CN113234653B - 一种提高合成气发酵产乙醇含量的突变株和利用突变株的应用 - Google Patents

一种提高合成气发酵产乙醇含量的突变株和利用突变株的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体为涉及一种提高合成气发酵产乙醇含量的突变株、突变株的构建以及应用和提高利用基因工程手段获得突变株合成气发酵产乙醇的方法。突变株为食气梭菌中2,3‑丁二醇脱氢酶的缺失或失活的突变。本发明构建的缺失突变体在几乎不影响菌株正常生长的情况下，显著降低了副产物2,3‑丁二醇的产量，以及在总发酵有机溶剂中的比例。以永达尔梭菌为例，2,3‑丁二醇产量由16.6g/L下调到了2.4g/L，乙醇生成基本不受影响。本发明通过基因缺失的方式减少了副产物2,3‑丁二醇在总发酵溶剂中的含量，同时提高了乙醇在总发酵溶剂中的占比，从而使发酵液的分离成本降低，对合成气发酵产燃料乙醇的工业化实施具有重要意义。

Description

一种提高合成气发酵产乙醇含量的突变株和利用突变株的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体为涉及一种提高合成气发酵产乙醇含量的突变株、突变株的构建以及应用和提高利用基因工程手段获得突变株合成气发酵产乙醇的方法。
背景技术
全球能源危机和环境问题正不断加剧，急需可再生的清洁能源来部分或完全替代传统的化石燃料。乙醇作为一种新型的可再生资源，由于具有辛烷值高、能够减少排放等优点，正受到越来越广泛的关注。燃料乙醇的生产方式主要有生物发酵法和化学合成法两种，考虑到成本及设备要求等问题，生物发酵法特别是合成气发酵，正成为生产乙醇的主流方法之一。
食气梭菌是一类以合成气或工业尾气等富碳气体作为主要碳源，发酵产溶剂的梭菌，主要的发酵产物为乙醇、乙酸和2,3-丁二醇，此外还有少量的乳酸。从代谢通路分析，2,3-丁二醇作为主要副产物，占总产醇量的25％左右，会竞争性地抑制乙醇的生成。
已公开的专利中尚未发现关于对食气梭菌2,3-丁二醇代谢途径改造的研究，而针对调整食气梭菌合成气发酵产物中2,3-丁二醇含量的相关专利，主要关注于提升2,3-丁二醇含量。
例如，CN103582703A公开了一种用于控制2,3-丁二醇生产的发酵方法，利用一种或多种以一氧化碳为营养源的产乙酸细菌，对含一氧化碳或含一氧化碳和氢气的气体底物进行厌氧发酵，通过耗尽底物中的氢气来增加2,3-丁二醇的产率。
又如，CN106507678A公开了一种用于通过利用一氧化碳的产乙酸微生物，在含有CO气体底物的发酵期间，生产和控制丙酮酸盐衍生产物的方法，所述方法涉及改变培养基中维生素混合物各组分的浓度，与2,3-丁二醇产量成正相关的联系。
在专利CN109072245A中公开了一种利用CRISPR/CAS9技术对C1固定菌进行基因工程改造的方法，所述C1固定菌是产乙醇梭菌、永达尔梭菌或拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)。
在食气梭菌中实施基于CRISPR/CAS9基因同框缺失操作技术，先前也已有文章报道(Huang,et al.,CRISPR/Cas9-Based Efficient Genome Editing in Clostridiumljungdahlii,an Autotrophic Gas-Fermenting Bacterium.ACS Synthetic Biology,发表于2016年)。该技术体系与传统工具相比，具有更快速、无需添加抗生素耐药基因、无疤和极效应小等优点。以野生型食气梭菌为出发菌株，本文运用上述方法得到了2,3-丁二醇脱氢酶基因同框缺失的食气梭菌突变菌株。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种提高合成气发酵产乙醇含量的突变株、突变株的构建以及应用和提高利用基因工程手段获得突变株合成气发酵产乙醇的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种提高合成气发酵产乙醇含量的突变株，突变株为食气梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶的缺失或失活的突变。
所述突变株为以食气梭菌为出发菌株，通过基因工程手段阻断其中间代谢产物乙偶姻至2,3-丁二醇的代谢途径，进而所得菌株。
所述食气梭菌为永达尔梭菌或产乙醇梭菌；或，与永达尔梭菌或产乙醇梭菌的16SrRNA基因序列相似性≥99.5％的菌株。
所述阻断其中间代谢产物乙偶姻至2,3-丁二醇的代谢途径的手段为CRISPR/Cas9基因同框缺失、CRISPR/Cas12a基因同框缺失、ClosTron二类内含子介导的基因失活、同源重组、或其它2,3-丁二醇脱氢酶失活手段。
所述突变株为食气梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶缺失失活；或，食气梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶被功能基因序列替换，其中，功能基因序列为丙酮酸脱羧酶基因、醛醇脱氢酶基因。
所述食气梭菌2,3-丁二醇脱氢酶蛋白序列为与永达尔梭菌中CLJU_c23220基因(Gene ID:45179669)和产乙醇梭菌中CAETHG_0385基因(Gene ID:33107402)编码的蛋白氨基酸序列具有至少95％的相似度。
所述突变体的碱基序列为永达尔梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶缺失，其碱基序列为野生型全基因组中"CLJU_c23220"(CP001666.1:2547792-2548865)其中从2547799-2548860缺失；
或，所述突变体的碱基序列为产乙醇梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶缺失，其碱基序列为野生型全基因组中CAETHG_0385(CP006763.1:413109-414182)，其中从413116-414177缺失；
或，永达尔梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶被丙酮酸脱羧酶基因替代，其碱基序列为野生型全基因组中从2547803-2548865由SEQID NO.1碱基序列替换；
或，永达尔梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶被醛醇脱氢酶基因替代，其碱基序列为野生型全基因组中从2547803-2548865由SEQID NO.2碱基序列替换。
一种所述的提高合成气发酵产乙醇含量的突变株的构建方法，所述突变株为以食气梭菌为出发菌株，通过基因工程手段阻断其中间代谢产物乙偶姻至2,3-丁二醇的代谢途径，进而所得菌株。
所述阻断其中间代谢产物乙偶姻至2,3-丁二醇的代谢途径的手段为CRISPR/Cas9基因同框缺失、CRISPR/Cas12a基因同框缺失、ClosTron二类内含子介导的基因失活、同源重组、或其它2,3-丁二醇脱氢酶失活手段。
进一步的具体为
(1)基因敲除质粒的构建：使用合适的限制性内切酶线性化载体；设计相应引物，通过聚合酶链式反应(PCR反应)获得sgRNA及同源臂(HAs)片段；然后将载体与片段连接，构建成基因敲除质粒。
(2)基因敲除菌株的构建：将步骤(1)所述的基因敲除质粒电转化至相应食气梭菌菌株中；通过阳性克隆子鉴定，筛选构建成功的突变株。
(3)突变株发酵实验：将步骤(2)所述的突变株在YTF培养基中活化，然后转接至PETC培养基(含15g/L果糖)继续培养24小时；转接至PETC气体培养基(含有CO的合成气)驯化至彻底适应，最后利用驯化后的菌株进行合成气发酵。
以构建永达尔梭菌2,3-丁二醇脱氢酶基因同框缺失突变株为例：
步骤(1)所述的限制性内切酶是：SalI和XhoI酶。
步骤(1)所述的设计的引物是：
sgRNA-F:
TAAGGAGGAGTTTTCGTCGACTAAAAAAGATGTAAGAGTAGGTTTTAGAGCTAGAAATA；
sgRNA-R:
ATAAAAATAAGAAGCCTGCAAATGCAGGCTTCTTATTTTTATAAAAAAAGCACCGACTC
HA-upstream-F:
TTGCAGGCTTCTTATTTTTATGGGCTCTGTACAGAATACATCTCCTTTAAATCC；
HA-upstream-R:
AAGGAGAGATAATTATGAAATTGTAAAAAGTACTCATAGAATTGA；
HA-downstream-F:
CAATTCTATGAGTACTTTTTACAATTTCATAATTATCTCTCCTTTTTTATAATAG；
HA-downstream-R:
GCCAAGCTTGCATGTCTGCAGGCCCCGGGGAAGGGGAAAGTGGCACTGGAAAAGAACTC。
步骤(2)所述的电转化宿主菌株是：永达尔梭菌DSM 13528和产乙醇梭菌DSM10061。
优选地，步骤(2)所述的电转化参数设置为1.0kV，200Ω，50μF。
优选地，步骤(3)所述的YTF培养基包含：酵母粉8～10g/L，胰蛋白胨12～16g/L，果糖8～10g/L，氯化钠0.1～0.2g/L，L-半胱氨酸0.3～0.5g/L，0.2％微量元素储存液(一水合硫酸锰4～5g/L，六水合氯化镍0.1～0.2g/L，硫酸铵4～5g/L，六水合氯化钴0.6～1g/L，七水合硫酸锌0.6～1g/L，二水合氯化铜0.1～0.2g/L)，氯化钙0.1～0.2g/L，氯化镁0.2～0.4g/L，钼酸钠0.0002～0.0004g/L，硒酸钠0.0002～0.0004g/L，钨酸钠0.0002～0.0004g/L，氨三乙酸0.002～0.004g/L，刃天青0.0005～0.001g/L，硫酸亚铁0.02～0.04g/L，0.1％维生素混合液(生物素1～2mg/L，叶酸1～2mg/L，维生素B6 8～10mg/L，硫胺素4～5mg/L，核黄素4～5mg/L，泛酸钙4～5mg/L，硫辛酸4～5mg/L，对氨基苯甲酸4～5mg/L，氰钴胺素4～5mg/L，烟酸4～5mg/L)。
优选地，步骤(3)所述的PETC培养基包含：大量元素(氯化铵0.5～1.0g/L，氯化钾0.1～0.2g/L,七水合硫酸镁0.2～0.4g/L,氯化钠0.8～1g/L,磷酸二氢钾0.1～0.2g/L，钨酸钠0.0025～0.005g/L)，微量金属元素(四水合氯化锰0.005～0.015g/L，一水合硫酸锰0.005～0.015g/L，硫酸亚铁0.02～0.04g/L,六水合氯化钴0.002～0.004g/L,七水合硫酸锌0.002～0.004g/L,六水合氯化镍0.0002～0.0004g/L,钼酸钠0.002～0.004g/L，硒酸钠0.001～0.002g/L)，氯化镁0.2～0.4g/L,一水合氯化钙0.02～0.04g/L，氯化钙0.1～0.2g/L，氨三乙酸0.002～0.006g/L，刃天青0.0005～0.001g/L，酵母粉0.5～1g/L，L-半胱氨酸0.25～0.5g/L，0.1％维生素混合液。
优选地，步骤(3)所述的发酵条件为：发酵温度30～40℃，发酵pH5.6～6.8，转速280～400rpm，发酵时间180～240h，合成气选用含有20％～90％CO，其余部分为CO2和H2的合成气，压力0.06～0.12MPa。
一种所述的提高合成气发酵产乙醇含量的突变株的应用，所述获得突变株在合成气发酵产乙醇中的应用。
一种合成气发酵产乙醇的方法，利用所述获得突变株在合成气发酵过程中厌氧发酵，进而提高乙醇的产量。
本发明的有益效果：
本发明以食气梭菌作为出发菌株通过基因工程手段阻断其中间代谢产物乙偶姻至2,3-丁二醇的代谢途径，进而所得菌株；其中，通过敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因，阻断从中间代谢产物乙偶姻到2,3-丁二醇的代谢途径，从而抑制2,3-丁二醇的生产，同时优化发酵条件，以维持乙醇处于较高产量。
同时，其阻断2,3-丁二醇生成途径中，将2,3-丁二醇脱氢酶基因读码框替换成丙酮酸脱羧酶基因进行表达，既可抑制2,3-丁二醇生成，并将丙酮酸转化成乙醛，提高乙醇产量。
并且，进一步的阻断2,3-丁二醇生成途径时，将2,3-丁二醇脱氢酶基因读码框替换成醛醇脱氢酶突变体基因进行表达，利用辅因子NADPH将乙酰辅酶A转化成乙醛及乙醇，提高乙醇产量。
本发明构建的突变体在合成气发酵中可不影响菌株正常生长，并显著降低了副产物2,3-丁二醇的产量，以及在总发酵有机溶剂中的比例，进而提高乙醇的含量。以永达尔梭菌为例，2,3-丁二醇产量由16.6g/L下调到了2.4g/L，乙醇生成基本不受影响。本发明通过基因缺失的方式减少了副产物2,3-丁二醇在总发酵溶剂中的含量，同时提高了乙醇在总发酵溶剂中的占比，从而使发酵液的分离成本降低，对合成气发酵产燃料乙醇的工业化实施具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例提供的永达尔梭菌DSM 13528突变株鉴定(1：突变株；2：野生型；M：marker)图。
图2为本发明实施例提供的产乙醇梭菌DSM 10061突变株鉴定(M：marker；1：野生型；2：突变株)图。
图3为本发明实施例提供的丙酮酸脱羧酶基因替代2,3-丁二醇脱氢酶基因表达的突变体鉴定(1：野生型2：丙酮酸脱羧酶基因替代2,3-丁二醇脱氢酶基因表达的突变体；M：marker)。
图4为本发明实施例提供的醛醇脱氢酶基因替代2,3-丁二醇脱氢酶基因表达的突变体鉴定(M，marker；1:野生型2：醛醇脱氢酶基因替代2,3-丁二醇脱氢酶基因表达的突变体)；
图5为本发明实施例提供的永达尔梭菌DSM 13528野生型与突变株合成气发酵生物量变化示意图。
图6为本发明实施例提供的永达尔梭菌DSM 13528野生型与突变株合成气发酵2,3-丁二醇产量变化示意图。
图7为本发明实施例提供的永达尔梭菌DSM 13528野生型与突变株合成气发酵乙醇产量变化示意图。
图8为本发明实施例提供的永达尔梭菌DSM 13528野生型与突变株合成气发酵乙酸产量变化示意图。
图9为本发明实施例提供的产乙醇梭菌DSM 10061野生型与突变株合成气发酵生物量变化示意图。
图10为本发明实施例提供的产乙醇梭菌DSM 10061野生型与突变株合成气发酵2,3-丁二醇产量变化示意图。
图11为本发明实施例提供的产乙醇梭菌DSM 10061野生型与突变株合成气发酵乙醇产量变化示意图。
图12为本发明实施例提供的产乙醇梭菌DSM 10061野生型与突变株合成气发酵乙酸产量变化示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对上述实施步骤作出详细说明。
菌株和质粒：
菌株为永达尔梭菌DSM 13528和产乙醇梭菌DSM 10061(均购买于德国微生物和细胞培养物保藏中心)。
质粒为pMTLcas-pta(记载于文献Huang H,Chai C,Li N,et al.Crispr/cas9-based efficient genome editing in clostridium ljungdahlii,an autotrophic gas-fermenting bacterium.ACS Synthetic Biology,2016.)
SMP缓冲液：270mM蔗糖，1mM氯化镁，7mM磷酸钠，10％DMSO，pH6.0。
YTF培养基包含：酵母粉10g/L，胰蛋白胨16g/L，果糖10g/L，氯化钠0.2g/L，L-半胱氨酸0.5g/L，0.2％微量元素储存液(一水合硫酸锰5g/L，六水合氯化镍0.2g/L，硫酸铵5g/L，六水合氯化钴1g/L，七水合硫酸锌1g/L，二水合氯化铜0.2g/L)，氯化钙0.2g/L，氯化镁0.4g/L，钼酸钠0.0004g/L，硒酸钠0.0004g/L，钨酸钠0.0004g/L，氨三乙酸0.004g/L，刃天青0.001g/L，硫酸亚铁0.04g/L，0.1％维生素混合液(生物素2mg/L，叶酸2mg/L，维生素B610mg/L，硫胺素5mg/L，核黄素5mg/L，泛酸钙5mg/L，硫辛酸5mg/L，对氨基苯甲酸5mg/L，氰钴胺素5mg/L，烟酸5mg/L)。
PETC培养基包含：大量元素(氯化铵0.5g/L，氯化钾0.2g/L,七水合硫酸镁0.4g/L,氯化钠1g/L,磷酸二氢钾0.2g/L，钨酸钠0.005g/L)，微量金属元素(四水合氯化锰0.015g/L，一水合硫酸锰0.015g/L，硫酸亚铁0.04g/L,六水合氯化钴0.004g/L,七水合硫酸锌0.004g/L,六水合氯化镍0.0004g/L,钼酸钠0.004g/L，硒酸钠0.002g/L)，氯化镁0.4g/L,一水合氯化钙0.02g/L，氯化钙0.2g/L，氨三乙酸0.002g/L，刃天青0.001g/L，酵母粉1g/L，L-半胱氨酸0.25g/L，0.1％维生素混合液(具体成分见上述YTF中0.1％维生素混合液成分)。
产物分析方法：高效液相色谱法(HPLC)。仪器：Agilent HPLC 1260(示差折光)。色谱条件：色谱柱：Aminex HPX-87H Column；流动相：5mM硫酸；流速：0.5mL/min；进样量:10μL；柱温：55℃；示差折光检测器。样品制备：发酵液4℃，12000rpm离心5min，取上清液适当稀释后，用0.22μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。
实施例1：永达尔梭菌DSM 13528 2,3-丁二醇脱氢酶缺失突变体的构建1、基因敲除质粒的构建
使用限制性内切酶SalI和XhoI双重消化质粒pMTLcas-pta，回收其中9000bp长的片断，获得线性化的pMTLcas载体骨架；
靶向永达尔梭菌DSM 13528中CLJU_c23220基因(2,3-丁二醇脱氢酶)的20nt目标区设计guide RNA，基因序列如Gene ID:45179669所示，而后以pMTLcas-pta为模板，sgRNA-F/sgRNA-R为引物，通过聚合酶链式反应(PCR)获得sgRNA支架。
聚合酶链式反应体系皆为50μl(2×KAPA Mix,25μl；sgRNA-F/sgRNA-R(10μM)各1μL，pMTLcas-pta载体1μL(50ng)，加水补至50μl)。
PCR扩增条件，①95℃预变性3min，②98℃变性20sec，③60℃退火20sec，④72℃延伸30秒每kb计算，②-④循环30次，⑤72℃延伸5min。
以永达尔梭菌DSM 13528基因组DNA为模板，HA-upstream-F/HA-upstream-R和HA-downstream-F/HA-downstream-R分别为引物，通过聚合酶链式反应获得位于CLJU_c23220开放阅读框两侧的两个同源臂(HA-upstream和HA-downstream)；
PCR体系及扩增条件参照上述步骤。
通过重叠延伸PCR，将HA-upstream和HA-downstream组装，得到HAs片断；(PCR体系：HA-upstream-F/HA-downstream-R引物各1μL，HA-upstream和HA-downstream DNA片段各10ng作为模板，2×KAPA Mix,25μl；，用水补齐至50μL。)PCR扩增条件参照上述步骤。
将sgRNA支架和HAs通过重叠延伸PCR组装，产生sgRNA-HA片段；sgRNA-F/HA-downstream-R引物各1μL，sgRNA和HAs DNA片段各1μL(摩尔浓度1：1)作模板，2×KAPA Mix,25μl；，用水补齐至50μL。)扩增条件参照上述步骤。
然后，使用ClonExpress MultiS一步克隆试剂盒组装线性pMTLcas片断和包含sgRNA-HA的DNA片段，以产生CRISPR/Cas9编辑的敲除质粒pMTLcas-CLJU_c23220。
上述采用的引物为：
sgRNA-F:
TAAGGAGGAGTTTTCGTCGACTAAAAAAGATGTAAGAGTAGGTTTTAGAGCTAGAAATA；
sgRNA-R:
ATAAAAATAAGAAGCCTGCAAATGCAGGCTTCTTATTTTTATAAAAAAAGCACCGACTC
HA-upstream-F:
TTGCAGGCTTCTTATTTTTATGGGCTCTGTACAGAATACATCTCCTTTAAATCC；
HA-upstream-R:
AAGGAGAGATAATTATGAAATTGTAAAAAGTACTCATAGAATTGA；
HA-downstream-F:
CAATTCTATGAGTACTTTTTACAATTTCATAATTATCTCTCCTTTTTTATAATAG；
HA-downstream-R:
GCCAAGCTTGCATGTCTGCAGGCCCCGGGGAAGGGGAAAGTGGCACTGGAAAAGAACTC。
2、基因敲除菌株的构建
将冻存的永达尔梭菌DSM 13528在冰上活化，然后在PETC液体培养基(含有40mMDL-苏氨酸)中转接两次，37℃培养生长至OD600nm达到0.2～0.3之间。4℃下10000rpm离心10min收取对数生长期细胞，用SMP缓冲液洗涤细胞两次，洗涤后细胞重悬于SMP缓冲液,控制细胞密度在1010～1011cells/mL,制得感受态细胞备用。
电转过程全部在厌氧箱内操作。取200μL上述获得的感受态细胞，与4μg上述质粒pMTLcas-CLJU_c23220冰上混合孵育10min；然后将感受态细胞与质粒的混合物转移到2mm电转杯中，使用Bio-Rad电转仪进行电转。电转参数设置为1.0kV，200Ω，50μF。
转化液用2mL冰冷的YTF培养基(含有0.4％L-半胱氨酸)重悬，37℃孵育6h，取100μl菌液涂布于YTF平板(含有5μg/ml的甲砜霉素)，37℃恒温培养约3天。
从筛选平板上挑取单菌落，利用PCR验证转化结果，鉴定引物为c23220-F/c23220-R，筛选阳性转化子，得到正确的突变株M-CLJU_c23220，鉴定结果如图1，即，突变体的碱基序列为永达尔梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶缺失，其碱基序列为野生型全基因组"CLJU_c23220"其中从(CP001666.1:2547799-2548860)敲除。
c23220-F:GGCATTCTGAGCCAGTTCTT；
c23220-R:AAGCAGCAAGAAGTGAATGC。
实施例2：产乙醇梭菌DSM 10061 2,3-丁二醇脱氢酶缺失突变体的构建1、基因敲除质粒的构建
使用限制性内切酶SalI和XhoI双重消化质粒pMTLcas-pta，获得线性化的pMTLcas载体片段；
以pMTLcas-pta为模板，sgRNA-F/sgRNA-R为引物，通过聚合酶链式反应(PCR)获得sgRNA，靶向产乙醇梭菌DSM 10061CAETHG_0385基因的20nt目标区，基因序列如Gene ID:33107402所示；
以产乙醇梭菌DSM 10061基因组DNA为模板，HA-upstream-F/HA-upstream-R和HA-downstream-F/HA-downstream-R分别为引物，通过聚合酶链式反应获得位于CAETHG_0385开放阅读框两侧的两个同源臂(HA-upstream和HA-downstream)；
通过重叠延伸PCR，将HA-upstream和HA-downstream组装，得到HAs片断；
sgRNA支架和HAs通过重叠延伸PCR组装，产生sgRNA-HA片段；
然后，使用ClonExpress MultiS一步克隆试剂盒组装线性pMTLcas载体片段和包含sgRNA-HA的DNA片段，以产生CRISPR/Cas9编辑的敲除质粒pMTLcas-CAETHG_0385。
2、基因敲除菌株的构建
将冻存的产乙醇梭菌DSM 10061冰上活化，然后在PETC液体培养基(含有40mM DL-苏氨酸)中转接两次，37℃培养生长至OD600nm达到0.2～0.3左右。4℃下10000rpm离心10min收取对数生长期细胞，用SMP缓冲液洗涤细胞两次，洗涤后细胞重悬于SMP缓冲液，控制细胞密度在1010～1011cells/mL,制得感受态细胞备用。
电转过程全部在厌氧箱内操作。取200μL上述获得的感受态细胞，与4μg质粒pMTLcas-CAETHG_0385冰上混合孵育10min；然后将感受态细胞与质粒的混合物转移到2mm电转杯中，使用Bio-Rad电转仪进行电转。电转参数设置为1.0kV，200Ω，50μF。
转化液用2mL冰冷的YTF培养基(含有0.4％L-半胱氨酸)重悬，37℃孵育6h，取100μl菌液涂布于YTF平板(含有5μg/ml的甲砜霉素)，37℃恒温培养约3天。
从筛选平板上挑取单菌落，利用PCR验证转化结果，鉴定引物为c23220-F/c23220-R，筛选阳性转化子，得到正确的突变株M-CAETHG_0385，鉴定结果如图2，即，突变体的碱基序列为产乙醇梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶缺失，其碱基序列为野生型全基因组"CAETHG_0385"从(CP006763.1:413116-414177)敲除。
实施例3：永达尔梭菌DSM 13528丙酮酸脱羧酶基因替代2,3-丁二醇脱氢酶基因表达突变体的构建
1、基因替代质粒的构建
丙酮酸脱羧酶可将丙酮酸转化为乙醛。具体来说，所述丙酮酸脱羧酶基因来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis subsp.mobilis ATCC 29191)。
为了优化运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)来源的丙酮酸脱羧酶基因(CP003704.1:1958606-1960312；Locus tag：ZZ6_1712)的异源表达，根据宿主永达尔梭菌DSM 13528的首选密码子，对丙酮酸脱酸酶基因进行密码子优化(委托华大基因公司进行密码子优化)，并合成优化后的基因序列，详见SEQID NO.1。
使用限制性内切酶SalI和XhoI双重消化质粒pMTLcas-pta，获得线性化的9000bp的pMTLcas载体骨架；
以pMTLcas-pta为模板，sgRNA-F/sgRNA-R为引物，通过聚合酶链式反应(PCR)获得sgRNA，靶向永达尔梭菌DSM 13528CLJU_c23220基因的20nt目标区，基因序列如Gene ID:45179669所示；
以永达尔梭菌DSM 13528基因组DNA为模板，HA-upstream-F/HA-upstream-R2和HA-downstream-F2/HA-downstream-R分别为引物，通过聚合酶链式反应获得位于CLJU_c23220开放阅读框两侧的两个同源臂(HA-upstream和HA-downstream)；
HA-upstream-R2:CCTTATTGTAAAAAGTACTCATAGAATTG
HA-downstream-F2:CATAATTATCTCTCCTTTTTTATAATAGTATGG
以合成的丙酮酸脱羧酶基因为模板，pdc-F/pdc-R为引物，通过聚合酶链式反应获得丙酮酸脱羧酶基因(pdc)；
pdc-F:
CAATTCTATGAGTACTTTTTACAATAAGGCTAAAGAAGCTTATTTACAGGTTTTCTAC
pdc-R:
CCATACTATTATAAAAAAGGAGAGATAATTATGAGTTACACTGTAGGCACTTACTTAGC
通过重叠延伸PCR将两个同源臂和丙酮酸脱羧酶基因组装，获得HA-pdc片段；(HA-upstream-F/HA-downstream-R引物各1μL，HA-upstream、HA-downstream以及pdc DNA片段各1μL(三个片段摩尔比1：1：1)，2xKAPAmix 25μL，用水补齐至50μL。)PCR扩增条件参照实施例1
sgRNA支架和HA-GAs通过重叠延伸PCR组装，产生sgRNA-HA-pdc片段；以相同摩尔浓度的sgRNA和HA-pdc片断为模板，以sgRNA-F/HA-downstream-R为引物
然后，使用ClonExpress MultiS一步克隆试剂盒组装线性pMTLcas载体骨架和sgRNA-HA-pdc片段，以产生CRISPR/Cas9编辑的基因替代质粒pMTLcas-CLJU_c23220/pdc。
2、基因替代菌株的构建
将冻存的永达尔梭菌DSM 13528在冰上活化，然后在PETC液体培养基(含有40mMDL-苏氨酸)中转接两次，37℃培养生长至OD600nm达到0.2～0.3之间。4℃下10000rpm离心10min收取对数生长期细胞，用SMP缓冲液洗涤细胞两次，洗涤后细胞重悬于SMP缓冲液,控制细胞密度在1010～1011cells/mL,制得感受态细胞备用。
电转过程全部在厌氧箱内操作。取200μL上述获得的感受态细胞，与4μg质粒pMTLcas-CLJU_c23220/pdc冰上混合孵育10min；然后将感受态细胞与质粒的混合物转移到2mm电转杯中，使用Bio-Rad电转仪进行电转。电转参数设置为1.0kV，200Ω，50μF。
转化液用2mL冰冷的YTF培养基(含有0.4％L-半胱氨酸)重悬，37℃孵育6h，取100μl菌液涂布于YTF平板(含有5μg/ml的甲砜霉素)，37℃恒温培养约3天。
从筛选平板上挑取单菌落，利用PCR验证转化结果，鉴定引物为c23220-F/c23220-R，筛选阳性转化子，得到正确的突变株M-CLJU_c23220/pdc，鉴定结果图图3，即，永达尔梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶被丙酮酸脱羧酶基因替代，其碱基序列为野生型全基因组"CLJU_c23220"中(CP001666.1:2547803-2548865)由SEQID NO.1碱基序列替换。
c23220-F:GGCATTCTGAGCCAGTTCTT；
c23220-R:AAGCAGCAAGAAGTGAATGC。
实施例4：永达尔梭菌DSM 13528醛醇脱氢酶基因替代2,3-丁二醇脱氢酶基因表达的突变体构建
1、基因替代突变体构建
醛醇脱氢酶可将乙酰辅酶A转化为乙醛及乙醇。具体来说，所述醛醇脱氢酶基因是来自热纤梭菌Hungateiclostridium thermocellum ATCC 27405的adhE(CP000568.1:531351-533972；locus tag:Cthe_0423)。将其编码的醛醇脱氢酶734位组氨酸突变成精氨酸后，辅因子由NADH依赖变成NADPH依赖(Brown et al.,Mutant alcohol dehydrogenaseleads to improved ethanol tolerance in Clostridium thermocellum.Proceedingsof the National Academy of Sciences 2011,108,13752-13757.)。
根据宿主永达尔梭菌DSM 13528的首选密码子，对adhE基因进行密码子优化(委托华大基因公司进行密码子优化)，并合成优化后的基因序列，详见SEQID NO.2。
使用限制性内切酶SalI和XhoI双重消化质粒pMTLcas-pta，获得线性化的pMTLcas载体骨架；
以pMTLcas-pta为模板，sgRNA-F/sgRNA-R为引物，通过聚合酶链式反应(PCR)获得sgRNA，靶向永达尔梭菌DSM 13528CLJU_c23220基因的20nt目标区，基因序列如Gene ID:45179669所示；
以永达尔梭菌DSM 13528基因组DNA为模板，HA-upstream-F/HA-upstream-R2和HA-downstream-F2/HA-downstream-R分别为引物，通过聚合酶链式反应获得位于CLJU_c23220开放阅读框两侧的两个同源臂(HA-upstream和HA-downstream)；
以合成的醛醇脱氢酶基因为模板，adhE-F/adhE-R为引物，通过聚合酶链式反应获得醛醇脱氢酶基因(adhE)；
adhE-F:CAATTCTATGAGTACTTTTTACAATAAGGCTACTTCTTTGCTCCGCCG
adhE-R:
CCATACTATTATAAAAAAGGAGAGATAATTATGACTAAAATAGCCAATAAATACGAGG
通过重叠延伸PCR将两个同源臂和醛醇脱氢酶基因组装，获得HA-adhE片段；
sgRNA支架和HA-adhE通过重叠延伸PCR组装，产生sgRNA-HA-adhE片段；
然后，使用ClonExpress MultiS一步克隆试剂盒组装线性pMTLcas载体骨架和sgRNA-HA-adhE片段，以产生CRISPR/Cas9编辑的基因替代质粒pMTLcas-CLJU_c23220/adhE。
2、基因替代菌株的构建
将冻存的永达尔梭菌DSM 13528在冰上活化，然后在PETC液体培养基(含有40mMDL-苏氨酸)中转接两次，37℃培养生长至OD600nm达到0.2～0.3之间。4℃下10000rpm离心10min收取对数生长期细胞，用SMP缓冲液洗涤细胞两次，洗涤后细胞重悬于SMP缓冲液,控制细胞密度在1010～1011cells/mL,制得感受态细胞备用。
电转过程全部在厌氧箱内操作。取200μL上述获得的感受态细胞，与4μg质粒pMTLcas-CLJU_c23220/adhE冰上混合孵育10min；然后将感受态细胞与质粒的混合物转移到2mm电转杯中，使用Bio-Rad电转仪进行电转。电转参数设置为1.0kV，200Ω，50μF。
转化液用2mL冰冷的YTF培养基(含有0.4％L-半胱氨酸)重悬，37℃孵育6h，取100μl菌液涂布于YTF平板(含有5μg/ml的甲砜霉素)，37℃恒温培养约3天。
从筛选平板上挑取单菌落，利用PCR验证转化结果，鉴定引物为c23220-F/c23220-R，筛选阳性转化子，得到正确的突变株M-CLJU_c23220/adhE，鉴定结果如图4，或，永达尔梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶被醛醇脱氢酶基因替代，其碱基序列为野生型全基因组"CLJU_c23220"中(CP001666.1:2547803-2548865)由SEQID NO.2碱基序列替换。
c23220-F:GGCATTCTGAGCCAGTTCTT；
c23220-R:AAGCAGCAAGAAGTGAATGC。
实施例5：永达尔梭菌DSM 13528突变体发酵实验
1、突变株的驯化
将上述获得的突变株M-CLJU_c23220按10wt％接种量接种于20mL YTF培养基，37℃恒温培养约48h，作为种子培养液。然后将获得的种子培养液按10wt％接种量转接到50mLPETC培养基(含15g/L果糖)中，继续培养24h，获得的菌液继续按10wt％接种量转接于PETC气体培养基(含有20％～90％CO，其余部分为CO2和H2的合成气,压力0.15～0.2MPa)中，适应性培养至OD值0.6左右，再在PETC气体培养基中传代培养五代以上，以使突变株彻底适应以合成气做碳源进行生长，获得稳定突变株，保存待用。
2、突变株的发酵
将上述突变株按10wt％接种量接种于50mL PETC气体培养基，37℃恒温培养48h进行活化，活化后的菌液再同时按10wt％接种量另转接4瓶50mL PETC气体培养基，37℃培养24h后，进行发酵罐培养。选用5L发酵罐，加入3L PETC气体培养基，发酵温度37℃，发酵pH维持在6.0左右，选用含90％CO，其余部分为CO2和H2的合成气做主要碳源，压力控制在0.10Mpa左右，发酵180h，每12h取一次样品，监测突变株发酵培养的生物量及产物的产量变化(见图5～图8)。
对比例1：永达尔梭菌DSM 13528野生型发酵实验
将保存的永达尔梭菌DSM 13528菌种按10％接种量接种于50mL PETC气体培养基，37℃恒温培养48h进行活化，活化后的菌液再同时按10％接种量另转接4瓶50mL PETC气体培养基，作为种子液，37℃培养24h后，进行发酵罐培养。
选用5L发酵罐，加入3L PETC气体培养基，发酵温度37℃，发酵pH维持在6.0左右，选用含90％CO，其余部分为CO2和H2的合成气做主要碳源，压力控制在0.1Mpa左右，发酵180h，每12h取一次样品，监测生物量及产物的产量变化(见图5～图8)。发酵截止至180h，OD600nm最大值达到8.6，2,3-丁二醇最大产量为8.2g/L，乙醇最大产量为44g/L，乙酸最大产量为18g/L。
由图5可见，突变株的生长速率与野生型相比变化不明显，而突变株2,3-丁二醇的产量如图6所示，最大产量降低到了2.4g/L，与野生型的8.2g/L相比，下调明显；而突变株乙醇的产量如图7所示，相比于野生型变化不大，乙醇产量从44g/L降到了39g/L；乙酸产量如图8所示，与野生型相比，产量由18g/L增长到22g/L。
实施例6：永达尔梭菌DSM 13528丙酮酸脱羧酶基因替代2,3-丁二醇脱氢酶基因表达突变体的发酵实验
1、突变株的驯化
将上述获得的突变株M-CLJU_c23220/pdc按10wt％接种量接种于20mL YTF培养基，37℃恒温培养约48h，作为种子培养液。然后将获得的种子培养液按10％接种量转接到50mL PETC培养基(含15g/L果糖)中，继续培养24h，获得的菌液继续按10wt％接种量转接于PETC气体培养基(含有90％CO，其余部分为CO2和H2的合成气,压力0.2MPa)中，适应性培养至OD值0.6左右，再在PETC气体培养基中传代培养五代以上，以使突变株彻底适应以合成气做碳源进行生长，获得稳定突变株，保存待用。
2、突变株的发酵
将上述稳定突变株按10wt％接种量接种于50mL PETC气体培养基，37℃恒温培养48h进行活化，活化后的菌液再同时按10wt％接种量另转接4瓶50mL PETC气体培养基，37℃培养24h后，进行发酵罐培养。选用5L发酵罐，加入3L PETC气体培养基，发酵温度37℃，发酵pH维持在5.6～6.8左右，选用含90％CO，其余部分为CO2和H2的合成气做主要碳源，压力控制在0.06～0.12Mpa左右，发酵180h，每12h取一次样品，监测生物量及产物的产量变化。突变株的生长速率与野生型相比变化不明显，而突变株2,3-丁二醇的产量与野生型相比，下调了78％；突变株的乙醇产量相比于野生型提高了52％。
实施例7永达尔梭菌DSM 13528醛醇脱氢酶基因替代2,3-丁二醇脱氢酶基因表达的突变体发酵实验
1、突变株的驯化
将上述获得的突变株M-CLJU_c23220/adhE按10％接种量接种于20mL YTF培养基，37℃恒温培养约48h，作为种子培养液。然后将获得的种子培养液按10％接种量转接到50mLPETC培养基(含15g/L果糖)中，继续培养24h，获得的菌液继续按10％接种量转接于PETC气体培养基(含有90％CO，其余部分为CO2和H2的合成气,压力0.2MPa)中，适应性培养至OD值0.6左右，再在PETC气体培养基中传代培养五代以上，以使突变株彻底适应以合成气做碳源进行生长，获得稳定突变株，保存待用。
2、突变株的发酵
将上述获得突变株按10％接种量接种于50mL PETC气体培养基，37℃恒温培养48h进行活化，活化后的菌液再同时按10％接种量另转接4瓶50mL PETC气体培养基，37℃培养24h后，进行发酵罐培养。选用5L发酵罐，加入3L PETC气体培养基，发酵温度37℃，发酵pH维持在5.6～6.8左右，选用含90％CO，其余部分为CO2和H2的合成气做主要碳源，压力控制在0.1Mpa左右，发酵180～240h，每12h取一次样品，监测生物量及产物的产量变化。突变株的生长速率与野生型相比变化不明显(图5)，而突变株2,3-丁二醇的产量与野生型的8.2g/L相比下降了84％；而突变株的乙醇产量相比于野生型增长了43％。
实施例8：产乙醇梭菌DSM 10061突变体发酵实验
1、突变株的驯化
将上述获得的突变株M-CAETHG_0385按10％接种量，接种于20mL YTF培养基，37℃恒温培养约48h，作为种子培养液。然后将获得的种子培养液按10％接种量转接到50mLPETC培养基(含15g/L果糖)中，继续培养24h，获得的菌液继续按10％接种量转接于PETC气体培养基(含有90％CO，其余部分为CO2和H2的合成气,压力0.2MPa)中，适应性培养至OD值0.6左右，再在PETC气体培养基中传代培养五代以上，以使突变株彻底适应以合成气做碳源进行生长，获得稳定突变株，保存待用。
2、突变株的发酵
将上述获得突变株按10％接种量接种于50mL PETC气体培养基，37℃恒温培养48h进行活化，活化后的菌液再同时按10％接种量另转接4瓶50mL PETC气体培养基，37℃培养24h后，进行发酵罐培养。选用5L发酵罐，加入3L PETC气体培养基，发酵温度37℃，发酵pH维持在6.0左右，选用含90％CO，其余部分为CO2和H2的合成气做主要碳源，压力控制在0.1Mpa左右，发酵180h，每12h取一次样品，监测生物量及产物的产量变化(见图7～图10)。
对比例2：产乙醇梭菌DSM 10061野生型发酵实验
将保存的产乙醇梭菌DSM 10061菌种按10％接种量接种于50mL PETC气体培养基，37℃恒温培养48h进行活化，活化后的菌液再同时按10％接种量另转接4瓶50mL PETC气体培养基，作为种子液，37℃培养24h后，进行发酵罐培养。
选用5L发酵罐，加入3L PETC气体培养基，发酵温度37℃，发酵pH维持在6.0左右，选用含90％CO，其余部分为CO2和H2的合成气做主要碳源，压力控制在0.1Mpa左右，发酵180h，每12h取一次样品，监测生物量及产物的产量变化(见图9～图12)。发酵截止至180h，OD600nm最大值达到7.3，2,3-丁二醇最大产量为1.6g/L，乙醇最大产量为9g/L，乙酸最大产量为11g/L。
由上述如图9所示，突变株的生长速率与野生型相比变化不明显；突变株2,3-丁二醇的产量如图10所示，最大产量降低到了0.6g/L，与野生型的1.6g/L相比，下调明显；乙醇产量与野生型相比，由11g/L下调到7g/L，变化不大，如图9；乙酸产量与野生型相比，由11g/L增长到13g/L，如图12。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQID NO.1
>Synthetic pdc
ATGAGTTACACTGTAGGCACTTACTTAGCAGAGAGGCTTGTACAGATAGGACTTAAGCATCACTTTGCAGTAGCAGGAGATTATAACTTAGTGCTTCTTGATAACCTTCTTCTGAACAAGAACATGGAGCAGGTATATTGCTGCAACGAGCTTAACTGTGGATTCAGTGCAGAGGGATATGCAAGAGCAAAAGGAGCAGCAGCAGCAGTAGTAACTTATAGTGTAGGAGCATTAAGTGCCTTCGACGCAATAGGAGGAGCATATGCAGAAAATTTACCTGTAATACTGATCAGCGGAGCCCCTAACAATAACGACCATGCAGCAGGACATGTATTACACCATGCATTAGGAAAAACTGACTACCACTATCAGCTTGAAATGGCAAAAAACATCACTGCAGCCGCAGAAGCAATATACACTCCTGAAGAAGCACCTGCAAAAATAGACCATGTAATAAAGACCGCCCTTAGGGAGAAGAAGCCTGTATACTTAGAGATAGCATGCAATACCGCAAGTATGCCTTGTGCAGCACCTGGACCTGCAAGTGCATTATTTAATGATGAAGCCAGTGACGAGGCAAGTCTTAATGCAGCAGTAGATGAAACTTTAAAGTTCATCGCAAACCGCGACAAGGTAGCAGTACTTGTAGGAAGTAAATTAAGGGCCGCAGGAGCAGAAGAAGCAGCAGTAAAATTTACTGATGCACTGGGAGGAGCAGTAGCAACTATGGCAGCAGCAAAAAGTTTTTTTCCCGAGGAGAACGCAAACTACATAGGAACTAGTTGGGGAGAGGTAAGTTATCCTGGAGTAGAAAAAACTATGAAGGAGGCAGATGCAGTAATAGCATTAGCACCTGTATTTAACGACTACAGTACTACCGGATGGACTGATATACCTGATCCTAAAAAACTGGTACTTGCAGAGCCTAGAAGTGTAGTAGTAAATGGAATAAGGTTCCCTAGTGTACACCTTAAAGACTATTTAACCAGGCTTGCCCAGAAGGTAAGTAAAAAGACTGGAAGTCTTGACTTCTTCAAGAGTCTTAACGCAGGCGAGCTTAAGAAAGCAGCACCTGCAGATCCTAGTGCACCTTTAGTAAATGCAGAAATAGCCAGACAGGTAGAGGCACTTTTAACTCCTAACACTACTGTAATAGCAGAGACTGGAGATAGTTGGTTTAACGCACAAAGAATGAAACTTCCTAACGGCGCAAGAGTAGAATATGAGATGCAATGGGGACATATAGGCTGGAGTGTACCTGCAGCATTTGGATATGCAGTAGGAGCACCTGAAAGAAGAAATATATTAATGGTAGTGACGGCAGTTTCCAGTTAACTGCACAAGAAGTAGCACAGATGGTAAGGTTAAAACTGCCCGTAATAATCTTCCTTATAAACAACTACGGATACACCATAGAGGTGATGATACACGATGGCCCTTATAACAATATAAAGAACTGGGACTACGCCGGACTTATGGAGGTATTTAACGGAAATGGAGGATACGACAGTGGAGCAGCAAAAGGATTAAAAGCAAAAACTGGCGGAGAGCTTGCAGAAGCAATAAAAGTAGCACTTGCAAATACTGACGGCCCCACTTTAATAGAGTGTTTTATAGGAAGGGAGGACTGCACTGAAGAGTTAGTAAAATGGGGAAAAAGGGTAGCAGCAGCAAATAGTAGAAAACCTGTAAATAAGCTTCTTTA
SEQID NO.2
>synthetic adhE
ATGACTAAAATAGCCAATAAATACGAGGTAATAGACAACGTGGAAAAGCTTGAGAAGGCACTTAAGAGGTTAAGGGAGGCACAAAGTGTATATGCAACTTATACTCAGGAGCAGGTAGACAAAATATTCTTCGAGGCAGCAATGGCAGCAAATAAAATGAGGATACCTTTAGCAAAGATGGCCGTAGAGGAGACTGGAATGGGAGTAGTAGAAGATAAAGTAATAAAAAACCACTACGCCAGTGAGTACATCTACAACGCATACAAGAACACTAAGACTTGCGGAGTAATAGAGGAGGACCCTGCATTTGGAATAAAAAAGATAGCAGAGCCCCTTGGAGTAATAGCCGCAGTAATACCTACTACTAATCCTACTAGTACTGCCATATTCAAGACTCTGATAGCACTTAAGACTAGGAACGCAATAATAATCAGTCCTCACCCTAGGGCAAAAAACAGTACTATAGAAGCAGCAAAGATAGTACTGGAGGCAGCAGTAAAGGCAGGAGCACCTGAAGGAATAATAGGATGGATAGATGTACCTAGTCTTGAGCTTACTAATCTTGTAATGAGGGAGGCAGACGTAATACTTGCAACTGGAGGACCTGGATTAGTAAAAGCAGCATATAGTAGTGGCAAGCCTGCAATAGGAGTAGGAGCAGGAAATACTCCTGCAATAATAGATGATAGCGCAGACATAGTACTTGCAGTAAACAGTATAATACACAGTAAGACCTTCGACAACGGCATGATATGCGCAAGTGAACAGAGTGTAATAGTACTGGACGGAGTATATAAGGAGGTAAAGAAGGAGTTCGAAAAGAGGGGATGTTATTTTCTTAACGAGGACGAGACTGAGAAGGTAAGGAAAACTATAATAATCAACGGCGCACTTAACGCAAAGATCGTAGGACAGAAAGCACACACTATAGCAAACCTTGCAGGATTTGAAGTACCTGAAACTACTAAAATACTGATAGGAGAGGTAACTAGTGTAGACATCAGTGAGGAATTCGCCCACGAAAAACTTTGCCCTGTACTTGCAATGTATAGGGCAAAAGACTTTGACGACGCACTTGATAAAGCAGAGAGATTAGTAGCAGATGGAGGATTTGGACATACTAGTAGTTTATACATCGACACTGTAACTCAGAAGGAGAAGCTTCAGAAATTCAGTGAGAGGATGAAAACTTGCAGGATACTTGTAAACACTCCTAGTAGTCAGGGAGGAATAGGAGATTTATATAACTTCAAGCTTGCACCCAGTCTGACTCTTGGATGCGGAAGTTGGGGAGGAAATAGTGTAAGTGATAATGTAGGAGTGAAGCACCTTCTTAACATAAAGACTGTGGCAGAGAGGAGGGAGAATATGCTTTGGTTTAGAACTCCTGAAAAGATATACATAAAGAGAGGATGCCTTCCCGTAGCATTAGATGAGTTAAAAAATGTGATGGGCAAGAAGAAGGCATTCATCGTAACTGACAACTTCCTTTATAACAACGGATACACTAAGCCTATAACTGACAAACTTGACGAGATGGGAATAGTGCATAAGACTTTTTTCGACGTAAGCCCCGACCCTAGTTTAGCAAGTGCAAAAGCAGGAGCAGCAGAAATGTTAGCATTTCAACCTGATACTATAATAGCAGTAGGAGGAGGAAGTGCAATGGATGCAGCAAAAATAATGTGGGTAATGTACGAGCACCCTGAGGTAGATTTTATGGATATGGCAATGAGATTCATGGACATAAGGAAGAGAGTATACACTTTCCCTAAGATGGGACAGAAAGCATATTTCATAGCCATCCCTACTAGTGCAGGAACTGGAAGTGAAGTAACTCCTTTTGCAGTAATAACTGACGAAAAAACTGGAATAAAGTACCCCCTTGCAGACTACGAACTTTTACCTGATATGGCAATAGTAGACGCCGATATGATGATGAATGCACCTAAAGGATTAACCGCAGCAAGTGGAATAGATGCATTAACCCATGCATTAGAGGCATACGTAAGTATGCTTGCAACTGACTACACTGATAGTCTTGCATTAAGGGCAATAAAAATGATATTCGAGTACCTTCCCAGGGCCTACGAGAACGGAGCAAGTGATCCTGTAGCAAGAGAAAAAATGGCAAATGCAGCAACTATAGCCGGAATGGCATTTGCAAATGCATTTCTTGGAGTATGCCACAGTATGGCAAGAAAATTAGGAGCATTCTATCACCTTCCCCACGGAGTAGCAAATGCATTAATGATAAACGAGGTGATAAGGTTCAACAGTAGTGAAGCCCCTACTAAGATGGGAACTTTTCCTCAATATGACCACCCTAGAACTTTAGAGAGGTACGCAGAAATAGCAGACTATATAGGACTTAAGGGCAAGAACAACGAGGAAAAGGTAGAAAACTTAATCAAGGCAATCGACGAGTTGAAAGAGAAGGTAGGAATAAGGAAGACTATAAAAGACTACGACATCGACGAGAAGGAGTTCCTTGATAGGCTTGACGAGATGGTAGAGCAAGCATTTGATGATCAATGTACTGGCACTAACCCTAGGTATCCTTTAATGAACGAGATAAGGCAAATGTACTTAAACGCATACTACGGCGGAGCAAAGAAGTAG
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
中国科学院分子植物科学卓越创新中心
<120> 一种提高合成气发酵产乙醇含量的突变株和利用突变株的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1705
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagttaca ctgtaggcac ttacttagca gagaggcttg tacagatagg acttaagcat 60
cactttgcag tagcaggaga ttataactta gtgcttcttg ataaccttct tctgaacaag 120
aacatggagc aggtatattg ctgcaacgag cttaactgtg gattcagtgc agagggatat 180
gcaagagcaa aaggagcagc agcagcagta gtaacttata gtgtaggagc attaagtgcc 240
ttcgacgcaa taggaggagc atatgcagaa aatttacctg taatactgat cagcggagcc 300
cctaacaata acgaccatgc agcaggacat gtattacacc atgcattagg aaaaactgac 360
taccactatc agcttgaaat ggcaaaaaac atcactgcag ccgcagaagc aatatacact 420
cctgaagaag cacctgcaaa aatagaccat gtaataaaga ccgcccttag ggagaagaag 480
cctgtatact tagagatagc atgcaatacc gcaagtatgc cttgtgcagc acctggacct 540
gcaagtgcat tatttaatga tgaagccagt gacgaggcaa gtcttaatgc agcagtagat 600
gaaactttaa agttcatcgc aaaccgcgac aaggtagcag tacttgtagg aagtaaatta 660
agggccgcag gagcagaaga agcagcagta aaatttactg atgcactggg aggagcagta 720
gcaactatgg cagcagcaaa aagttttttt cccgaggaga acgcaaacta cataggaact 780
agttggggag aggtaagtta tcctggagta gaaaaaacta tgaaggaggc agatgcagta 840
atagcattag cacctgtatt taacgactac agtactaccg gatggactga tatacctgat 900
cctaaaaaac tggtacttgc agagcctaga agtgtagtag taaatggaat aaggttccct 960
agtgtacacc ttaaagacta tttaaccagg cttgcccaga aggtaagtaa aaagactgga 1020
agtcttgact tcttcaagag tcttaacgca ggcgagctta agaaagcagc acctgcagat 1080
cctagtgcac ctttagtaaa tgcagaaata gccagacagg tagaggcact tttaactcct 1140
aacactactg taatagcaga gactggagat agttggttta acgcacaaag aatgaaactt 1200
cctaacggcg caagagtaga atatgagatg caatggggac atataggctg gagtgtacct 1260
gcagcatttg gatatgcagt aggagcacct gaaagaagaa atatattaat ggtagtgacg 1320
gcagtttcca gttaactgca caagaagtag cacagatggt aaggttaaaa ctgcccgtaa 1380
taatcttcct tataaacaac tacggataca ccatagaggt gatgatacac gatggccctt 1440
ataacaatat aaagaactgg gactacgccg gacttatgga ggtatttaac ggaaatggag 1500
gatacgacag tggagcagca aaaggattaa aagcaaaaac tggcggagag cttgcagaag 1560
caataaaagt agcacttgca aatactgacg gccccacttt aatagagtgt tttataggaa 1620
gggaggactg cactgaagag ttagtaaaat ggggaaaaag ggtagcagca gcaaatagta 1680
gaaaacctgt aaataagctt cttta 1705
<210> 2
<211> 2622
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgactaaaa tagccaataa atacgaggta atagacaacg tggaaaagct tgagaaggca 60
cttaagaggt taagggaggc acaaagtgta tatgcaactt atactcagga gcaggtagac 120
aaaatattct tcgaggcagc aatggcagca aataaaatga ggataccttt agcaaagatg 180
gccgtagagg agactggaat gggagtagta gaagataaag taataaaaaa ccactacgcc 240
agtgagtaca tctacaacgc atacaagaac actaagactt gcggagtaat agaggaggac 300
cctgcatttg gaataaaaaa gatagcagag ccccttggag taatagccgc agtaatacct 360
actactaatc ctactagtac tgccatattc aagactctga tagcacttaa gactaggaac 420
gcaataataa tcagtcctca ccctagggca aaaaacagta ctatagaagc agcaaagata 480
gtactggagg cagcagtaaa ggcaggagca cctgaaggaa taataggatg gatagatgta 540
cctagtcttg agcttactaa tcttgtaatg agggaggcag acgtaatact tgcaactgga 600
ggacctggat tagtaaaagc agcatatagt agtggcaagc ctgcaatagg agtaggagca 660
ggaaatactc ctgcaataat agatgatagc gcagacatag tacttgcagt aaacagtata 720
atacacagta agaccttcga caacggcatg atatgcgcaa gtgaacagag tgtaatagta 780
ctggacggag tatataagga ggtaaagaag gagttcgaaa agaggggatg ttattttctt 840
aacgaggacg agactgagaa ggtaaggaaa actataataa tcaacggcgc acttaacgca 900
aagatcgtag gacagaaagc acacactata gcaaaccttg caggatttga agtacctgaa 960
actactaaaa tactgatagg agaggtaact agtgtagaca tcagtgagga attcgcccac 1020
gaaaaacttt gccctgtact tgcaatgtat agggcaaaag actttgacga cgcacttgat 1080
aaagcagaga gattagtagc agatggagga tttggacata ctagtagttt atacatcgac 1140
actgtaactc agaaggagaa gcttcagaaa ttcagtgaga ggatgaaaac ttgcaggata 1200
cttgtaaaca ctcctagtag tcagggagga ataggagatt tatataactt caagcttgca 1260
cccagtctga ctcttggatg cggaagttgg ggaggaaata gtgtaagtga taatgtagga 1320
gtgaagcacc ttcttaacat aaagactgtg gcagagagga gggagaatat gctttggttt 1380
agaactcctg aaaagatata cataaagaga ggatgccttc ccgtagcatt agatgagtta 1440
aaaaatgtga tgggcaagaa gaaggcattc atcgtaactg acaacttcct ttataacaac 1500
ggatacacta agcctataac tgacaaactt gacgagatgg gaatagtgca taagactttt 1560
ttcgacgtaa gccccgaccc tagtttagca agtgcaaaag caggagcagc agaaatgtta 1620
gcatttcaac ctgatactat aatagcagta ggaggaggaa gtgcaatgga tgcagcaaaa 1680
ataatgtggg taatgtacga gcaccctgag gtagatttta tggatatggc aatgagattc 1740
atggacataa ggaagagagt atacactttc cctaagatgg gacagaaagc atatttcata 1800
gccatcccta ctagtgcagg aactggaagt gaagtaactc cttttgcagt aataactgac 1860
gaaaaaactg gaataaagta cccccttgca gactacgaac ttttacctga tatggcaata 1920
gtagacgccg atatgatgat gaatgcacct aaaggattaa ccgcagcaag tggaatagat 1980
gcattaaccc atgcattaga ggcatacgta agtatgcttg caactgacta cactgatagt 2040
cttgcattaa gggcaataaa aatgatattc gagtaccttc ccagggccta cgagaacgga 2100
gcaagtgatc ctgtagcaag agaaaaaatg gcaaatgcag caactatagc cggaatggca 2160
tttgcaaatg catttcttgg agtatgccac agtatggcaa gaaaattagg agcattctat 2220
caccttcccc acggagtagc aaatgcatta atgataaacg aggtgataag gttcaacagt 2280
agtgaagccc ctactaagat gggaactttt cctcaatatg accaccctag aactttagag 2340
aggtacgcag aaatagcaga ctatatagga cttaagggca agaacaacga ggaaaaggta 2400
gaaaacttaa tcaaggcaat cgacgagttg aaagagaagg taggaataag gaagactata 2460
aaagactacg acatcgacga gaaggagttc cttgataggc ttgacgagat ggtagagcaa 2520
gcatttgatg atcaatgtac tggcactaac cctaggtatc ctttaatgaa cgagataagg 2580
caaatgtact taaacgcata ctacggcgga gcaaagaagt ag 2622

Claims (9)

1.一种提高合成气发酵产乙醇含量的突变株，其特征在于：突变株为食气梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶的缺失或失活的突变；
所述食气梭菌为永达尔梭菌DSM 13528和产乙醇梭菌DSM 10061。
2.按权利要求1所述提高合成气发酵产乙醇含量的突变株，其特征在于：所述突变株为以食气梭菌为出发菌株，通过基因工程手段阻断其中间代谢产物乙偶姻至2,3-丁二醇的代谢途径，进而所得菌株。
3.按权利要求1所述提高合成气发酵产乙醇含量的突变株，其特征在于：所述阻断其中间代谢产物乙偶姻至2,3-丁二醇的代谢途径的手段为CRISPR/Cas9基因同框缺失、CRISPR/Cas12a基因同框缺失、ClosTron二类内含子介导的基因失活、同源重组等基因编辑技术、或2,3-丁二醇脱氢酶关键氨基酸残基突变失活手段。
4.按权利要求1所述提高合成气发酵产乙醇含量的突变株，其特征在于：所述突变株为食气梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶缺失失活；或，食气梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶被功能基因序列替换，其中，功能基因序列为丙酮酸脱羧酶基因、醛醇脱氢酶基因。
5.按权利要求1所述提高合成气发酵产乙醇含量的突变株，其特征在于：所述突变体的碱基序列为永达尔梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶缺失，其碱基序列为野生型全基因组中CLJU_c23220"(CP001666.1:2547792-2548865)其中从2547799-2548860缺失；
或，所述突变体的碱基序列为产乙醇梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶缺失，其碱基序列为野生型全基因组中"CAETHG_0385"(CP006763.1:413109-414182)"从413116-414177缺失；
或，永达尔梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶被丙酮酸脱羧酶基因替代，其碱基序列为野生型全基因组中CP006763.1:2547803-2548865由SEQ ID NO.1碱基序列替换；
或，永达尔梭菌中2,3-丁二醇脱氢酶被醛醇脱氢酶基因替代，其碱基序列为野生型全基因组中CP006763.1:2547803-2548865由SEQ ID NO.2碱基序列替换。
6.一种权利要求1所述的提高合成气发酵产乙醇含量的突变株的构建方法，其特征在于：所述突变株为以食气梭菌为出发菌株，通过基因工程手段阻断其中间代谢产物乙偶姻至2,3-丁二醇的代谢途径，进而所得菌株。
7.按权利要求6所述的提高合成气发酵产乙醇含量的突变株的构建方法，其特征在于：所述阻断其中间代谢产物乙偶姻至2,3-丁二醇的代谢途径的手段为CRISPR/Cas9基因同框缺失、CRISPR/Cas12a基因同框缺失、ClosTron二类内含子介导的基因失活、同源重组、或其它2,3-丁二醇脱氢酶失活手段。
8.一种权利要求1所述的提高合成气发酵产乙醇含量的突变株的应用，其特征在于：所述权利要求1-5任意一项所述获得突变株在合成气发酵产乙醇中的应用。
9.一种合成气发酵产乙醇的方法，其特征在于：利用权利要求1-5任意一项所述获得突变株在合成气发酵过程中厌氧发酵，进而提高乙醇的产量。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US8426174B2 (en) * 2007-05-02 2013-04-23 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Method for the production of 2-butanol
EA031093B1 (ru) * 2012-01-31 2018-11-30 Ланцатек Нью Зилэнд Лимитед Рекомбинантный карбоксидотрофный ацетогенный микроорганизм, способ его получения и способ получения продуктов с его использованием
CN105936915A (zh) * 2016-03-24 2016-09-14 中国科学院南海海洋研究所 一株双基因敲除工程菌及其构建方法和在发酵生产1,3-丙二醇中的应用
CN111088201B (zh) * 2019-12-18 2021-08-31 南京工业大学 一株重组丙酮丁醇梭菌及其构建方法与应用

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