JP5185940B2 - キシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)のキシリトール合成変異体を使用するエタノール産生 - Google Patents
キシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)のキシリトール合成変異体を使用するエタノール産生 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5185940B2 JP5185940B2 JP2009530430A JP2009530430A JP5185940B2 JP 5185940 B2 JP5185940 B2 JP 5185940B2 JP 2009530430 A JP2009530430 A JP 2009530430A JP 2009530430 A JP2009530430 A JP 2009530430A JP 5185940 B2 JP5185940 B2 JP 5185940B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- xylose
- gfor
- glucose
- xylitol
- ethanol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
- C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本出願は、2006年9月28日に出願された米国仮特許出願第60/847856号明細書(すべての目的のために、その全体が本明細書の一部として援用される)の利益を主張する。
本発明は、エネルギー省から授与された契約番号04−03−CA−70224およびDE−FC36−03GO13146に基づく米国政府の助成により行われた。政府は、本発明において所定の権利を有する。
a)キシロースを資化して、エタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス(Zymomonas)株を提供する工程であって、前記株は、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を減少する少なくとも1つの遺伝子改変を含んでなる工程と、b)キシロースを含んでなる培地において(a)の株を培養し、それによって、キシロースがエタノールに変換される工程と
を含んでなる、エタノールを産生させるための方法を提供する。
本発明は、以下の詳細な説明、図面、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
キシロースを炭素源として資化することが可能であるザイモモナス(Zymomonas)の任意の株を、本方法において使用される株を調製するための宿主として使用してもよい。エタノールへのキシロースの発酵のために操作されているZ.モビリス(Z.mobilis)の株が特に有用である。内因性遺伝子は、代謝経路の部分を提供してもよく、またはキシロース代謝に有用な酵素活性を伴うタンパク質を提供するための任意の既知の遺伝子操作技術によって改変されてもよい。例えば、内因性トランスケトラーゼは、キシロース資化経路を作製するときに他の誘導された酵素活性を補い得る。典型的に、米国特許第5514583号明細書(参照により本明細書に援用される)に記載のように、キシロース代謝(図1)に関与する4つの酵素の発現のために、4つの遺伝子がZモビリス(Z mobilis)に導入されている。これらは、キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ、およびキシルロースをリン酸化して、キシルロース5−リン酸を形成させるキシルロキナーゼをコードする遺伝子を含む。さらに、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ、ペントースリン酸経路の2つの酵素は、キシルロース5−リン酸を、キシロースからエタノールへの代謝を可能にする解糖系のエントナー−ドウドレフ(Entner−Douderoff)経路にペントース代謝を結合する中間体に変換する。これらの酵素をコードするDNA配列は、腸内細菌、ならびにいくつかの酵母および真菌のようなキシロースを代謝することが可能である多数の微生物のいずれかから入手してもよい。コーディング領域の供給源として、ザントモナス(Xanthomonas)、クレブシエラ(Klebsiella)、エシェリキア(Escherichia)、ロドバクター(Rhodobacter)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、アセトバクター(Acetobacter)、グルコノバクター(Gluconobacter)、リゾビウム(Rhizobium)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、サルモネラ(Salmonella)、シュードモナス(Pseudomonads)、およびザイモモナス(Zymomonas)が挙げられる。大腸菌(E.coli)のコーディング領域が特に有用である。
Z.モビリス(Z.mobilis)のキシロース資化株による所望されない副産物キシリトールの合成は、エタノールの回収率を減少し、そして細菌増殖を阻害する毒性化合物であるキシリトール5−リン酸の形成を生じる(図2を参照のこと)。さらに、キシリトールは、キシロースイソメラーゼ、キシロース資化のために操作された経路における第1の酵素の強力なインヒビターであり、そしてその合成は、細胞がキシロースを代謝する能力を減少する。インビトロ実験は、Z.モビリス(Z.mobilis)におけるキシリトール形成のための少なくとも2つの経路が存在することを確立している(フェルドマン(Feldmann)ら、上掲、ダニエルソン(Danielson)ら、上掲)が、本出願人らは、生理学的に産生されるキシリトールの大部分がGFOR酵素活性の結果であることを発見している。本出願人らは、キシロース含有培地上で増殖するキシロースを資化することができるZ.モビリス(Z.mobilis)株(または野生型Z.モビリス(Z.mobilis)のキシルロース合成誘導体)によって合成されるキシリトールの量は、GFOR酵素活性の非存在下で顕著に減少することを見出している。本出願人らはまた、キシロースからキシルロースへの変換が、インビボでのGFOR仲介キシリトール産生の必須条件であること、およびこの反応は、キシロースイソメラーゼを発現するZ.モビリス(Z.mobilis)株のみにおいて生じ得ることを見出した。それ故、キシロース上で増殖するように操作されているZ.モビリス(Z.mobilis)株におけるキシリトールの主な生理学的供給源は、図IIおよびIIIに依存する反応のうちの1つまたは両方を介してGFORによって合成されることが提唱される。
本方法において使用されるキシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)株は、キシリトール合成が減少するほどに、GFORをコードする遺伝子の発現が減少しているかまたは認められないように操作される。機能性酵素の存在を減少するための当業者に既知の任意の遺伝子改変を使用して、GFOR発現を改変してもよい。方法として、GFORをコードする遺伝子全体または遺伝子の一部の欠失、タンパク質が発現されないかまたはより低いレベルで発現されるように(プロモーターもしくはコーディング領域のいずれかにおいて)GFOR遺伝子にDNAフラグメントを挿入すること、GFORコーディング領域に変異を導入して、機能性タンパク質が発現されないように終止コドンまたはフレームシフトを付加すること、およびGFORコーディング領域に1つ以上の変異を導入して、非機能性であるかまたはそれほど活性ではないタンパク質が発現されるようにアミノ酸を変更することが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アンチセンスRNAまたは干渉RNAの発現によってGFOR発現を阻止してもよく、そして共抑制を生じる構築物を挿入してもよい。これらの方法のすべては、GFORをコードする既知の配列(配列番号38)を利用する当業者によって容易に実践することができる。GFORコード配列の周囲のDNA配列はまた、いくつかの改変手順において有用であり、そして完全なゲノム配列(ジェンバンク(GenBank)受託番号AE008692)の形でZ.モビリス(Z.mobilis)に利用可能である。
本方法において使用されるGFOR改変キシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)株を、キシロースを含有する培地において、他の糖類(「混合糖類」)の非存在または存在下で増殖させる。混合糖類は、キシロースに加えて少なくとも1つの糖を含む。ザイモモナス(Zymomonas)細胞の代謝のエネルギー源を提供し得る任意の糖、またはキシロースを含有する混合物に存在する任意の糖が含まれていてもよい。バイオマス糖化から生成される糖類上でGFOR改変キシロース資化性Z.モビリス(Z.mobilis)細胞を増殖させることが望ましい。典型的に、バイオマスは、例えば、国際公開第2004/081185号パンフレットならびに共有および同時係属中の米国特許出願第60/670437号明細書に記載のように、前処置され、次いで、リンド,L.R.(Lynd,L.R.)ら(Microbiol.Mol.Biol.Rev.(2002年)66:506−577)によって概説されているように、糖化酵素で処置される。バイオマス糖化は、典型的に、キシロースとグルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マンノース、および/またはアラビノースとの混合物を含み得る糖類を生成する。キシロースおよびグルコースを含む混合糖類組成物が好ましく、ここで、さらなる糖類が存在してもよい。
エタノールの産生のため、組み換えGFOR改変キシロース資化性Z.モビリス(Z.mobilis)を、キシロースを含む混合糖類を含有する培地と接触させる。増殖が阻害されるほど混合糖類の濃度が高い場合、培地は、ソルビトール、マンニトール、またはそれらの混合物を含んでいる。ガラクチトールまたはリビトールを、ソルビトールまたはマンニトールの代わりに使用するか、またはソルビトールまたはマンニトールと組み合わせてもよい。Z.モビリス(Z.mobilis)は、発酵が発生し、そしてエタノールが産生される培地で増殖する。発酵は、空気、酸素、または他の気体の補充を伴わずに(嫌気性、微好気性(microaerobic)、または微好気性(microaerophilic)発酵のような条件を含み得る)、少なくとも約24時間行うが、30時間以上行ってもよい。エタノール産生が最大に到達するタイミングは、発酵条件に依存してばらつきがある。典型的に、インヒビターが培地中に存在する場合、より長い発酵期間が必要である。発酵は、約30℃〜約37℃の間の温度、約4.5〜約7.5のpHで行ってもよい。
ここで使用した標準的な組換えDNAおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、サンブルック,J.(Sambrook,J.)、フリッシュ,E.F.(Fritsch,E.F.)およびマニアティス,T.(Maniatis,T.)Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版;コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor,NY)(1989年)(以後、「マニアティス(Maniatis)」);ならびにシルハビー,T.J.(Silhavy,T.J.)、ベンナン,M.L.(Bennan,M.L.)、およびエンクイスト,L.W.(Enquist,L.W.)、Experiments with Gene Fusions;コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor,NY)(1984年);ならびにグリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウィリー−インターサイエンス(Greene Publishing Assoc.and Wiley−Interscience)ニュージャージー州ホーボーケン(Hoboken,NJ)(1987年)から出版されたアウスベル,F.M.(Ausubel,F.M.)ら、Current Protocols in Molecular Biologyにより記載されている。
細胞を、50mlのRM+2%グルコース中、30℃で、1晩、1.0〜1.2のOD600まで増殖させた。細胞を、4500rpmで10分間、4℃で、遠心分離により回収した。上清を廃棄し、そして細胞ペレットを、25ml氷冷音波処理用緩衝液(10mMのTris、pH7.6、10mMのMgCl2)で洗浄し、続いて、4500rpmで10分間、遠心分離を行った。ペレットを、2.0〜2.5ml音波処理用緩衝液+1mMジチオスレイトールに再懸濁した。500μlアリコートを、1分間、エッペンドルフ遠心管中、4℃で遠心分離した。上清のほとんどを廃棄し、約10〜20μlを残して、ペレットの乾燥を防止した。細胞を凍結し、そしてアッセイを行うまで−80℃で貯蔵した。アッセイの前に、細胞を融解し、そして500μlの音波処理用緩衝液+1mMジチオスレイトールで再懸濁した。混合物を、ブランソン(Branson)ソニファイアー450を使用して、45秒間、62%デューティサイクルおよび2の出力制御関数で、音波処理の間隔の間、サンプルを約3〜5分間冷やしながら、2回音波処理した。サンプルを、14,000rpmで60分間、ベックマン(Beckman)微量遠心機中、4℃で遠心分離した。上清を、新しいチューブに移し、そして4℃で保持した。ピアス(Pierce)BCAアッセイを、タンパク質濃度を決定するために使用した。
1単位は、30℃における1μmolのD−フルクトース6−リン酸/分の形成に対応する。
U(μモル/分)=勾配(dA340/分)*反応物の容積(μL)/6220/0.55cm
(NADP→NADPHのモルは1cmキュベットにおける1Lあたり1モルあたりの6220A340である)
(マイクロプレートにおける1ウェルあたり200μlの路長=0.55cm)
比活性(μモル/分−mg)=μモル/分/タンパク質濃度(mg)
1単位は、30℃における1分間あたりの1μmolのD−グリセルアルデヒドの形成に対応する。
U(μモル/分)=勾配(dA340/分)*反応物の容積(μL)/6220/0.55cm
(NADH→NADのモルは1cmキュベットにおける1Lあたり1モルあたりの6220A340である)
(マイクロプレートにおける1ウェルあたり200μlの路長=0.55cm)
比活性(μモル/分−mg)=μモル/分/タンパク
1単位は、30℃における1分間あたりの1μモルのD−キシルロースの形成に対応する。
U(μモル/分)=勾配(dA340/分)*反応物の容積(μL)/6220/0.55cm
(NADHP→NADのモルは1cmキュベットにおける1Lあたり1モルあたりの6220A340である)
(マイクロプレートにおける1ウェルあたり200μlの路長=0.55cm)
比活性(μモル/分−mg)=μモル/分/タンパク質濃度(mg)
1単位は、30℃における1分間あたりの1μモルのD−キシルロースからD−キシルロース−5−リン酸への形成に対応する。
U(μモル/分)=勾配(dA340/分)*反応物の容積(μL)/6220/0.55cm
(NADH→NADのモルは1cmキュベットにおける1Lあたり1モルあたりの6220A340である)
(マイクロプレートにおける1ウェルあたり200μlの路長=0.55cm)
比活性(μモル/分−mg)=μモル/分/タンパク質濃度(mg)
分析は、LC 3DのAgilent1100シリーズHPLCおよびAgilent ChemStationソフトウェアで行った。カラムは、BioRad Micro−Guard Cartridge Cation−H(125−0129)を伴うBioRad Aminex HPX−87H(HPLC Organic Analysis Column125−0140)であった。操作条件は以下のとおりであった:
流速:0.6mL/分
溶媒:0.01N H2SO4
停止時間:25分
注入容積:5μl
オ−トサンプラ−:温度管理(10℃または4℃)
カラム温度:55℃
検出器:外部標準検量線を伴う屈折率(40℃)
ZW658、キシロースを発酵させるザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)株の構築
ZW658を、連続的な転位事象を介して、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする4つのキシロース資化遺伝子を含有する2つのオペロン、PgapxylABおよびPgaptaltktをZW1(ATCC番号31821)のゲノムに組込むことによって構築し、続いて、キシロースを含有する選択培地に適応した。以前に、米国特許出願公開第2003/0162271号明細書に記載の8bと呼ばれるキシロースを発酵させるザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)株を、相同組み換えおよびトランスポゾンアプローチの組み合わせを介して、選択抗生物質マーカーと共に2つのオペロンPgapxylAxylBおよびPenotaltktをザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)5Cのゲノムに組込むことによって、構築し、続いて、適応およびNTG変異誘導を行った。このアプローチは利点として組込み部位の多数の選択肢および比較的高い挿入頻度を付与するため、ZW658の調製では、部位特異的相同組み換えとは対照的に、転位(エピセンター(Epicentre)社製EZ::Tnインビトロ転位システム)を使用した。キシロース資化酵素をコードする4つの遺伝子を配列し、そして組込みのための2つの個別のオペロン:PgapxylABおよびPgaptaltktとしてクローニングした。2つのP1ファージCreリコンビナーゼ認識配列(loxP)によってフランキングされる抗生物質耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性(Cmr)遺伝子を、組込み体の選択のための各オペロンに付着させた。2つのオペロンの組込みを、2段階の連続様式:Pgaptaltkt続いて、PgapxylABで達成した。Cm耐性選択は、プラスミド上のCreリコンビナーゼを発現させ、続いて、各組込み後のプラスミドのキュアリングによって、取り出されるため、両方の組込みにおいて使用した。このプロセスにより、選択のために同じ抗生物質マーカーを複数回使用することが可能であった。さらに重要なことに、それは、オペロンの組込みの選択のために誘導される抗生物質マーカーの取り出しを可能にした。このプロセスにより、商業的用途のための発酵株に対する抗生物質耐性遺伝子の悪影響がなくされた。
米国特許出願公開第2003/0162271号明細書(その明細書の実施例9)に記載のように、大腸菌(E.coli)由来のトランスケトラーゼ(tkt)コーディング領域を含有する2.2kbのDNAフラグメントを、BglII/XbaI消化によってpUCtaltkt(米国特許出願公開第2003/0162271号明細書)から単離し、そしてBamHI/XbaIで消化したpMOD(エピセンターバイオテクノロジーズ(Epicentre Biotechnologies)、ウィスコンシン州マディソン(Madison,WI))ベクターにクローニングし、pMODtktを得た。ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)gap(Pgap;グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ)遺伝子のプロモーター領域を大腸菌(E.coli)トランスアルドラーゼのコーディング領域(tal)に次のとおりに融合することによって、Pgaptalと命名されるPCRフラグメントを作製した。配列番号1および2を伴うプライマーを使用して、Pgapフラグメント(その構築については米国特許第5514583号明細書(実施例3)に記載されている)をpZB4から増幅した。pZB4は、Pgap−xylA/xylBオペロンおよびPENO−tal/tktオペロンを含有する。配列番号3および4を伴うプライマーを使用して、talコーディング領域フラグメントを、pZB4から増幅した。テンプレートとしてPgapおよびtalフラグメントを使用し、配列番号5および6を伴うプライマーを使用して、Pgaptalフラグメントを増幅した。このフラグメントをXbaIで消化し、そしてプラスミドpMODtktのtktコーディング領域の上流にクローニングした。Cmlox(F,sfi)およびCmlox(R,sfi)プライマー(配列番号7および8)ならびにテンプレートとしてpZB186を使用するPCRによって、loxP::Cmフラグメントを作製した。pZB186は、生来のZ.モビリス(Z.mobilis)プラスミド、ならびに米国特許第514583号明細書(実施例3)およびチャン(Zhang)ら((1995年)Science267:240−243)に記載のpACYC184の組み合わせである。最後に、loxP::CmPCRフラグメントを、Pgaptaltktを含有するプラスミドのSfiI部位に挿入し、組込みプラスミドpMODPgaptaltktCm(図4)を形成させた。このプラスミドでは、Pgaptaltkt loxP::Cmフラグメントを、pMODベクターの2つのモザイク末端(mosaic end)(トランスポナーゼ結合部位)の間に挿入した。pMODPgaptaltktCmプラスミドの完全なヌクレオチド配列を、配列番号9として示す。
プラスミドpMODは、pUCに基づくベクターであり、従って、ザイモモナス(Zymomonas)における非複製ベクターである。プラスミドpMODPgaptaltktCmを、Mg2+の存在下、室温で1時間、トランスポゼースで処置し、そして(200オーム、25μFおよび16kV/cmに設定したバイオラッド・ジーン・パルサー(BioRad Gene Pulser)を使用する)エレクトロポレーションによって、ZW1細胞を形質転換するために使用した。エレクトロポレートした細胞を、50g/Lグルコースおよび1mMのMgSO4を補充した10g/L酵母抽出物、5g/Lトリプトン、2.5g/Lの(NH4)2SO4、0.2g/LのK2HPO4)からなる接合培地(mating medium)(MM)中、6時間、30℃でインキュベートした。形質転換混合物を、50g/Lグルコースおよび120μg/mLクロラムフェニコールを補充したMM中に15g/Lバクト(Bacto)寒天を含有する寒天プレート上でプレート化し、そして30℃で嫌気的にインキュベートした。約2日間後、形質転換体が目視で認められた。形質転換/転位頻度は、約3×101/μgのDNAであった。
染色体からCmrマーカーを取り出すため、T2、T3、T4およびT5をpZB188/Spec−Creで形質転換した。このプラスミドは、Creリコンビナーゼの発現カセットを含有するザイモモナス(Zymomonas)−大腸菌(E.coli)シャトルベクターpZB188[チャン(Zhang)ら(1995年)Science267:240−243;米国特許第5514583号明細書]の誘導体である。pZB188/Spec−Creは、それがカナマイシン−耐性遺伝子の代わりにスペクチノマイシン−耐性遺伝子を有することを除いて、実施例10に記載されているCre発現ベクター(pZB188/Kan−Cre)と同一である。2%グルコースおよび200μg/mlスペクチノマイシン)を補充したMM寒天プレート上で、形質転換体を選択した。Spr耐性コロニーを拾い出して、2%グルコースおよび200μg/mlスペクチノマイシンを補充したRM寒天プレートおよび2%グルコースおよび120μg/mLのCmを補充したRM寒天プレート上に移した。拾い出したコロニーの100%がCmsであったことから、CreによるCmrの高い効率の切り出しが示された。SprCms形質転換体を、RM+2%グルコースにおいて、37℃、2〜5回の連日継代で培養し、pZB188aadACreFをキュアリングした。各継代時に、細胞を希釈し、そして拾い出して、200μg/mLのSpを伴うまたは伴わない同じ培地のさらなるプレートに移すために、RM+2%グルコース寒天プレート上にプレート化した。PCRによってSpsコロニーを分析して、pZB188aadACreFの消失を確認した。組込み体のプラスミドがキュアリングされた子孫を、T2C、T3C、T4CおよびT5Cと命名した。これらの転位組込み体が安定であるかどうかを調べるために、これらの4つの株を、RM+2%グルコースにおいて増殖させ、次いで、10mlの同じ培地に移し、そして37℃で、2回反復測定の試験管において増殖させた。細胞を、10日間連日、または約100代まで継代した。1代および10代継代後、コロニーを希釈し、そしてコロニー単離のためにRMGプレート上にプレート化した。試験した各株の各継代由来の12個のコロニーは、5’Pgapおよび3’tktプライマー(配列番号1および11)を使用するコロニーPCRによるPgaptaltktの存在についてポジティブであった。トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ活性もまた、(一般的方法に記載のとおりに)1回目および10回目の継代後の単離体について測定した。4つのすべての組込み体は、非選択的倍地上の100代目後もTALおよびTKT活性の両方について類似のレベルを有したことから、これらの組込み体が遺伝的に安定であることが示唆された。
次の工程は、ZW1::Pgaptaltkt組込み体(T2C、T3C、T4CおよびT5C)にPgapxylAB loxP::Cmオペロンをさらに組込むことであった。プラスミドpMODPgaptaltktCm(図4)に基づいて、組込みプラスミドpMODPgapxylABCm(図5)を構築した。SacI/SfiI消化によってPgaptaltktDNAフラグメントを取り出した。SacI、NotI、およびSfiI制限部位を含有するアダプターフラグメントを、連結によって導入した。次いで、pZB4(米国特許第5514583号明細書)から単離したPgapxylABのNotIフラグメントを、アダプターのNotI部位にクローニングした。キシロースイソメラーゼ(XI)はxylAによってコードされ、そしてキシルロキナーゼ(XK)はxylBによってコードされる。pMODPgapxylABCmプラスミドの完全なヌクレオチド配列を、配列番号12として示す。
PgaptaltktCmの組み込みと同様のアプローチを使用して、T2C、T3C、T4CおよびT5Cを、トランスポナーゼで処置した(上記の)pMODPgapxylABCmで形質転換/転位した。Cm選択後の2回の形質転換/転位実験で、6つの組込み体(T3CCmX1、T3CCmX2、T3CCmX3、T4CCmX1、T5CCmX1、T5CCmX2)を得た。すべてについて、2つの組のプライマー:配列番号13、および14、ならびに配列番号15および16を使用するPCRによって、xylABの存在か確認されたが、但し、T2CcmX1およびT2CcmX6については、プライマー配列番号13および14を使用すると、PCRフラグメントが検出されなかった。
キシロース資化のための4つのすべての酵素活性が存在しているにもかかわらず、先の観察(米国特許出願公開第2003/0162271号明細書)では、組込み体は、キシロース上で直ぐには増殖しないことが示された。キシロース上での増殖は、(試験管中またはプレート上のいずれかにおける)キシロース培地上での長期のインキュベーション、適応と呼ばれるプロセス後、生じ得る。
ンキュベーションの後、17および19個のコロニーが、それぞれT3CCmX1およびT3CCmX2細胞をプレート化したMMGX上で認められた。コロニーは小さく、そしてプレート上では健常でないように見えた(透明であった)。12個のコロニー(T3CCmX1プレーティング由来の4個:T3CCmX11、T3CCmX12、T3CCmX13およびT3CCmX110;T3CCmX2プレーティング由来の8個:T3CCmX24、T3CCmX25、T3CCmX26、T3CCmX27、T3CCmX28、T3CCmX29、T3CCmX211およびT3CCmX212)をRMGCm120に播種し、そしてさらなる適応のために3mlのRMXに移して、キシロース上でより迅速に増殖することが可能な系統を得た。
先に記載のように、RMX上、30℃での初期のZW1::PgaptaltktPgapxylABCm株の適応により、これらの条件における株の増殖が顕著に改善された。しかし、適応された株は、RMX(6%)における37℃での増殖および発酵の間、長
い停滞を蒙る。より高い糖濃度および温度を含む好適なプロセス条件でキシロース発酵のために組込み体をさらに改善するために、進化または適応プロセスを、RMX(5%)中37℃で継続させた。連続継代を行い、そして最も良好な資化増殖体を選択した。このプロセスで使用した組込み体は、X13aC、X13bC、X13cC、X26CおよびX13FLCを含んだ。これらの5つの株を、RMX中30℃で6継代増殖させた後、さらに5〜16代の継代のために、37℃でRMX(5%)に移した。すべての継代中および後、培養物をRMXプレート上に画線し、そして37℃でインキュベートして、単一のコロニーを単離した。大きなコロニーについてさらに、RMXプレート上への画線および37℃でのインキュベートを3〜4回行い、コロニーを精製した。最終的な大きなコロニーを、RMX(5%)における37℃での増殖試験のために選択した。
連続継代による適応後に単離した18個のコロニーを、はじめに、RMX(5%)試験管中、37℃で試験した。12の株を、第2の試験管評価のために選択した。比較のために、株8bをすべての評価に含めた。18個のコロニーを、RMGにおいて、37℃で1晩増殖させ、遠心分離し、そして細胞を、第1の評価のために、試験管中4mlのRMX(5%)に37℃で、静置状態で播種した。増殖(OD600、非線形的)およびエンドポイントのHPLC結果(低い残留キシロースおよび高エタノール)に基づいて、12の株を、第2の評価のために選択した。
最上位の改善されたキシロース資化株の37℃における発酵の評価
以下の実施例は、バイオマス加水分解物において予想される糖濃度および酢酸レベルを模倣する発酵条件下の改善されたキシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)株ZW658の発酵性能を例示する。株ZW658を、それぞれ、10%グルコース(RMG10%)、8%キシロース(RMX8%)、10%グルコース+8%キシロース(RMGX10%8%)および10%グルコース+8%キシロース+0.6%酢酸(RMGXAc10%8%0.6%)を補充したRM培地を含有する発酵槽に播種した。すべての発酵は、300ml培地を伴うシックスフォース(Sixfors)中、150rpm、pH5.5および37℃で行った。窒素を、発酵槽中の培地に1晩パージし、そして播種直前に停止した。発酵中は、窒素をパージしなかった。RMG5%においてワーキングストックから起こした後の振盪フラスコ(150rpm)中37℃でのRMGX(10%、4%)によって、発酵のための播種物を調製した。株8bを、同じ条件下のコントロールとして使用した。図10に示すように、ZW658は、RMG10%上で8bと比較して、より緩徐に増殖し(AおよびB)、そしてRMX8%上では8bに類似の速度で増殖した(CおよびD)。より緩徐な増殖速度にもかかわらず、図10は、グルコース培地での発酵の終了時にZW658のエタノール収率(93%)が8bに類似したことを示す。RMX8%培地では、エタノール収率は、8b(0.44gエタノール/g糖)と比較するとZW658(0.46gエタノール/g糖)の方が高かった。ZW658は、RMX8%において8bと比較して、約4g/l多いエタノールを産生した。興味深いことに、ZW658は、何らキシリトールを産生しなかった一方、8bは、RMX8%における発酵の終了時に低レベルのキシリトール(0.7g/l)を産生した。図11に示すデータは、酢酸塩を伴って(C、D)または伴わずに(A、B)10%グルコース+8%キシロースを発酵する際に、ZW658が、8bと比較してより良好に作動したことを示し、より多いグルコースおよびキシロース消費、より少ないキシリトール産生、およびより多いエタノール産生によって示される。37℃およびpH5.5でのRMG10%X8%における両方の株の発酵の終了時に、グルコースのほとんどが使用され、そして実質的な残留キシロースが保持されたが、ZW658は、8bより約8g/l多いキシロースを使用した。37℃およびpH5.5でのRMG10%X8%中ZW658における発酵の終了時のキシリトール産生(4.9g/l)は、8bのキシリトール産生(8.2g/l)より有意に低かった。酢酸塩(6g/l)の存在下において、両方の株の細胞増殖は、有意に減少し、グルコースおよびキシロースの両方の貧弱な発酵性能を生じたが、ZW658は、より多いグルコースおよびキシロース産生、より少ないキシリトール産生およびより多いエタノール産生について、僅かにより良好な発酵性能を示した。RMX8%とは異なり、酢酸塩を伴うまたは伴わないRMG10%X8%では、両方の株とも副産物キシリトールを産生したが、8bと比較してZW658ではキシリトールがより少なく産生された。2つの株の発酵性能を表1に要約する。全体として、ZW658は、純粋な糖発酵において8bより良好に作動した。実施例1に記載のように、ZW658は、抗生物質選択マーカーを含まず、これは、商業的用途において発酵生物体に貴重な特性である。
ZW1およびZW658におけるグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ(GFOR)遺伝子の挿入不活化の自殺構築物の調製
ZW1およびZW658においてグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼをコードする遺伝子をノックアウトするために使用される自殺構築物(「GFORSp−9WW」)を、宿主経由、二重交差、相同組み換えおよび選択マーカーとしてスペクチノマイシン耐性を使用して、Z.モビリス(Z.mobilis)においてD−乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子を挿入により不活化するために先に使用された別の自殺構築物(「pLDHSp−9WW」)から誘導した。pLDHSp−9WWもまた、先に作製された他の多くの構築物から誘導した。これらの構築物のすべての最初の前駆体は、プラスミドベクターpNEB193(NEB番号N3051S;ニュー・イングランド・バイオラブス(New England Biolabs))であった。それは大腸菌(E.coli)において複製することができるが、それはZ.モビリス(Z.mobilis)では複製することができないため、このプラスミドを選択した。GFORを作製するのに関与したすべての工程および中間体について、プラスミドpNEB193から開始して、年代順に以下に説明する。
以下に説明するDNAフラグメントの挿入のために、pNEB193をSbfIおよびAscIで二重消化した。両方の制限部位は独特であり、そしてプラスミドのマルチクローニング領域に局在する。SbfI/AscI−線状化pNEB193プラスミドDNAフラグメントを、製造者のプロトコルに従い、キアゲン(Qiagen)社製QIAクイック・ピュリフィケーション・キット(QIAQuick Purification Kit)(カタログ番号28104)を使用して、精製した。pNEB193にクローニングされたDNAフラグメントは、キアゲン(Qiagen)社製ブラッド・アンド・セル・カルチャー・マキシ・キット(Blood & Cell Culture Maxi Kit)(カタログ番号13362)を使用して、株ZW1から単離されたZ.モビリス(Z.mobilis)ゲノムDNAからPCR増幅された2268bpフラグメントであった。このフラグメントのPCR増幅のために使用した合成オリゴヌクレオチドは、プライマー1および2であった:
プライマー1(配列番号17):
CTACTCATTTcctgcaggTGGTAACTCATTGCGCGCTC
プライマー2(配列番号18):
CATCTTACTggcgcgccAAAAATCTGCGGCTGACATAC
プラスミドpLDH193は、ldhオープンリーディングフレームの中間付近に局在する独特なNcoI部位を有する。この部位を使用して、テトラサイクリンに対して耐性を付与するDNAフラグメントを挿入した。この操作のために使用したテトラサイクリン耐性カセット(Tcr−カセット)を、DNAテンプレートとしてプラスミドpACYC184(ジェンバンク(GenBank)受託番号X06403)、ならびにPCRプライマーとしてプライマー3および4を使用するPCRによって作製した。
プライマー3(配列番号19):
ACTCATTTccatggCGATCGCACTATgcggccgcAATGTAGCACCTGAAGTCAGCC
プライマー4(配列番号20):
ATCTCACTccatggCCGGCCAACTAttaattaaGAATTGATTGGCTCCAATTCTTG
pLDHTc139#7を使用して、ZW1におけるD−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を「ノックアウト」し得ることを実証したことから、次の工程は、Creリコンビナーゼを使用して、遺伝子破壊後の染色体から選択マーカーを取り出すことが可能であるように、この構築物を改変することであった。この目的を達成するために、Tcr−カセットにフランキングする4つの独特な制限部位、即ち、5’末端におけるAsiSIおよびNotIならびに3’末端におけるPacIおよびFseIを利用して、2つの野生型loxP部位(リー(Lee)およびサイトウ(Saito)、1998年)をpLDHTc139#7に付加した。構築物を両方の酵素で切断し、そして得られる大きなDNAフラグメントを精製した後、第1のloxP部位を、プラスミドpLDHTc139#7のAsiSIおよびNotI部位の間に挿入した。この位置に挿入されたloxP部位は、それらの5’末端で両方ともリン酸化された2つの合成オリゴヌクレオチド5および6(配列番号21および22)から作製した。
オリゴヌクレオチド5(配列番号21):
cgcATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATgc
オリゴヌクレオチド6(配列番号22):
ggccgcATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATgcgat
オリゴヌクレオチド7(配列番号23):
taaATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATggccgg
オリゴヌクレオチド8(配列番号24):
ccATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATttaat
pLDHSp−9WWはpLDHTc139#7−9WWと同一であるが、但し、後者の構築物のテトラサイクリン耐性カセットは、スペクチノマイシンに対する耐性を付与するDNAフラグメント(即ち、Specr−カセット)で置き換えられた。後者は、テンプレートとしてプラスミドpHP15578(カフーン(Cahoon)ら、2003年)ならびにプライマー9および10を使用するPCRによって作製した。pHP15578は、Specr−カセットの完全なヌクレオチド配列およびそのプロモーターを含有し、3’(9)−O−ヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするトランスポゾンTn7 aadA遺伝子(ジェンバンク(GenBank)受託番号X03403)の公開された配列に基づく。
プライマー9(配列番号25):
ATAAAAgcggccgcAGCACAGGATGA
プライマー10(配列番号26):
GGCGttaattaaGGCAGGTCAGCAAG
pLDHSp−9WWを、以下に記載の第2の工程手順におけるZ.モビリス(Z.mobilis)グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ(GFOR)の遺伝子不活化のための自殺構築物に変換した。第1の工程は、3’ldhフランキングDNAを取り出し、そしてそれを、GFORをコードする染色体遺伝子をプラスミド構築物の標的にする類似のDNAフラグメントで置き換えることであった。後者のDNAフラグメント(以降、3’GFORフランキングDNAと称する)は、テンプレートとしてZW1ゲノムDNAおよびPCRプライマーとしてプライマー11および12を使用するPCRによって作製した。
プライマー11(配列番号27):
CTACTCATggccggccTCAGAACGATCCTGCACAGC
プライマー12(配列番号28):
CATCTTACTggcgcgccGGACGAGGTTCATCATCAGG
プライマー13(配列番号29):
CTACTCATatgcatGTCCAGAAAAGACAGCATTCC
プライマー14(配列番号30):
CATCTTACTgcgatcgcTGCACGGTTCATTGGAT
Z.モビリス(Z.mobilis)のための大腸菌(E.coli)キシロースイソメラーゼ発現ベクターの作製
出発物質として大腸菌(E.coli)/Z.モビリス(Z.mobilis)シャトルベクター(pZB188)を使用して、以下に記載のように、Z.モビリス(Z.mobilis)における大腸菌(E.coli)キシロースイソメラーゼの発現のためのプラスミド構築物(pZB188/Kan−XylA)を作製した(図13)。pZB188の構築に関与する工程については、米国特許第5,514,583号明細書に開示されている。簡単に説明すると、この7008bpのプラスミドは、2つの異なる複製開始点を、それぞれの細菌種に対して1つずつ有するため、それは、大腸菌(E.coli)およびZ.モビリス(Z.mobilis)において複製することが可能である。pZB188はまた、テトラサイクリンに対する耐性を付与するDNAフラグメント(即ち、Tcr−カセット)を含有する。pZB188/Kan−XylAの構築における第1の工程は、pZB188からTcr−カセットを取り出し、そしてそれを、カナマイシンに対する耐性を付与するDNAフラグメント(即ち、Kanr−カセット)で置き換えることであった。pZB188からTcr−カセットを切り出すために、プラスミドをXbaIおよびBssHIIで切断し、そして得られた大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。PCR増幅のために、テンプレートとしてプラスミドpET−24a(ノバジェン(Novagen))ならびにプライマー15および16を使用するPCRによって、Kanr−カセットを作製した。pET−24aは、Kanr遺伝子の完全なオープンリーディングフレームおよびその関連するプロモーターを含有する。
プライマー15(配列番号32):
GCtctagaGCAGCAGATTACGCGC
プライマー16(配列番号33):
ACATTGgcgcgcTTAGAAAAACTCATC
ZW1 GFORノックアウト変異体の作製
ZW1(ZW658が最初に誘導された野生型株)においてGFOR酵素活性をなくすために、実施例3において詳述した自殺構築物pGFORSp−9WWを使用した。米国特許第5514583号明細書に本質的に記載されているように、エレクトロポレーションを使用して、非複製プラスミドDNAを細菌宿主に導入した。簡単に説明すると、50μlの形質転換反応物は、10%(v/v)グリセロール中の約1010個の細胞/mlおよび実施例3に記載のように大腸菌(E.coli)SSC110から単離した約0.9μgの非メチル化プラスミドDNAを含有した。コントロール反応物も全く同様に処置したが、プラスミドDNAを含まなかった。エレクトロポレーターの設定は、16kv/cm、200Ω、および25μF、およびキュベットのギャップ幅は0.1cmであった。エレクトロポレーション後、形質転換物を1.0mlのMMG培地(50g/Lグルコース、10g/L酵母抽出物、5g/Lのトリプトン、2.5g/Lの(NH4)2SO4、0.2g/LのK2HPO4、および1mMのMgSO4)で希釈し、そして細胞を約5時間、30℃で回復させた。次いで、細胞を、室温で、滅菌1.5ml微量遠心管中、遠心分離(13,000×g、5分間)によって回収し、そして上清を注意深く取り出した。細胞ペレットを、150μlの液体MMG培地に再懸濁し、そして50および100μlアリコートの細胞懸濁液を、1.5%寒天および200μg/mlのスペクチノマイシンを含有するMMG培地上でプレート化した。プレートを、嫌気チャンバにおいて30℃でインキュベートし、そして2〜3日後、50〜150個のコロニーが実験プレート上に出現した。このとき、コントロールプレート上にスペクチノマイシン耐性コロニーは認められなかったが、さらに48時間のインキュベーション期間後に若干出現した。以下に記載のさらなる操作のために、GFORノックアウト構築物による形質転換から生じたスペクチノマイシン耐性コロニーのうち2個を選択した。
グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼは、生理学的条件下でキシリトール形成に対する主な寄与物であり得る
ZW1 GFORノックアウト変異体(ZW1−ΔGFOR)を使用して、Z.モビリス(Z.mobilis)のキシロース資化性組み換え株におけるキシリトール形成が、ペリプラズム酵素GFORか、または酵素的に活性でもあるそのより大きな分子量のサイトゾル前駆体によって少なくとも部分的に仲介されるという仮説(ロース(Loos)ら、上掲)を試験した。実施例2(図11)に示されるように、キシリトールは、キシロース資化株8bおよびZW658の主な副産物であるが、キシロースが増殖培地に存在する場合にのみ形成される。CP4のようなZ.モビリス(Z.mobilis)の野生型株は、キシロースをキシリトールに直接還元することができるNADPH依存性アルドースレダクターゼを有する(フェルドマン(Feldmann)ら、上掲)が、図IIおよびIIIに示すように、増殖培地がキシロースまたはグルコースおよびキシロースの混合物を含有する場合、GFORはまた、インビボでのキシリトール形成に寄与し得ることが考えられる。しかし、インビトロでのGFOR酵素特徴付けアッセイにおいて示されるように、この化合物はGFOR仲介キシリトール産生に不可欠な電子受容体であるため、これらの反応のいずれかが生じるためには、酵素がキシルロースにアクセスする必要がある(ザカライオウ(Zachariou)およびスコープス(Scopes)、上掲)。キシロース上での増殖のために操作されるZ.モビリス(Z.mobilis)株では、キシリトール合成に必要なキシルロースは、キシロース代謝(図1)の第1の工程を触媒し、ZW1のような野生型株には存在しないキシロースイソメラーゼによって作製される。
ZW658 GFORノックアウト変異体の作製およびこの株が機能性GFOR酵素を産生しないことの実証
実施例6において示されるように、グルコースおよびキシルロースの両方が利用可能である場合、生理学的条件下で、Z.モビリス(Z.mobilis)におけるキシリトール形成に寄与することができるGFORをコードする遺伝子を、自殺構築物、pGFORSp−9WW(実施例3に記載されている)を使用して、ZW658において挿入により不活化した。この手順におけるすべての工程は、実施例5におけるZW1 GFORノックアウト変異体に記載の工程と同一であり、3つの組のPCRプライマーによる二重交差事象の確認を含む。以下に記載の以後の実験のために選択したZW658ノックアウト変異体を、ZW800と命名した。
、そして廃棄した。次に、細胞ペレットを、次の組成を有する5mlの新鮮増殖培地に再懸濁した:110g/Lグルコース、110g/Lフルクトース、10g/L酵母抽出物、2g/LのKH2PO4、1g/LのMgSO4、および4g/LのKHCO3。上記のすべての工程を滅菌条件下で実施し、そして細胞を再懸濁する前に、増殖培地の初期pHを濃リン酸で5.8に調整した。次いで、得られた培養物を、30℃で、穏やかに撹拌(150rpm)しながら増殖させ、そして表2に示された時間に、実施例6に記載したのと同じ手順を使用して、発酵ブロスのHPLC分析のためにサンプルを取り出した。この実験のための目的のピークは、グルコース、フルクトース、ソルビトールおよびエタノールであり、そして細胞を遠心分離によって回収した後、既知量の標準物質を使用して、発酵ブロスにおけるそれらの濃度を算出した;表2では、すべての濃度をg/Lで表す。
の強固に結合した補因子を還元することが可能であるグルコースまたはキシロースのような糖電子供与体、2)電子受容体としてのキシルロース(何故なら、酵素が実際にキシリトールに還元するのはこの化合物であるからである)、および3)機能性GFOR酵素。キシルロースが反応混合物に添加されない場合、無細胞抽出物はまた、キシロースをキシルロースに変換するためのキシロースイソメラーゼを含有しなければならない。
ソルビトールはグルコースおよびキシロースの濃縮混合物におけるZW800の増殖に必要である
グルコースおよびキシロースの濃縮混合物におけるZW800によるエタノールの産生のための発酵性能を試験した。実験は、pH制御された発酵槽において、97g/Lまたは188g/Lの全糖において約5:4の一定のグルコース対キシロース比を使用して、行った。
GFOR不活化は、プロセス関連条件下でキシロースからのエタノール産生を改善する
プロセス関連条件下でのグルコースおよびキシロースの濃縮混合物におけるZW658およびZW800の発酵性能を、並行する様式で比較して、GFOR不活化が有益または有害な代謝エンジニアリングストラテジーであるかどうかを決定した。高濃度のグルコースおよびキシロースをこれらの実験において使用したため、ソルビトールを培地に添加して、ZW800の増殖を可能にした。ここに記載されていない実験では、ソルビトールがZW658の停滞期をなくすことも発見した。それ故、増殖培地のソルビトール補充は、これらの2つの株をプロセス関連条件下で比較するための理想的な方法を提供する。
ZW800からの選択マーカーの取り出し、および得られた株、ZW801−4の特徴付け
Cre発現構築物、pZB188−Kan/Creの作製
実施例3に記載のように、ZW800におけるGFORオープンリーディングフレームに挿入されたSpecr−カセットは、2つの野生型loxP部位の間に挟まれている。この配置は、Creリコンビナーゼを使用することによって、染色体から選択マーカーを取り出すことを容易にしている(スタンバーグ(Sternberg)およびハミルトン(Hamilton)(1981年)J.Mol.Biol.150:467−486;リー(Lee)およびサイトウ(Saito)、上掲;トリン(Trinh)ら(2000年)Journal of Immunological Methods244(2):185−193)。しかし、これを行うために、第1に、Z.モビリス(Z.mobilis)において複製することができるCre発現ベクター(図22)を作製する必要があった。Cre発現ベクターの前駆体はpZB188/Kanであり、実施例4において詳述した。簡単に説明すると、pZB188/Kanは両方の細菌種の複製開始点を有するため、それは、大腸菌(E.coli)およびZ.モビリス(Z.mobilis)において複製することができるシャトルベクターである。それはまた、カナマイシンに対する耐性を付与するDNAフラグメント(即ち、Kanr−カセット)を含有する。pZB188/Kanを、NcoIおよびNotIで二重消化し、そして大きなベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。次の工程は、Cre−発現カセットを作製することであり、そしてプライマー17および18を使用するPCRによって、これを達成した。Cre−発現カセットの増幅のために使用したDNAテンプレートは、そのプロモーターを含むバクテリオファージPI Creリコンビナーゼの完全長の遺伝子を含有するプラスミド(スタンバーグ(Sternberg)ら(1986年)J.Mol.Biol.187(2):197−212))であった。
プライマー17(配列番号35):
CTACTCATccatggCATCTTGAGCTTGAGAAAAACC
プライマー18(配列番号36):
CATCTTACTgcggccgcTTAATGGCTAATCGCCATCTTC
バクテリオファージP1のCreリコンビナーゼ(Cre)は、特定の34bpのDNA配列、8bpの非対称コアにフランキングする2つの13bpの逆方向反復を含有する「loxP部位」を認識することが可能である(スタンバーグ(Sternberg)およびハミルトン(Hamilton)、1981年、上掲;リー(Lee)およびサイトウ(Saito)、上掲;トリン(Trinh)ら、上掲)。Creはまた、2つの同一のloxP部位の間に配置される任意の介在DNAフラグメントを切り出すことが可能であり、そして切り出し反応は極めて迅速である。GFORオープンリーディングフレームからSpecr−カセットを取り出すために、Cre発現ベクター(pZB188/Kan−Cre)をZW800に導入した。形質転換プロトコルは、本質的に実施例5に記載のとおりであったが、回収期間後、Cre発現ベクターの選択因子である350mg/mlのカナマイシンを含有するMMG培地上で、細胞をプレート化した。Creにより染色体から回収したSpecr−カセットは、Z.モビリス(Z.mobilis)において複製することができないDNAの環状片(circlular piece)であるため、このプロセスから回収した一次形質転換体は、スペクチノマイシンに対してもはや耐性ではなかった。30℃、嫌気条件下で48時間のインキュベーション期間後、Kanr/Specs一次形質転換体のうちの2つを、Creプラスミドキュアリングプロセスに供した。pZB188/Kan−Creは、Z.モビリス(Z.mobilis)において複製することができるが、カナマイシンを含有しない培地で細胞を増殖させることによって、このプラスミドをキュアリングすることは比較的容易である。本発明においてCre発現ベクターをキュアリングするために、細胞を、高温度(37℃)で、カナマイシンを含有しない液体MMG培地で増殖させた;細胞を、同じ組成を伴う新鮮増殖培地に、24〜36時間ごとに移した。少なくとも50代が生じた後、単一のコロニーをMMGプレート上で単離し、そして両方の本来の一次形質転換体由来の5個のコロニーを、さらなる特徴付けのために無作為に選択した。予想したとおり、これらのうち、カナマイシン(350μg/ml)またはスペクチノマイシン(200μg/ml)を含有するMMGプレート上で増殖することが可能なコロニーは認められなかった。カナマイシン上で増殖することができないことは、プラスミドキュアリングプロセスが成功したことを良好に示すものであったが、この結果を、Cre−発現カセットにハイブリダイズするプライマーを使用するコロニーPCRによって確認した。これらの実験に基づいて、Cre処置した、プラスミドがキュアリングされたZW800誘導体のうち3つを、さらなる特徴付けのために選択したが、これらの株を、以降、ZW801−4、ZW801−5およびZW801−6と称する。
ZW801−4由来のゲノムDNAの配列解析は、正確なCre切り出し事象が実際に生じた明白な証拠を提供した。ZW801−4における破壊されたGFORオープンリーディングの完全なヌクレオチド配列(本来の開始コドンから本来の終止コドンまで)を配列番号37に示し、そして図24は、翻訳された変異体配列と野生型GFORタンパク質
とのアラインメントを示し;後者は、ジェンバンク(GenBank)受託番号AE008692のnt683751〜685052の逆相補鎖によってコードされる。予想したとおり、Specr−カセットのCre切り出しは、GFORオープンリーディングフレームの中間において単一の野生型loxP部位を残し、そしてこの挿入事象は、タンパク質を未熟な状態で切り詰めるインフレーム終止コドンを生じた;「lox scar」の局在を、灰色で強調された残基によって示す。自殺構築物の設計の結果として、変異体ヌクレオチド配列もまた、同じ場所で生来の野生型GFORヌクレオチド配列のうち約72bpを失っている。
1.a)キシロースを資化して、エタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株であって、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を低下させる少なくとも1つの遺伝子改変を含む上記株を提供すること、および
b)キシロースを含む培地において(a)の株を培養し、それによって、キシロースをエタノールに変換させること
を含む、エタノールの生産方法。
2.(a)の株が、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を低下させる少なくとも1つの遺伝子改変を伴わない組み換えザイモモナス株に関連して、キシロースからエタノールへの変換を改善する、上記1に記載の方法。
3.(a)の株が、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を低下させる少なくとも1つの遺伝子改変を伴わない組み換えザイモモナス株に関連して、エタノールへのキシロース変換の速度、力価または収率の1つまたはそれ以上を改善する、上記2に記載の方法。
4.(a)の株は、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を低下させる少なくとも1つの遺伝子改変を伴わないザイモモナス株と比較して、キシロースをエタノールへ代謝する場合のキシリトールの産生量が少ない、上記1に記載の方法。
5.(a)の株が、キシロースをエタノールへ代謝する場合、実質的にキシリトールを産生しない、上記4に記載の方法。
6.(a)の組み換えザイモモナス株が、ZW800、ZW801−4およびZW801−6からなる群から選択される、上記1に記載の方法。
7.培地は、キシロースを含む糖類と、ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、リビトール、およびそれらの混合物からなる群から選択される糖アルコールとの混合物を含み、ここで、糖類の混合物は、少なくとも約120g/Lの濃度で存在し、ここで、糖アルコールは、約2mMと約100mMとの間にある最終濃度で存在する、上記1に記載の方法。
8.糖アルコールは、約5mMと約20mMとの間にある濃度にある、上記7に記載の方法。
Claims (1)
- a)キシロースを資化して、エタノールを産生することが可能な組み換えザイモモナス株であって、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ活性を低下させる少なくと
も1つの遺伝子改変を含む上記株を提供すること、および
b)キシロースを含む培地において(a)の株を培養し、それによって、キシロースをエタノールに変換させること
を含む、エタノールの生産方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US84785606P | 2006-09-28 | 2006-09-28 | |
US60/847,856 | 2006-09-28 | ||
PCT/US2007/020945 WO2008051348A2 (en) | 2006-09-28 | 2007-09-28 | Ethanol production using xylitol synthesis mutant of xylose-utilizing zymomonas |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010504756A JP2010504756A (ja) | 2010-02-18 |
JP2010504756A5 JP2010504756A5 (ja) | 2010-10-21 |
JP5185940B2 true JP5185940B2 (ja) | 2013-04-17 |
Family
ID=39325091
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009530430A Expired - Fee Related JP5185940B2 (ja) | 2006-09-28 | 2007-09-28 | キシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)のキシリトール合成変異体を使用するエタノール産生 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7741084B2 (ja) |
EP (1) | EP2066797B1 (ja) |
JP (1) | JP5185940B2 (ja) |
CN (1) | CN102124117B (ja) |
BR (1) | BRPI0715285A2 (ja) |
CA (1) | CA2659443A1 (ja) |
DE (1) | DE602007005823D1 (ja) |
WO (1) | WO2008051348A2 (ja) |
Families Citing this family (38)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7781191B2 (en) * | 2005-04-12 | 2010-08-24 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Treatment of biomass to obtain a target chemical |
EP2205753B1 (en) * | 2007-10-30 | 2011-04-20 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Process for the production of ethanol in a medium comprising xylose employing a recombinant zymomonas strain with reduced hima expression |
WO2009058927A1 (en) * | 2007-10-30 | 2009-05-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Zymomonas with improved ethanol production in medium containing concentrated sugars and acetate |
US7998722B2 (en) * | 2008-03-27 | 2011-08-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Zymomonas with improved xylose utilization |
EP2271755B1 (en) * | 2008-03-27 | 2017-03-22 | E. I. du Pont de Nemours and Company | High expression zymomonas promoters |
US20100159521A1 (en) * | 2008-12-19 | 2010-06-24 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Ozone treatment of biomass to enhance enzymatic saccharification |
US8247208B2 (en) * | 2008-12-22 | 2012-08-21 | Alliance For Sustainable Energy Llc | Zymomonas with improved xylose utilization in stress conditions |
US20110143408A1 (en) * | 2009-06-18 | 2011-06-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Zymomonas with improved arabinose utilization |
GB2483591A (en) | 2009-06-25 | 2012-03-14 | Shell Int Research | Water injection systems and methods |
IN2012DN00568A (ja) * | 2009-07-09 | 2015-06-12 | Verdzyne Inc | |
US20110250645A1 (en) | 2009-10-12 | 2011-10-13 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Methods to improve monomeric sugar release from lignocellulosic biomass following alkaline pretreatment |
US8623623B2 (en) | 2010-06-29 | 2014-01-07 | E I Du Pont De Nemours And Company | Xylose utilization in recombinant Zymomonas |
US8679822B2 (en) | 2010-06-29 | 2014-03-25 | E I Du Pont De Nemours And Company | Xylose utilization in recombinant zymomonas |
US8889384B2 (en) | 2010-10-07 | 2014-11-18 | Shell Oil Company | Process for the production of alcohols from biomass |
AU2011323322B2 (en) | 2010-11-05 | 2015-03-12 | Shell Internationale Research Maatschappij B.V. | Treating biomass to produce materials useful for biofuels |
US8476048B2 (en) | 2010-12-17 | 2013-07-02 | E I Du Pont De Nemours And Company | Xylose utilizing zymomonas mobilis with improved ethanol production in biomass hydrolysate medium |
US8609379B2 (en) | 2010-12-20 | 2013-12-17 | Shell Oil Company | Process for the production of alcohols from biomass |
US8765426B2 (en) | 2011-04-07 | 2014-07-01 | E I Du Pont De Nemours And Company | Pantothenic acid biosynthesis in zymomonas |
US8911983B2 (en) | 2011-12-20 | 2014-12-16 | E I Du Pont De Nemours And Company | Pnp gene modification for improved xylose utilization in Zymomonas |
US20130157332A1 (en) | 2011-12-20 | 2013-06-20 | E I Du Pont De Nemours And Company | Gene inactivation allowing immediate growth on xylose medium by engineered zymomonas |
JPWO2013105651A1 (ja) | 2012-01-13 | 2015-05-11 | 東レ株式会社 | 化学品の製造方法 |
CN104395478B (zh) | 2012-05-07 | 2017-07-28 | 国际壳牌研究有限公司 | 处理生物质以生产可用于生物燃料的材料的连续或半连续方法 |
US8846357B2 (en) | 2012-12-20 | 2014-09-30 | E I Du Pont De Nemours And Company | Stabilized chlorine dioxide for contamination control in Zymomonas fermentation |
US20150087040A1 (en) | 2013-09-26 | 2015-03-26 | E I Du Pont De Nemours And Company | Production of ethanol and recycle water in a cellulosic fermentation process |
US20150087041A1 (en) | 2013-09-26 | 2015-03-26 | E I Du Pont De Nemours And Company | Production of ethanol with reduced contaminants in a cellulosic biomass based process |
US20150299739A1 (en) | 2014-04-17 | 2015-10-22 | Shell Oil Company | Processes for producing fermentation products |
US9371546B2 (en) | 2014-06-24 | 2016-06-21 | E I Du Pont De Nemours And Company | Enhancing D-xylose and L-arabinose utilization in Zymomonas cells |
US10138218B2 (en) | 2014-08-14 | 2018-11-27 | Shell Oil Company | Process for preparing furfural from biomass |
AU2015301619B2 (en) | 2014-08-14 | 2017-06-22 | Shell Internationale Research Maatschappij B.V. | Improved process for treating biomass to produce materials useful for biofuels |
CA2954306C (en) | 2014-08-14 | 2022-08-30 | Shell Internationale Research Maatschappij B.V. | Process for preparing furfural from biomass |
WO2017192498A1 (en) | 2016-05-03 | 2017-11-09 | Shell Oil Company | Lignin-based solvents and methods for their preparation |
CA3039603A1 (en) | 2016-11-01 | 2018-05-11 | Shell Internationale Research Maatschappij B.V. | Process for the recovery of furfural |
BR112019008819B1 (pt) | 2016-11-01 | 2022-12-27 | Shell Internationale Research Maatschappij B.V. | Processo para a recuperação de furfural |
CA3039792A1 (en) | 2016-11-01 | 2018-05-11 | Shell Internationale Research Maatschappij B.V. | Process for the recovery of furfural |
US10501430B2 (en) | 2016-11-01 | 2019-12-10 | Shell Oil Company | Process for the recovery of furfural |
EP3559208A4 (en) | 2016-12-21 | 2020-08-12 | Creatus Biosciences Inc. | PROCESS AND ORGANISM FOR EXPRESSION OF METSCHNIKOWIA XYLOSE TRANSPORTERS FOR INCREASED XYLOSE UPTAKE |
CA3138828A1 (en) | 2019-05-22 | 2020-11-26 | Shell Internationale Research Maatschappij B.V. | Process for the production of furfural |
WO2024158616A1 (en) | 2023-01-23 | 2024-08-02 | Shell Usa, Inc. | Method for treating grains to produce material useful for chemicals and biofuels |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5231020A (en) | 1989-03-30 | 1993-07-27 | Dna Plant Technology Corporation | Genetic engineering of novel plant phenotypes |
JPH0466090A (ja) * | 1990-07-05 | 1992-03-02 | Shinenerugii Sangyo Gijutsu Sogo Kaihatsu Kiko | 異種遺伝子高発現ベクター |
US5514583A (en) | 1994-04-15 | 1996-05-07 | Midwest Research Institute | Recombinant zymomonas for pentose fermentation |
US5843760A (en) | 1994-04-15 | 1998-12-01 | Midwest Research Institute | Single zymomonas mobilis strain for xylose and arabinose fermentation |
US5712133A (en) | 1994-04-15 | 1998-01-27 | Midwest Research Institute | Pentose fermentation by recombinant zymomonas |
WO1995028476A1 (en) | 1994-04-15 | 1995-10-26 | Midwest Research Institute | Recombinant zymomonas for pentose fermentation |
US7354755B2 (en) | 2000-05-01 | 2008-04-08 | Midwest Research Institute | Stable zymomonas mobilis xylose and arabinose fermenting strains |
US7374939B1 (en) | 2000-05-01 | 2008-05-20 | Midwest Research Institute | Method of inactivation of an end product of energy metabolism in Zymomonas mobilis |
US7223575B2 (en) | 2000-05-01 | 2007-05-29 | Midwest Research Institute | Zymomonas pentose-sugar fermenting strains and uses thereof |
US6566107B1 (en) | 2000-11-01 | 2003-05-20 | Midwest Research Institute | Recombinant Zymomonas mobilis with improved xylose utilization |
US20040231060A1 (en) | 2003-03-07 | 2004-11-25 | Athenix Corporation | Methods to enhance the activity of lignocellulose-degrading enzymes |
CN1600850A (zh) | 2003-09-23 | 2005-03-30 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 运动发酵单胞菌工程菌及其应用 |
-
2007
- 2007-09-27 US US11/862,736 patent/US7741084B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-09-28 WO PCT/US2007/020945 patent/WO2008051348A2/en active Application Filing
- 2007-09-28 JP JP2009530430A patent/JP5185940B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-09-28 EP EP07867168A patent/EP2066797B1/en not_active Ceased
- 2007-09-28 CA CA002659443A patent/CA2659443A1/en not_active Abandoned
- 2007-09-28 DE DE602007005823T patent/DE602007005823D1/de active Active
- 2007-09-28 CN CN200780035804.3A patent/CN102124117B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2007-09-28 BR BRPI0715285-0A2A patent/BRPI0715285A2/pt not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2066797A2 (en) | 2009-06-10 |
CA2659443A1 (en) | 2008-05-02 |
DE602007005823D1 (de) | 2010-05-20 |
WO2008051348A2 (en) | 2008-05-02 |
CN102124117A (zh) | 2011-07-13 |
US20080187973A1 (en) | 2008-08-07 |
JP2010504756A (ja) | 2010-02-18 |
EP2066797B1 (en) | 2010-04-07 |
BRPI0715285A2 (pt) | 2013-07-16 |
US7741084B2 (en) | 2010-06-22 |
WO2008051348A3 (en) | 2008-09-12 |
CN102124117B (zh) | 2014-01-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5185940B2 (ja) | キシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)のキシリトール合成変異体を使用するエタノール産生 | |
JP5346808B2 (ja) | エタノール産生のためのキシロース資化性ザイモモナス(Zymomonas)のキシリトール合成変異体 | |
JP5232156B2 (ja) | 糖アルコールの存在下でキシロースを含有する混合糖類の発酵における改善されたエタノール産生 | |
US7897396B2 (en) | Zymomonas with improved ethanol production in medium containing concentrated sugars and acetate | |
US7803623B2 (en) | Zymomonas with improved ethanol production in medium containing concentrated sugars and acetate | |
JP6109190B2 (ja) | ザイモモナス属(Zymomonas)中における改善されたキシロース利用のためのPNP遺伝子修飾 | |
JP2015506169A (ja) | 改変ザイモモナス属(Zymomonas)によるキシロース培地上での即事増殖を可能にする遺伝子不活性化 | |
US9371546B2 (en) | Enhancing D-xylose and L-arabinose utilization in Zymomonas cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100818 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100818 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20121225 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130118 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5185940 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160125 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |