al,2000,Elucidation of enzymes in fermentationpathways used by Clostridium thermosuccinogenes growing on inulin.Appl.Environ.Microbiol.66,246-51)。反应混合物含有下列物质：0.1M Tris-Cl pH 6.5、10mM DTT、0.15mM NADH、5mM延胡索酸、0.3mM NADH和无细胞提取物。通过加入OAA引发反应并在室温下监测。自产乙醇梭菌的无细胞提取物中的所述酶的比活力测定为160±17nmol min-1mgprotein-1。该活力和在37℃下测定的琥珀酸嗜热梭菌中存在的苹果酸脱氢酶活力相当(Sridhar J.et al,2000,Elucidation of enzymes in fermentation pathways used byClostridium thermosuccinogenes growing on inulin.Appl.Environ.Microbiol.66,246-51)。
基于延胡索酸到琥珀酸的转化测量了延胡索酸还原酶的活力(Sridhar J.et al,2000,Elucidation of enzymes in fermentation pathways used by Clostridiumthermosuccinogenes growing on inulin.Appl.Environ.Microbiol.66,246-51)。反应混合物含有下列物质：0.1M Tris-Cl pH 6.5、10mM DTT、0.15mM NADH、5mM延胡索酸和无细胞提取物。通过加入延胡索酸引发反应并在室温下监测。自产乙醇梭菌的无细胞提取物中的所述酶的比活力测定为17.3±1.3nmol min-1mg protein-1。
所述测定法确认了自产乙醇梭菌具有苹果酸脱氢酶活性、延胡索酸还原酶/琥珀酸脱氢酶活性。
如本文所述，本发明提供了微生物和使得能够通过微生物发酵含一氧化碳的底物而增加乙醇产生的方法。其也提供了琥珀酸产生的方法。之前没有报道通过产乙酸菌产生琥珀酸，更不用说一氧化碳营养型产乙酸菌。通过微生物发酵产生琥珀酸的潜能可能比目前石油化工生产方法具有很有优势。所述微生物也产生之前已被描述为通过产乙酸微生物的发酵的产物的甲酸和支链氨基酸。
琥珀酸被用作很多工业化学物质的产生的整体平台化学物质(bulk platformchemical)，所述工业化学物质包括1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、乙二胺二琥珀酸、丁二酸二乙酯和己二酸。甲酸被用在动物食物贮藏中和皮革鞣制加工过程中，以及纸浆和造纸工业中的漂白溶液中。支链氨基酸在工业生物技术中具有很多用途。
本发明微生物也产生一种或多种其他产物。这些产物的用途已经在本文别处描述。
实施例3：基于II型内含子的参与自产乙醇梭菌DSM23693中2,3-BDO生物合成的基因的插入失活
靶向budA和2,3bdh基因的ClosTron构建体的设计和构建：
使用ClosTron II型内含子介导的基因破坏工具使参与自产乙醇梭菌DSM23693中2,3-BDO产生的乙酰乳酸脱羧酶(budA)和2,3-丁二醇脱氢酶(2,3-bdh)基因失活(Heap etal.,2010)。使用ClosTron.com上的Perutka算法分别确定了budA和2,3-bdh基因的正义链上的碱基450/451和468/469间的II型内含子靶位点。使用同样的算法设计内含子靶向区域(Seq.ID.82和83)，通过DNA2.0商业合成所述内含子靶向区域并将其在pMTL007C-E5载体中递送。最终载体——pMTL007C-E5-budA-450！451s和pMTL007C-E5-2,3bdh-468！469s含有逆转座活化的ermb标记(Retro-tranposition-Activated ermB Marker，RAM)，一旦插入到靶位点中，所述标记即赋予对抗生素克拉霉素的抗性。
通过与作为供体的供体大肠杆菌菌株CA434接合将所述pMTL007C-E5-budA-450！451s和pMTL007C-E5-2,3bdh-468！469s质粒引入自产乙醇梭菌DSM23693中。简而言之，所述供体菌株在补充有25μg/ml氯霉素和100μg/ml壮观霉素的LB培养基中过夜生长。从1.5ml的培养物中收集细胞并在磷酸盐缓冲盐水中洗涤。将所述供体细胞片状沉淀重悬于200μl的指数生长受体自产乙醇梭菌DSM23693的培养物中。将混合物点样在补充有果糖的PETC琼脂培养基上并在37℃下在加压气罐中孵育。24小时以后，将细胞破碎并重悬于500μl PETC发酵液中并使细胞在补充有15μg/ml甲砜霉素(Sigma)和10μg/ml甲氧苄氨嘧啶(Sigma)的PETC琼脂培养基上铺板。使用15μg/ml甲砜霉素筛选自产乙醇梭菌转化接合子并使用10μg/ml甲氧苄氨嘧啶反选大肠杆菌CA434菌株。在37℃下在加压气罐中孵育3天后观察克隆。
依次首先在含有15μg/ml甲砜霉素和10μg/ml甲氧苄氨嘧啶的PETC-MES培养基上进行单克隆划线，接着在含有5μg/ml克拉霉素的PETC培养基的琼脂板上划线。使用引物通过PCR随机筛选II型内含子插入的每个质粒的4个克隆，所述引物如下：位于budA基因的II型内含子插入位点侧翼的引物Og44f(Seq.ID.29)和Og45r(Seq.ID.30)，以及位于2,3-bdh基因的II型内含子插入位点侧翼的引物Og42f(Seq.ID.84)和Og43r(Seq.ID.85)。用MaximePCR PreMix Kit进行PCR。也使用引物fD1(Seq.ID.27)和rP2(Seq.ID.28)以及Maxime PCRPreMix Kit进行了16s rDNA的PCR扩增。
确认用ClosTronII型插入失活工具对budA和2,3-bdh基因进行的破坏:
使用引物Og44f/Og45r和Og42f/Of43r进行的273和375bp的PCR产物扩增分别代表了未修饰的野生型budA和2,3-bdh基因。使用同样一组引物进行的约2kb的PCR产物扩增表明了ClosTronII型内含子在靶基因中的插入。在靶向budA基因的克隆中，克隆1和克隆3具有预期大小的条带。克隆4看起来是野生型和破坏的基因的混合(图6)。如通过约2kb的PCR产物的扩增可见，靶向2,3-bdh基因的所有4个克隆都显示对基因破坏是阳性的(表6)。这些结果确认了在自产乙醇梭菌DSM23693中budA和2,3-bdh基因的破坏。
Δ2,3bdh ClosTron克隆2(Seq ID.86和87)和克隆4(Seq ID.88和89)以及ΔbudAClosTron克隆1(Seq ID.90和91)和克隆3(Seq ID.92和93)的16s rDNA PCR产物是确认为属于自产乙醇梭菌DSM23693的序列。
因此，本发明人已经证明了使用两种不同的方法在产乙酸自产乙醇梭菌DSM23693中的靶向基因破坏，所述两种不同的方法为：(i)通过同源重组的基因敲除和(ii)通过使用基于II型内含子的插入失活工具进行的基因破坏。
用于2,3-BDO产生的ΔbudA和Δ2,3bdhClosTron突变体的研究：
通过HPLC分析了来自在血清瓶中生长的ΔbudA和Δ2,3bdh突变体的代谢物(如之前解释的)。所述ΔbudA ClosTron突变体(如ΔbudA敲除突变体)不产生2,3-BDO(表8)。在自产乙醇梭菌中通过两种不同的方法对budA基因的破坏确认了budA基因在2,3-BDO生物合成中的作用。
表8：由ΔbudA和Δ2,3bdhClosTron自产乙醇梭菌DSM23693突变体产生的代谢物
Figure GDA0000651664670000511
所述Δ2,3bdh ClosTron突变体仍然产生2,3-BDO(表8)，表明第二种基因参与了乙偶姻到2,3-BDO的转化。
Yan et al已经表明来自拜氏梭菌(C.beijerinckii)和三种其他生物体的第二种醇脱氢酶也能将乙偶姻转化为2,3-BDO(Yan.Lee & Liao,2009)。在自产乙醇梭菌DSM23693(Seq ID 34和35)、扬氏梭菌(Seq ID 36)和拉氏梭菌(Seq ID 37)中发现了类似的第二种醇脱氢酶(SecAdh)。
在自产乙醇梭菌DSM23693中缺失2,3-bdh基因的情况下，所述SecAdh很可能会将乙偶姻转化为2,3-BDO。
第二种醇脱氢酶在将乙偶姻转化为2,3-BDO中的作用：
为测试第二种基因在将乙偶姻转化为2,3-BDO中的作用，在发酵实验中用10g/l乙偶姻供给野生型自产乙醇梭菌DSM23693和Δ2,3bdh ClosTron突变体。
使用野生型和Δ2,3bdh ClosTron突变体的发酵：
在1.5l生物反应器中在37℃下并且如下所述用含CO的钢铁厂气体作为唯一能源和碳源进行发酵。将每升含有MgCl、CaCl2(0.5mM)、KCl(2mM)、H3PO4(5mM)、Fe(100μM)、Ni、Zn(5μM)、Mn、B、W、Mo、Se(2μM)的确定成分培养基用于培养物生长。将所述培养基转移到生物反应器中并在121℃下高压灭菌45分钟。高压灭菌后，向所述培养基补加硫胺素、泛酸盐(0.05mg)、生物素(0.02mg)并用3mM盐酸半胱氨酸还原。为实现厌氧，通过0.2μm过滤器用氮气吹扫反应器容器。在接种前，将所述气体切换成含CO的钢铁厂气体，连续进料至所述生物反应器。所述进料气体组成为2％ H2、42％ CO、20％CO2、36％N2。将所述培养物的pH保持在5-5.2之间。所述气流最初设定为80ml/min，在指数期中期增加至200ml/min，同时搅拌从200rpm增加到350rpm。将Na2S以0.25ml/hr的量加入到所述生物反应器中。一旦OD600达到0.5，将所述生物反应器切换到速率为1.0ml/min的连续模式(稀释速率0.96d-1)。当生长稳定时，向反应器中添加10g/L乙偶姻的外消旋混合物。取培养基样品以通过HPLC测量生物质和代谢物。
通过HPLC定期分析代谢物直到乙偶姻消失。所述野生型自产乙醇梭菌DSM23693在不到1小时内将所有乙偶姻转化为内消旋BDO和2,3-BDO(图7)。在Δ2,3bdh ClosTron突变体中，乙偶姻转化为内消旋BDO和2,3-BDO的速率相对较低。所述Δ2,3bdh ClosTron突变体在2小时以上的时间内还原10g/L乙偶姻。这些结果证明第二种脱氢酶在补偿2,3-bdh基因破坏中的作用，尽管以较低的速率。
实施例4：仅产生乙偶姻的修饰的自产乙醇梭菌DSM23693菌株
和乙偶姻的下游产物2,3-BDO相比，从乙醇中工业分离乙偶姻在技术上更可行。因此需要有产生乙偶姻而不是其还原形式——2,3-BDO的自产乙醇梭菌菌株。由于Δ2,3bdhClosTron突变体仍然产生2,3-BDO，需要有其中2,3bdh和SecAdh基因都被破坏的自产乙醇梭菌DSM23693菌株。这可通过两种方式来实现：(a)同源重组和(b)如实施例1和实施例3所解释的使用ClosTron工具进行的无标记基因破坏(marker less gene disruption)。
(a)通过同源重组得到的Δ2,3bdh、ΔSecAdh双敲除的自产乙醇梭菌DSM23693菌株：
使用自产乙醇梭菌DSM23693基因组DNA对2,3bdh基因的约1kb的5’(Seq.ID.94)和3’(Seq.ID.95)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物Og13f(Seq.ID.96)/Og14r(Seq.ID.97)和Og15f(Seq.ID.98)/Og16r(Seq.ID.99)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-2,3bdh-KO。通过如以上实施例所述的接合或电穿孔将该质粒引入自产乙醇梭菌DSM23693。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR和该PCR产物测序的位于2,3bdh同源臂侧翼的引物Og33f(Seq.ID.100)和Og34r(Seq.ID.101)筛选2,3bdh敲除的转化体。
用于SecAdh基因敲除的质粒被类似地构建。使用自产乙醇梭菌DSM23693基因组DNA对SecAdh基因的约1kb的5’(Seq.ID.102)和3’(Seq.ID.103)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物Sec5f(Seq.ID.104)/Sec5r(Seq.ID.105)和Sec3f(Seq.ID.106)/Sec3r(Seq.ID.107)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-SecAdh-KO。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR的位于SecAdh基因同源臂侧翼的引物SecOf(Seq.ID.108)和SecOr(Seq.ID.109)筛选SecAdh敲除的转化体。
一旦已经在自产乙醇梭菌DSM23693中实现2,3bdh或SecAdh基因的敲除，则使用pMTL85151-2,3bdh-KO或pMTL85151-SecAdh-KO质粒靶向这些单突变体中的第二种基因。通过在实施例1和3中已经描述的电穿孔或接合将该质粒引入单基因敲除突变体。使用位于相应基因的同源臂侧翼的引物筛选第二种基因敲除的转化体。
(b)使用ClosTron的Δ2,3bdh、ΔsecAdh双基因破坏：
翻转酶重组位点(Flippase Recombination sites，Frt)位于ClosTron II型内含子构建体中的RAM ermB盒的两侧。通过接合或电穿孔将翻转重组酶(flippaserecombinase)引入Δ2,3bdh ClosTron突变体，从而从突变体的基因组中去除约1.3kb的RAM ermB标记并因此回收利用ermB标记。一段II型内含子的约0.8kb的片段将留在所述基因组上。这可通过两种方式得以确认：(i)通过测试突变体对克拉霉素的敏感性和(ii)通过使用位于II型内含子插入位点侧翼的引物以引物Og42f(Seq.ID.84)和Og43r(Seq.ID.85)进行PCR并对PCR产物进行测序。一旦获得了不含RAM ermB标记的Δ2,3bdh ClosTron突变体(Δ2,3bdh-ermB ClosTron)，则使用ClosTron II型内含子插入失活工具以类似的方式靶向所述突变体的SecAdh基因。使用ClosTron.com上的Perutka算法确定了SecAdh基因正义链上碱基399和400之间的内含子插入位点并设计了内含子靶向盒(Seq.ID.110)。通过DNA2.0商业合成所述内含子靶向盒并将其以pMTL007C-E5-SecAdh-399！400s形式在pMTL007C-E2载体中递送，通过接合或电穿孔将所述pMTL007C-E5-SecAdh-399！400s引入Δ2,3bdh-ermB ClosTron突变体中。随后在甲砜霉素和克拉霉素琼脂平板上选择转化体并如之前在实施例3中解释的通过使用引物SecCTf(Seq.ID.111)和SecCTr(Seq.ID.112)进行的PCR筛选转化体。
如以上段落所解释的，通过使用同源重组技术或通过ClosTron II型内含子插入失活工具构建了Δ2,3bdhΔsecAdh双基因破坏的自产乙醇梭菌DSM23693突变体。
如之前所述，通过进行用于将乙偶姻转化为2,3-BDO的酶活力测定和通过HPLC对所述突变体产生的产物进行的分析确认了2,3bdh和SecAdh基因的破坏以及乙偶姻、其他代谢物和2,3-BDO的产生。
实施例5：产生降低的或不产生2,3-BDO的修饰的产乙醇梭菌DSM23693菌株
如图1所示，乙酰乳酸是2,3-BDO生物合成中的中间体之一并且也是支链氨基酸合成的前体。所述酶乙酰乳酸合酶催化以2分子丙酮酸作为底物生成乙酰乳酸的反应。所述酶乙酰乳酸合酶广义上被分成两组：(i)合成代谢乙酰乳酸合酶是与参与支链氨基酸(如缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸)合成的基因相关和(ii)分解代谢乙酰乳酸合酶是与2,3-BDO合成相关(alsS；氨基酸-AEI90719.1和核酸-HQ876013.1)。
自产乙醇梭菌DSM23693的基因组具有3种推测的合成代谢乙酰乳酸合酶基因：ilvC、ilvI和ilvB。从GenBank获得来自自产乙醇梭菌(AEI90719.1、AEI90730.1、AEI90731.1、AEI90713.1、AEI90714.1)、扬氏梭菌(ADK15104.1、ADK15104.1、ADK15105.1、ADK15400.1、ADK15400.1)和拉氏梭菌(AEI90734.1、AEI90734.1、AEI90735.1、AEI90727.1、AEI90727.1)的示例性氨基酸序列以及来自自产乙醇梭菌(HQ876013.1、HQ876023.1、HQ876021.1)、扬氏梭菌(CP001666.1-CLJU_c38920、CLJU_c32420、CLJU_c20420-30)和拉氏梭菌(HQ876014.1、HQ876024.1、HQ876022.1)的各个核酸序列。
所有4种乙酰乳酸合酶基因或者4种基因的任意组合的破坏应该都会降低乙偶姻和2,3-BDO的产生。为了确保这些突变体的生长，向培养基中补加三种支链氨基酸——缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
如实施例1、3和4所述，可通过同源重组或使用ClosTron II类内含子突变工具创建自产乙醇梭菌DSM23693的单突变体——alsS、ilvC、ilvI和ilvB突变体。
alsS、ilvC、ilvI和ilvB敲除盒的设计:
如上所述设计alsS、ilvC、ilvI和ilvB基因的敲除构建体。使用自产乙醇梭菌DSM23693基因组DNA对alsS基因的约1kb的5’(Seq.ID.113)和3’(Seq.ID.114)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物alsS5f(Seq.ID.115)/alsS5r(Seq.ID.116)和alsS3f(Seq.ID.117)/alsS3r(Seq.ID.118)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-alsS-KO。通过如上述实例所述的接合或电穿孔将该质粒引入自产乙醇梭菌DSM23693。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR和该PCR产物测序的位于alsS同源臂侧翼的引物alsSOf(Seq.ID.119)和alsSOr(Seq.ID.120)筛选alsS敲除的转化体。
对于ilvC基因的敲除，使用自产乙醇梭菌DSM23693基因组DNA对ilvC基因的约1kb的5’(Seq.ID.121)和3’(Seq.ID.122)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物ilvC5f(Seq.ID.123)/ilvC5r(Seq.ID.124)和ilvC3f(Seq.ID.125)/ilvC3r(Seq.ID.126)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-ilvC-KO。通过如上述实例所述的接合或电穿孔将该质粒引入自产乙醇梭菌DSM23693。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR和该PCR产物测序的位于ilvC基因同源臂侧翼的引物ilvCOf(Seq.ID.127)和ilvCOr(Seq.ID.128)筛选ilvC敲除的转化体。
对于ilvI基因的敲除，使用自产乙醇梭菌DSM23693基因组DNA对ilvI基因的约1kb的5’(Seq.ID.129)和3’(Seq.ID.130)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物ilvI5f(Seq.ID.131)/ilvI5r(Seq.ID.132)和ilvI3f(Seq.ID.133)/ilvI3r(Seq.ID.134)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-ilvI-KO。通过如上述实例所述的接合或电穿孔将该质粒引入自产乙醇梭菌DSM23693。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR和该PCR产物测序的位于ilvI基因同源臂侧翼的引物ilvIOf(Seq.ID.135)和ilvIOr(Seq.ID.136)筛选ilvI敲除的转化体。
对于ilvB基因的敲除，使用自产乙醇梭菌DSM23693基因组DNA对ilvB基因的约1kb的5’(Seq.ID.137)和3’(Seq.ID.138)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物ilvB5f(Seq.ID.139)/ilvB5r(Seq.ID.140)和ilvB3f(Seq.ID.141)/ilvB3r(Seq.ID.142)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-ilvB-KO。通过如上述实例所述的接合或电穿孔将该质粒引入自产乙醇梭菌DSM23693。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR和该PCR产物测序的位于ilvB基因同源臂侧翼的引物ilvBOf(Seq.ID.143)和ilvBOr(Seq.ID.144)筛选ilvB敲除的转化体。
一旦获得了单个基因的敲除突变体，则依次靶向其他3种乙酰乳酸合酶基因以创建缺失所有4种乙酰乳酸合酶基因的突变体。这些突变体的生长可能是支链氨基酸营养缺陷型的。如之前实施例所描述的，可通过HPLC分析这些突变体中的乙偶姻、2,3-BDO和其他代谢物的产生或产生的缺失。可进行以丙酮酸为底物、以二磷酸硫胺和黄素腺嘌呤二核苷酸为辅因子的酶活力测定来确认所述突变体中的乙酰乳酸合酶活性的缺失(Tittmann,Vyazmensky,Hubner,Barak & Chipman,2005；Vinogradov et al,2006)。
alsS、ilvC、ilvI和ilvB基因的ClosTron II型内含子靶向盒的设计:
也可使用ClosTron II型内含子介导的基因破坏工具破坏或失活自产乙醇梭菌DSM23693alsS、ilvC、ilvI和ilvB基因(Heap et al.,2010)。使用ClosTron.com上的Perutka算法分别确定了alsS、ilvC和ilvI的正义链上和ilvB基因的反义链上的碱基303/304、228/229、975/976和157/158间的II型内含子靶位点。其他由该算法确定的位点也能够被靶向。使用同样的算法设计内含子靶向区域(alsS-Seq.ID.145；ilvC-Seq.ID.146；ilvI-Seq.ID.147和ilvB-Seq.ID.148)，通过DNA2.0商业合成所述内含子靶向区域并将其在pMTL007C-E2载体中递送。最终载体——pMTL007C-E2-alsS-303！304s、pMTL007C-E2-ilvC-228！229s、pMTL007C-E2-ilvI-975！976s和pMTL007C-E2-ilvB-157！158a都含有逆转座活化的ermB标记(RAM)，一旦插入到靶位点中，所述标记即赋予对抗生素克拉霉素的抗性。通过接合或电穿孔将这些质粒引入自产乙醇梭菌DSM23693。随后在甲砜霉素和克拉霉素琼脂平板上选择转化体并通过PCR筛选alsS、ilvC、ilvI和ilvB基因失活的转化体，所述PCR分别使用如下引物：alsSCTf(Seq.ID.149)和alsSCTr(Seq.ID.150)、ilvCCTf(Seq.ID.151)和ilvCCTr(Seq.ID.152)、ilvICTf(Seq.ID.153)和ilvICTr(Seq.ID.154)以及ilvBCTf(Seq.ID.155)和ilvBCTr(Seq.ID.156)。
一旦获得了具有破坏的单基因的ClosTron突变体，则使用携带翻转酶基因的pMTL质粒从所述突变体的基因组中去除RAM ermB盒，所述pMTL质粒是通过电穿孔或接合而被引入突变体。通过以下两种方式筛选所得到的ermB盒缺失的转化体：(i)通过测试转化体对克拉霉素的敏感性和(ii)通过使用位于II型内含子插入位点侧翼的引物以以下引物进行PCR，并且进一步对PCR产物进行测序：alsS、ilvC、ilvB1和ilvB2基因中的alsSCTf(Seq.ID.149)和alsSCTr(Seq.ID.150)、ilvCCTf(Seq.ID.151)和ilvCCTr(Seq.ID.152)、ilvICTf(Seq.ID.153)和ilvICTr(Seq.ID.154)以及ilvBCTf(Seq.ID.155)和ilvBCTr(Seq.ID.156)。
确认ermB盒缺失后，随后靶向ClosTron突变体(如所述敲除突变体)以失活其他乙酰乳酸合酶基因。在一个实施方案中，这些ClosTron突变体在支链氨基酸的存在下进行生长。如之前实施例所描述的，可通过HPLC分析这些突变体中的乙偶姻、2,3-BDO和其他代谢物的产生或产生的缺失。可进行以丙酮酸为底物、以二磷酸硫胺和黄素腺嘌呤二核苷酸为辅因子的酶活力测定来确认所述突变体中的乙酰乳酸合酶活性的缺失(Tittman et al,2005；Vinogradov et al,2006)。
实施例6：扬氏梭菌和拉氏梭菌中的2,3-BDO途经基因的破坏
2,3-BDO产生的途经在产乙酸菌中是保守的，所述产乙酸菌包括自产乙醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌。这3种产乙酸菌中的alsS、ilvC、ilvI、ilvB、budA、2,3bdh和SecAdh基因具有高度的序列同源性。因此，可将这些基因进行遗传修饰以提高或降低所述3种产乙酸菌中的2,3-BDO的产生。已经记载了通过电穿孔遗传修饰扬氏梭菌的方法(
Figure GDA0000651664670000571
et al.,2010)(PCT/NZ2011/000203)。任何技术人员都可将上述用于自产乙醇梭菌的电穿孔和接合方法应用于拉氏梭菌。
可从GenBank中获得扬氏梭菌和拉氏梭菌的alsS、ilvC、ilvB1、ilvB2、budA和2,3bdh基因的氨基酸和核酸序列。提供了扬氏梭菌(Seq.ID.36)和拉氏梭菌(Seq.ID.37)的SecAdh的核苷酸序列。
用来通过同源重组和基于ClosTronII类内含子的插入失活破坏自产乙醇梭菌中的alsS、ilvC、ilvB1、ilvB2、budA、2,3bdh和SecAdh基因的敲除和ClosTron质粒也可被用于破坏扬氏梭菌和拉氏梭菌中的同样的基因。例如，可通过如上所述用于实施例1和3中的自产乙醇梭菌的电穿孔或接合将pMTL85141-budA-ko、pMTL007C-E5-budA-450！451s和pMTL007C-E5-2,3bdh-468！469s引入扬氏梭菌(在以下实施例6a中解释)和拉氏梭菌(在以下实施例6b中解释)。可在扬氏梭菌和拉氏梭菌中使用类似的突变体筛选和表征方法。
实施例6a：通过同源重组和基于II型内含子的插入失活对扬氏梭菌中budA和2,3-bdh基因进行破坏以不产生和产生降低的2,3-BDO:
通过电穿孔将质粒pMTL85141-budA-ko引入扬氏梭菌(Koepke et al 2010)。在含有15μg/ml甲砜霉素的PETC琼脂平板上选择转化体并使引物Og44f(Seq.ID.29)和Og45r(Seq.ID.30)筛选budA敲除。
对于使用基于ClosTronII型内含子的插入失活工具在扬氏梭菌中进行的budA和2,3bdh基因的破坏，通过接合将质粒pMTL007C-E5-budA-450！451s和pMTL007C-E5-2,3bdh-468！469s引入扬氏梭菌。依次首先在含有15μg/ml甲砜霉素和10μg/ml甲氧苄氨嘧啶的PETC-琼脂培养基上进行单克隆划线，接着在含有5μg/ml克拉霉素的PETC培养基的琼脂板上划线。使用引物通过PCR随机筛选II型内含子插入的每个质粒的克隆，所述引物如下：位于budA基因的II型内含子插入位点侧翼的引物Og44f(Seq.ID.29)和Og45r(Seq.ID.30)，以及位于2,3-bdh基因的II型内含子插入位点侧翼的引物Og42f(Seq.ID.84)和Og43r(Seq.ID.85)。
如实施例1和3中所解释的，通过HPLC和在生物反应器中的发酵来分析上述生成的budA和2,3bdh敲除以及ClosTron扬氏梭菌突变体中的2,3-BDO和乙偶姻产生。
实施例6b:通过同源重组和基于II型内含子的插入失活对拉氏梭菌中budA和2,3-bdh基因进行破坏以不产生和产生降低的2,3-BDO:
通过如上所述用于自产乙醇梭菌或扬氏梭菌的电穿孔、或通过电穿孔或接合将质粒pMTL85141-budA-ko引入拉氏梭菌。在含有15μg/ml甲砜霉素的PETC琼脂平板上选择转化体并使引物Og44f(Seq.ID.29)和Og45r(Seq.ID.30)筛选budA敲除。
对于使用基于ClosTronII型内含子的插入失活工具在拉氏梭菌中进行的budA和2,3bdh基因的破坏，通过接合将质粒pMTL007C-E5-budA-450！451s和pMTL007C-E5-2,3bdh-468！469s引入拉氏梭菌。依次首先在含有15μg/ml甲砜霉素和10μg/ml甲氧苄氨嘧啶的PETC-琼脂培养基上进行单克隆划线，接着在含有5μg/ml克拉霉素的PETC培养基的琼脂板上划线。使用引物通过PCR随机筛选II型内含子插入的每个质粒的克隆，所述引物如下：位于budA基因的II型内含子插入位点侧翼的引物Og44f(Seq.ID.29)和Og45r(Seq.ID.30)，以及位于2,3-bdh基因的II型内含子插入位点侧翼的引物Og42f(Seq.ID.84)和Og43r(Seq.ID.85)。
如实施例1和3中所解释的，通过HPLC和在生物反应器中的发酵来分析上述生成的budA和2,3bdh敲除以及ClosTron拉氏梭菌突变体中的2,3-BDO和乙偶姻产生。
实施例7：仅产生乙偶姻的修饰的扬氏梭菌
如之前所解释的，和2,3-BDO相比，从乙醇中分离乙偶姻在技术上更可行。因此需要有产生乙偶姻而不是2,3-BDO的扬氏梭菌菌株。这可通过如实施例6a所解释的以两种方式删除或破坏2,3-bdh和SecAdh基因来实现：(a)同源重组和(b)使用ClosTron工具进行的无标记的基因破坏。
(a)通过同源重组得到的Δ2,3bdhΔSecAdh双敲除的扬氏梭菌菌株：
使用扬氏梭菌基因组DNA对2,3bdh基因的约1kb的5’(Seq.ID.94)和3’(Seq.ID.95)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物Og13f(Seq.ID.96)/Og14r(Seq.ID.97)和Og15f(Seq.ID.98)/Og16r(Seq.ID.99)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-2,3bdh-KO。通过如以上实施例6a所述的接合或电穿孔将该质粒引入扬氏梭菌。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR和该PCR产物测序的位于2,3bdh同源臂侧翼的引物Og33f(Seq.ID.100)和Og34r(Seq.ID.101)筛选2,3bdh敲除的转化体。
用于SecAdh基因敲除的质粒被类似地构建。使用扬氏梭菌基因组DNA对SecAdh基因的约1kb的5’(Seq.ID.102)和3’(Seq.ID.103)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物Sec5f(Seq.ID.104)/Sec5r(Seq.ID.105)和Sec3f(Seq.ID.106)/Sec3r(Seq.ID.107)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-SecAdh-KO。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR的位于SecAdh基因同源臂侧翼的引物SecOf(Seq.ID.108)和SecOr(Seq.ID.109)筛选SecAdh敲除的转化体。
一旦已经在扬氏梭菌中实现2,3bdh或SecAdh基因的敲除，则使用pMTL85151-2,3bdh-KO或pMTL85151-SecAdh-KO质粒靶向这些单突变体中的第二种基因。通过在实施例6a中已经描述的电穿孔或接合将该质粒引入单基因敲除突变体。使用位于相应基因的同源臂侧翼的引物筛选第二种基因敲除的转化体。
(b)使用ClosTron在扬氏梭菌中进行的Δ2,3bdh ΔsecAdh双基因破坏：
翻转酶重组位点(Frt)位于ClosTron II型构建体中的RAM ermB盒的两侧。通过接合或电穿孔将翻转重组酶引入Δ2,3bdh ClosTron突变体，从而从突变体的基因组中去除约1.3kb的RAM ermB标记并因此回收利用ermB标记。一段II型内含子的约0.8kb的片段将留在所述基因组上。这可通过两种方式得以确认：(i)通过测试突变体对克拉霉素的敏感性和(ii)通过使用位于II型内含子插入位点侧翼的引物以引物Og42f(Seq.ID.84)和Og43r(Seq.ID.85)进行PCR并对PCR产物进行测序。一旦获得了不含RAM ermB标记的Δ2,3bdhClosTron突变体(Δ2,3bdh-ermB ClosTron)，则使用ClosTron II型内含子插入失活工具以类似的方式靶向所述突变体的SecAdh基因。使用ClosTron.com上的Perutka算法确定了SecAdh基因正义链上碱基399和400之间的内含子插入位点并设计了内含子靶向盒(Seq.ID.110)。通过DNA2.0商业合成所述内含子靶向盒并将其以pMTL007C-E5-SecAdh-399！400s的形式在pMTL007C-E2载体中递送，通过接合或电穿孔将所述pMTL007C-E5-SecAdh-399！400s引入Δ2,3bdh-ermB ClosTron突变体中。随后在甲砜霉素和克拉霉素琼脂平板上选择转化体并如之前在实施例6a中解释的通过使用引物SecCTf(Seq.ID.111)和SecCTr(Seq.ID.112)进行的PCR筛选转化体。
如以上段落所解释的，通过使用同源重组技术或通过ClosTron II型内含子插入失活工具构建了Δ2,3bdhΔsecAdh双基因破坏的扬氏梭菌。
如之前所述，通过用于将乙偶姻转化为2,3-BDO而进行的酶活力测定和通过HPLC对所述突变体产生的产物进行的分析确认了2,3bdh和SecAdh基因的破坏以及代谢物和2,3-BDO的产生。
实施例8：产生降低的或不产生2,3-BDO的修饰的扬氏梭菌
如图1所示，乙酰乳酸是2,3-BDO生物合成中的中间体之一并且也是支链氨基酸合成的前体。所述酶乙酰乳酸合酶催化以2分子丙酮酸作为底物生成乙酰乳酸的反应。所述酶乙酰乳酸合酶广义上被分成两组：(i)合成代谢乙酰乳酸合酶是与参与支链氨基酸(如缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸)合成的基因相关和(ii)分解代谢乙酰乳酸合酶是与2,3-BDO合成相关。
扬氏梭菌的基因组具有3种推测的合成代谢乙酰乳酸合酶基因：ilvC、ilvI和ilvB以及1种分解代谢的乙酰乳酸合酶，alsS。从GenBank获得来自扬氏梭菌(ADK15104.1、ADK15104.1、ADK15105.1、ADK15400.1、ADK15400.1)的示例性氨基酸序列以及来自扬氏梭菌(CP001666.1-CLJU_c38920、CLJU_c32420、CLJU_c20420-30)的各个核酸序列。
所有4种乙酰乳酸合酶基因或者4种基因的任意组合的破坏应该都会降低乙偶姻和2,3-BDO的产生。为了确保这些突变体的生长，向培养基中补加三种支链氨基酸——缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
如实施例6a和7所述，可通过同源重组或使用ClosTron II类内含子突变工具创建扬氏梭菌的单突变体——alsS、ilvC、ilvI和ilvB突变体。
alsS、ilvC、ilvI和ilvB敲除盒的设计:
如上所述设计alsS、ilvC、ilvI和ilvB基因的敲除构建体。
使用扬氏梭菌基因组DNA对alsS基因的约1kb的5’(Seq.ID.113)和3’(Seq.ID.114)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物alsS5f(Seq.ID.115)/alsS5r(Seq.ID.116)和alsS3f(Seq.ID.117)/alsS3r(Seq.ID.118)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-alsS-KO。通过如以上实施例所述的接合或电穿孔将该质粒引入扬氏梭菌。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR和该PCR产物测序的位于alsS同源臂侧翼的引物alsSOf(Seq.ID.119)和alsSOr(Seq.ID.120)筛选alsS敲除的转化体。
对于ilvC基因的敲除，使用扬氏梭菌基因组DNA对ilvC基因的约1kb的5’(Seq.ID.121)和3’(Seq.ID.122)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物ilvC5f(Seq.ID.123)/ilvC5r(Seq.ID.124)和ilvC3f(Seq.ID.125)/ilvC3r(Seq.ID.126)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-ilvC-KO。通过如以上实施例所述的接合或电穿孔将该质粒引入扬氏梭菌。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR和该PCR产物测序的位于ilvC基因同源臂侧翼的引物ilvCOf(Seq.ID.127)和ilvCOr(Seq.ID.128)筛选ilvC敲除的转化体。
对于ilvI基因的敲除，使用扬氏梭菌基因组DNA对ilvI基因的约1kb的5’(Seq.ID.129)和3’(Seq.ID.130)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物ilvI5f(Seq.ID.131)/ilvI5r(Seq.ID.132)和ilvI3f(Seq.ID.133)/ilvI3r(Seq.ID.134)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-ilvI-KO。通过如以上实施例所述的接合或电穿孔将该质粒引入扬氏梭菌。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR和该PCR产物测序的位于ilvI基因同源臂侧翼的引物ilvIOf(Seq.ID.135)和ilvIOr(Seq.ID.136)筛选ilvI敲除的转化体。
对于ilvB基因的敲除，使用扬氏梭菌基因组DNA对ilvB基因的约1kb的5’(Seq.ID.137)和3’(Seq.ID.138)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物ilvB5f(Seq.ID.139)/ilvB5r(Seq.ID.140)和ilvB3f(Seq.ID.141)/ilvB3r(Seq.ID.142)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-ilvB-KO。通过如以上实施例所述的接合或电穿孔将该质粒引入扬氏梭菌。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR和该PCR产物测序的位于ilvB基因同源臂侧翼的引物ilvBOf(Seq.ID.143)和ilvBOr(Seq.ID.144)筛选ilvB敲除的转化体。
一旦获得了单个基因的敲除突变体，则依次靶向其他3种乙酰乳酸合酶基因以创建缺失所有4种乙酰乳酸合酶基因的突变体。这些突变体的生长可能是支链氨基酸营养缺陷型的。如之前实施例所描述的，可通过HPLC分析这些突变体中的乙偶姻、2,3-BDO和其他代谢物的产生或产生的缺失。可进行以丙酮酸为底物、以二磷酸硫胺和黄素腺嘌呤二核苷酸为辅因子的酶活力测定来确认所述突变体中的乙酰乳酸合酶活性的缺失(Tittmann,Vyazmensky,Hubner,Barak & Chipman,2005；Vinogradov et al,2006)。
alsS、ilvC、ilvI和ilvB基因的ClosTron II型内含子靶向盒的设计:
也可使用ClosTron II型内含子介导的基因破坏工具破坏或失活扬氏梭菌alsS、ilvC、ilvI和ilvB基因(Heap et al.,2010)。使用ClosTron.com上的Perutka算法分别确定了alsS、ilvC和ilvI的正义链上和ilvB基因的反义链上的碱基303/304、228/229、975/976和157/158间的II型内含子靶位点。其他由该算法确定的位点也能够被靶向。使用同样的算法设计内含子靶向区域(alsS-Seq.ID.145；ilvC-Seq.ID.146；ilvI-Seq.ID.147和ilvB-Seq.ID.148)，通过DNA2.0商业合成所述内含子靶向区域并将其在pMTL007C-E2载体中递送。最终载体——pMTL007C-E2-alsS-303！304s、pMTL007C-E2-ilvC-228！229s、pMTL007C-E2-ilvI-975！976s和pMTL007C-E2-ilvB-157！158a都含有逆转座活化的ermB标记(RAM)，一旦插入到靶位点中，所述标记即赋予对抗生素克拉霉素的抗性。通过接合或电穿孔将这些质粒引入扬氏梭菌。随后在甲砜霉素和克拉霉素琼脂平板上选择转化体并通过PCR筛选alsS、ilvC、ilvI和ilvB基因失活的转化体，所述PCR分别使用如下的引物：alsSCTf(Seq.ID.149)和alsSCTr(Seq.ID.150)、ilvCCTf(Seq.ID.151)和ilvCCTr(Seq.ID.152)、ilvICTf(Seq.ID.153)和ilvICTr(Seq.ID.154)以及ilvBCTf(Seq.ID.155)和ilvBCTr(Seq.ID.156)。
一旦获得了具有破坏的单基因的ClosTron突变体，则使用携带翻转酶基因的pMTL质粒从所述突变体的基因组中去除RAM ermB盒，所述pMTL质粒是通过电穿孔或接合而被引入突变体。通过以下两种方式筛选所得到的ermB盒缺失的转化体：(i)通过测试转化体对克拉霉素的敏感性和(ii)通过使用位于II型内含子插入位点侧翼的引物以以下引物进行PCR，并且进一步对PCR产物进行测序：alsS、ilvC、ilvB1和ilvB2基因中的alsSCTf(Seq.ID.149)和alsSCTr(Seq.ID.150)、ilvCCTf(Seq.ID.151)和ilvCCTr(Seq.ID.152)、ilvICTf(Seq.ID.153)和ilvICTr(Seq.ID.154)以及ilvBCTf(Seq.ID.155)和ilvBCTr(Seq.ID.156)。
确认ermB盒缺失后，随后靶向ClosTron突变体(如所述敲除突变体)以失活其他乙酰乳酸合酶基因。在一个实施方案中，这些ClosTron突变体在支链氨基酸的存在下进行生长。如之前实施例所描述的，可通过HPLC来分析并通过进行酶活力测定来研究这些突变体中的乙偶姻、2,3-BDO和其他代谢物的产生或产生的缺失。可进行以丙酮酸为底物、以二磷酸硫胺和黄素腺嘌呤二核苷酸为辅因子的所述酶活力测定来确认所述突变体中的乙酰乳酸合酶活性的缺失(Tittman et al,2005；Vinogradov et al,2006)。
实施例9：仅产生乙偶姻的修饰的拉氏梭菌
如之前所解释的，和2,3-BDO相比，从乙醇中分离乙偶姻在技术上更可行。因此需要有产生乙偶姻而不是2,3-BDO的拉氏梭菌菌株。这可通过如实施例6b所解释的以两种方式删除或破坏2,3-bdh和SecAdh基因来实现：(a)同源重组和(b)使用ClosTron工具进行的无标记基因破坏。
(a)通过同源重组得到的Δ2,3bdh ΔSecAdh双敲除的拉氏梭菌菌株：
使用拉氏梭菌基因组DNA对2,3bdh基因的约1kb的5’(Seq.ID.94)和3’(Seq.ID.95)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物Og13f(Seq.ID.96)/Og14r(Seq.ID.97)和Og15f(Seq.ID.98)/Og16r(Seq.ID.99)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-2,3bdh-KO。通过如以上实施例6b所述的接合或电穿孔将该质粒引入拉氏梭菌。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR和该PCR产物测序的位于2,3bdh同源臂侧翼的引物Og33f(Seq.ID.100)和Og34r(Seq.ID.101)筛选2,3bdh敲除的转化体。
用于SecAdh基因敲除的质粒被类似地构建。使用拉氏梭菌基因组DNA对SecAdh基因的约1kb的5’(Seq.ID.102)和3’(Seq.ID.103)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物Sec5f(Seq.ID.104)/Sec5r(Seq.ID.105)和Sec3f(Seq.ID.106)/Sec3r(Seq.ID.107)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-SecAdh-KO。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR的位于SecAdh基因同源臂侧翼的引物SecOf(Seq.ID.108)和SecOr(Seq.ID.109)筛选SecAdh敲除的转化体。
一旦已经在拉氏梭菌中实现2,3bdh或SecAdh基因的敲除，则使用pMTL85151-2,3bdh-KO或pMTL85151-SecAdh-KO质粒靶向这些单突变体中的第二种基因。通过在实施例6b中已经描述的电穿孔或接合将该质粒引入单基因敲除突变体。使用位于相应基因的同源臂侧翼的引物筛选第二种基因敲除的转化体。
(b)使用ClosTron在拉氏梭菌中进行的Δ2,3bdh ΔsecAdh双基因破坏：
翻转酶重组位点(Frt)位于ClosTron II型构建体中的RAM ermB盒的两侧。通过接合或电穿孔将翻转重组酶引入Δ2,3bdh ClosTron突变体，从而从突变体的基因组中去除1.3kb的RAM ermB标记并因此回收利用ermB标记。一段II型内含子的约0.8kb的片段将留在所述基因组上。这可通过两种方式得以确认：(i)通过测试突变体对克拉霉素的敏感性和(ii)通过使用位于II型内含子插入位点侧翼的引物以引物Og42f(Seq.ID.84)和Og43r(Seq.ID.85)进行PCR并对PCR产物进行测序。一旦获得了不含RAM ermB标记的Δ2,3bdhClosTron突变体(Δ2,3bdh-ermB ClosTron)，则使用ClosTron II型内含子插入失活工具以类似的方式靶向所述突变体的SecAdh基因。使用ClosTron.com上的Perutka算法确定了SecAdh基因正义链上碱基399和400之间的内含子插入位点并设计了内含子靶向盒(Seq.ID.110)。通过DNA2.0商业合成所述内含子靶向盒并将其以pMTL007C-E5-SecAdh-399！400s形式在pMTL007C-E2载体中递送，通过接合或电穿孔将所述pMTL007C-E5-SecAdh-399！400s引入Δ2,3bdh-ermB ClosTron突变体中。随后在甲砜霉素和克拉霉素琼脂平板上选择转化体并如之前在实施例6b中解释的通过使用引物SecCTf(Seq.ID.111)和SecCTr(Seq.ID.112)进行的PCR筛选转化体。
如以上段落所解释的，通过使用同源重组技术或通过ClosTron II型内含子插入失活工具构建了Δ2,3bdh ΔsecAdh双基因破坏的拉氏梭菌。
如之前所述，通过用于将乙偶姻转化为2,3-BDO而进行的酶活力测定和通过HPLC对所述突变体产生的代谢物和2,3-BDO进行的分析确认了2,3bdh和SecAdh基因的破坏。
实施例10：产生降低的或不产生2,3-BDO的修饰的拉氏梭菌
如图1所示，乙酰乳酸是2,3-BDO生物合成中的中间体之一并且也是支链氨基酸合成的前体。所述酶乙酰乳酸合酶催化以2分子丙酮酸作为底物生成乙酰乳酸的反应。所述酶乙酰乳酸合酶广义上被分成两组：(i)合成代谢乙酰乳酸合酶是与参与支链氨基酸(如缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸)合成的基因相关和(ii)和分解代谢乙酰乳酸合酶是与2,3-BDO合成相关。
拉氏梭菌的基因组具有3种推测的合成代谢乙酰乳酸合酶基因：ilvC、ilvI和ilvB以及1种分解代谢的乙酰乳酸合酶，alsS。从GenBank获得来自拉氏梭菌(AEI90734.1、AEI90734.1、AEI90735.1、AEI90727.1、AEI90727.1)的示例性氨基酸序列以及来自拉氏梭菌(HQ876014.1、HQ876024.1、HQ876022.1)的各个核酸序列。
所有4种乙酰乳酸合酶基因或者4种基因的任意组合的破坏应该都会降低乙偶姻和2,3-BDO的产生。为了确保这些突变体的生长，向培养基中补加三种支链氨基酸——缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
如实施例6b和9所述，可通过同源重组或使用ClosTron II类内含子突变工具创建拉氏梭菌的单突变体——alsS、ilvC、ilvI和ilvB突变体。
alsS、ilvC、ilvI和ilvB敲除盒的设计:
如上所述设计alsS、ilvC、ilvI和ilvB基因的敲除构建体。
使用拉氏梭菌基因组DNA对alsS基因的约1kb的5’(Seq.ID.113)和3’(Seq.ID.114)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物alsS5f(Seq.ID.115)/alsS5r(Seq.ID.116)和alsS3f(Seq.ID.117)/alsS3r(Seq.ID.118)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-alsS-KO。通过如以上实施例所述的接合或电穿孔将该质粒引入拉氏梭菌。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR和该PCR产物测序的位于alsS同源臂侧翼的引物alsSOf(Seq.ID.119)和alsSOr(Seq.ID.120)筛选alsS敲除的转化体。
对于ilvC基因的敲除，使用拉氏梭菌基因组DNA对ilvC基因的约1kb的5’(Seq.ID.121)和3’(Seq.ID.122)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物ilvC5f(Seq.ID.123)/ilvC5r(Seq.ID.124)和ilvC3f(Seq.ID.125)/ilvC3r(Seq.ID.126)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-ilvC-KO。通过如以上实施例所述的接合或电穿孔将该质粒引入拉氏梭菌。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR和该PCR产物测序的位于ilvC基因同源臂侧翼的引物ilvCOf(Seq.ID.127)和ilvCOr(Seq.ID.128)筛选ilvC敲除的转化体。
对于ilvI基因的敲除，使用拉氏梭菌基因组DNA对ilvI基因的约1kb的5’(Seq.ID.129)和3’(Seq.ID.130)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物ilvI5f(Seq.ID.131)/ilvI5r(Seq.ID.132)和ilvI3f(Seq.ID.133)/ilvI3r(Seq.ID.134)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-ilvI-KO。通过如以上实施例所述的接合或电穿孔将该质粒引入拉氏梭菌。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR和该PCR产物测序的位于ilvI基因同源臂侧翼的引物ilvIOf(Seq.ID.135)和ilvIOr(Seq.ID.136)筛选ilvI敲除的转化体。
对于ilvB基因的敲除，使用拉氏梭菌基因组DNA对ilvB基因的约1kb的5’(Seq.ID.137)和3’(Seq.ID.138)同源臂进行PCR扩增。分别使用引物ilvB5f(Seq.ID.139)/ilvB5r(Seq.ID.140)和ilvB3f(Seq.ID.141)/ilvB3r(Seq.ID.142)扩增5’和3’同源臂。将两个PCR产物克隆到pMTL85151质粒中的Sbf1/Not1和Nhe1/Asc1位点间以得到pMTL85151-ilvB-KO。通过如以上实施例所述的接合或电穿孔将该质粒引入拉氏梭菌。在甲砜霉素平板上筛选后，使用用于PCR和该PCR产物测序的位于ilvB基因同源臂侧翼的引物ilvBOf(Seq.ID.143)和ilvBOr(Seq.ID.144)筛选ilvB敲除的转化体。
一旦获得了单个基因的敲除突变体，则依次靶向其他3种乙酰乳酸合酶基因以创建缺失所有4种乙酰乳酸合酶基因的突变体。这些突变体的生长可能是支链氨基酸营养缺陷型的。如之前实施例所描述的，可通过HPLC分析这些突变体中的乙偶姻、2,3-BDO和其他代谢物的产生或产生的缺失。可进行以丙酮酸为底物、以二磷酸硫胺和黄素腺嘌呤二核苷酸为辅因子的酶活力测定来确认所述突变体中的乙酰乳酸合酶活性的缺失(Tittmann,Vyazmensky,Hubner,Barak & Chipman,2005；Vinogradov et al,2006)。
alsS、ilvC、ilvI和ilvB基因的ClosTron II型内含子靶向盒的设计:
也可使用ClosTron II型内含子介导的基因破坏工具破坏或失活拉氏梭菌alsS、ilvC、ilvI和ilvB基因(Heap et al.,2010)。使用ClosTron.com上的Perutka算法分别确定了alsS、ilvC和ilvI的正义链上和ilvB基因的反义链上的碱基303/304、228/229、975/976和157/158间的II型内含子靶位点。其他由该算法确定的位点也能够被靶向。使用同样的算法设计内含子靶向区域(alsS-Seq.ID.145；ilvC-Seq.ID.146；ilvI-Seq.ID.147和ilvB-Seq.ID.148)，通过DNA2.0商业合成所述内含子靶向区域并将其在pMTL007C-E2载体中递送。最终载体——pMTL007C-E2-alsS-303！304s、pMTL007C-E2-ilvC-228！229s、pMTL007C-E2-ilvI-975！976s和pMTL007C-E2-ilvB-157！158a都含有逆转座活化的ermB标记(RAM)，一旦插入到靶位点中，所述标记即赋予对抗生素克拉霉素的抗性。通过接合或电穿孔将这些质粒引入拉氏梭菌。随后在甲砜霉素和克拉霉素琼脂平板上选择转化体并通过PCR筛选alsS、ilvC、ilvI和ilvB基因失活的转化体，所述PCR分别使用如下的引物：alsSCTf(Seq.ID.149)和alsSCTr(Seq.ID.150)、ilvCCTf(Seq.ID.151)和ilvCCTr(Seq.ID.152)、ilvICTf(Seq.ID.153)和ilvICTr(Seq.ID.154)以及ilvBCTf(Seq.ID.155)和ilvBCTr(Seq.ID.156)。
一旦获得了具有破坏的单基因的ClosTron突变体，则使用携带翻转酶基因的pMTL质粒从所述突变体的基因组中去除RAM ermB盒，所述pMTL质粒是通过电穿孔或接合而被引入突变体。通过以下两种方式筛选所得到的ermB盒缺失的转化体：(i)通过测试转化体对克拉霉素的敏感性和(ii)通过使用位于II型内含子插入位点侧翼的引物以如下引物进行PCR，并且进一步对PCR产物进行测序：alsS、ilvC、ilvB1和ilvB2基因中的alsSCTf(Seq.ID.149)和alsSCTr(Seq.ID.150)、ilvCCTf(Seq.ID.151)和ilvCCTr(Seq.ID.152)、ilvICTf(Seq.ID.153)和ilvICTr(Seq.ID.154)以及ilvBCTf(Seq.ID.155)和ilvBCTr(Seq.ID.156)。
确认ermB盒缺失后，随后靶向ClosTron突变体(如所述敲除突变体)以失活其他乙酰乳酸合酶基因。在一个实施方案中，这些ClosTron突变体在支链氨基酸的存在下进行生长。如之前实施例所描述的，可通过HPLC来分析并通过进行酶活力测定来研究这些突变体中的乙偶姻、2,3-BDO和其他代谢物的产生或产生的缺失。可进行以丙酮酸为底物、以二磷酸硫胺和黄素腺嘌呤二核苷酸为辅因子的所述酶活力测定来确认所述突变体中的乙酰乳酸合酶活性的缺失(Tittman et al,2005；Vinogradov et al,2006)。
本文已参照某些优选实施方案描述了本发明，以使得读者无需过多实验即可实施本发明。但是，本领域普通技术人员应容易地认识到，可将许多组分和参数作一定程度的变化或修改或者替换为已知的等价物，而不背离本发明范围。应理解，这样的修改和等价物如同单独提出一样被纳入本文。提供名称、标题等的目的是增强读者对本文的理解，而不应当被解读为是限制本发明的范围。
如果有的话，上文和下文引用的所有申请、专利和公开文本的全部公开内容均以引用方式纳入本文。但是，本说明书中对任何申请、专利和公开文本的引用不是也不应被理解为，承认或以任何形式暗示它们在世界上任何国家构成有效的现有技术或者形成公知常识的一部分。
在整个该说明书以及以下的任何权利要求中，除非上下文另有说明，词语“包含(comprise)”、“包括(comprising)”等应以与排除意义相反的包括意义来解释，也就是说，“包含但不限于”的意思。
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Claims (19)

1.一种重组的一氧化碳营养型产乙酸微生物，所述微生物被改造为适于在发酵含一氧化碳的底物时产生一种或多种产物以及降低量的或基本不产生2,3-丁二醇和/或其前体，所述微生物与亲代微生物相比包含破坏了2,3-丁二醇生物合成途径的一种或多种遗传修饰，
其中所述微生物包括至少一种遗传修饰，所述遗传修饰破坏了选自以下的酶的表达和/或活性：能将丙酮酸转化成乙酰乳酸的酶、能将乙酰乳酸转化成乙偶姻的酶、能将乙偶姻转化成2,3-丁二醇的酶。
2.权利要求1的重组的一氧化碳营养型产乙酸微生物，所述微生物被改造为适于产生乙醇作为主要产物。
3.权利要求2的重组微生物，其中所述微生物被改造为适于进一步产生甲酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乙酰乳酸、苹果酸、延胡索酸、2-酮戊二酸、柠檬酸中的一种或多种。
4.权利要求1-3中任一项的重组微生物，其中与亲代微生物相比，所述微生物被改造为适于产生增加量的乙醇、甲酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乙酰乳酸、苹果酸、延胡索酸、2-酮戊二酸、柠檬酸中的一种或多种。
5.权利要求1的重组微生物，其中所述能将丙酮酸转化成乙酰乳酸的酶是乙酰乳酸合酶(alsS)；所述一种或多种能将乙酰乳酸转化成乙偶姻的酶是乙酰乳酸脱羧酶(budA)；或所述一种或多种能将乙偶姻转化成2,3-丁二醇的酶为选自以下的酶：2,3-丁二醇脱氢酶(2,3bdh)、乙偶姻还原酶、伯醇:仲醇脱氢酶。
6.权利要求1-5中任一项的重组微生物，其中所述一种或多种遗传修饰破坏了乙酰乳酸合酶(alsS)、乙酰乳酸脱羧酶(BudA)、2,3-丁二醇脱氢酶(2,3bdh)、乙偶姻还原酶、伯醇:仲醇脱氢酶中的一种或多种的表达和/或活性。
7.权利要求1-6中任一项的重组微生物，其中所述亲代微生物选自自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)和科斯卡塔梭菌(Clostridium coskatii)。
8.权利要求1的重组微生物，其中所述亲代微生物是自产乙醇梭菌DSM23693。
9.一种产生重组的一氧化碳营养型产乙酸微生物的方法，所述微生物能够在发酵含一氧化碳的底物时产生一种或多种产物以及降低量的或基本不产生2,3-丁二醇和/或其前体，所述方法包括遗传修饰一氧化碳营养型产乙酸亲代微生物以破坏2,3-丁二醇生物合成途径。
10.权利要求9的产生重组的一氧化碳营养型产乙酸微生物的方法，所述微生物能够产生乙醇作为主要产物。
11.权利要求9或10的方法，其中所述方法包括将一种或多种遗传修饰引入到所述亲代微生物中，所述遗传修饰破坏了一种或多种基因，所述基因编码能将丙酮酸转化成乙酰乳酸、将乙酰乳酸转化成乙偶姻和/或将乙偶姻转化成2,3-丁二醇的一种或多种酶。
12.权利要求11的方法，其中所述方法包括将一种或多种遗传修饰引入到所述亲代微生物中，所述遗传修饰破坏了两种或多种所述基因的组合。
13.权利要求11的方法，其中所述一种或多种能将丙酮酸转化成乙酰乳酸的酶是乙酰乳酸合酶(alsS)，所述一种或多种能将乙酰乳酸转化成乙偶姻的酶是乙酰乳酸脱羧酶(budA)和/或所述一种或多种能将乙偶姻转化成2,3-丁二醇的酶为选自以下的酶：2,3-丁二醇脱氢酶(2,3bdh)、乙偶姻还原酶、伯醇:仲醇脱氢酶。
14.权利要求9-13中任一项的方法，其中所述方法包括将一种或多种遗传修饰引入到所述亲代微生物中，所述遗传修饰破坏了一种或多种基因，所述基因编码乙酰乳酸合酶(alsS)、乙酰乳酸脱羧酶(BudA)和2,3-丁二醇脱氢酶(2,3bdh)中的一种或多种。
15.一种用于产生一种或多种产物的方法，所述方法包括使用如权利要求1-7中任一项的微生物发酵含CO的底物。
16.权利要求15的方法，其中所述产物为乙醇、甲酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乙酰乳酸、苹果酸、延胡索酸、2-酮戊二酸、柠檬酸中的一种或多种。
17.权利要求15的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)将含CO的底物提供给生物反应器，所述生物反应器含有一种或多种权利要求1-7中任一项的微生物的培养物；和
(b)在所述生物反应器中厌氧发酵所述培养物以产生所述一种或多种产物；或者
(a)在由工业生产过程产生的含CO的气体被释放到大气中之前，将所述气体捕获；
(b)通过培养物厌氧发酵所述含CO的气体以产生所述一种或多种产物，所述培养物含有一种或多种权利要求1-7中任一项的微生物；
并且任选地还包括从所述发酵液中回收所述一种或多种产物的步骤。
18.权利要求17的方法，其中所述产物包括乙醇。
19.权利要求17的方法，其中所述所述底物含有20体积％至100体积％的CO。
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