BRPI0715285A2 - processo de produÇço de etanol - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE PRODUÇçO DE ETANOL. Descobriu-se que a produção de etanol empregando uma linhagem de Zymomonas que utiliza xilose com uma modificação genética do gene glicose-frutose oxidorreductase foi aprimorada devido à grande redução da produção de xilitol, um subproduto prejudicial do metabolismo de xilose sintetizado durante a fermentação.

Description

"PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL" Referência Cruzada a Pedido Relacionado

O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Norte-Americano n° 60/847.856, depositado em 28 de setembro de 2006, que é integralmente incorporado como parte do presente para todos os fins.

Declaração de Direitos Governamentais A presente invenção foi realizada com apoio do governo dos Estados Unidos com base nos Contratos n° 04-03-CA-70224 e DE-FC36- 03G013146, concedidos pelo Departamento de Energia. O governo detém

certos direitos sobre a presente invenção.

Campo da Invenção A presente invenção refere-se aos campos de microbiologia e engenharia genética. Mais especificamente, a produção de etanol empregando uma linhagem de Zymomonas que utiliza xilose com uma modificação genética do gene glicose-frutose oxidorreductase foi considerada aprimorada devido à grande redução da produção de xilitol, um subproduto prejudicial do metabolismo de xilose sintetizado durante a fermentação.

Antecedentes da Invenção A produção de etanol por micro-organismos fornece uma fonte de energia alternativa para combustíveis fósseis e, portanto, é uma área importante de pesquisa atual. Zymomonas mobilis é um etanologênico bacteriano que cresce sobre glicose, frutose e sacarose, metabolizando esses açúcares em CO2 e etanol por meio do processo Entner-Douderoff. Embora linhagens do tipo selvagem não possam utilizar xilose como uma fonte de carbono, foram elaboradas linhagens recombinantes de Z mobilis que são capazes de crescer sobre esse açúcar (US 5.514.583, US 5.712.133, WO 95/28476, Feldmann et al (1992), Appl. Microbiol. Biotechnoi 38: 354-361, Zhang et al (1995), Science 267: 240-243). Xilose é o principal pentose em materiais lignocelulósicos hidrolisados e, portanto, pode fornecer um substrato de carbono com baixo custo e abundantemente disponível para uso em fermentação. Z mobilis foi elaborado para expressão de quatro enzimas necessárias para o metabolismo de xilose: 1) xilose isomerase, que catalisa a conversão de xilose em xilulose; 2) xiluloquinase, que fosforila xilulose para formar 5-fosfato de xilulose; 3) transquetolase; e 4) transaldolase (US 5.514.583, US 6.566.107; Zhang et al (1995), Science 267: 240-243). Por meio das ações combinadas destas quatro enzimas e da maquinaria metabólica normal da célula, três moléculas de xilose são convertidas em duas moléculas de 6-fosfato de glicose e uma molécula de 3-fosfato de gliceraldeído, que são convertidas em seguida em etanol e CO2 sobre o lado de glicose do processo (vide Figura 1).

Embora tenha havido sucesso na elaboração de linhagens de Z mobilis para o metabolismo de xilose, as linhagens não crescem e produzem etanol sobre xilose tão bem quanto sobre glicose. Um fator que causa o baixo crescimento sobre xilose é a produção de xilitol como um subproduto do metabolismo de xilose (Feldmann et al, acima; Kim et al (2000), Applied and Environmental Microbiology 66: 186-193). Xilitol é fosforilado por xilulose quinase para produzir 5-fosfato de xilitol, que se acumula na célula e inibe o crescimento bacteriano. A síntese de xilitol também reduz o rendimento de etanol, pois linhagens recombinantes de Z mobilis que utilizam xilose não podem converter xilitol em etanol. Além disso, xilitol é um inibidor potente de xilose isomerase (Smith et al (1991), Biochem. J. 277: 255-261), que catalisa a primeira etapa da utilização de xilose no processo de metabolismo de xilose elaborada. Vide Figura 2 para um diagrama que exibe a síntese e os efeitos de xilitol.

O processo fisiológico e as enzimas que são responsáveis pela síntese de xilitol in vivo não foram determinados. Demonstrou-se, entretanto, que extratos livres de células de Z. mobilis do tipo selvagem são capazes de reduzir xilose em xilitol quando são suplementados com NADPH (Feldmann et al, acima) e que essa reação é catalisada por uma aldose reductase dependente de NADPH. Também se demonstrou que extratos livres de células de Z mobilis são capazes de converter uma pequena quantidade de xilose em xilitol sem suplementação de NADPH e que a produção de xilitol sob essas condições aumenta de três a quatro vezes ao também adicionar-se xilose isomerase purificada à mistura de reação (Danielson, 2001, Tese de Mestrado da Universidade do Colorado). Como xilose isomerase é capaz de converter xilose em xilulose, a implicação clara deste último experimento é que a enzima glicose-frutose oxidorreductase (GFOR) de Z mobilis pode utilizar xilose como um doador de elétrons e xilulose como um receptor de elétrons para gerar xilitol, como será discutido com mais detalhes abaixo. Desta forma, existem pelo menos dois processos de produção de xilitol em Z mobilis com base nos experimentos in vitro, mas permanece a ser determinado até que ponto eles contribuem com a formação de xilitol sob condições fisiológicas.

Para a produção de etanol em alto nível, Z mobilis é cultivado em altas concentrações de uma fonte de carbono fermentável, o que pode resultar em choque osmótico. O choque osmótico manifesta-se como um longo período de demora antes do início do crescimento quando linhagens do tipo selvagem são transferidas para meios líquidos que contêm > 200 g/l de glicose ou frutose ou > 360 g/l de sacarose (Loos et al (1994), J. Bacterioi 176: 7688-7693). Além disso, a adição de sorbitol ao meio de crescimento reduz o período de demora quando linhagens do tipo selvagem são alteradas para altas concentrações desses açúcares (Wiegert et al (1996), Arch. Microbiol. 166: 32-41, Loos et al, acima).

Também se demonstrou que a enzima periplasmática glicose- frutose oxidorreductase (GFOR) desempenha um papel importante no equilíbrio osmótico quando Z. mobilis d o tipo selvagem é cultivado em misturas concentradas de glicose e frutose (Loos et al, acima) ou soluções concentradas de sacarose (Wiegert et al, acima, Loos et al, acima). Resumidamente, GFOR, com o seu cofator firmemente unido, catalisa a oxidação de glicose em gluconolactona e subsequente redução de frutose em sorbitol em um clássico mecanismo Ping Pong Bi, conforme exibido no Diagrama I. O sorbitol que é gerado no espaço periplasmático é transportado para células contra um gradiente de concentração onde se acumula até altos níveis, pois não é adicionalmente metabolizado. A alta concentração de sorbitol no interior das células elimina a diferença de pressão osmótica ao longo da membrana de plasma e restaura o equilíbrio osmótico.

Demonstrou-se que um mutante espontâneo de Z mobilis do tipo selvagem que não pode gerar sorbitol produz níveis mais altos de etanol que células do tipo selvagem quando cultivado sobre baixas concentrações de sacarose (< 150 g/l), mas esta linhagem não pôde crescer sobre altas concentrações de sacarose (Kirk e Doelle (1993), Biotechnol. Letters 15: 985- 990). Demonstrou-se em seguida que esse mutante não possui a expressão de glicose-frutose oxidorreductase (GFOR), o que justifica a sua incapacidade de conversão de qualquer frutose derivada de sacarose no subproduto indesejado sorbitol (Wiegert et al, acima). Também se demonstrou que o crescimento do mutante com deficiência de sorbitol em altas concentrações de sacarose poderá ser restaurado por meio da adição de sorbitol ao meio de crescimento (Wiegert et al, acima). Desta forma, GFOR desempenha um papel fundamental no equilíbrio osmótico por sintetizar sorbitol quando Z. mobilis é cultivado em misturas concentradas de glicose e frutose ou altas concentrações de sacarose, que é hidrolisada em glicose e frutose pela invertase da célula hospedeira. Diagrama I

glicose + GFOR-NADP+ <-> gluconolactona + GFOR-NADPH GFOR-NADPH + frutose sorbitol + GFOR-NADP+ CN 1600850 (A) descreve uma linhagem mutante de Z mobilis que não utiliza xilose e contém um gene GFOR desativado e a produção de etanol utilizando esta linhagem. A falta de produção de sorbitol com esta linhagem resultou em níveis mais altos de etanol quando glicose, frutose ou

sacarose era a fonte de carbono.

Os efeitos da redução ou eliminação da atividade da enzima glicose-frutose oxidorreductase em uma linhagem de Z mobilis que utiliza xilose elaborada que é cultivada sobre uma mistura de xilose e glicose (na ausência de qualquer sacarose ou frutose adicionada) não são conhecidos.

O problema a ser abordado é como produzir quantidades mais altas de etanol em fermentações utilizando uma linhagem de Z mobilis que utiliza xilose cultivada sobre meio que contém xilose. Os depositantes solucionaram o problema determinando o princípio do processo de produção de xilitol in vivo e eliminando a atividade enzimática que é responsável pela sua formação por meio de desativação genética, de forma a criar uma linhagem de Z mobilis que pode ser utilizada para maior produção de etanol. Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção refere-se a um processo de produção de etanol utilizando uma linhagem de Zymomonas que possui produção reduzida de xilitol e maior produção de etanol quando cultivada na presença de xilose. Os depositantes descobriram que a produção de xilitol em Z mobilis que metabolisa xilose é predominantemente mediada pela enzima glicose-frutose oxidorreductase (GFOR). Uma linhagem geneticamente modificada que não expressa GFOR (um mutante knockout GFOR) foi elaborada e descobriu-se que ela produz quantidades reduzidas de xilitol quando cultivada sobe misturas de açúcar que contêm xilose. O mutante knockout GFOR também consumiu mais xilose e produziu concentrações mais altas de etanol quando cultivado em misturas com alto teor de açúcar na presença de sorbitol que a linhagem parental que expressa GFOR. Além disso, o rendimento de etanol (a quantidade de etanol produzida por grama de açúcar consumido) foi significativamente mais alto para a linhagem knockout GFOR.

Consequentemente, a presente invenção fornece um processo de

produção de etanol que compreende:

a. fornecimento de uma linhagem de Zymomonas recombinante capaz de utilizar xilose para produzir etanol, em que a

mencionada linhagem compreende pelo menos uma modificação genética que reduz a atividade de glicose-frutose oxidorreductase; e

b. cultivo da linhagem de (a) em um meio que compreende xilose, por meio do quê a xilose é convertida em etanol.

O processo acima fornece conversão aprimorada de xilose em

etanol com relação a uma linhagem de Zymomonas recombinante sem pelo menos uma modificação genética que reduz a atividade de glicose-frutose oxidorreductase.

O processo melhora especificamente um ou mais dos parâmetros velocidade, título ou rendimento da conversão de xilose em etanol com relação a uma linhagem de Zymomonas recombinante, sem pelo menos uma modificação genética que reduz a atividade de glicose-

frutose oxidorreductase.

Em um aspecto da presente invenção, o processo descrito no presente é aprimorado pelo fato de que a linhagem de (a) acima produz uma quantidade reduzida de xilitol ou nenhum xilitol, em comparação com linhagem de Zymomonas sem pelo menos uma modificação genética que reduza a atividade de glicose-frutose oxidorreductase. Breve Descrição das Figuras. Depósitos Biológicos ε Descrições de

Seqüências

A presente invenção pode ser compreendida mais completamente a partir da descrição detalhada a seguir, das figuras e das descrições de seqüências anexas que fazem parte do presente pedido.

A Figura 1 exibe um diagrama das quatro enzimas (em caixas) que foram utilizadas para elaborar Z. mobilis para utilização de xilose e processos bioquímicos de produção de etanol utilizando xilose.

A Figura 2 exibe um diagrama das duas primeiras etapas do processo de xilose elaborado (em caixas), síntese de xilitol, formação de 5- fosfato de xilitol (um intermediário final tóxico) e inibição de xilose isomerase por xilitol.

A Figura 3 exibe as estratégias de testes de enzimas de transquetolase (A), transaldolase (B), xilose isomerase (C) e xiuloquinase (D). A Figura 4 exibe um mapa de plasmídeos de pMODPgaptaltktCm.

A Figura 5 exibe um mapa de plasmídeos de

pMOD PgapxyIABCm.

A Figura 6 exibe um gráfico das atividades de xilose isomerase (XI) e xiluloquinase (XK) em linhagens T2C, T3C, T4C e T5C transformadas

com PgapxylAB.

A Figura 7 exibe um gráfico das atividades de transaldolse (TAL) e transquetolase (TKT) em linhagens T2C, T3C, T4C e T5C transformadas com PgapxylAB.

A Figura 8 exibe um gráfico do percentual de rendimento teórico de etanol e do percentual de utilização de xilose de colônias de linhagens que utilizam xilose adaptadas selecionadas.

A Figura 9 exibe um gráfico do crescimento de linhagens que utilizam xilose adaptadas após setenta horas sobre RM (meio rico) com 5% de > 8

xilose (RMX5%) antes e depois do cultivo de cinqüenta gerações em RM com

5% de glicose (RMG).

A Figura 10 exibe gráficos de crescimento, utilização de glicose ou xilose e produção de etanol e xilitol para a linhagem selecionada, ZW658, em comparação com o controle, 8b, em RM + 10% glicose (RMG 10%) (A, B) e RM + 8% xilose (RMX8%) (C, D).

A Figura 11 exibe gráficos de crescimento, utilização de glicose e xilose e produção de etanol e xilitol para a linhagem selecionada, ZW658, em comparação com o controle, 8b, em RM + 10% glicose e 8% xilose sem acetato

(A, B) ou com 0,6% acetato (C, D).

A Figura 12 exibe mapas de plasmídeos elaborados durante a formação de uma construção suicida para desativação por inserção do gene GFOR e o produto final: GFORSp-9WW.

A Figura 13 exibe mapas de plasmídeos elaborados para a construção de um plasmídeo de expressão de xilose isomease: pZB188/Kan- XyIA e um diagrama do conjunto de expressão de xilose isomerase de E. coli que foi utilizado para esta construção (em caixas).

A Figura 14 exibe gráficos da produção de xilitol e xilulose por linhagens ZW1 com e sem desativação de genes GFOR1 na presença e ausência da expressão de xilose isomerase.

A Figura 15 exibe gráficos de crescimento, utilização de glicose e xilose e produção de etanol de linhagens de Z mobilis que utilizam xilose sem (A) e com (B) desativação de genes GFOR, cultivadas sobre 97 g/l de xilose + glicose total.

A Figura 16 exibe gráficos de crescimento, utilização de glicose e

xilose e produção de etanol de linhagens de Z mobilis que utilizam xilose sem (A) e com (B) desativação de gene GFOR, cultivadas sobre 188 g/l de total de xilose + glicose. A Figura 17 exibe um gráfico de crescimento de uma linhagem de Z mobilis que utiliza xilose com desativação do gene GFOR na presença de diferentes concentrações de sorbitol.

A Figura 18 exibe gráficos da utilização de xilose, produção de etanol e produção de xilitol de linhagens de Z mobilis que utilizam xilose sem (A, C) e com (B, D) desativação de gene GFOR, na ausência (A, B) e presença (C, D) de acetato em 174 g/l de total de xilose + glicose.

A Figura 19 exibe gráficos da utilização de xilose, produção de etanol e produção de xilitol de linhagens de Z mobilis que utilizam xilose sem (A, C) e com (B, D) desativação de gene GFOR1 na ausência (A, B) e presença (C, D) de acetato em 203 g/l de total de xilose + glicose.

A Figura 20 exibe gráficos da utilização de xilose, produção de etanol e produção de xilitol de linhagens de Z mobilis que utilizam xilose sem (A, C) e com (B, D) desativação de gene GFOR1 na ausência (A, B) e presença (C, D) de acetato em 203 g/l de total de xilose + glicose com bicarbonato de potássio adicional para maior capacidade de tamponamento.

A Figura 21 exibe um gráfico de utilização de xilose e glicose, produção de etanol e produção de xilitol de uma linhagem de Z mobilis que utiliza xilose com desativação de gene GFOR, na presença de acetato em 189 g/l de total de xilose + glicose em uma condução de fermentação com pH controlado.

A Figura 22 exibe mapas de plasmídeos de pZB188/Kan e pZB188/kan-Cre, um vetor de expressão de Cre que pode reproduzir-se em Z mobilis.

A Figura 23A exibe uma comparação do crescimento de ZW801-4

e ZW800 em alto teor de glicose + xilose com acetato sob condições de pH controlado. A Figura 23B exibe um gráfico da utilização de glicose e xilose e produção de etanol para ZW801-4 em comparação com ZW800. A Figura 24 exibe um alinhamento da seqüência mutante traduzida em ZW801-4 com a proteína GFOR do tipo selvagem.

A presente invenção pode ser compreendida mais completamente a partir da descrição detalhada a seguir e das descrições de seqüências anexas que fazem parte do presente pedido.

As seqüências a seguir estão de acordo com 37 C. F. R. 1.821- 1.825 (Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequenee Rules) e consistentes com o Padrão ST.25 (1998) da Organização Mundial da Propriedade Intelectual (OMPI) e as exigências de listagens de seqüências do EPO e PCT (Regras 5.2 e 49.5 (a-bis) e Capítulo 208 e Anexo C das Instruções Administrativas). Os símbolos e formato utilizados para dados de seqüências de aminoácidos e de nucleotídeos atendem às regras definidas em 37 C. F. R. § 1.822.

-15 É fornecida com o presente uma Listagem de Seqüências em

Disco Compacto. O conteúdo do Disco Compacto que contém a Listagem de Seqüências é incorporado ao presente como referência de acordo com 37 CFR 1.52 (e). Os Discos Compactos são apresentados em duplicata e são idênticos entre si. Os discos são marcados "Cópia 1 - Listagem de Seqüências" e "Cópia 2 - Listagem de Seqüências". Os discos contêm o arquivo a seguir: CL3662 seq list.ST25.

SEQ ID N0 1 e 2 são as seqüências de nucleotídeos de primers para amplificação de um fragmento de DNA que contém o promotor genético 3- fosfato de gliceraldeído desidrogenase (Pgap) de pZB4. SEQ ID N0 3 e 4 são as seqüências de nucleotídeos de primers

para amplificação de um fragmento de DNA que contém uma região de

codificação tal de pZB4.

SEQ ID N0 5 e 6 são as seqüências de nucleotídeos de primers para amplificação de um fragmento de DNA que contém Pgapía/ dos fragmentos de Pgap e tal.

SEQ ID N0 7 e 8 são as seqüências de nucleotídeos de primers para amplificação de um fragmento de DNA que contém IoxPv.Cm de pZB186. SEQ ID N0 9 é a seqüência de nucleotídeos completa para o

plasmídeo pMODPgaptaltktCm.

SEQ ID N0 10 e 11 são as seqüências de nucleotídeos de primers para amplificação de um fragmento de DNA de 3 kb que contém regiões de codificação taletktem transformadores que recebem pMODPgapía/f/cíCm. SEQ ID N0 12 é a seqüência de nucleotídeos completa para o

plasmídeo pMODPgapxylABCm.

SEQ ID N0 13 e 14 são as seqüências de nucleotídeos de primers

para amplificação de um fragmento de DNA de PgapxyIA de 1,6 kb dos integrantes T2C, T3C, T4C e T5C com pMOOPgapxylABCm. SEQ ID N0 15 e 16 são as seqüências de nucleotídeos de primers

para amplificação de um fragmento de DNA de xylB de 1,3 kb dos integrantes T2C, T3C, T4C e T5C com pMODPgapxy//4SCm.

SEQ ID N0 17 e 18 são as seqüências de nucleotídeos de primers para amplificação de um fragmento de DNA de 2268 bp de DNA genômico de Z. mobilis W1 que contém uma parte da extremidade 3' do gene pgm, o gene Idh e uma parte da extremidade 5' do gene adhl.

SEQ ID N0 19 e 20 são as seqüências de nucleotídeos de primers para amplificação do conjunto de resistência à tetraciclina de pACYC184.

SEQ ID N0 21 e 22 são seqüências de oligonucleotídeos

utilizadas para criar um local IoxP.

SEQ ID N0 23 e 24 são seqüências de oligonucleotídeos

utilizadas para criar um local IoxP.

SEQ ID N0 25 e 26 são as seqüências de nucleotídeos de primers para amplificação do conjunto Specr de pHP15578.

SEQ ID N0 27 e 28 são as seqüências de nucleotídeos de primers para amplificação de DNA que ladeia 3' GFOR de DNA genômico de ZW1.

SEQ ID N0 29 e 30 são as seqüências de nucleotídeos de primers para amplificação de DNA que ladeia 5' GFOR de DNA genômico de ZW1.

SEQ ID N0 31 é a seqüência de nucleotídeos do plasmídeo

pGF0RSp-9WW.

SEQ ID N0 32 e 33 são as seqüências de nucleotídeos de primers

para amplificação do conjunto Kanr de pET-24a.

SEQ ID N0 34 é a seqüência de nucleotídeos do conjunto de

expressão de xylA de E. coli que foi derivada de pZB4.

SEQ ID N0 35 e 36 são as seqüências de nucleotídeos de primers para amplificação de um conjunto de expressão de Cre.

SEQ ID N0 37 é a seqüência de nucleotídeos completa da região de codificação de GFOR rompida em ZW801-4 (do códon de início original até o códon de parada original), SEQ ID N0 38 é a seqüência de nucleotídeos completa da região de codificação de GFOR do tipo selvagem (do códon de início original até o códon de parada original).

Os depositantes realizaram o depósito biológico a seguir com base nos termos do Tratado de Budapeste Sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-Organismos para os Propósitos de Procedimento de Patentes na Coleção Norteamericana de Culivos de Tipos

Identificação de referência do depositante Designação do depositário internacional Data do depósito ZW658 ATCC n° PTA-7858 12 de setembro de 2006

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção descreve um processo de produção de etanol por meio de fermentação utilizando linhagens de Zymomonas que utilizam xilose geneticamente modificadas com reduzida atividade de enzima GFOR. O Zymomonas recombinante que utiliza xilose empregado no processo é adicionalmente elaborado com pelo menos uma modificação do gene glicose- frutose oxidorreductase (GFOR)1 de tal forma que a expressão da enzima ativa seja reduzida ou eliminada. Os depositantes demonstram que a eliminação da atividade da enzima GFOR resulta em redução da produção de xilitol durante o metabolismo de xilose e aumento da produção de etanol. O etanol produzido pela nova linhagem de Zymomonas pode ser utilizado como uma fonte de energia alternativa para os combustíveis fósseis.

As definições e abreviações a seguir serão utilizadas para a interpretação do relatório descritivo e das reivindicações:

"Glicose-frutose oxidorred uctase" é abreviada GFOR.

RM é meio rico.

RMG5% é RM + 5% glicose.

RMG10% é RM + 10% de glicose.

RMX8% é RM + 8% de xilose.

RMX2% é RM + 2% de xilose.

RMX5% é RM + 5% de xilose.

RMGX10%8% é RM + 10% de glicose e 8% de xilose.

RMGX5%8% é RM + 5% de glicose e 8% de xilose.

"Gene" indica um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, que inclui seqüências reguladoras anteriores (seqüências não codificadoras 5') e posteriores (seqüências não codificadoras 3') à seqüência de codificação. "Gene nativo" ou "gene do tipo selvagem" designa um gene conforme encontrado na natureza com as suas próprias seqüências reguladoras. "Gene quimérico" indica qualquer gene que não seja um gene nativo, que compreende seqüências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender seqüências reguladoras e seqüências de codificação que são derivadas de fontes diferentes ou seqüências reguladoras e seqüências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma forma diferente da encontrada na natureza. "Gene endógeno" indica um gene nativo no seu local natural no genoma de um organismo. Gene "exógeno" indica um gene normalmente não encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por meio de transferência genética. Genes exógenos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo ou

genes quiméricos.

A expressão "construção genética" indica um fragmento de ácido

nucleico que codifica a expressão de uma ou mais proteínas específicas. Na construção genética, o gene pode ser de natureza nativa, quimérica ou exógena. Tipicamente, uma construção genética compreenderá uma "seqüência de codificação". "Seqüência de codificação" designa uma seqüência de DNA que codifica uma seqüência de aminoácido específica.

"Promotor" ou "regiões de controle de início" designa uma seqüência de DNA capaz de controlar a expressão de uma seqüência de codificação ou RNA funcional. Geralmente, uma seqüência de codificação está localizada a 3' de uma seqüência promotora. Promotores podem ser completamente derivados de um gene nativo ou ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de DNA sintéticos. Os técnicos no assunto compreendem que diferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de células, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais. Promotores que causam a expressão de um gene na maior parte dos tipos de células na maior parte das vezes são comumente denominados "promotores constitutivos".

O termo "expressão", da forma utilizada no presente, indica a transcrição e acúmulo estável de RNA com (mRNA) ou sem sentido derivado de um gene. Expressão pode também designar a tradução de mRNA em um polipeptídeo. "Inibição sem sentido" indica a produção de transcritos de RNA sem sentido capazes de suprimir a expressão da proteína alvo. "Sobre- expressão" indica a elaboração de um produto genético em organismos transgênicos que excede os níveis de produção em organismos normais ou não transformados. "Cossupressão" indica a produção de transcritos de RNA com sentido capazes de suprimir a expressão de genes endógenos ou exógenos idênticos ou substancialmente similares (US 5.231.020).

A expressão "RNA mensageiro (mRNA)", da forma utilizada no presente, indica o RNA que não contém introns e que pode ser traduzido em proteína pela célula.

A expressão "gene não funcional", da forma utilizada no presente,

indica um gene que não expressa a proteína codificada normalmente como na linhagem do tipo selvagem em que o gene é endógeno. A expressão de um gene não funcional pode ser rompida em qualquer nível, tal como transcrição, processamento de RNA ou tradução. Um gene não funcional possui tipicamente pouca ou nenhuma expressão da proteína codificada. Ele pode também codificar, entretanto, uma proteína modificada que possui atividade enzimática mais baixa que a proteína do tipo selvagem.

O termo "transformação", da forma utilizada no presente, designa a transferência de um fragmento de ácido nucleico para um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. O ácido nucleico transferido pode apresentar-se na forma de um plasmídeo mantido na célula hospedeiro ou parte do ácido nucleico transferido pode ser integrado ao genoma da célula hospedeira. Os organismos hospedeiros que contêm os fragmentos de ácidos nucleicos transformados são denominados organismos "transgênicos", "recombinantes" ou "transformados".

Os termos "plasmídeo" e "vetor", da forma utilizada no presente, designam um elemento cromossômico adicional que freqüentemente conduz genes que não são parte do metabolismo central da célula e, normalmente, encontram-se na forma de moléculas de DNA de fita dupla circulares. Esses elementos podem ser seqüências reprodutoras autônomas, seqüências integrantes de genomas, seqüências de fagos ou nucleotídeos, lineares ou circulares, de um RNA ou DNA de fita simples ou dupla, derivados de qualquer fonte, em que uma série de seqüências de nucleotídeos uniu-se ou recombinou-se em uma única construção que é capaz de introduzir um fragmento promotor e seqüência de DNA para um produto genético selecionado junto com seqüência não traduzida 3' apropriada em uma célula.

A expressão "ligado operativamente" designa a associação de seqüências de ácidos nucleicos sobre um único fragmento de ácido nucleico, de tal forma que a função de um seja afetada pelo outro. Um promotor é ligado operativamente com uma seqüência de codificação, por exemplo, quando é capaz de afetar a expressão daquela seqüência de codificação (ou seja, aquela seqüência de codificação encontra-se sob o controle transcricional do promotor). Seqüências de codificação podem ser ligadas operativamente a seqüências reguladoras em orientação com ou sem sentido.

A expressão "marcador selecionável" indica um fator de identificação, normalmente um gene de resistência a antibióticos ou substâncias químicas, que possa ser selecionado com base no efeito do gene marcador, ou seja, resistência a um antibiótico, em que o efeito é utilizado para rastrear a herança de um ácido nucleico de interesse e/ou para identificar uma célula ou organismo que tenha herdado o ácido nucleico de interesse.

As expressões produção de xilitol "substancialmente eliminada" e "substancialmente nenhum" subproduto de xilitol designam o caso em que a quantidade de xilitol detectada utilizando análise laboratorial típica é próxima de zero.

A expressão "alta concentração de açúcares misturados" designa uma concentração total de açúcar no meio que resulta na inibição do crescimento de Z mobilis que utiliza xilose mutante de GFOR. Esta é tipicamente de mais de cerca de 100 g/l, embora a concentração exata possa variar dependendo de outros componentes no meio.

A expressão "açúcar fermentável" designa oligossacarídeos e monossacarídeos que podem ser utilizados como uma fonte de carbono por um micro-organismo em um processo de fermentação.

O termo "lignocelulósico" designa uma composição que compreende Iignina e celulose. Material lignocelulósico pode também compreender hemicelulose. O termo "celulósico" designa uma composição que compreende

celulose e componentes adicionais, que incluem hemicelulose.

O termo "sacarificação" indica a produção de açúcares fermentáveis a partir de polissacarídeos.

A expressão "biomassa previamente tratada" indica biomassa que tenha sido submetida a tratamento prévio antes da sacarificação.

"Biomassa" indica qualquer material celulósico ou lignocelulósico e inclui materiais que compreendem celulose e, opcionalmente, que compreendem adicionalmente hemicelulose, lignina, amido, oligossacarídeos e/ou monossacarídeos. Biomassa pode também compreender componentes adicionais, tais como proteína e/ou lipídio. Biomassa pode ser derivada de uma única fonte ou a biomassa pode compreender uma mistura derivada de mais de uma fonte; biomassa poderá compreender, por exemplo, uma mistura de espigas de milho e forragem de milho, ou uma mistura de gramas e folhas. Biomassa inclui, mas sem limitar-se a safras bioenergéticas, resíduos agrícolas, lixo sólido municipal, lixo sólido industrial, lodo de fabricação de papel, resíduos de jardinagem, madeira e resíduos florestais. Exemplos de biomassa incluem, mas sem limitar-se a grãos de milho, espigas de milho, resíduos de safra tais como cascas de milho, forragem de milho, grama, trigo, palha de trigo, cevada, palha de cevada, feno, palha de arroz, brotos de grama, resíduos de papel, bagaço de cana de açúcar, sorgo, soja, componentes obtidos a partir da moagem de grãos, árvores, ramos, raízes, folhas, flocos de madeira, serragem, moitas e arbustos, legumes, frutas, flores e esterco animal. "Hidrolisado de biomassa" indica o produto resultante da

sacarificação de biomassa. A biomassa pode também ser tratada previamente

antes da sacarificação.

Os métodos de clonagem molecular e DNA recombinante padrão utilizados no presente são bem conhecidos na técnica e descritos por Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989 (a seguir, "Maniatis"); e por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. e Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1984; e por Ausubel, F. M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, publicado pela Greene Publishing e Wiley- Interscience, 1987.

A presente invenção refere-se a um processo de produção de etanol a partir de meio que contém xilose utilizando mutantes de GFOR de Zymomonas que utilizam xilose. As linhagens elaboradas de Zymomonas que utilizam xilose com reduzida atividade de enzima GFOR possuem produção de etanol aprimorada. Um desafio para aumentar a produção de etanol por Z. mobilis que utiliza xilose é a redução ou eliminação da síntese de xilitol, que (a) representa um sifão de carbono que não agrega valor; (b) inibe a primeira etapa da utilização de xilose; e (c) é fosforilado até um intermediário final tóxico que inibe o crescimento bacteriano. Os depositantes descobriram que a enzima endógena GFOR é predominantemente responsável pela síntese de xilitol in vivo e que, reduzindo-se ou eliminando-se a atividade da enzima GFOR1 aprimora-se a produção de etanol (velocidade, rendimento e título) a partir de xilose.

Linhagem hospedeira de Zymomonas que utiliza xilose Qualquer linhagem de Zymomonas que seja capaz de utilizar xilose como uma fonte de carbono pode ser empregada como um hospedeiro para preparar as linhagens utilizadas no presente processo. Linhagens de Z mobilis que tenham sido elaboradas para fermentação de xilose em etanol são particularmente úteis. Genes endógenos podem fornecer parte do processo metabólico ou podem ser alterados por meio de qualquer método conhecido de manipulação genética para fornecer uma proteína com atividade enzimática útil para metabolismo de xilose. A transquetolase endógena pode complementar, por exemplo, as atividades de outras enzimas introduzidas na criação de um processo de utilização de xilose. Tipicamente, foram introduzidos quatro genes em Z. mobilis para expressão de quatro enzimas envolvidas no metabolismo de xilose (Figura 1), conforme descrito em US 5.514.583, que é incorporada ao presente como referência. Estas incluem genes que codificam xilose isomerase, que catalisa a conversão de xilose em xilulose e xiluloquinase, que fosforila xilulose para formar 5-fosfato de xilulose. Além disso, transquetolase e transaldolase, duas enzimas do processo de fosfato de pentose, convertem 5- fosfato de xilulose em intermediários que acoplam metabolismo de pentose no processo glicolítico de Entner-Douderoff que permite o metabolismo de xilose em etanol. Seqüências de DNA que codificam estas enzimas podem ser obtidas a partir de qualquer dentre numerosos micro-organismos que sejam capazes de metabolizar xilose, tais como bactérias entéricas, e algumas leveduras e fungos. Fontes das regiões de codificação incluem Xanthomonas, Klebsiellal Escherichia, Rhodobacter, Flavobacterium, Acetobacter1 Gluconobacter, Rhizobium1 Agrobacterium, Salmonella1 Pseudomonas e Zymomonas. São particularmente úteis as regiões de codificação de E. coli.

As seqüências de DNA codificadores são ligadas operativamente

a promotores que são expressos em células de Z mobilis tais como os promotores de 3-fosfato de gliceraldeído desidrogenase de Z mobilis (promotor de GAP) e enolase de Z mobilis (promotor de ENO). As regiões de codificação podem ser expressas individualmente a partir de promotores ou duas ou mais regiões de codificação podem ser unidas em um operador com expressão do mesmo promotor. Os genes quiméricos resultantes podem ser introduzidos em Zymomonas e mantidos sobre um plasmídeo ou integrados ao genoma utilizando, por exemplo, recombinação homóloga, integração dirigida a local ou integração aleatória. Linhagens que utilizam xilose que são de uso específico incluem CP4 (pZB5) (US 5.514.583), ATCC31821/pZB5 (US 6.566.107), 8b (US 20030162271; Mohagheghi et al (2004), Biotechnol. Lett. 25; 321-325) e ZW658 (descritos no presente; depositado, ATCC n° PTA-7858).

Linhagens de Zymomonas qu e são adicionalmente elaboradas para utilizar açúcares diferentes de xilose, que naturalmente não utilizam, podem ser empregadas no processo do presente. Um exemplo é uma linhagem de Z mobilis elaborada para utilização de arabinose conforme descrito em US 5.843.760, que é incorporada ao presente como referência.

Descoberta da síntese de xilitol por meio de GFOR Síntese do subproduto xilitol indesejado por linhagens que utilizam xilose de Z mobilis reduz o rendimento de etanol e resulta na formação de 5-fosfato de xilitol que é um composto tóxico que inibe o crescimento bacteriano (vide a Figura 2). Além disso, xilitol é um inibidor potente de xilose isomerase, a primeira enzima no processo elaborado para utilização de xilose e a sua síntese reduz a capacidade das células para metabolizar xilose. Embora experimentos in vitro tenham estabelecido que existem pelo menos dois processos de formação de xilitol em Z. mobilis (Feldmann et al, acima, Danielson et al, acima), os depositantes descobriram que a maior parte do xilitol que é produzido fisiologicamente é o resultado da atividade de enzimas GFOR. Os depositantes descobriram que a quantidade de xilitol que é sintetizada por linhagens de Z. mobilis que podem utilizar xilose (ou derivados de síntese de xilulose de Z. mobilis do tipo selvagem) que são cultivados sobre meios que contêm xilose é grandemente reduzida na ausência da atividade de enzima GFOR. Os depositantes também descobriram que a conversão de xilose em xilulose é um requisito prévio de produção de xilitol mediada por GFOR in vivo e que esta reação pode ocorrer apenas em linhagens de Z. mobilis que expressam xilose isomerase. Desta forma, propõe-se que a principal fonte fisiológica de xilitol em linhagens de Z. mobilis que são elaboradas para cultivo sobre xilose seja sintetizada por GFOR por meio de uma ou das duas reações que são ilustradas nos Diagramas Il e III.

diagrama il

xilose + GFOR-NADp+ ^ ácido xilônico + GFOR-NADPH GFOR-NADPH + xilulose ^ xilitol + GFOR-NADP+ diagrama iii

glicose + GFOR-NADP+ <-► gluconolactona + GFOR-NADPH GFOR-NADPH + xilulose ~ xilitol + GFOR-NADP+ Salientamos que, nos dois esquemas, xilulose serve de aceitador de elétrons obrigatório para GFOR e que este composto é reduzido em xilitol ao contrário da reação conhecida com frutose que resulta na produção de sorbitol (Diagrama I). Embora GFOR seja bastante específico para glicose e frutose, demonstrou-se que ele pode utilizar outros açúcares como doadores de elétrons e receptores de elétrons, embora de forma um tanto fraca (Zachariou e Scopes (1986), Journal of Bacteriology 167: 863-869). Desta forma, ao incubar-se xilose e frutose com a proteína purificada, observou-se produção de sorbitol mas houve uma redução de cerca de doze vezes da atividade de enzima GFOR em comparação com a reação de controle com glicose. No mesmo documento, demonstrou-se que xilulose pode substituir frutose como um aceitador de elétrons e que esta reação gera xilitol conforme ilustrado no Diagrama III. Com esta combinação de substratos, entretanto, houve uma redução de cerca de quatorze vezes da atividade de enzima GFOR. Além destas observações, também se demonstrou que extratos livres de células preparados a partir de Z. mobilis do tipo selvagem são capazes de gerar xilitol a partir de xilose ao adicionar-se xilose isomerase à mistura de reação para fornecer uma fonte de xilulose (Danielson, acima), de forma a demonstrar que GFOR pode também catalisar a reação que é ilustrada no Diagrama II. Independentemente, entretanto, de se essas reações mediadas por GFOR ocorrem em células vivas e, se ocorrerem, o ponto até o qual elas contribuem com a formação de xilitol in vivo permanecia sem ser determinado até a descoberta dos depositantes. As mesmas incertezas referentes à atividade de aldose reductase dependente de NADPH que também está presente em extratos livres de células de Z mobilis do tipo selvagem, que é capaz de converter diretamente xilitose em xilitol (Feldmann et al, acima). De fato, nenhum dos experimentos com extratos livres de células indicados acima forneceu nenhuma indicação das contribuições relativas de GFOR e aldose reductase dependente de NADPH para a formação de xilitol in vitro, muito menos in vivo sob condições relevantes de processo. Desta forma, a descoberta dos depositantes que GFOR é principalmente responsável pela produção de xilitol em linhagens de Z mobilis que são elaboradas para crescimento sobre xilose sob condições fisiológicas em meios que contêm xilose foi surpreendente e não poderia ser antecipada a partir do estado da técnica.

Alteração da expressão de gene GFOR Uma linhagem de Zymomonas que utiliza xilose empregada no processo do presente é elaborada de tal forma que haja expressão reduzida ou nenhuma do gene que codifica GFOR1 de forma que a síntese de xilitol seja reduzida. Qualquer método de modificação genética conhecido dos técnicos no assunto para reduzir a presença de uma enzima funcional pode ser utilizado para alterar a expressão de GFOR. Os métodos incluem, mas sem limitar-se a exclusão do gene completo ou de uma parte do gene que codifica GFOR, inserção de um fragmento de DNA no gene GFOR (na região promotora ou de codificação), de tal forma que a proteína não seja expressa ou seja expressa em níveis mais baixos, introdução de uma mutação na região de codificação de GOFR que adiciona um códon de parada ou alteração de quadro, de tal forma que não seja expressa uma proteína funcional, e introdução de uma ou mais mutações na região de codificação de GFOR para alterar aminoácidos, de forma que seja expressa uma proteína não funcional ou enzimaticamente menos ativa. Além disso, a expressão de GFOR pode ser bloqueada pela expressão de um RNA sem sentido ou um RNA interferente e podem ser introduzidas construções que resultam em cossupressão. Todos esses métodos podem ser facilmente praticados pelos técnicos no assunto, utilizando a seqüência conhecida que codifica GFOR (SEQ ID N0 38). Seqüências de DNA que rodeiam a seqüência de codificação de GFOR também são úteis em alguns procedimentos de modificação e são disponíveis para Z. mobilis na seqüência de genoma completa (Acesso GenBank n° AE008692). Um método particularmente apropriado de criação de uma

linhagem de GFOR geneticamente modificada, conforme exemplificado no presente nos Exemplos 3 e 5, é a utilização de recombinação homóloga mediada por seqüências de DNA laterais de GFOR que unem um gene de resistência à espectinomicina ou um outro marcador selecionável, gerando a inserção do marcador selecionável na região de codificação de GFOR de tal forma que uma enzima GFOR funcional não seja expressa. Além disso, o marcador selecionável pode ser unido por locais de recombinação específicos de locais, de tal forma que, após a expressão da recombinase específica de locais correspondente, o gene de resistência é extirpado do gene GFOR sem reativar este último. A recombinação específica de local deixa para trás um local de recombinação que rompe a expressão da enzima GFOR. O vetor de recombinação homólogo pode ser construído para também deixar uma exclusão no gene GFOR após a extirpação do marcador selecionável, como é bem conhecido dos técnicos no assunto.

Prefere-se eliminar completamente a expressão de GFOR, mas o uso de linhagens de Zymomonas recombinantes com expressão grandemente reduzida de GFOR também é uma realização do processo do presente. Neste caso, um gene GFOR não funcional designa o não funcionamento da forma normal, de tal forma que níveis abaixo do normal de enzima GFOR estejam presentes. Alguns métodos de desativação genética podem resultar em alguma expressão de baixo nível remanescente, tal como cossupressão. No presente, linhagem de GFOR modificada designa uma linhagem geneticamente modificada com atividade de enzima GFOR reduzida ou inexistente.

Crescimento ε produção de etanol por linhagem modificada de GFOR

Uma linhagem de Zymomonas que utiliza xilose modificada por GFOR utilizada no processo do presente é cultivada em um meio que contém xilose na ausência ou presença de outros açúcares ("açúcares misturados"). Os açúcares misturados incluem pelo menos um açúcar adicional a xilose. Qualquer açúcar que possa fornecer uma fonte de energia para o metabolismo das células de Zymomonas ou qualquer açúcar que esteja presente em uma mistura que contém xilose pode ser incluído. É desejável cultivar células de Z mobilis que utilizam xilose modificadas por GFOR sobre açúcares que sejam produzidos a partir da sacarificação de biomassa. Tipicamente, a biomassa é previamente tratada, tal como conforme descrito no Pedido de Patente WO 2004/081185 e no Pedido de Patente Norteamericano copendente e de propriedade comum n° 60/670437, e tratada em seguida com enzimas de sacarificação, conforme analisado em Lynd, L. R. et al (Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2002) 66: 506-577). Sacarificação de biomassa produz açúcares que podem incluir tipicamente uma mistura de xilose com glicose, frutose, sacarose, galactose, manose e/ou arabinose. É preferida uma composição de açúcares misturados que inclui xilose e glicose, na qual podem estar presentes açúcares adicionais.

A razão entre diferentes açúcares pode variar na mistura, com xilose tipicamente em pelo menos cerca de 10% da quantidade total de açúcares. Preferencialmente, xilose é de cerca de 40% a cerca de 60%. Frutose está presente em açúcares produzidos por meio da sacarificação de alguma biomassa tal como bagaço de cana de açúcar e pode substituir uma parte de xilose ou glicose, de tal forma que xilose permaneça em pelo menos cerca de 10% da mistura de açúcares. Além disso, arabinose é derivada de hemicelulose e, portanto, é um componente típico de açúcares misturados derivados de biomassa sacarificada que contém hemicelulose.

Sob condições de fermentação em que xilitol não seria produzido por uma linhagem de Z. mobilis que utiliza xilose que não seja uma linhagem modificada por GFOR, linhagens de Z. mobilis que utilizam xilose modificada por GFOR crescem e produzem etanol comparativamente com linhagens não modificadas por GFOR. Em meio com baixo teor de açúcar, por exemplo, tal como cerca de 100 g/l de açúcares misturados com uma razão 5:4 entre glicose e xilose, as células de Z mobilis que utilizam xilose modificadas por GFOR apresentam desempenho similar a linhagens não modificadas por GFOR.

Para máxima produção de etanol e eficiência de fermentação, é desejável cultivar um etanologênico que utilize xilose em um meio que contém altos níveis de acúcares, incluindo xilose. Os açúcares misturados podem ser empregados em uma alta concentração no meio para o crescimento de linhagens de Z. mobilis que utilizam xilose modificadas por GFOR no presente processo. Isso permite o uso direto de açúcares de sacarificação de biomassa ou uso com pouca diluição, de forma a reduzir os volumes de fermentação, o que é desejável para a produção de etanol em escala comercial. São utilizadas altas concentrações de açúcar, de forma que possam ser produzidas concentrações mais altas de etanol. A concentração de açúcares misturados no meio de fermentação é de tipicamente pelo menos cerca de 120 g/l e até cerca de 300 g/l. É particularmente útil uma alta concentração de açúcares misturados que seja de cerca de 150 g/l a cerca de 235 g/l. Nas condições de açúcares misturados sob alta concentração

desejadas para a produção de etanol, sorbitol é incluído no meio de fermentação para o Z. mobilis que utiliza xilose modificado por GFOR. Os depositantes descobriram surpreendentemente que a adição de sorbitol ao meio com alto teor de açúcares misturados permitiu bom crescimento de Z. mobilis que utiliza xilose modificado por GFOR, enquanto sem a inclusão de sorbitol o Z. mobilis que utiliza xilose modificado por GFOR exibiu pouco ou nenhum crescimento. Isso ocorre em notável contraste com linhagens produtoras de GFOR que são capazes de adaptar-se à mistura de açúcar concentrada sem adição de sorbitol após um período de demora de 12 a 36 horas. Em meio que não contém frutose nem sacarose (como fonte de frutose), não se esperava que GFOR sintetizasse sorbitol ou desempenhasse um papel na adaptação osmótica. Sem a presença de frutose no meio de crescimento, a reação conhecida de GFOR para síntese de sorbitol, exibida no Diagrama I, não pôde processar-se. A capacidade de linhagens de Z mobilis que utiliza xilose com atividade de enzima GFOR normal para crescimento em uma mistura concentrada de glicose e xilose, embora com um longo período de espera, sugeriu que a síntese de sorbitol por GFOR não era necessária para adaptação osmótica, pois sem frutose não se esperaria que GFOR sintetizasse sorbitol. Desta forma, não se esperava que a eliminação da atividade de enzima GFOR apresentasse efeito sobre o nível de produção de sorbitol em meio de crescimento sem frutose e a necessidade de sorbitol para crescimento da linhagem de Z. mobilis que utiliza xilose modificada por GFOR em uma mistura concentrada de glicose e xilose era completamente inesperada.

Sorbitol (D-sorbitol e/ou L-sorbitol) pode estar presente no meio em concentrações que são de cerca de 0,5 mM a 200 mM. Concentrações finais mais apropriadas no meio são concentrações de cerca de 2 mM a 100 mM, em que são preferidas concentrações de 5 mM a 20 mM. Manitol pode ser utilizado no meio no lugar de sorbitol, ou em combinação com sorbitol. Descobriu-se que manitol possui efeitos similares aos de sorbitol no Pedido de Patente Norteamericano copendente e de propriedade comum n° 60/847.997, que é incorporado ao presente como referência. Além disso, descobriu-se que galactilol e/ou ribitol podem ser utilizados no lugar de sorbitol e/ou manitol, ou em combinação com estes. Sorbitol, manitol, galactilol, ribitol ou suas combinações são todos utilizados nas mesmas concentrações descritas para sorbitol. Sob condições de fermentação em que xilitol seria produzido por uma linhagem de Z mobilis que utiliza xilose que não é uma linhagem modificada por GFOR, tal como em meio com alto teor de açúcar na presença ou ausência de inibidores tais como acetato, linhagens de Z mobilis que utilizam xilose modificadas por GFOR utilizadas no processo superam o desempenho de linhagens não modificadas por GFOR. Os depositantes descobriram que a quantidade total de xilose que é consumida e o título final de etanol são maiores para uma linhagem modificada por GFOR que uma linhagem não modificada. Além disso, nenhum xilitol foi produzido em fermentações por Z mobilis que utiliza xilose modificado por GFOR sob condições relevantes do processo, embora pequenas quantidades pudessem ser sintetizadas por um mecanismo não de GFOR sob certas circunstâncias, conforme exibido no

Exemplo 6 do presente.

O aumento da utilização de xilose e produção de etanol varia sob diferentes condições de fermentação. Sob condições em que é produzido um nível mais alto de xilitol por uma linhagem de Z. mobilis que utiliza xilose não modificada por GFOR, a falta de síntese de xilitol gera um efeito maior da mutação de GFOR. Quando um inibidor tal como acetato estiver presente no meio, por exemplo, quantidades maiores de xilitol são produzidas por linhagens não modificadas por GFOR. Esta produção de xilitol é completamente eliminada pela mutação de GFOR, o que permite um aumento maior da utilização de xilose e produção de etanol que em condições em que teriam sido produzidas baixas quantidades de xilitol sem a mutação de GFOR. Como acetato está tipicamente presente em biomassa celulósica tratada, redução da sensibilidade a acetato é desejável em um etanologênico a ser cultivado sobre fontes de carbono derivadas de biomassa celulósica tratada. Desta forma, a fermentação empregando uma linhagem de Z mobilis que utiliza xilose modificada por GFOR é particularmente benéfica ao utilizar-se hidrolisado de biomassa na fermentação.

Fermentação para produção de etanol Para a produção de etanol, Z mobilis que utiliza xilose modificado por GFOR recombinante é colocado em contato com meio que contém açúcares misturados que incluem xilose. Quando a concentração de açúcares misturados for alta a ponto de inibir o crescimento, o meio inclui sorbitol, manitol ou uma de suas misturas. Galactilol ou ribitol podem substituir sorbitol ou manitol, ou ser combinados com eles. Z. mobilis cresce no meio em que ocorre a fermentação e é produzido etanol. A fermentação é conduzida sem a suplementação de ar, oxigênio ou outros gases (que podem incluir condições tais como fermentação anaeróbica, microaeróbica ou microaerofílica) por pelo menos cerca de 24 horas e pode ser conduzida por trinta horas ou mais. O tempo para atingir a produção máxima de etanol é variável, dependendo das condições de fermentação. Tipicamente, caso estejam presentes inibidores no meio, é necessário um período de fermentação mais longo. As fermentações podem ser conduzidas sob temperaturas de cerca de 30 cC a cerca de 37 °C, sob pH de cerca de 4,5 a cerca de 7,5.

No processo do presente, Z. mobilis que utiliza xilose modificado por GFOR pode ser cultivado em meio que contém açúcares misturados que incluem xilose em fermentadores em escala de laboratório e em fermentação em escalas maiores, onde são produzidas quantidades comerciais de etanol. Ao desejar-se a produção comercial de etanol, pode-se aplicar uma série de metodologias de cultivo. A produção em larga escala a partir de Z. mobilis que utiliza xilose modificado por GFOR, por exemplo, pode ser atingida por meio de metodologias de bateladas e cultivo contínuo. Um método de cultivo por bateladas clássico é um sistema fechado em que a composição do meio é definida no início do cultivo e não submetida a alterações artificiais durante o processo de cultivo. Desta forma, no início do processo de cultivo, o meio é inoculado com o organismo desejado e permite-se a ocorrência de crescimento ou atividade metabólica sem adicionar nada ao sistema. Tipicamente, entretanto, um cultivo de "bateladas" é em bateladas com relação à adição de fonte de carbono e freqüentemente são realizadas tentativas de controle de fatores tais como pH e a concentração de oxigênio. Em sistemas em bateladas, as composições de biomassa e de metabólitos do sistema alteram-se constantemente até o momento do término do cultivo. Em cultivos em bateladas, as células são moderadas ao longo de uma fase de demora estática até uma fase de registro de alto crescimento e, por fim, até uma fase estacionária na qual a velocidade de crescimento é reduzida ou suspensa. Caso não sejam tratadas, as células na fase estacionária eventualmente morrerão. As células na fase de registro são freqüentemente responsáveis pelo grande volume de elaboração de produto final ou intermediário em alguns sistemas. A produção em fase pós-exponencial ou estacionária pode ser obtida em outros sistemas.

Uma variação do sistema de bateladas padrão é o sistema de Bateladas Alimentadas. Processos de cultivo de Bateladas Alimentadas também são apropriados no processo do presente e compreendem um sistema de bateladas típico, com exceção da adição do substrato em parcelas à medida que o cultivo progride. Os sistemas de Bateladas Alimentadas são úteis quando a repressão de catabólitos está apta a inibir o metabolismo das células e é desejável ter quantidades limitadas de substrato no meio. A medição da concentração real de substratos em sistemas de Bateladas Alimentadas é difícil e, portanto, estimada com base nas alterações de fatores mensuráveis tais como pH e a pressão parcial de gases residuais tais como CO2. Métodos de cultivo em bateladas e bateladas alimentadas são comuns e bem conhecidos na técnica. Exemplos podem ser encontrados em Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Crueger, Crueger e Brock, segunda edição (1989), Sinauer Associates, Inc., Sunderland MA, ou Deshpande, Mukund V., Appi Biochem. Biotechnol. 36, 227 (1992), incorporados ao presente como referência.

A produção comercial de etanol pode também ser realizada com

um cultivo contínuo. Os cultivos contínuos são sistemas abertos em que um meio de cultivo definido é adicionado continuamente a um biorreator e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para processamento. Os cultivos contínuos geralmente mantêm as células em uma alta densidade de fase líquida constante em que as células encontram-se principalmente em crescimento de fase de registro. Alternativamente, o cultivo contínuo pode ser praticado com células imobilizadas, em que carbono e nutrientes são adicionados continuamente e produtos valiosos, subprodutos ou produtos residuais são removidos continuamente da massa celular. A imobilização celular pode ser realizada utilizando uma ampla variedade de suportes sólidos compostos de materiais naturais e/ou sintéticos, como sabem os técnicos no assunto. Cultivo contínuo ou semicontínuo permite a modulação de um

fator ou qualquer quantidade de fatores que afetam o crescimento celular ou a concentração de produto final. Um método manterá, por exemplo, um nutriente limitador tal como a fonte de carbono ou o nível de nitrogênio em uma velocidade fixa e permitirá a moderação de todos os demais parâmetros. Em outros sistemas, pode-se alterar continuamente uma série de fatores que afetam o crescimento enquanto a concentração celular, medida pela turvação do meio, é mantida constante. Sistemas contínuos lutam para manter as condições de crescimento em estado estável e, desta forma, a perda celular devido à retirada do meio deve ser equilibrada contra a velocidade de crescimento celular no cultivo. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento para processos de cultivo contínuos, bem como métodos de maximização da velocidade de formação de produtos, são bem conhecidos na técnica de microbiologia industrial e uma série de métodos é detalhada por Brock, acima.

É particularmente apropriado para a produção de etanol um

regime de fermentação conforme segue. A linhagem de Z. mobilis que utiliza xilose modificada por GFOR desejada é cultivada em frascos de agitação em meio semicomplexo a cerca de 30 0C até cerca de 37 0C com agitação a cerca de 150 rpm em agitadores orbitais e transferida em seguida para um fermentador de sementes de 1 a 10 litros contendo meio similar. O cultivo de sementes é realizado no fermentador de sementes de forma anaeróbica até que OD6Oo seja de 3 a 6, quando é transferido para o fermentador de produção em que os parâmetros de fermentação são otimizados para a produção de etanol. Os volumes de inoculado típicos transferidos do tanque de sementes para o tanque de produção variam de cerca de 2% a cerca de 20% v/v. Meio de fermentação típico contém componentes de meio mínimos tais como fosfato de potássio (1,0 a 10,0 g/l), sulfato de amônio (0 a 2,0 g/l), sulfato de magnésio (0 a 5,0 g/l), uma fonte de nitrogênio complexa tal como extrato de levedura ou produtos com base em soja (0 a 10 g/l). Uma concentração final de cerca de 5 mM de sorbitol ou manitol. Açúcares misturados que incluem xilose e pelo menos um açúcar adicional tal como glicose (ou sacarose), fornecendo uma fonte de carbono, são adicionados continuamente ao recipiente de fermentação mediante esgotamento da fonte de carbono em bateladas inicial (50 a 200 g/l) para maximizar o título e a taxa de etanol. As velocidades de alimentação de fontes de carbono são ajustadas dinamicamente para garantir que o cultivo não esteja acumulando glicose em excesso, o que poderia gerar acúmulo de subprodutos tóxicos tais como ácido acético. A fim de maximizar o rendimento de etanol produzido a partir de substrato utilizado, o crescimento de biomassa é restringido pela quantidade de fosfato que é colocada em bateladas iniciais ou que é alimentada no transcurso da fermentação. A fermentação é controlada sob pH 5,0 a 6,0 utilizando solução cáustica (tal como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio ou hidróxido de sódio) e ácido sulfúrico ou fosfórico. A temperatura do fermentador é controlada a 30 0C até 35 0C. A fim de maximizar a formação de espuma, agentes antiespumantes (qualquer classe; com base em silicone, com base orgânica etc.) são adicionados ao recipiente conforme o necessário. Um antibiótico, para o qual existe um marcador resistente a antibióticos na linhagem, tal como canamicina, pode ser opcionalmente utilizado para minimizar a contaminação.

Qualquer conjunto de condições descritas no presente e, adicionalmente, variações dessas condições que são bem conhecidas dos técnicos no assunto são condições apropriadas de produção de etanol por uma linhagem de Zymomonas recombinante que utiliza xilose.

Exemplos

A presente invenção é adicionalmente definida nos Exemplos a seguir. Dever-se-á compreender que estes Exemplos, embora indiquem realizações preferidas da presente invenção, são fornecidos apenas como forma de ilustração. A partir da discussão acima e destes Exemplos, os técnicos no assunto podem determinar as características essenciais da presente invenção e, sem abandonar o seu espírito e escopo, podem realizar várias alterações e modificações da presente invenção para adaptá-la aos vários usos e condições.

Métodos gerais

Os métodos de clonagem molecular e DNA recombinante padrão utilizados no presente são bem conhecidos na técnica e descritos por Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989) (a seguir, "Maniatis"); e por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. e Enquist1 L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1984); e por Ausubel, F. M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, publicado pela Greene Publishing Assoc. e Wiley-lnterscience, Hoboken NJ (1987).

O significado das abreviações é o seguinte: "kb" indica quilobase(s), "bp" indica pares de bases, "nt" indica nucleotídeo(s), "h" indica hora(s), "min" indica minuto(s), "seg" indica segundo(s), "d" indica dia(s), "I" indica litro(s), "ml" indica mililitro(s), "μΙ" indica microlitro(s), "pg" indica micrograma(s), "ng" indica nanograma(s), "mM" indica milimolar, "μΜ" indica micromolar, "nm" indica nanômetro(s), "μιτιοΓ indica micromol(es), "pmol" indica picomol(es), "Cm" indica cloranfenicol, "Cmr" indica resistente a cloranfenicol, "Cms" indica sensível a cloranfenicol, "Spr" indica resistência a espectinomicina, "Sps" indica sensível a espectinomicina, "XI" é xilose isomerase, "XK" é xiluloquinase, "TAL" é transaldolase, "TKT" é transquetolase, "EFT" indica tempo de fermentação decorrido, "RM" indica meio rico que contém 10 g/l de extrato de levedura mais 2 g/l de KH2PO4, "MM" indica meio de acasalamento que contém 10 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de triptona, 2,5 g/l de (NH4)2SO4 e 0,2 g/l de KH2PO4.

Preparação de extratos livres de células de Zymomonas para testes

enzimáticos

Células foram cultivadas em 50 ml de RM + 2% de glicose a 30 0C por uma noite até ODeoo de 1,0 a 1,2. As células foram colhidas por meio de centrifugação a 4500 rpm por dez minutos a 4 0C. O sobrenadante foi descartado e a pelota celular foi lavada com 25 ml de tampão de sonicação resfriado com gelo (10 mM de Tris, pH 7,6, 10 mM de MgCI2), seguida por centrifugação a 4500 rpm por dez minutos. A pelota foi novamente suspensa em 2,0 a 2,5 ml de tampão de sonicação mais 1 mM de ditiotreitol. Uma parcela de 500 μΙ foi centrifugada por um minuto em uma centrífuga Eppendorf a 4 0C. A maior parte do sobrenadante foi descartada, deixando cerca de 10 a 20 μΙ para trás para evitar a secagem da pelota. As células foram congeladas e armazenadas a -80 0C até o teste. Antes do teste, as células foram descongeladas e novamente suspensas com 500 μΙ de tampão de sonicação + 1 mM de DTT. A mistura foi sonicada por duas vezes por 45 segundos em ciclo de trabalho de 62% e um controle de saída de 2 utilizando um sonificador Branson 450, mantendo as amostras em resfriamento por cerca de três a cinco minutos entre as sonicações. Amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm por sessenta minutos em um microcentrifugador Beckman a 4 °C. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e mantido a 4 0C. O teste BCA Pierce foi utilizado para determinar concentrações de proteína. O teste de transquetolase (TKT) foi normalmente realizado em

primeiro lugar, pois esta enzima é mais instável que as demais. Um diagrama do teste de TKT é exibido na Figura 3A.

Em um teste de microplacas, 20 μΙ de extrato livre de células foram adicionados a cada recipiente em uma mistura de reação, a 30 0C1 que incluiu as concentrações finais de componentes a seguir: 0,37 mM de NADP, 50 mM de TrisHCI, pH 7,5, 8,4 mM de MgCI2, 0,1 mM de TPP (pirofosfato cloreto de tiamina), 0,6 mM de E4P (4-fosfato de eritrose), 4 mM de BHP (beta- hidroxipiruvato), 4 U/ml de PGI (fosfoglicose isomerase) e 4 U/ml de G6PD (6- fosfato de glicose desidrogenase). A340 foi lido sobre um leitor de placas por três a cinco minutos. A atividade de TKT foi calculada conforme segue:

1 unidade corresponde à formação de 1 pmol de 6-fosfato de D- frutose/min a 30 0C.

U (pmol/min) = inclinação (dA34o/min) * volume de reação (μΙ) / 6220 / 0,55 cm

(moles de NADP -» NADPH é 6220 A34O por mol por litro em uma

cubeta de 1 cm)

(comprimento de trajeto de 200 μΙ por cavidade em microplaca =

0,55 cm)

Atividade específica (pmol/min-mg) = μmol/min/concentração de proteína (mg)

A base do teste de transaldolase (TAL) é exibida na Figura 3B.

Em um teste de microplacas, 20 μΙ de extrato livre de células foram adicionados a cada cavidade em uma mistura de reação a 30 0C que incluiu as concentrações finais de componentes a seguir: 0,38 mM de NADH, 87 mM de trietanolamina, 17 mM de EDTA, 33 mM de F6P (6-fosfato de frutose), 1,2 mM de E4P (4-fosfato de eritrose), 2,0 U/ml de GDH (3-fosfato de glicerol desidrogenase) e 20 U/ml de TPI (fosfato de triose isomerase). A placa foi incubada por cinco minutos e, em seguida, A34O foi lido por três a cinco minutos. A atividade de TAL foi calculada conforme segue:

1 unidade corresponde à formação de 1 pmol de D-gliceraldeído

por minuto a 30 0C.

U (pmol/min) = inclinação (dA34o/min) * volume de reação (μΙ) /

6220/0,55 cm

(moles de NADH -» NAD é 6220 A34O por mol por litro em uma

cubeta de 1 cm)

(comprimento de trajeto de 200 μΙ por cavidade em microplaca =

0,55 cm)

Atividade específica (pmol/min-mg) = pmol/min/proteína

A base do teste de xilose isomerase (XI) é exibida na Figura 3C. Em um teste de microplacas, 20 μΙ de extrato livre de células foram adicionados a cada cavidade em uma mistura de reação, a 30 0C, que incluiu as concentrações finais de componentes a seguir: 0,256 mM de NADH, 50 mM de xilose, 10 mM de MgSO4, 10 mM de trietanolamina e 1 U/ml de SDH (sorbitol desidrogenase). A340 foi lido sobre um leitor de placas por três a cinco minutos. A atividade de Xl foi calculada conforme segue:

1 unidade de Xl corresponde à formação de 1 pmol de D-xilulose por minuto a 30 0C.

U (pmol/min) = inclinação (dA340/min) * volume de reação (μΙ) /

6220 / 0,55 cm

(moles de NADHP -> NAD é 6220 A340 por mol por litro em uma cubeta de 1 cm) (comprimento de trajeto de 200 μΙ por cavidade em microplaca =

0,55 cm)

Atividade específica (μηηοΙ/min-mg) = Mmol/min/concentração de proteína (mg)

A base do teste de xiluloquinase (XK) é exibida na Figura 3D. Em

um teste de microplacas, 20 μΙ de extrato livre de células foram adicionados a cada cavidade em uma mistura de reação, a 30 0C1 que incluiu as concentrações finais de componentes a seguir: 0,2 mM de NADH1 50 mM de Tris HCI, pH 7,5, 2,0 mm de MgCI2-6H20, 2,0 M de ATP, 0,2 M de PEP

(fosfoenolpiruvato), 8,5 mM de D-xilulose, 5 U/ml de PK (piruvato quinase) e 5 U/ml de LDH (lactato desidrogenase). A340 foi lido sobre um leitor de placas por três a cinco minutos. A atividade de Xl foi calculada conforme segue:

1 unidade corresponde à formação de 1 pmol de D-xilulose em 5- fosfato de D-xilulose por minuto a 30 0C.

U (μηηοΙ/ηιίη) = inclinação (dA34o/min) * volume de reação (μΙ) /

6220 / 0,55 cm

(moles de NADH NAD é 6220 A34O por mol por litro em uma cubeta de 1 cm)

(comprimento de trajeto de 200 μΙ por cavidade em microplaca =

0,55 cm)

Atividade específica (pmol/min-mg) = μηιοΙ/min/concentração de proteína (mg)

MÉTODO DE HPLC

A análise foi realizada com um HPLC série Aligent 1100 e

software Agilent ChemStation para LC 3D. A coluna foi BioRad Aminex HPX- 87H (Coluna de Análise Orgânica HPLC 125-0140) com Cátion de Cartucho BioRad Micro-Guard H (125-0129). As condições de operação foram:

Fluxo: 0,6 ml/min. Solvente: 0,01 N de H2SO4.

Tempo de parada: 25 minutos

Volume de injeção: 5 μΙ.

Autoamostrador: temperatura controlada a 10 0C ou 4 0C. Temperatura da coluna: 55 0C.

Detector: índice de refração (40 °C) com curvas de calibragem padrão externas.

Exemplo 1

Construção de ZW658. uma Linhagem de Zymomonas mobius de Fermentação de Xilose

ZW658 foi construído por meio da integração de dois operadores, PgapxyIAB e Pgaptaltkt, que contêm quatro genes que utilizam xilose codificadores de xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquelotase, no genoma de ZW1 (ATCC n° 31821) por meio de eventos de transposição seqüenciais, seguido pela adaptação sobre meios seletivos que contêm xilose. Anteriormente, foi construída uma linhagem de Zymomonas mobilis de fermentação de xilose denominada 8b, conforme descrito no Pedido de Patente Norteamericano n° 20030162271, por meio de integração dos dois operadores PgapxylAxylB e Penotaltkt, junto com marcadores antibióticos selecionáveis, no genoma de Zymomonas mobilis 5C por meio de uma combinação de abordagens de recombinação homóloga e transpossons seguida por adaptação e mutagênese de NTG. Na preparação de ZW658, foi utilizada a transposição (sistema de transposição in vitro EZ::Tn da Epicentre), ao contrário de recombinação homóloga específica de locais, pois essa abordagem oferece as vantagens de diversas escolhas de locais de integração e freqüência de inserções relativamente alta. Os quatro genes que codificam as enzimas de utilização de xilose foram dispostas e clonadas na forma de dois operadores separados: PgapxylAB e P9^taltkt para a integração. Um marcador de resistência a antibióticos, um gene de resistência a cloranfenicol (Cmr) ladeado por duas seqüências de reconhecimento de Cre-recombinase fago P1 (IoxP), foi ligado a cada operador para a seleção de integrantes. A integração dos dois operadores foi realizada de uma forma seqüencial em duas etapas: Pgaptaltkt seguido por PgapxylAB. A seleção da resistência de Cm foi utilizada nos dois eventos de integração, pois foi removida por meio da expressão de uma Cre recombinase sobre um plasmídeo seguido por cura do plasmídeo após cada integração. Este processo permitiu a utilização do mesmo marcador de antibiótico para diversos tempos de seleção. De forma mais importante, ele permitiu a remoção do marcador antibiótico introduzido para seleção da integração dos operadores. Este processo eliminou o impacto negativo de gene(s) de resistência a antibióticos sobre a linhagem de fermentação para uso comercial.

Construção de pMODP^taltktCm para transposição

Conforme descrito no Pedido de Patente Norteamericano n°

20030162271 (Exemplo 9), um fragmento de DNA de 2,2 kb que contém a região de codificação de transquetolase (tkt) de E. coli foi isolado de pUCtaltkt (Pedido de Patente Norteamericano n° 20030162271) por meio de digestão de Bglll/Xbal e clonado em um vetor pMOD (Epicentre Biotechnologies, Madison Wl) digerido com BamHI/Xbal, o que resulta em pMODtkt. Um fragmento de PCR denominado Pgaptal foi gerado por meio da fusão da região promotora do gene gap de Zymomonas mobilis (Pgap', 3-fosfato de gliceraldeído desidrogenase) à região de codificação de transaldolase (tal) de E. coli conforme segue. Um fragmento de Pgap foi amplificado a partir de pZB4, cuja construção é descrita em US 5.514.583 (Exemplo 3), utilizando primers com SEQ ID N0 1 e 2. pZB4 contém um operador Pgap-xylA/xylB e um operador PENo-tal/tkt. Um fragmento de região de codificação tal foi amplificado a partir de pZB4 utilizando primers com SEQ ID N0 3 e 4. Um fragmento de Pgapfa/foi amplificado utilizando os fragmentos Pgap e tal como modelo empregando primers com SEQ ID N0 5 e 6. Este fragmento foi digerido com Xbal e clonado no plasmídeo pMODf/cf, acima no fluxo da região de codificação tkt. Um fragmento de IoxP::Cm foi gerado por meio de PCR utilizando primers Cmlox(F, sfi) e Cmlox(R, sfi) (SEQ ID N0 7 e 8) e pZB186 como modelo. pZB186 é uma combinação de um plasmídeo de Z mobilis nativo e pACYC184, descrito em US 5.514.583 (Exemplo 3) e Zhang et al ((1995) Science 267: 240-243). Por fim, o fragmento de PCR IoxP::Cm foi inserido no local Sfil do plasmídeo que contém Pgaptaltkt para formar o plasmídeo integrante pMODPgapte/fWCm (Figura 2). Neste plasmídeo, o fragmento de Pgaptaltkt IoxP::Cm foi inserido entre duas extremidades de mosaico (locais de união de transposase) no vetor pMOD. A seqüência de nucleotídeos completa para o plasmídeo pMODPgapfa/f/cfCm é fornecida como SEQ ID N0 9.

Transposição ε transformação de ρΜΟΡΡ^ρ7>μ-γκ7€μ em ZW1 O plasmídeo pMOD é um vetor com base em pUC e, portanto, é

um vetor não reprodutivo em Zymomonas. O plasmídeo pMOOPgaptaltl<tCm foi tratado com transposase na presença de Mg2+ à temperatura ambiente por uma hora e utilizado para transformar células ZW1 por meio de eletroporação (utilizando um Pulsionador de Genes BioRad definido em 200 ohms, 25 pF e 16 kV/cm). Células eletroporadas foram incubadas em um meio de acasalamento (MM) que consiste de 10 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de triptona, 2,5 g/l de (NH4)2SO4, 0,2 g/l de K2HPO4) suplementado com 50 g/l de glicose e 1 mM de MgSO4 por seis horas a 30 0C. A mistura de transformação foi colocada em placas sobre placas Agar contendo 15 g/l de Agar Bacto em MM suplementado com 50 g/l de glicose e 120 pg/ml de cloranfenicol e incubado anaerobicamente a 30 0C. Os transformadores foram visíveis após cerca de dois dias. A freqüência de transformação e transposição foi de cerca de 3 χ 101/pg de DNA.

Foi obtido um total de 39 colônias de transformadores Cmr. Vinte e uma colônias foram tomadas e adicionalmente analisadas por meio de PCR e testes de atividade enzimática. PCR utilizando os primers SEQ ID N0 10 e 11 confirmou a presença de um fragmento de DNA de 3 kb que contém regiões de codificação tal e tkt nos transformadores. Transformação reversa com DNA de plasmídeo das 21 colônias integrantes não gerou transformadores reversos em E. coli, o que sugere que o tale tkt foram integrados ao genoma de ZW1. Estes integrantes foram testados para determinar as atividades de transaldolase e transquetolase utilizando protocolos modificados para microplacas (Métodos Gerais). O teste de proteínas BCA Pierce foi utilizado para a determinação de concentrações de proteínas. Os transformadores foram cultivados em meio RM contendo 2% (p/v) de glicose suplementado com 120 pg/ml de cloranfenicol em 50 ml de tubos centrífugos cônicos a 30 0C. As linhagens de controle 8b e ZW1 também foram cultivadas (RM + 2% glicose foi utilizado para ZW1) para testes enzimáticos. Foram colhidas células quando OD6oo atingiu 1,0. As células foram lavadas uma vez e novamente suspensas em tampão de sonicação (10 mM de Tris-HCI, pH 7,6 e 10 mM de MgCI2). Foram conduzidos testes enzimáticos conforme descrito no Pedido de Patente Norteamericano n° 20030162271. As unidades são fornecidas como pmol/min-mg. Todas as amostras apresentaram atividades de transaldolase e transquetolase, exceto uma. Hibridização Southern foi realizada sobre DNA de plasmídeo e

genômico de integrantes selecionados digeridos com Pstl utilizando uma sonda tkt. DNA de ZW1 não se hibridizou com a sonda tkt. Uma faixa de 1,5 kb comum era visível em todas as amostras de DNA genômico integrantes, que é o fragmento de DNA esperado entre um local Pstl em tkt e um local Pstl em tal. Uma segunda faixa com alto peso molecular (6 kb ou mais) visível era única entre as linhas independentes T2, T3, T4 e T5, o que indica um local de integração genômica separado em cada linha. De forma interessante, DNA genômico e de plasmídeo de T5 hibridizaram-se com a sonda tkt, o que indica que era provável que Pgaptaltkt também era integrado em T5 sobre o plasmídeo nativo. Estas quatro linhagens (T2, T3, T4 e T5) foram selecionadas para tratamento de Cre adicional para remoção do marcador Cmr.

TRATAMENTO DE CRE PARA REMOVER MARCADOR CMr DE INTEGRANTES TALTKT Para remover o marcador Cmr1 T2, T3, T4 e T5 foram

transformados com pZB188/Spec-Cre. Este plasmídeo é um derivado do vetor impulsionador de Zymomonas-E. coli pZB188 (Zhang et al (1995), Science 267: 240-243; US 5.514.583) que contém um conjunto de expressão para Cre Recombinase. pZB188/Spec-Cre é idêntico ao vetor de Expressão de Cre que é descrito no Exemplo 10 (pZB188/Kan-Cre), exceto pelo fato de que é um gene de resistência a espectinomicina em vez de um gene de resistência a canamicina. Os transformadores foram selecionados sobre placas Agar MM suplementadas com 2% de glicose e 200 pg/ml de espectinomicina). As colônias resistentes a Spr foram tomadas sobre placas Agar RM suplementadas com 2% de glicose e 200 pg/ml de espectinomicina e placas Agar RM suplementadas com 2% de glicose e 120 pg/ml de Cm. Cem por cento das colônias tomadas eram Cms1 o que indica a extirpação com alta eficiência de Cmr por Cre. Os transformadores SprCms foram cultivados em RM mais 2% de glicose a 37 0C para duas a cinco transferências diárias para curar pZB188aadACreF. Em cada transferência, as células foram diluídas e colocadas em placas sobre placas Agar RM mais 2% glicose para tomada sobre placas adicionais do mesmo meio com ou sem 200 pg/ml de Sp. Colônias de Sps foram analisadas por meio de PCR para confirmar a perda de pZB188aadACreF. Os descendentes curados por plasmídeo dos integrantes foram denominados T2C, T3C, T4C e T5C. Para examinar se esses integrantes de transposição eram estáveis, estas quatro linhagens foram cultivadas em RM + 2% glicose e transferidas em seguida para 10 ml do mesmo meio e cultivadas a 37 0C em tubos de ensaio em duplicata. As células foram transferidas diariamente por dez dias ou cerca de cem gerações. As colônias foram diluídas e colocadas em placas sobre placas RMG para isolamento de colônias após a primeira e décima transferências. Doze colônias de cada transferência de cada linhagem apresentaram resultados de teste positivos para a presença de Pggptaltkt por meio de PCR de colônia utilizando primers 5' Pgap e 3' tkt (SEQ ID N0 1 e 11). Atividades de transaldose e transquelotase também foram medidas para determinar isolados após as primeira e décima transferências (conforme descrito em Métodos Gerais). Todos os quatro integrantes continham níveis similares de atividades de TAL e TKT após cem gerações sobre o meio não seletivo, o que sugere que estes integrantes eram geneticamente estáveis.

Construção de pMODP^pXYlABCm para transposição A etapa seguinte foi a integração adicional do operador PgapxylAB IoxP::Cm nos integrantes ZW\::Pgeptaltkt (T2C, T3C, T4C e T5C). O plasmídeo integrante pMODPgapxylABCm (Figura 5) foi construído com base no plasmídeo pMODPgaptaltktCm (Figura 4). O fragmento de DNA Pgaptaltkt foi removido por meio de digestão de Sacl/Sfil. Um fragmento adaptador que contém locais de restrição Saci, Notl e Sfil foi introduzido por meio de ligação. Um fragmento de Notl de PgapxylAB, que foi isolado de pZB4 (US 5.514.583), foi clonado em seguida no local Notl do adaptador. Xilose isomerase (XI) é codificada por xylA e xiluloquinase (XK) é codificada por xylB. A seqüência de nucleotídeos completa para o plasmídeo pMODPgapxylABCm é fornecida como SEQ ID N0 12.

Transposição ε transformação de pMODP^bXylABCm em T2C. T3C. T4C e

T5C

Utilizando uma abordagem similar à integração de PgaptaltktCm,

T2C, T3C, T4C e T5C foram transformados/transpostos com pMODPgapxylABCm (descrito acima) tratado com transposase. Seis integrantes (T3CCmX1, T3CCmX2, T3CCmX3, T4CCmX1, T5CCmX1, T5CCmX2) foram obtidos em dois experimentos de transformação e transposição após seleção de Cm. Todos tiveram confirmada a presença de xylAB por meio de PCR utilizando dois conjuntos de primers: SEQ ID N0 13 e 14 e SEQ ID N0 15 e 16, exceto por T2CcmX1 e T2CcmX6 dos quais nenhum fragmento de PCR foi detectado utilizando os primers SEQ ID N0 13 e 14.

Os integrantes, incluindo as duas linhas negativas PCR, foram testados para determinar as atividades de XI, XK1 TAL e TKT (Métodos Gerais). Os resultados exibidos nas Figuras 6 e 7 indicaram que todos os seis integrantes xylAB T3CCmX1, T3CCmX2, T3CCmX3, T4CCmX1, T5CCmX1 e T5CCmX2 apresentaram atividades XI, XK, TAL e TKT. As atividades Xl e XK foram recém obtidas em comparação com os controles parentais negativos (Figura 6). As atividades de TAL e TKT foram mantidas como nos controles parentais. Todos os resultados indicaram que as proteínas foram elaboradas e eram funcionais. Os níveis de atividade enzimática variaram, com atividades de Tl e XK similares às de integrantes ZW1 transformados/transpostos com o mesmo plasmídeo. Os níveis de atividades de XI, XK, TAL e TKT foram mais

baixos que os da linhagem 8b.

A integração do operador xylAB foi confirmada por meio de hibridização Southern. DNA de plasmídeo e genômico das seis linhas foi digerido com Sphl e hibridizado em uma sonda xylB marcada por digoxenina. Uma faixa comum de cerca de 3 kb, que é gerada a partir de um local Sphl em xylB e um outro local Sphl nos locais de clonagem adjacentes sobre o vetor pMOD, estava presente em todas as amostras de DNA genômicas e, adicionalmente, faixas hibridizantes com peso molecular mais alto nas amostras de DNA genômico indicaram que havia quatro locais de integração para o operador PgapXyIAB no cromossomo. T3CCmX1 e T3CCmX2 aparentemente possuem o mesmo local de integração, T3CCmX3 e T4CCmX1 podem possuir o mesmo local de integração e T5CCmX1 e T5CCmX2 possuem um local de integração separado cada um. Digestão do mesmo DNA com Pstl seguida por hibridização Southern com a sonda tkt demonstrou que cada integrante possuía o mesmo padrão de hibridização da sua linhagem

parental correspondente. adaptação dos integrantes ZW1 ::PgaptaltktPgapXylAB Cm sobre meios de

xllose

Apesar da presença de todas as quatro atividades enzimáticas da utilização de xilose, observações anteriores (Pedido de Patente Norteamericano n° 20030162271) indicaram que os integrantes podem não crescer sobre xilose imediatamente. O crescimento sobre xilose pode ocorrer após incubação prolongada sobre meio de xilose (em tubos de ensaio ou sobre placas), um processo denominado adaptação.

As linhagens foram adaptadas conforme segue. Linhagens integrantes de Z\NV.:PgaptaltktPgapXylABCm foram inoculadas em tubos de ensaio e placas contendo RMX (que contêm 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 20 g/l ou 2% (p/v) xilose, bem como RMGX (RM com 0,025% (p/v) de glicose, 4% (p/v) e xilose). O baixo nível de glicose foi utilizado para sustentar o crescimento inicial para aumentar a possibilidade de mutação durante a adaptação. Uma dentre pelo menos cinco tentativas de adaptação sobre xilose nos cultivos e placas foi bem sucedida. Após dez dias de incubação anaeróbica a 30 0C, 17 e 19 colônias foram visíveis sobre MMGX em placas com células T3CCmX1 e T3CCmX2, respectivamente. As colônias foram pequenas e pareceram não saudáveis (transparentes) sobre as placas. Doze colônias (quatro da formação de placas de T3CCmX1: T3CCmX11, T3CCmX12, T3CCmX13 e T3CCmX110; oito de formação de placas de T3CCmX2: T3CCmX24, T3CCmX25, T3CCmX26, T3CCmX27, T3CCmX28, T3CCmX29, T3CCmX211 e T3CCmX212) foram inoculadas em RMGCmI20 e transferidas para 3 ml de RMX para adaptação adicional, para obter linhagens que foram capazes de crescer mais rapidamente sobre xilose.

A adaptação de integrantes em tubos de ensaio que contêm 3 ml de RMX foi conduzida a 30 0C. OD60O foi monitorado constantemente em um espectrofotômetro Spectronic 601. Quando o crescimento atingiu a metade da fase de registro, os cultivos foram transferidos para tubos novos de RMX. Este processo prosseguiu por sete transferências. As velocidades de crescimento e ODs finais (leituras não lineares) aumentaram ao longo das transferências.

Na sexta transferência, os cultivos foram riscados sobre placas RMX para isolar colônias isoladas. Três integrantes cresceram mais rapidamente que os demais sobre placas riscadas RMX: T3CCmX13, T3CCmX26 e T3CCmX27, que são denominadas X13, X26 e X27 nas tabelas e na discussão abaixo. Para selecionar os melhores cultivos de xilose, selecionamos quatro colônias grandes (L1-4) e quatro pequenas (S1-4) para TX13, X26 e X27 cada e as cultivamos em tubos de ensaio RMX, de forma que pudemos monitorar o crescimento, utilização de açúcar e produção de etanol. As colônias foram cultivadas por uma noite a 30 0C, seguidas por inoculação de ODeoo = 0,05 em 3 ml de RMX em tubos de ensaio em duplicatas. X27 cresceu mais lentamente em RMG que os demais cultivos e foi novamente inoculado seis horas e meia mais tarde. Após 69 horas (62,5 horas para X27), foram retiradas amostras para análise HPLC (Métodos Gerais). A Figura 8 mapeia o rendimento médio de etanol (percentual de rendimento teórico) e utilização de xilose (%) para cultivos após 69 horas (62,5 horas para todos os cultivos X27). Não houve diferença significativa entre as colônias grandes e pequenas. Embora o desempenho de X27 fosse melhor em comparação com X26 sobre xilose, ele exibiu crescimento mais lento sobre glicose. Portanto, os melhores produtores, grandes colônias de X13 (X13L3) e X26 (X26L1), foram selecionados para avaliação adicional em fermentações com pH controlado. As fermentações foram conduzidas em RMG (6% glicose), RMX (6% xilose) e RMGX (8%:4%; glicose:xilose) a 37 0C para as linhagens X13L3 e X26L1, bem como a linhagem de controle 8b. A fermentação de glicose por X13L3 e X26L1 cultivados em RMG (6%) e RMGX (8%:4%) processou-se de forma razoavelmente rápida. A fermentação de xilose no RMGX (8%:4%) foi mais lenta para X13L3 e X26L1 em comparação com a da linhagem 8b. Além disso, o crescimento sobre RMX (6%) a 37 0C ocorreu após uma longa demora para X13L3 e X26L1. Vários isolados, X13b, X13c e X13FL, foram recuperados de fermentações de RMX (6%). Estes isolados, junto com as linhagens originais X13a (um isolado de X13L3) e X26, foram submetidos a tratamento Cre1 conforme descrito anteriormente neste Exemplo, para remover o marcador Cmr de TyNV.PgaptaltktPgapXylABCm. Os integrantes livres de Cmr tratados com Cre resultantes foram denominados: X13aC, X13bC, X13cC, X13FLC e X26C. Adaptação de integrantes em meio de xilose por meio de transferências em

série em RMX (5%) a 37 °C Conforme descrito anteriormente, a adaptação das linhagens

ZW1:: PggptaltktPgapXylABCm iniciais sobre RMX a 30 0C aumentou grandemente o crescimento de linhagens nessas condições. As linhagens adaptadas sofreram, entretanto, uma longa demora durante o crescimento e fermentação em RMX (6%) a 37 0C. Para aumentar adicionalmente os integrantes para fermentação de xilose sob condições de processamento preferidas que incluem concentração de açúcar e temperatura mais altas, o processo de adaptação ou evolutivo prosseguiu em RMX (5%) a 37 0C. Foram conduzidas transferências em série e os melhores produtores foram selecionados. Integrantes utilizados neste processo incluíram X13aC, X13bC, X13cC, X26C e X13FLC. Estas cinco linhagens foram cultivadas em RMX a 30 0C para seis transferências antes da sua transferência para RMX (5%) a 37 0C para outras cinco a dezesseis transferências. Durante e após todas as transferências, os cultivos foram riscados sobre placas RMX e incubados a 37 0C para isolar colônias isoladas. Colônias grandes foram adicionalmente riscadas sobre placas RMX e incubadas a 37 0C por três a quatro vezes para purificar as colônias. Colônias grandes finais foram selecionadas para o teste

de crescimento em RMX (5%) a 37 °C. Avaliação de linhagens de adaptação em meio RMX15%) a 37 0C

Dezoito colônias isoladas após adaptação com transferências em série foram testadas em tubos de ensaio RMX (5%) a 37 0C inicialmente. Doze linhagens foram selecionadas para uma segunda avaliação em tubo de ensaio. A linhagem 8b foi incluída em todas as avaliações para comparação. As dezoito colônias foram cultivadas em RMG a 37 0C por uma noite, centrifugadas e as células foram inoculadas em 4 ml de RMX (5%) a 37 0C1 estaticamente em tubos de ensaio para a primeira avaliação. Com base nos resultados de crescimento (OD600, não linear) e HPLC de ponto final (baixa xilose residual e alto etanol), doze linhagens foram selecionadas para a

segunda avaliação.

Um dos propósitos da segunda avaliação foi o teste da

estabilidade de crescimento aprimorado sobre xilose e a capacidade de

utilização de xilose das linhagens. Todas as doze linhagens foram submetidas

a um estudo de estabilidade para observar se as linhagens adaptadas eram

estáveis após a exposição a um meio não seletivo no qual foram transferidas

em série a 37 0C por cinqüenta gerações. Cultivos antes e depois de

transferências de RMG (5%) foram inoculados em tubos de ensaio com RMX

(5%) e cultivados a 37 0C para avaliação. Os ODs não lineares foram

monitorados por meio de leitura direta de tubos de ensaio em um

espectrofotômetro Spectronic 601. Os ODs na 70a hora de crescimento em

RMX (5%) antes e depois de cinqüenta gerações de crescimento em RMG são

plotados na Figura 9. Os resultados indicaram que a maior parte das linhagens

era estável após cinqüenta gerações em RMG a 37 0C. Os sobrenadantes finais (na fase estacionária) também foram analisados por meio de HPLC para determinar as concentrações de xilose e etanol. As baixas concentrações residuais de xilose e altas de etanol nesses cultivos sustentaram o fato de que a linhagem cresceu e fermentou bem xilose. Com base nos resultados da avaliação em tubo de ensaio acima

(baixa concentração residual de xilose, alta de etanol e OD mais alto) e uma seleção de cultivo de placas de microtítulos subsequente com altas concentrações de glicose e/ou xilose (até 20%) e misturas de glicose e xilose com acetato para selecionar melhores produtores com altos teores de açúcar e na presença de acetato, decidimos concentrar-nos na linhagem n° 26, denominada ZW658, que exibiu o melhor desempenho geral.

Exemplo 2

Avaliação da Fermentação de Linhagens de Utilização de Xilose Aprimoradas Superiores a 37 °C

o exemplo a seguir ilustra o desempenho de fermentação da

linhagem de Zymomonas que utiliza xilose aprimorada ZW658 sob condições de fermentação que imitam as concentrações de açúcar e o nível de ácido acético esperado em um hidrolisado de biomassa. A linhagem ZW658 foi inoculada em fermentadores que contêm meio RM suplementado com 10% de glicose (RMG10%), 8% xilose (RMX8%), 10% glicose + 8% xilose (RMGX10%8%) e 10% glicose + 8% xilose + 0,6% ácido acético (RMGXAd0%8%0,6%), respectivamente. Todas as fermentações foram conduzidas em Sixfors com 300 ml de meios a 150 rpm, pH 5,5 e 37 0C. Nitrogênio foi purgado através do meio nos fermentadores por uma noite e suspenso pouco antes da inoculação. Nenhum nitrogênio foi purgado durante a fermentação. Foram preparados inoculados para a fermentação com RMGX (10%,4%) a 37 0C em frascos de agitação (150 rpm) após renascimento dos estoques de trabalho em RMG5%. A linhagem 8b foi utilizada como um controle sob as mesmas condições. Conforme exibido na Figura 10, ZW658 cresceu mais lentamente sobre RMG10% em comparação com 8b (A e B) e cresceu sob velocidade similar a 8b sobre RMX8% (C e D). Apesar da menor velocidade de crescimento, a Figura 10 demonstra que o rendimento de etanol

•i

de ZW658 (93%) era similar ao de 8b ao final da fermentação em meio de glicose. Em meio RMX8%, o rendimento de etanol era mais alto para ZW658 (0,46 g de etanol/g de açúcar) em comparação com 8b (0,44 g de etanol/g de açúcar). ZW658 produziu cerca de 4 g/l mais etanol em comparação com 8b em RMX8%. De forma interessante, ZW658 não produziu nenhum xilitol, enquanto 8b produziu um baixo nível de xilitol (0,7 g/l) ao final da fermentação em RMX8%. Os dados exibidos na Figura 11 demonstram que ZW658 apresentou melhor desempenho em comparação com 8b na fermentação de 10% glicose + 8% xilose com (C, D) ou sem (A, B) acetato, indicado por maior consumo de glicose e xilose, menor produção de xilitol e maior produção de etanol. A maior parte da glicose foi utilizada e xilose residual substancial permaneceu ao final da fermentação para as duas linhagens em RMG10%X8% a 37 0C e sob pH 5,5, embora ZW658 utilizasse cerca de 8 g/l mais xilose que 8b. A produção de xilitol (4,9 g/l) em ZW658 em RMG10%X8% a 37 0C e sob pH 5,5 ao final da fermentação foi significativamente mais baixa que a de 8b (8,2 g/l). Na presença de acetato (6 g/l), o crescimento celular das duas linhagens foi reduzido significativamente, resultando em baixo desempenho de fermentação de glicose e xilose, embora ZW658 exibisse desempenho de fermentação levemente melhor em termos de maior consumo de glicose e xilose, menor produção de xilitol e maior produção de etanol. Ao contrário de RMX8%, as duas linhagens geraram o subproduto xilitol em RMG10%X8% com ou sem acetato, embora menos xilitol fosse produzido por ZW658 em comparação com 8b. O desempenho de fermentação das duas linhagens encontra-se resumido na Tabela 1. Ao final, ZW658 apresentou melhor desempenho que 8b em fermentações com açúcar puro. Conforme descrito no Exemplo 1, ZW658 é livre de marcadores de seleção de antibióticos, o que é uma propriedade valiosa para organismos de fermentação em aplicações comerciais.

Tabela 1

Resumo do Desempenho de Fermentação de ZW658 ε 8b para Produção de

Etanol

Rendimento de etanol g etanol/g açúcar Vol. prod. g/l/h Etanol g/l CPI g/g 8b (GIu) 0,47 5,15 52 21 ZW658 (GIu) 0,48 4,13 52 15 8b (XyI) 0,44 1,66 37 24 ZW658 (XyI) 0,46 1,83 41 23 8b (Glu Xyl) 0,43 1,80 58 52 ZW658 (Glu Xyl) 0,45 2,03 65 35 8b (Glu Xyl Ac) 0,46 0,67 48 136 ZW658 (Glu Xyl Ac) 0,47 1,04 50 90

CPI é o índice de Produtividade Celular: g etanol/g de peso seco

de células.

Exemplo 3

Preparação de uma Construção Suicida para Desativação por Inserção do Gene Glicose-Frutose Oxidorreductase (GFOR) em ZW1 ε ZW658

A construção suicida utilizada para realizar knockout do gene que codifica glicose-frutose oxidorreductase em ZW1 e ZW658 ("GFORSp-9WW") foi derivada de uma outra construção suicida ("pLDHSp-9WW") que foi utilizada anteriormente para desativar por inserção o gene para D-Iactato desidrogenase em Ζ. mobilis utilizando recombinação homóloga cruzada dupla mediada por hospedeiro e resistência à espectinomicina como um marcador selecionável. pLDHSp-9WW também foi derivado de uma série de outras construções que foram geradas anteriormente. O precursor inicial de todas essas construções foi o vetor de plasmídeo pNEB193 (NEB n° N3051S; New England Biolabs). Este plasmídeo foi selecionado porque pode reproduzir-se em E. coli, mas não pode reproduzir-se em Z. mobilis. Todas as etapas e intermediários que foram envolvidos na geração da construção de knockout de GFOR são descritos abaixo em ordem cronológica a partir do plasmídeo pNEB193. Construção de PLDH193

pNEB193 sofreu dupla digestão com Sbfl e Ascl para inserção do fragmento de DNA que é descrito abaixo. Os dois locais de restrição são exclusivos e localizados na região de clonagem múltipla do plasmídeo. O fragmento de DNA de plasmídeo pNEB193 Iinearizado por Sbfl/Ascl foi purificado utilizando o Kit de Purificação QIAQuick da Qiagen (catálogo n° 28104) de acordo com o protocolo do fabricante. O fragmento de DNA que foi clonado em pNEB193 foi um fragmento de 2268 bp que foi amplificado por PCR a partir de DNA genômico de Z. mobilis e isolado a partir da linhagem ZW1 utilizando Kit Maxi de Cultivo de Sangue e Células da Qiagen (catálogo n° 13362). Os oligonucleotídeos sintéticos que foram utilizados para amplificação por PCR deste fragmento foram os Primers 1 e 2: Primer 1 (SEQ ID N0 17):

Ρ.ΤΔ PTP ATTTcctq na α aTG GTAACTC ATTG CGC G CTC Primer 2 (SEQ ID N0 18): P. ATP.TTACTgg ca caccAAAAATCTG CGG CTG AC ATAC

As bases sublinhadas de Primer 1 (primer frontal) hibridizam-se aos nucleotídeos 1262739-1262720 do número de acesso GenBank AE008692 na extremidade 3' do quadro de leitura aberta que codifica fosfogliceromutase (pgm), enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Sbfl que foi adicionado à extremidade 5' do primer. As bases sublinhadas de Primer 2 (primer reverso) hibridizam-se aos nucleotídeos 1260490-1260472 do número de acesso GenBank AE008692, que está um pouco acima no fluxo do quadro de leitura aberta que codifica álcool desidrogenase I (adhl), enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Ascl que foi adicionado à extremidade 5' do primer. O fragmento de DNA com 2268 bp que foi o alvo de amplificação por PCR consiste, portanto, dos elementos a seguir, a partir do local Sbfl e terminando no local Ascl: (a) a extremidade 3' do gene pgm; (b) o gene Idh completo que codifica D-Iactato desidrogenase; e (c) uma região 5' não traduzida do gene adhl. O produto de PCR foi cortado com Sbfl e Ascl e o fragmento de DNA resultante foi ligado ao vetor pNEB193 Iinearizado por Sbfl/Ascl que foi descrito acima. A mistura de reação de ligação foi utilizada para transformar E. coli JM110 e as células transformadas foram colocadas em placas sobre meio LB que continha ampicilina (100 pg/ml). Transformadores resistentes a ampicilina que continham plasmídeos com o inserto com tamanho correto foram identificados inicialmente por meio de PCR utilizando colônias novamente suspensas ("PCR de colônia") e os Primers 1 e 2. Confirmação subsequente de clones positivos decorreu de análise de digestão de restrição de DNA de plasmídeo com Sbfl e Ascl e análise de seqüências de DNA do fragmento de 2268 bp que foi gerado por meio de PCR de colônia com os transformadores resistentes a ampicilina. O plasmídeo que foi selecionado para manipulação adicional é denominado abaixo pLDH193.

Construção de pLDHTc139#7: O plasmídeo pLDH193 contém um local Ncol exclusivo que está

localizado perto do meio do quadro de leitura aberta Idh. Este local foi utilizado para inserir um fragmento de DNA que confere resistência a tetraciclina. O conjunto de resistência a tetraciclina (conjunto Tcr) que foi utilizado para esta manipulação foi gerado por meio de PCR utilizando o plasmídeo pACYC184 (acesso GenBank n° X06403) como um modelo de DNA e os Primers 3 e 4 como primers de PCR.

Primer 3 (SEQ ID N0 19):

ACTCATTTccataaCGATCGCACTATqcqgccqcAATGTAGCACCT GAAGTCAGCC

Primer 4 (SEQ ID N0 20):

ATCTCACTccatqqCCGGCCAACTAftaaftaaGAATTGATTGGCTC CAATTCTTG

As bases sublinhadas e em negrito do Primer 3 (primer frontal) hibridizam-se pouco acima do fluxo do promotor para o gene de resistência à tetraciclina. O Primer 3 também possui três locais de restrição (Ncol, AsiSI e Notl) que foram adicionados à sua extremidade 5'. O local Ncol encontra-se em letras minúsculas. O local AsiSI é sublinhado com uma linha fina. O local Not I encontra-se em letras minúsculas, em itálico. As bases sublinhadas e em negrito do Primer 4 (primer reverso) hibridizam-se pouco abaixo no fluxo do códon de parada para o gene de resistência à tetraciclina e este primer também contém três locais de restrição (Ncol, Fsel e Pacl) que foram adicionados à sua extremidade 5'. De forma similar à marcação acima, o local Ncol encontra-se em letras minúsculas, o local Fsel é sublinhado com uma linha fina e o local Pacl encontra-se em letras minúsculas, em itálico. O conjunto Tcr de 1448 bp que foi gerado com os Primers 3 e 4 foi cortado com Ncol e purificado por meio de eletroforese de gel de agarose preparativa. O fragmento de DNA resultante foi ligado em seguida ao local Ncol exclusivo que está presente no quadro de leitura aberta Idh do plasmídeo, pLDH193. Para minimizar a possibilidade de recircularização do vetor sem um inserto, o pNEB193 digerido por Ncol foi desfosforilado com fosfatase alcalina de intestino de bezerro antes da ligação. A mistura de reação de ligação foi introduzida em Escherichia coli JM110 e as células transformadas foram colocadas em placas sobre meio LB que continha 20 Mg/ml de tetraciclina. Transformadores resistentes a tetraciclina que continham plasmídeos com o inserto correto foram identificados por meio de análise de digestão de restrição com Ncol1 AsiSI1 Notl1 Fsel e Pacl e a orientação do conjunto Tcr foi confirmada por meio de análise de PCR utilizando primers apropriados. Um diagrama de círculo do plasmídeo que foi selecionado para manipulação adicional (pLDHTc139#7) é exibido na Figura 12. Em experimentos não descritos no presente, esta construção suicida foi utilizada para desativar por inserção (ou seja, fazer "knockout" ou "romper") o gene D-Iactato desidrogenase em ZW1 utilizando recombinação homóloga cruzada dupla mediada por hospedeiro e crescimento sobre tetraciclina como a seleção.

Construção de pLDHTc139#7-9WW Após demonstrar que pLDHTc139#7 poderia ser utilizado para realizar "knockout" do gene D-Iactato desidrogenase em ZW1, a etapa seguinte foi a modificação desta construção, de forma que fosse possível remover o marcador selecionável do cromossomo após o rompimento genético, utilizando Cre recombinase. Para atingir esse objetivo, foram adicionados dois locais IoxP do tipo selvagem (Lee e Saito, 1998) a pLDHTc139#7, utilizando os quatro locais de restrição exclusivos que ladeiam o conjunto Tcr, nomeadamente AsiSI e Notl na extremidade 5' e Pacl e Fsel na extremidade 3'. O primeiro local IoxP foi inserido entre os locais AsiSI e Notl do plasmídeo pLDHTc139#7 após o corte da construção com as duas enzimas e purificação do fragmento de DNA grande resultante. O local IoxP que foi inserido nesse local foi gerado a partir de dois oligonucleotídeos sintéticos 5 e 6 (SEQ ID N0 21 e 22) que foram ambos fosforilados na sua extremidade 5'.

Oligonucleotídeo 5 (SEQ ID N0 21): cgcATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATgc Oligonucleotídeo 6 (SEQ ID N0 22):

ggccgcATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATgcgat Estes oligonucleotídeos são complementares entre si e, quando combinados, formam um local IoxP do tipo selvagem com fita dupla e comprimento total que possui sobreposições de fita única nas duas extremidades, que permitem a ligação do fragmento de DNA entre os locais AsiSI e Notl de pLDHTc139#7. As letras maiúsculas nos oligonucleotídeos correspondem ao local IoxP do tipo selvagem com comprimento total, enquanto as letras minúsculas indicam os nucleotídeos que foram utilizados para ligar o fragmento de DNA de fita dupla nos locais AsiSI e Notl de pLDHTc139#7.

A mistura de reação de ligação foi utilizada para transformar E. coli DH10B e as células transformadas foram colocadas em placas sobre meio LB que continha 20 pg/ml de tetraciclina. Transformadores resistentes a tetraciclina que continham plasmídeos com o local IoxP inserido corretamente nos locais AsiSi e Notl de pLDHTc139#7 foram identificados por meio de análise de digestão de restrição, PCR de colônia e análise de seqüências de DNA das regiões relevantes. O plasmídeo que foi selecionado para manipulação adicional é indicado abaixo como pLDHTc139#7-9W.

Em seguida, um segundo local IoxP do tipo selvagem foi inserido entre os locais Pacl e Fsel na outra extremidade do conjunto Tcr em pLDHTcl 39#7-9W, após o corte do plasmídeo com as duas enzimas e purificação do fragmento de vetor grande resultante. O local IoxP que foi inserido neste local também foi gerado com dois oligonucleotídeos sintéticos 7 e 8 (SEQ ID N0 23 e 24) que foram ambos fosforilados na sua extremidade 5'. Oligonucleotídeo 7 (SEQ ID N0 23):

taaAT AACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATggccgg Oligonucleotídeo 8 (SEQ ID N0 24):

ccATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATttaat Os oligonucleotídeos 7 e 8 são complementares entre si e, quando hibridizados, formam um local IoxP do tipo selvagem com fita dupla e comprimento total que possui sobreposições de fita única nas duas extremidades que permitem a ligação do fragmento de DNA entre os locais Pacl e Fsel de pLDHTc139#7-9W. As letras maiúsculas nos oligonucleotídeos correspondem ao local IoxP de comprimento total e as letras minúsculas indicam os nucleotídeos que foram utilizados para ligar o fragmento de DNA de fita dupla nos locais Pacl e Fsel de pLDHTcl 39#7-9W.

A mistura de reação de ligação foi utilizada para transformar E. coli DH10B e as células transformadas foram colocadas em placas sobre meio LB que continha 20 pg/ml de tetraciclina. Transformadores resistentes a tetraciclina que continham plasmídeos com o local IoxP do tipo selvagem inserido corretamente nos locais Pacl e Fsel de pLDHTcl 39#7-9W foram identificados por meio de análise de digestão de restrição, PCR de colônia e análise de seqüências de DNA das regiões relevantes. O plasmídeo que foi selecionado para manipulação adicional é indicado abaixo como pLDHTcl 39#7-9WW e um diagrama de círculo desta construção é exibido na Figura 12.

Construção de pLDHSp-9WW

pLDHSp-9WW é idêntico a pLDHTcl 39#7-9WW1 mas o conjunto

de resistência a tetraciclina nesta última construção foi substituído com um fragmento de DNA que confere resistência a espectinomicina (ou seja, um conjunto Specr). Este último foi gerado por meio de PCR utilizando o plasmídeo pHP15578 (Cahoon et al, 2003) como modelo e os Primers 9 e 10. pHP15578 contém a seqüência de nucleotídeos completa para o conjunto Specr e seu promotor, que é baseado na seqüência publicada do gene Transposon Tn7 aadA (acesso GenBank n° X03403) que codifica 3' (9)-0-nucleotidiltransferase.

Primer 9 (SEQ ID N0 25): ATAAAAgcgqccgcAGCACAGGATGA Primer 10 (SEQ ID N0 26): GGCGttaattaaGGCAGGTCAGCAAG

As bases sublinhadas do Primer 9 (primer frontal) hibridizam-se pouco acima no fluxo do promotor para o conjunto Specr (para nts 6-17 do acesso GenBank n° X03043), enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Notl que foi adicionado à extremidade 5' do primer. As bases sublinhadas do Primer 10 (primer reverso) hibridizam cerca de 130 bases abaixo no fluxo do códon de parada para o conjunto Specr (até nts 1006-1019 do acesso GenBank n° X03043), enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Pacl que foi adicionado à extremidade 5' do primer. O conjunto Specr gerado por PCR de 1040 bp sofreu digestão dupla com Notl e Pacl e o fragmento de DNA resultante foi purificado por meio de eletroforese de gel de agarose. O plasmídeo pLDHTc139#7-9WW também foi cortado com as mesmas duas enzimas de restrição para remover o conjunto Tcr e o fragmento de vetor grande resultante foi purificado por meio de eletroforese de gel de agarose. Os dois fragmentos de DNA de interesse foram ligados entre si em seguida e a mistura de reação de transformação foi introduzida em E. coli DH10B utilizando eletroporação. Os transformadores foram colocados em placas sobre meio LB que continha espectinomicina (200 pg/ml) e cultivados a 37 °C. Transformadores resistentes a espectinomicina que continham plasmídeos com o inserto com o tamanho correto foram identificados por meio de análise de digestão de restrição com Notl e Pacl e o plasmídeo que foi selecionado para manipulação adicional é indicado abaixo como pLDHSp- 9WW; um diagrama de círculo desta construção é exibido na Figura 12. Em experimentos não descritos no presente, pLDHSp-9WW foi utilizado para realizar knockout do gene para D-Iactato desidrogenase em ZW1 utilizando a resistência à espectinomicina como o marcador selecionável. Desativação genética com a construção suicida ocorreu por meio de recombinação homóloga mediada por hospedeiro, cruzada dupla (WO 01/83784 A2), o que resultou na inserção do marcador selecionável (o conjunto Specr) que é ladeado por dois locais IoxP do tipo selvagem no meio do quadro de leitura aberta ldh. O evento cruzado duplo foi direcionado ao gene Idh por dois fragmentos de DNA que ladeiam o conjunto Specr em pLDHSp-9WW. Um destes fragmentos (indicado abaixo como DNA lateral 5' Idh) está exatamente acima no fluxo do conjunto Specr e está localizado entre os locais Sbfl e AsiSI. A seqüência de nucleotídeos deste fragmento de DNA de cerca de 1100 bp é idêntica ao DNA cromossômico ZW1 que codifica a extremidade 3' do gene pgm e cerca da primeira metade do quadro de leitura aberta ldh. O outro fragmento de DNA (indicado abaixo como o DNA lateral 3' Idh) está localizado na extremidade oposta do conjunto Specr entre os locais Fsel e Ascl. A seqüência de nucleotídeos do DNA lateral 3' Idh (que também é de cerca de 1100 bp) é idêntica ao DNA cromossômico que codifica a outra metade do gene Idh e parte da região não traduzida 5' do gene adhl. Um evento cruzado dobrado ocorre quando os dois fragmentos de DNA laterais 5' e 3' Idh interagem com os seus correspondentes cromossômicos e sofrem recombinação homóloga. Este fenômeno, que é essencialmente irreversível e completamente mediado pela maquinaria enzimática do hospedeiro, desativa o gene Idh cromossômico por meio da inserção do conjunto Specr no meio do quadro de leitura aberta. Como a construção não pode reproduzir-se em Z. mobilis, tornando-o uma construção suicida, a única forma de gerar colônias resistentes a espectinomicina estáveis com pLDHSp-9WW (além de mutantes resistentes a drogas espontâneos que ocorrem em uma freqüência muito baixa) é um evento cruzado duplo por meio de recombinação homóloga. É importante observar que o conjunto Specr que fica inserido no cromossomo pelo evento cruzado duplo ainda é colocado em sanduíche entre os dois locais IoxP do tipo selvagem que estavam presentes na construção suicida. Devido a esta disposição, fica fácil remover o marcador selecionável do gene D-Iactato desidrogenasse sem reativá-lo utilizando o vetor de expressão Cre que é descrito no Exemplo 10. Construção de pGFORSp-9WW

pLDHSp-9WW foi convertido em uma construção suicida para desativação genética de glicose-frutose oxidorreductase (GFOR) de Z. mobilis em um procedimento de duas etapas conforme descrito abaixo. A primeira etapa foi a remoção do DNA lateral de 3' Idh e sua substituição com um fragmento de DNA análogo que dirigiria a construção de plasmídeo para o gene cromossômico que codifica GFOR. O último fragmento de DNA (denominado abaixo DNA lateral de 3' GFOR) foi gerado por meio de PCR utilizando DNA genômico ZW1 como modelo e os Primers 11 e 12 como primers de PCR. PrimerH (SEQIDN0 27):

CTACTCATaaccaaccTCAGAACGATCCTGCACAGC Primer 12 (SEQIDN0 28):

CATCTTACTaaca caccGGACGAGGTTCATCTCAGG As bases sublinhadas do Primer 11 (primer frontal) hibridizam-se nos nucleotídeos 684324-684305 do acesso GenBank n° AE008692 que se encontram aproximadamente no meio do quadro de leitura aberta de GFOR, enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Fsel que foi adicionado à extremidade 5' do primer. As bases sublinhadas do Primer 12 (primer reverso) hibridizam-se nos nucleotídeos 683124-683143 do acesso GenBank n° AE008692 que se encontra a cerca de 625 bp abaixo no fluxo do códon de parada de GFOR, enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Ascl que foi adicionado à extremidade 5' do primer. O fragmento de PCR de 1234 bp foi cortado com Fsel e Ascl. pLDHSp-9WW também foi cortado com as mesmas enzimas de restrição para remover o DNA lateral 3' Idh e o fragmento de vetor grande resultante dessa manipulação foi purificado por meio de eletroforese de gel de agarose. O DNA lateral de 3' GFOR gerado por PCR foi ligado em seguida entre os locais Fsel e Ascl do fragmento de vetor grande purificado com gel descrito acima e uma parcela da mistura de reação de ligação foi eletroporada em E. coli DH10B. As células transformadas foram colocadas em placas sobre meio LB que continha 200 pg/ml de espectinomicina e as placas foram incubadas a 37 °C. Transformadores resistentes a espectinomicina que continham plasmídeos com o inserto correto foram identificados por meio de PCR de colônia e análise de digestão de restrição com Fsel e Ascl e o plasmídeo que foi selecionado para manipulação adicional é denominado abaixo pLDH/GFORSp-9WW.

A etapa seguinte foi a remoção do DNA lateral 5' Idh de pLDH/GFORSp-9WW e sua substituição com DNA lateral de 5' GFOR1 de forma que um evento cruzado duplo pudesse ocorrer nos alvos cromossômicos que foram selecionados para rompimento do quadro de leitura aberta de GFOR. O fragmento de DNA lateral de 5' GFOR foi gerado por meio de PCR utilizando DNA genômico de ZW1 como modelo e os Primers 13 e 14 como Primers de PCR.

Primer 13 (SEQIDN0 29):

CTACTCATatacatGTCCAGAAAAGACAGCATTCC

Primer 14 (SEQ ID N0 30):

nATCTTACTacaatcacTGCACGGTTCATTGGAT

As bases sublinhadas do Primer 13 (primer frontal) hibridizam-se nos nucleotídeos 685584-685564 do acesso GenBank n° AE008692 que se encontram a cerca de 520 bp acima no fluxo do códon de início de GFOR1 enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Nsil que foi adicionado à extremidade 5' do primer. As bases sublinhadas do Primer 14 (primer reverso) hibridizam-se nos nucleotídeos 684396-684415 do acesso GenBank n° AE008692 que estão próximos do meio do quadro de leitura aberta GFOR e exatamente abaixo no fluxo do local de união para o Primer 11, enquanto as letras minúsculas correspondem a um local AsiSI que foi adicionado à extremidade 5' do primer. O produto de PCR de 1217 bp foi cortado com Nsil e AsiSI e pLDH/GFORSp-9WW sofreu digestão dupla com Sbfl e AsiSI para remover o DNA lateral 5' Idh; o fragmento de vetor grande resultante desta última manipulação foi purificado por meio de eletroforese de gel de agarose. O DNA lateral de 5' GFOR gerado por PCR foi ligado em seguida aos locais Sbfl e AsiSI do fragmento de vetor grande purificado com gel descrito acima e uma parcela da mistura de reação de ligação foi eletroporada em E. coli SCS110 (que é dcm" e dam") para obter DNA de plasmídeo não metilado para transformação subsequente de ZW1 e ZW658, que é descrita em detalhes abaixo nos Exemplos 5 e 7. Observe-se que o uso de DNA de plasmídeo não metilado para transformação de manchas de Z mobilis que são derivadas de ZM4 é fundamental para o sucesso, pois DNA de plasmídeo metilado que é isolado de linhagens de E. coli do tipo selvagem, como DH10B, é facilmente destruído pelo sistema de modificação e restrição do hospedeiro (descrito em US 6.566.107 B1). Observe-se ainda que Nsil e Sbfl possuem extremidades adesivas compatíveis, mas os dois locais são destruídos quando são unidos entre si. Os transformadores foram colocados em placas sobre meio LB que continha 100 pg/ml de espectinomicina e as placas foram incubadas a 37 °C. Transformadores resistentes a espectinomicina que continham plasmídeos com o inserto correto foram identificados por meio de PCR de colônia e análise de digestão de restrição. Esta construção suicida resultante que foi utilizada para realizar "knockout" do gene GFOR em ZW1 e ZW658 é denominada abaixo pGFORSp-9WW. Um diagrama em círculo deste plasmídeo é exibido na Figura 12 e a sua seqüência de nucleotídeos completa é descrita em SEQ ID N0 31. É importante observar que um evento cruzado duplo entre esta construção suicida e o cromossomo de Z. mobilis resulta na inserção de um conjunto Specr que é ladeado por dois locais IoxP do tipo selvagem, análogos à situação descrita acima para pl_DH-Spec-9WW. Exemplo 4

Geração de um Vetor de Expressão de Xilose Isomerase de e. coli para Z.

mobilis

Foi gerada uma construção de plasmídeo para expressão de xilose isomerase de E. coli em Z. mobilis (pZB188/Kan-XylA) conforme descrito abaixo utilizando um vetor impulsor de E. coli/Z. mobilis (pZB188) como material de partida (Figura 13). As etapas envolvidas na construção de pZB188 são descritas em US 5.514.583. Resumidamente, este plasmídeo de 7008 bp é capaz de reproduzir-se em E. coli e Z. mobilis porque possui duas origens de reprodução diferentes, uma para cada espécie de bactéria. pZB188 também contém um fragmento de DNA que confere resistência a tetraciclina (ou seja, um conjunto Tcr). A primeira etapa da construção de pZB188/Kan-XylA foi a remoção do conjunto Tcr de pZB188 e sua substituição com um fragmento de DNA que confere resistência a canamicina (ou seja, conjunto Kanr). Para extirpar o conjunto Tcr de pZB188, o plasmídeo foi cortado com Xbal e BssHII e o fragmento de vetor grande resultante foi purificado por meio de eletroforese de gel de agarose. O conjunto Kanr foi gerado por meio de PCR utilizando o plasmídeo pET-24a (Novagen) como modelo e os Primers 15 e 16 para amplificação por PCR. pET-24a contém o quadro de leitura aberta completo para o gene Kanr e o seu promotor associado. Primer 15 (SEQ ID N0 32): GCtctaaaGCAGCAGATTACGCGC

Primer 16 (SEQ ID N0 33): ACATTGgcacacTTAGAAAAACTCATC As bases sublinhadas do Primer 15 (primer frontal) hibridizam-se a cerca de 160 bp acima no fluxo do códon de início para o gene Kanr em pET- 10

24a, enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Xbal que foi adicionado à extremidade 5' do primer. As bases sublinhadas do Primer 16 (primer reverso) hibridizam-se na outra extremidade do quadro de leitura aberta para o gene Kanr e incluem o códon de término, enquanto as letras minúsculas correspondem a um local BssHII que foi adicionado à extremidade 5' do primer. O conjunto Kanr gerado por PCR de 991 bp foi cortado com Xbal e Bsshll e purificado por meio de eletroforese de gel de agarose.

O fragmento de DNA resultante foi inserido em seguida entre os locais Xbal e BssHII do fragmento de DNA pZB188 descrito acima em uma reação de ligação padrão. A mistura de reação de transformação foi introduzida em E. coli DH10B utilizando eletroporação e as células foram colocadas em placas sobre meio LB que continha canamicina (50 pg/ml); o crescimento ocorreu a 37 °C. DNA de plasmídeo foi isolado a partir de um dos transformadores resistentes a canamicina e a construção resultante é denominada abaixo pZB188/Kan; um diagrama de círculo deste vetor impulsionador é exibido na Figura 13.

Na etapa a seguir, um conjunto de expressão de xilose isomerase de E. coli foi inserido entre os locais Ncol e Acll de pZB188/Kan após o corte desta última com as duas enzimas e purificação do fragmento de vetor grande por meio de eletroforese de gel de agarose. O fragmento de DNA de cerca de 2 kbp que serviu de conjunto de expressão de xilose isomerase de E. coli foi derivado do plasmídeo pZB4 após o corte da construção posterior com Ncol e Clal e purificação do fragmento de DNA relevante por meio de eletroforese de gel de agarose. O plasmídeo pZB4 é descrito em detalhes em US 5.514.583 e uma representação esquemática do conjunto de expressão de E. coli PgapXyIA (SEQ ID N0 34) é exibida no diagrama em caixas da Figura 13.

Os locais Ncol e Clal foram posicionados nas extremidades 5' e 3', respectivamente, do conjunto de expressão de xilose isomerase de E coli. Conforme descrito em US 5.514.583, este fragmento contém o promotor 3- fosfato de gliceraldeído desidrogenase (GAP) de Z mobilis constitutivo, que é fundido precisamente ao quadro de leitura aberta completo do gene xylA de E. coli que codifica xilose isomerase. Ele também contém a região de circuito de haste pequena que se segue imediatamente ao códon de parada de xilose isomerase. O conjunto de expressão de xilose isomerase de E. coli foi inserido entre os locais Ncol e Acll de pZB188/Kan em uma reação de ligação padrão. Observe-se que Clal e Acll geram "extremidades adesivas" compatíveis, mas os dois locais são destruídos quando são ligados entre si. A mistura de reação de ligação foi eletroporada em seguida em E. coli SSC110 (dcm", dam") para obter DNA de plasmídeo não metilado para transformação subsequente de Z mobilis conforme descrito abaixo no Exemplo 6 e células transformadas foram colocadas em placas sobre meio LB que continha canamicina (50 Mg/ml); o crescimento ocorreu a 37 °C. Transformadores resistentes a canamicina que continham um plasmídeo com um inserto com o tamanho correto foram identificados por meio de análise de digestão de restrição e PCR de colônia. O plasmídeo que foi utilizado para expressar xilose isomerase de E. coli em Z mobilis é denominado abaixo "pZB188/Kan-XylA"; um diagrama de círculo desta construção é exibido na Figura 13. Exemplo 5

Geração do Mutante Knockout ZW1 GFOR Para eliminar a atividade da enzima GFOR em ZW1 (a linhagem do tipo selvagem da qual ZW658 foi originalmente derivada), utilizou-se a construção suicida pGFORSp-9WW, que foi descrita em detalhes no Exemplo 3. O DNA de plasmídeo sem repetição foi introduzido no hospedeiro bacteriano utilizando eletroporação, essencialmente conforme descrito em US 5.514.583. Resumidamente, 50 μΙ de reações de transformação continham cerca de 1010 células/ml em 10% (v/v) de glicerol e cerca de 0,9 pg de DNA de plasmídeo não metilado que foi isolado de E. coli SSC110 conforme descrito no Exemplo 3. A reação de controle foi tratada de forma idêntica, mas não recebeu nenhum DNA de plasmídeo. As configurações do eletroporador foram de 16 kv/cm, 200 Ω e 25 pF e a largura da lacuna da cubeta foi de 0,1 cm. Após eletroporação, as reações de transformação foram diluídas com 1,0 ml de meios MMG (50 g/l de glicose, 10 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de triptona, 2,5 g/l de (NH4)2SO4, 0,2 g/l de K2HPO4 e 1 mM de MgSO4) e as células foram mantidas em recuperação por cerca de cinco horas a 30 °C. As células foram colhidas em seguida por meio de centrifugação à temperatura ambiente (13.000 χ g, 5 min) em tubos de microcentrifugação estéreis de 1,5 ml e os sobrenadantes foram cuidadosamente removidos. Pelotas celulares foram novamente suspensas em 150 μΙ de meios MMG líquidos e parcelas de 50 e 100 μΙ da suspensão celular foram colocadas em placas sobre meio MMG que continha 1,5% de Agar e 200 pg/ml de espectinomicina. As placas foram incubadas em uma câmara anaeróbica a 30 0C e 50 a 150 colônias apareceram nas placas experimentais após dois a três dias. Nenhuma colônia resistente a espectinomicina encontrava-se sobre as placas de controle nesse momento, embora algumas aparecessem após um outro período de incubação de 48 horas. Duas das colônias resistentes a espectinomicina que resultaram da transformação com a construção knockout de GFOR foram selecionadas para manipulação adicional conforme descrito abaixo.

Experimentos anteriores com Z. mobilis e construções suicidas que são simialres a pGFORSp-9WW revelaram que a interação inicial entre o cromossomo e o DNA de plasmídeo é um evento de cruzamento único em um dos dois locais alvo e que eventos de cruzamento único eventualmente geram eventos de cruzamento duplo. A transição do evento de cruzamento duplo normalmente ocorre muito rapidamente após algumas transferências em série em meio líquido que contém o agente seletivo para a construção suicida. Para facilitar o evento de cruzamento duplo para os dois transformadores ZW1 selecionados que resultaram da construção knockout de GFOR, as células foram inoculadas em 10 ml de meios RM (10 g/l de extrato de levedura e 2 g/l de KH2PO4) que continha 100 g/l de glicose e 200 pg/ml de espectinomicina. Os dois cultivos atingiram fase estacionária após um período de incubação de 24 horas a 30 °C. Em seguida, parcelas de 10 μΙ dos cultivos de primeira passagem foram utilizadas para inocular 10 ml do mesmo meio de cultivo e estes dois cultivos também atingiram fase estacionária após 24 horas a 30 °C. Por fim, parcelas de 10 μΙ dos cultivos de segunda passagem foram inoculadas em 10 ml do mesmo meio de cultivo e permitiu-se a efetivação do crescimento por mais 24 horas a 30 °C. Após a última transferência em meio líquido, parcelas dos cultivos de terceira passagem foram diluídas e colocadas em placas sobre meio MMG que continha espectinomicina (200 μg/ml) para obter colônias isoladas e as placas foram incubadas a 30 0C por 48 horas sob condições anaeróbicas.

A confirmação de que o evento cruzado duplo realmente ocorreu foi obtida por meio de experimentos de PCR de colônia utilizando três pares diferentes de primers. O primeiro par de primers de PCR somente pode gerar um fragmento de DNA com o tamanho correto caso o DNA lateral de 5' GFOR na construção suicida tenha passado por um evento de cruzamento único com o seu parceiro cromossômico. De forma similar, o segundo par de primers de PCR somente pode gerar um fragmento de DNA com o tamanho correto caso o DNA lateral de 3' GFOR na construção suicida tenha passado por um evento de cruzamento isolado com o seu parceiro cromossômico. Por fim, o terceiro par de primers de PCR somente pode gerar um fragmento de DNA com o tamanho correto caso tenha ocorrido um evento de cruzamento duplo e, além disso, seja eliminada a possibilidade de uma população misturada de eventos de cruzamento único e duplo. As duas colônias resistentes a espectinomicina que foram utilizadas para esta análise foram derivadas de dois transformadores primários diferentes da reação de eletroporação de ZW1 com a construção suicida que foram transferidos três vezes em meio líquido e colocados em placas para a obtenção de colônias isoladas conforme descrito acima e o controle para este experimento foi a linhagem parental, ZW1. Como os dois transformadores geraram resultados positivos com os três conjuntos diferentes de primers de PCR1 apenas um deles foi selecionado para análise adicional. Esta linhagem (o mutante knockout ZW1 GFOR) é denominada abaixo ZW1- AGFOR.

Exemplo 6

Glicose-Frutose Oxidorreductase Pode Ser um Colaborador Importante para a Formação de Xilitol sob Condições Fisiológicas

O mutante knockout ZW1 GFOR (ZW1-AGFOR) foi utilizado para testar a hipótese de que a formação de xilitol em linhagens recombinantes que utilizam xilose de Z. mobilis é ao menos parcialmente mediada pela enzima periplasmática GFOR ou o seu precursor citosólico com peso molecular maior que também é enzimaticamente ativo (Loos et al, acima). Conforme exibido no Exemplo 2 (Figura 11), xilitol é um subproduto importante de linhagens que utilizam xilose 8b e ZW658, mas somente é formado quando xilose está presente no meio de crescimento. Embora linhagens do tipo selvagem de Z. mobilis, como CP4, possuam uma aldose reductase dependente de NADPH que pode reduzir diretamente xilose em xilitol (Feldmann et al, acima), é concebível que GFOR possa também contribuir com a formação de xilitol in vivo quando o meio de crescimento contiver xilose ou uma mistura de glicose e xilose conforme ilustrado nos Diagramas Il e III. Para que qualquer dessas reações ocorra, entretanto, a enzima necessitaria ter acesso a xilulose, pois este composto é o receptor de elétrons obrigatório para a produção de xilitol mediada por GFOR conforme exibido em testes de caracterização de enzima GFOR in vitro (Zachariou e Scopes1 acima). Em linhagens de Z. mobilis que são elaboradas para crescimento sobre xilose, a xilulose que seria necessária para síntese de xilitol seria gerada por xilose isomerase, que catalisa a primeira etapa de metabolismo de xilose (Figura 1) e é ausente em linhagens do tipo selvagem, tais como ZW1.

Para testar a possibilidade de geração de xilitol por GFOR quando xilose e glicose estiverem ambas presentes no meio de crescimento, o vetor de expressão de xilose isomerase de E. coli (pZB188/Kan-XylA) que foi descrito no Exemplo 4 foi introduzido em ZW1 e ZW1-AGFOR. A estratégia foi o fornecimento de um processo de xilose em xilulose em duas linhagens que não podem crescer sobre nenhum desses açúcares e determinação se GFOR poderá gerar xilitol. O procedimento de eletroporação que foi utilizado para transformação foi essencialmente conforme descrito no Exemplo 5 mas, após o período de recuperação, as células transformadas foram colocadas em placas sobre meio MMG que continha 300 pg/ml de canamicina. Como controles para este experimento, ZW1 e ZW1-AGFOR também foram transformados com pZB188/Kan (Figura 13), que é idêntico a pZB188/Kan-XylA, mas não contém o conjunto de expressão de xilose isomerase de E. coli. Colônias resistentes a canamicina que abrigam o pZB188/Kan-XylA ou o plasmídeo controle foram identificadas por meio de PCR de colônia e uma colônia representativa de cada reação de transformação foi selecionada aleatoriamente para o experimento que é exibido na Figura 14. Estas quatro linhagens portadoras de plasmídeos são denominadas abaixo ZW1 (pZB188/Kan), ZW1 (pZB188/Kan-XylA), ZW1- AGFOR (pZB188/Kan) e ZW1-AGFOR (pZB188/Kan-XylA). Cultivos por uma noite cresceram em tubos de ensaio tampados

de 15 ml a 30 0C em 5 ml de 60 g/l de glicose, 10 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de KH2PO4, 2 g/l de (NH4)2SO4l 1 g/l de MgSO2 (7 H2O) e 300 pg/ml de canamicina. Parcelas desses cultivos por uma noite foram utilizadas em seguida para inocular cultivos de 20 ml (em tubos de ensaio tampados de 50 ml) que continham o mesmo meio de crescimento, com ou sem 20 g/l de xilose. O crescimento ocorreu a 30 0C com suave agitação e valores OD6oo iniciais foram de cerca de 0,1. Após 0, 24, 48 e 120 horas de crescimento, parcelas de 1,0 ml dos cultivos foram removidas para análise de HPLC utilizando um HP 1100 equipado com um detector de índice de refração (Hewlett-Packard, Palo Alto CA) para determinar as concentrações de xilose, xilulose e xilitol que estavam presentes no caldo de fermentação. Antes da análise de HPLC, as células foram removidas por meio de centrifugação e o sobrenadante foi filtrado através de um filtro de tubo centrífugo Spin-X de 0,22 Mm de acetato de celulose (Costar, catálogo n° 8160) para remover partículas pequenas. Os compostos foram separados sobre uma coluna Aminex HPX-87H (Bio-Rad) que foi conduzida a 55 0C sob condições isocráticas utilizando uma velocidade de fluxo de 0,6 ml/min e 0,01 N de H2SO4 como a fase móvel. Padrões autênticos com concentração conhecida foram utilizados para quantificar os picos de interesse e todos os resultados são expressos em g/l.

Os resultados demonstram que, quando ZW1 (pZB188/Kan), a linhagem de controle com o vetor "vazio", foi cultivado na presença de glicose e xilose, apenas uma pequena quantidade de xilitol acumulou-se no meio de crescimento após um período de incubação de 120 horas (Figura 14A). A quantidade máxima de xilitol que foi observada com esta linhagem foi de <0,5 g/l. Por outro lado, nenhum xilitol foi formado quando ZW1 (pZB188/Kan) foi cultivado na mesma concentração de glicose mas xilose foi omitida e isso foi verdadeiro também para as outras três linhagens. Consequentemente, somente os experimentos que foram realizados na presença de glicose e xilose são exibidos na Figura 14. Notadamente, a expressão de xilose isomerase de E. coli em ZW1 aumentou grandemente a quantidade de xilitol que apareceu no caldo de fermentação e, após 120 horas, ZW1 (pZB188/Kan-XylA) havia gerado cinco vezes mais este composto que ZW1 (pZB188/Kan) (Figura 14B). Conforme antecipado, a expressão de xilose isomerase em ZW1 também resultou na produção de xilulose, pois xilose isomerase catalisa a isomerização de xilose em xilulose. Observe-se que, neste experimento, cerca de 16% da xilose total que foi adicionada ao meio de crescimento foram convertidos em xilulose ou xilitol. Também se observa que existe um relacionamento de produto e precursor aparente entre estes dois compostos (xilulose caiu à medida que xilitol aumentou), consistente com a hipótese de que GFOR é capaz de converter xilulose em xilitol sob condições fisiológicas quando glicose e xilose estiverem ambos presentes no meio de crescimento.

De forma similar a ZW1, muito pouco xilitol foi gerado por ZW1- AGFOR na ausência do vetor de expressão de xilose isomerase (Figura 14C). A pequena quantidade de xilitol que foi formada sob estas condições pode vir de uma aldose reductase dependente de NADPH, conforme sugerido por Feldmann et al (1992, acima). Surpreendentemente, quando xilose isomerase foi expressa no mutante knockout de ZW1 GFOR, nenhum xilitol adicional foi gerado (Figura 14D), ao contrário dos resultados que foram obtidos com ZW1 (pZB188/Kan-XylA). Ao contrário, ZW1-AGFOR (pZB188/Kan-XylA) produziu quantidades massivas de xilulose e a quantidade deste composto que foi formada era muito similar à quantidade total de xilulose e xilitol que foi gerada pela linhagem ZW1 correspondente (ou seja ZW1 pZB188/Kan-XylA)). Estes experimentos demonstram claramente que GFOR pode contribuir substancialmente para a formação de xilitol in vivo quando a enzima possuir acesso a xilulose, o que certamente é o caso de linhagens recombinantes de Z. mobilis que utilizam xilose e são cultivadas em misturas de glicose e xilose. Estes resultados indicam adicionalmente que aldose reductases dependentes de NADPH desempenham um papel menor na produção de xilitol quando linhagens recombinantes de Z. mobilis são cultivadas em meios que contêm xilose, ao contrário das expectativas da literatura (Feldmann et al, acima; Kim et al, acima).

Exemplo 7

Geração do Mutante Knockout GFOR ZW658 ε Demonstração que Esta Linhagem Não Produz uma Enzima GFOR Funcional

O gene que codifica GFOR, que pode contribuir com a formação de xilitol em Z. mobilis sob condições fisiológicas quando glicose e xilulose forem ambos disponíveis conforme exibido no Exemplo 6, foi desativado por meio de inserção em ZW658 utilizando a construção suicida, pGFORSp-9WW (descrita no Exemplo 3). Todas as etapas deste procedimento foram idênticas às descritas para o mutante knockout ZW1 GFOR no Exemplo 5, incluindo a confirmação do evento de cruzamento duplo com os três conjuntos de primers de PCR. O mutante knockout ZW658 que foi selecionado para o experimento subsequente descrito abaixo foi denominado ZW800. Para demonstrar que ZW800 não produz uma enzima que pode

gerar sorbitol a partir de glicose e frutose, que é a reação fisiológica que é catalisada por GFOR, foi realizado o experimento a seguir. Cultivos de 1,5 ml de ZW800 e a linhagem parental ZW658 foram cultivados até a fase estacionária inicial em tubos de ensaio de 10 ml tampados a 30 0C em meio líquido que continha 75 g/l de glicose, 25 g/l de xilose, 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4 e 1 g/l de MgSO4. Quando os cultivos atingiram ODeoo de cerca de 5,5, as células foram colhidas por meio de centrifugação e o sobrenadante foi cuidadosamente removido e descartado. Em seguida, as pelotas celulares foram novamente suspensas em 5 ml de meio de cultivo novo que possuía a composição a seguir: 110 g/l de glicose, 110 g/l de frutose, 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4 e 4 g/l de KHCO3. Todas as etapas acima foram realizadas sob condições estéreis e o pH inicial do meio de cultivo foi ajustado em 5,8 com ácido fosfórico concentrado antes 10

da nova suspensão das células. Os cultivos resultantes cresceram em seguida a 30 0C com suave agitação (150 rpm) e nos momentos indicados na Tabela 2, as amostras foram removidas para análise de HPLC do caldo de fermentação utilizando o mesmo procedimento que foi descrito no Exemplo 6. Os picos de interesse para este experimento foram glicose, frutose, sorbitol e etanol e os padrões autênticos de quantidade conhecida foram utilizados para calcular as suas concentrações no caldo de fermentação após a remoção das células por meio de centrifugação; todas as concentrações são expressas em g/l na Tabela 2.

Tabela 2

Produção de Sorbitol em ZW658 e ZW800 - Medições in Vivo

Linhagem

ZW658

Hora

Glicose

110

Frutose

110

Sorbitol

Etanol

ZW658

23

5,99

61,43

45,99

49,36

ZW658

47

ZW800

1,55 110

21,98

45,89

69,04

110

ZW800

23

60,44

73,85

ZW800

47

6,79

10,21

96,21

Conforme exibido na Tabela 2, o cultivo de ZW658 consumiu quase toda a glicose e cerca da metade da frutose após 23 horas e gerou quantidades comparáveis de sorbitol e etanol como produtos importantes; os valores para os dois últimos compostos durante o primeiro momento foram de 45,99 g/l e 49,36 g/l, respectivamente. Desta forma, mais de 40% da frutose original foram convertidos em sorbitol por GFOR no cultivo de ZW658. Em contraste surpreendente, nenhum sorbitol foi detectado no caldo de fermentação do cultivo de ZW800 após um período de incubação de 23 horas e, no seu lugar, a glicose e a frutose foram convertidas quase quantitativamente em etanol, o que estava muito próximo do seu valor teórico de 0,51 gramas de etanol por grama de açúcar consumido. Observe-se que não houve aumento adicional da quantidade de sorbitol no cultivo de ZW658 após mais 24 horas de crescimento. Isso era esperado, pois quase toda a glicose foi esgotada anteriormente e não houve doador de elétrons para a reação de GFOR com frutose. De forma interessante, uma pequena quantidade de sorbitol (10,21 g/l) foi encontrada no caldo de fermentação do cultivo de ZW800 após 47 horas e isso pode haver sido gerado por uma aldose reductase dependente de NADPH (Feldmann et al, acima) ou alguma outra enzima que permanece sem ser elucidada. Entretanto, os resultados acima fornecem evidência que o conjunto Specr que foi inserido no meio do quadro de leitura aberta GFOR de ZW800 aboliu em grande parte, se não inteiramente, a atividade enzimática de GFOR.

Suporte adicional para esta conclusão vem de experimentos in vitro com extratos livres de células que foram preparados a partir de ZW1, ZW658 e ZW800. O objetivo foi de determinar se ZW658 pode converter xilose em xilitol na ausência de outros cofatores ou substratos adicionados e observar se ZW800 perdeu a capacidade de condução desta reação como resultado da desativação de GFOR. Existem três exigências para a produção de xilitol mediada por GFOR com extratos livres de células de Z. mobilis: 1) um doador de elétrons de açúcar como glicose ou xilose que é capaz de reduzir o cofator unido firmemente de GFOR; 2) xilulose como um aceitador de elétrons, pois ele é o composto que a enzima realmente reduz em xilitol; e 3) uma enzima GFOR funcional. Caso xilulose não seja adicionada à mistura de reação, o extrato livre de células deve também conter xilose isomerase para conversão de xilose em xilulose.

Extratos livres de células foram preparados com cultivos de 100 ml que cresceram a 33 0C em frascos de agitação de 250 ml que continham 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4 e 50 g/l de glicose. As células foram colhidas por meio de centrifugação em Οϋβοο de 2 a 3 e foram lavadas por duas vezes com 50 mM de Tris-HCI resfriado com gelo (pH 7,0), 1,0 mM de MgCb e 1 mM de ditiotreitol. As pelotas finais foram novamente suspensas em 1,0 ml do mesmo tampão e as células foram rompidas por meio de sonicação. Após a remoção dos fragmentos celulares por meio de centrifugação a 4 0C (16.000 χ g, 60 min), os extratos livres de células foram imediatametne testados imediatamente para determinar a produção de xilitol conforme descrito abaixo. As reações de 500 μΙ foram conduzidas em tubos de microcentrifugação de polipropileno e continham concentrações finais dos componentes a seguir: 50 mM de Tris-HCI (pH 7,0), 1,0 mM de MgCh, 1 mM de ditiotreitol, 66 mM de xilose e 0,32 a 0,35 mg de proteína de extrato livre de células; as concentrações de proteínas foram determinadas por meio do Teste de Proteína BCA (Pierce) utilizando albumina de soro como padrão. Após um período de incubação de quinze horas a 40 °C, as reações foram encerradas com uma concentração final de 30 mM de ácido piválico e parcelas foram analisadas por meio de HPLC utilizando uma coluna SH1011 (Showdex) com 0,01 N de ácido sulfúrico como a fase móvel. A temperatura da coluna foi mantida a 50 °c e a velocidade de fluxo foi de 1,0 ml/min. O controle para este experimento não recebeu extrato livre de células, mas no restante foi tratado de forma idêntica.

Conforme exibido na Tabela 3, ao adicionar-se o extrato livre de células ZW1 à mistura de reação, xilose não foi convertida em xilulose ou xilitol durante o período de incubação de quinze horas. Conforme já observado, esperava-se este resultado pois ZW1 é uma linhagem do tipo selvagem que não expressa xilose isomerase de E. coli, ao contrário de ZW658 e ZW800. Por outro lado, quantidades significativas de xilulose e xilitol foram geradas ao utilizar-se o extrato livre de células ZW658, pois ele continha as duas enzimas que são necessárias para a formação destes dois compostos. Observe-se que, neste caso, cerca de 8% dos 66 mM de xilose originais foram utilizados para a produção de xilitol, pois duas moléculas de xilose são consumidas para cada molécula de xilitol que é gerada quando xilose é o único substrato de GFOR que é adicionado à mistura de reação. Por fim, e mais importante, o extrato livre de células ZW800 somente foi capaz de converter xilose em xilulose pois, embora possuísse atividade de xilose isomerase, ele não possuía atividade de enzima GFOR. Estes resultados fornecem evidências adicionais que ZW800 não produz uma enzima GFOR funcional e demonstram ainda que esta proteína é capaz de utilizar xilose como um doador de elétrons para reduzir xilulose em xilitol, conforme exibido anteriormente com extratos livres de células do tipo selvagem que foram cravejados com xilose isomerase purificada (Danielson, acima).

Tabela 3

Produção Mediada por GFOR de Xilitol a Partir de Xilose também

Necessita de Xilulose - Medições in vitro

Extrato livre de células Xilulose (mM) Xilitol (mM) Nenhum 0 0 ZW1 O 0 ZW658 9,45 2,6 ZW800 10,63 0

Exemplo 8

Sorbitol é Necessário para o Crescimento de ZW800 em Misturas Concentradas de Glicose ε Xilose

Foi testado o desempenho de fermentação para a produção de

etanol por ZW800 em uma mistura concentrada de glicose e xilose. Os experimentos foram conduzidos em fermentadores com pH controlado utilizando uma razão fixa entre glicose e xilose de cerca de 5:4 a 97 g/l ou 188 g/l de açúcar total.

Cultivos de sementes de ZW658 e ZW800 cresceram em frascos de agitação a 37 0C em meio líquido que continha 75 g/l de glicose, 25 g/l de xilose, 10 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de KH2PO4, 2 g/l de (NH4)2SO4 e 1 g/l de MgSO4; o pH inicial foi ajustado em 5,5 com 4 N KOH. Quando OD6oo atingiu cerca de 5,0, foram utilizadas parcelas de 50 ml dos cultivos de sementes para inocular fermentadores de um litro (sistema B-DCU da BIOSTAT®, Sartorius BBI System Inc., Bethlehem1 Pensilvânia, Estados Unidos) que continham 450 ml de meio de cultivo. Os cultivos de 500 ml finais continham 5 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 2 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l de MgSO4 e uma baixa concentração de açúcar (54 g/l de glicose e 43 g/l de xilose) ou uma alta concentração de açúcar (104 g/l de glicose e 84 g/l de xilose). O cultivo deu-se a 33 0C e o pH foi mantido em 5,5 por meio de adição automática de 4N KOH. A velocidade de mistura foi definida em 150 rpm. Em vários momentos, foram removidas parcelas para análise de HPLC do caldo de fermentação utilizando o mesmo procedimento e condições que foram descritos no Exemplo 6. Os compostos de interesse para este experimento foram glicose, xilose e etanol e foram utilziados padrões autênticos com concentração conhecida para quantificar os picos dos cromatogramas. O crescimento celular foi também monitorado seguindo-se as alterações da turvação com um espectrofotômetro que foi definido em uma densidade ótica de 600 nm e os valores OD6oo resultantes foram plotados.

Conforme exibido na Figura 15, a desativação d e GFOR não apresentou efeito sobre o crescimento, consumo de açúcar ou título de etanol quando o fermentador continha uma baixa concentração de açúcar (54 g/l de glicose, 43 g/l de xilose). Foi observada, entretanto, uma grande diferença do desempenho de fermentação quando a concentração total de açúcar aumentou cerca de duas vezes conforme observado na Figura 16. ZW658 experimentou um período de atraso de cerca de trinta horas, o que é típico para linhagens recombinantes que utilizam xilose de Z. mobilis quando são alteradas de uma mistura diluída de glicose e xilose para uma mistura concentrada dos mesmos açúcares que excede cerca de 180 g/l de açúcar total. Após o período de demora, as células começaram a crescer e consumiram toda a glicose no meio e cerca de 75% da xilose, de forma a resultar em um título final de etanol de cerca de 73 g/l (Figura 16A). Por outro lado, o cultivo de ZW800 não se recuperou do período de demora mesmo após um período de incubação de 130 horas (Figura 16B) e este resultado foi obtido em duas ocasiões separadas.

Como ZW800 cresceu bem na mistura diluída de glicose e xilose conforme exibido na Figura 15, pareceu possível que a incapacidade desta linhagem de recuperar-se na mistura com alto teor de açúcar apresentasse alguma relação com tensão osmótica. De fato, GFOR desempenha um papel fundamental na manutenção do equilíbrio osmótico por meio da geração de sorbitol quando Z. mobilis do tipo selvagem é transferido para misturas concentradas de glicose e frutose ou altas concentrações de sacarose, o que também gera glicose e frutose por meio da ação de invertase (Loos et al, acima). O sorbitol que é produzido por GFOR no espaço periplasmático é transportado para células contra um gradiente de concentração onde é acumulado até altos níveis, pois ele não é adicionalmente metabolizado. Isso elimina a diferença de pressão osmótica ao longo da membrana de plasma e restaura o equilíbrio osmótico (Wiegert et al, acima). Um requisito prévio da produção de sorbitol mediada por GFOR, entretanto, é a presença simultânea de glicose e frutose e esta reação não deverá ocorrer em meios de crescimento que não contenham frutose. Entretanto, como sorbitol é o produto fisiologicamente importante de GFOR e esta enzima é inativa em ZW800, o efeito da adição de sorbitol à mistura concentrada de glicose e xilose foi testado no experimento descrito abaixo.

Após cerca de setenta horas na mistura com alto teor de açúcar (momento designado pela seta vertical da Figura 16), cinco parcelas de 4,5 ml do cultivo de ZW800 suspenso foram removidas do fermentador e transferidas para tubos de ensaio de 15 ml tampados. Quatro dos tubos foram suplementados em seguida com 0 a 20 mM de sorbitol (concentração final) e o volume total dos cultivos foi ajustado em 5,0 ml com água deionizada em todos os casos; a solução padrão de sorbitol que foi utilizada para este experimento também foi composta em água. Para controlar a diluição a 10% do meio de cultivo ao adicionar-se a água e sorbitol, nada foi adicionado ao quinto cultivo. Todos os cultivos foram incubados em seguida a 33 0C com suave agitação (200 rpm) e o crescimento foi monitorado espectrofotometricamente. As células começaram a crescer quase imediatamente ao adicionar-se sorbitol ao meio de cultivo conforme exibido na Figura 17, mesmo com a mais baixa concentração testada (5 mM). Algum estímulo de crescimento também foi observado quando sorbitol não era adicionado, mas o cultivo foi diluído a 10% com água, o que reduziu a concentração total de açúcar de 188 g/l para 169 g/l. O efeito estimulante de sorbitol sobre o crescimento, entretanto, era muito maior que o efeito de diluição.

O resgate de crescimento de ZW800 por sorbitol era completamente inesperado, pois ZW658 recuperou-se do período de demora e cresceu bem na mistura concentrada de glicose e xilose, sem uma fonte conhecida de frutose. Como este último composto é um receptor de elétrons obrigatório para a produção de sorbitol mediada por GFOR, não era evidente que GFOR pudesse sintetizar sorbitol ou desempenhar um papel no equilíbrio osmótico em meios que contêm altas concentrações de glicose e xilose. Desta forma, não havia indicação que sorbitol pudesse ser um fator importante para o crescimento de ZW658 ou ZW800 em misturas concentradas de glicose e xilose.

Exemplo 9

Desativação de GFOR Aumenta a Produção de Etanol a Partir de Xilose Sob Condições Relevantes de Processo

Os desempenhos de fermentação de ZW658 e ZW800 em misturas concentradas de glicose e xilose sob condições relevantes de processo foram comparados lado a lado para determinar se a desativação de GFOR é uma estratégia de elaboração metabólica benéfica ou prejudicial. Como altas concentrações de glicose e xilose foram utilizadas nestes experimentos, adicionou-se sorbitol ao meio para permitir o crescimento de ZW800. Em expderimentos que não são descritos no presente, também se descobriu que sorbitol elimina o período de demora para ZW658. Desta forma, suplementação de sorbitol ao meio de crescimento fornece uma forma ideal de comparação destas duas linhagens sob condições relevantes de processo.

ZW658 e ZW800 foram comparados sob seis condições diferentes utilizando duas concentrações de açúcares totais, na presença e na ausência de acetato e, para a mistura de açúcar mais concentrada, foram examinadas duas capacidades de tamponamento diferentes. Estes experimentos foram conduzidos com cultivos de 20 ml que cresceram a 30 0C em tubos de ensaio de 50 ml com suave agitação (150 rpm). O pH não foi controlado, mas o pH inicial do meio de crescimento foi ajustado em 5,8 com ácido fosfórico concentrado antes da inoculação com o cultivo de semente. O meio de crescimento básico continha 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4, 5 mM de sorbitol e 4 g/l (Figuras 18 e 19) ou 8 g/l (Figura 20) de KHCO3. Todos os valores fornecidos acima e abaixo são concentrações finais após a adição do cultivo de semente. O KHCO3 foi utilizado para aumentar a capacidade de tamponamento do meio de crescimento para minimizar a queda de pH que normalmente ocorre durante o crescimento bacteriano. A fonte de carbono para todos estes experimentos foi uma mistura de glicose e xilose que aproximou a razão destes dois açúcares em hidrolisato de forragem de milho previamente tratado em duas concentrações diferentes de açúcar total. As concentrações iniciais de glicose e xilose foram de 92 g/l e 82 g/l, respectivamente (Figura 18) ou 107 g/l e 96 g/l (Figuras 19 e 20). Quando indicado, 6 g/l de acetato (um inibidor que está presente em hidrolisato de forragem de milho previamente tratado) também estavam presentes. O cultivo de sementes cresceu a 30 0C até Οϋβοο de cerca de 5,0 em meios líquidos que continham 75 g/l de glicose, 25 g/l de xilose, 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4 e um décimo do volume foi utilizado para inocular os cultivos experimentais. Em vários momentos, foram removidas parcelas para análise de HPLC do caldo de fermentação conforme descrito anteriormente no Exemplo 6. Os compostos de interesse para este experimento foram glicose, xilose, etanol e xilitol e todos os valores são relatados em g/l. Como virtualmente toda a glicose foi consumida antes da tomada dos primeiros momentos, os valores para este açúcar não foram plotados nos gráficos.

A partir dos experimentos que são exibidos nas Figuras 18 a 20, fica claro que ZW800 apresentou melhor desempenho que ZW658 sob todas as condições testadas conforme julgado por meio de dois critérios diferentes: (a) a quantidade total de xilose que foi consumida no transcurso do experimento; e (b) o título máximo de etanol que foi atingido. Também é evidente a partir destes dados que os efeitos benéficos de desativação de GFOR ocorreram em grande parte durante a última etapa de fermentação, quando foram encontradas as condições mais estressantes (ou seja, depois que toda a glicose foi esgotada e a concentração de etanol começou a aproximar-se de níveis tóxicos). De fato, as diferenças mais surpreendentes entre as duas linhagens foram observadas quando uma concentração inibidora de acetato estava presente no meio de crescimento, o que constitui uma tensão adicional. O aumento médio do título de etanol para ZW800 na presença de acetato para os três conjuntos de condições experimentais foi de 10,2% com valores que variam de 4,4% a 13,7%. ZW800 também produziu mais etanol que ZW658 na ausência de acetato em todos os três experimentos, em que o aumento médio neste caso é de 3,2%. Conforme antecipado, ZW658 converteu quantidades significativas de xilose no subproduto indesejado xilitol e os níveis mais altos deste composto foram observados quando as condições eram as de maior tensão (ou seja, durante as últimas etapas de fermentação e com a presença de acetato no meio de crescimento). Nos experimentos com acetato que são exibidos nas Figuras 18 a 20, por exemplo, ZW658 converteu 8,1%, 8,3% e 9,9% do total de xilose que foi consumido em xilitol. Por outro lado, nenhum xilitol foi encontrado nos cultivos de ZW800 sob nenhuma das condições que foram testadas. Estes resultados demonstram claramente que a desativação de GFOR é benéfica para o metabolismo de xilose para a produção de etanol sob condições relevantes de processo, especialmente na presença de concentrações inibidoras de acetato. Os experimentos em tubos de ensaio que são exibidos nas Figuras 18 e 19 foram realizados duas vezes e foram obtidos resultados virtualmente idênticos.

Um outro experimento lado a lado com ZW800 e ZW658 em uma mistura concentrada de glicose e xilose com acetato foi realizado utilizando fermentadores com pH controlado. Subprodutos de metabolismo tais como ácidos orgânicos e dióxido de carbono produzidos por Z mobilis podem reduzir o pH do meio de cultivo, o que aumenta a razão entre ácido acético e acetato, e sabe-se que a substância protonada é o composto que realmente inibe o crescimento bacteriano (Kim et al (2000), Applied Biochemistry and Biotechnology, 84-86: 357-370). Desta forma, o controle de pH é muito importante em fermentação em larga escala, pois uma queda de pH de 5,8 para 5,0 resultaria em um aumento de cerca de cinco vezes na concentração de ácido acético.

Cultivos de sementes para ZW800 e ZW658 cresceram em frascos com agitação a 37 0C em meio líquido que continha 75 g/l de glicose, g/l de xilose, 10 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de KH2PO4, 2 g/l de (NH4)2SO4 e 1 g/l de MgSO4; o pH inicial foi ajustado em 5,5 com 4 N KOH. Quando Οϋβοο atingiu cerca de 5,0, parcelas de 50 ml dos cultivos de sementes foram utilizadas para inocular fermentadores de um litro (sistema B-DCU da BIOSTAT®, Sartorius BBI System Inc., Bethlehem, Pensilvânia, Estados Unidos) que continham 450 ml de meio de cultivo. Os cultivos finais de 500 ml continham 92 g/l de glicose, 97 g/l de xilose, 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 10 mM de sorbitol e 7,2 g/l de acetato. O crescimento deu-se a 33 0C e o pH foi mantido em 5,5 por meio da adição automática de 4 N KOH; a velocidade de mistura foi de 150 rpm. Em vários momentos, foram removidas parcelas para análise de HPLC do caldo de fermentação utilizando o mesmo procedimento que é descrito no Exemplo 6. Os compostos de interesse para este experimento foram glicose, xilose, etanol e xilitol e o crescimento celular (ODeoo) também foi monitorado. A Figura 21 exibe o transcurso total desses parâmetros para o fermentador conduzido com o cultivo ZW800 e a Tabela 4 resume valores finais para xilose, etanol e xililol para as duas linhagens.

Tabela 4

Valores Finais para Xilose. Etanol ε Xilitol em Fermentadores com pH

Controlado com ZW800 ε ZW658

zw658 zw800 Etanol (g/l) 65,95 72,31 Xilose consumida (g/l) 60,71 69,14 zw658 zw800 Xilitol (g/l) 3,92 0 Rendimento de etanol (g de etanol/g de açúcar) 0,43 0,45

De forma similar aos resultados de tubos de ensaio com acetato

(Figuras 18 a 20), ZW800 consumiu 14% mais xilose e gerou 9,6% mais etanol que ZW658 nos fermentadores com pH controlado (Figura 21). O rendimento de etanol para ZW800 também foi cerca de 5% mais alto, pois esta linhagem não produziu nenhum xilitol detectável. Por outro lado, a concentração final de xilitol em caldo de fermentação para ZW658 foi de 3,92 g/l, o que representa cerca de 6,5% do total de xilose que foi consumido no transcurso do experimento. Estes experimentos fornecem evidências adicionais que a desativação de GFOR aumenta a produção de etanol a partir de xilose por meio da eliminação da formação de xilitol. Conforme já observado, o subproduto indesejado xilitol interfere com o metabolismo de xilose em pelo menos duas formas diferentes e inibe o crescimento bacteriano, o que resulta em níveis mais baixos de ATP. Desta forma, quando GFOR gera xilitol, ele reduz a capacidade de Z. mobilis de atingir todas as demais tensões de consumo de energia que normalmente encontra durante a produção de etanol a partir de estoques de alimentação de lignocelulose. Como ZW800 não necessita competir com tensões relativas a xilitol ao contrário de ZW658, ele consome mais xilose, produz mais ATP e gera mais etanol durante a última etapa de fermentação quando é encontrado o nível de tensão mais alto. exemplo 10

remoção do marcador selecionável de zw800 e caracterização da

linhagem resultante. zw801-4 geração da construção de expressão de cre, pzb188-kan/cre

Conforme descrito no Exemplo 3, o conjunto Specr que foi inserido no quadro de leitura aberta GFOR em ZW800 é colocado em sanduíche entre dois locais IoxP do tipo selvagem. Esta disposição possibilita a remoção do marcador selecionável do cromossomo utilizando Cre Recombinase (Sternberg e Hamilton (1981), J. Mol. Biol. 150: 467-486; Lee e Saito1 acima; Trinh et al (2000), Journal of Immunological Methods 244 (2): 185-193). A fim de fazê-lo, entretanto, foi necessário em primeiro lugar gerar um vetor de Expressão de Cre que pode reproduzir-se em Z mobilis (Fig. 22). O precursor do vetor de Expressão de Cre foi pZB188/Kan, que foi descrito em detalhes no Exemplo 4. Resumidamente, pZB188/Kan é um vetor impulsionador que pode reproduzir-se em E. coli e Z mobilis porque possui uma origem de reprodução para as duas espécies bacterianas. Ela também contém um fragmento de DNA que confere resistência a canamicina (ou seja, um conjunto Kanr). pZB188/Kan sofreu digestão dupla com Ncol e Notl e o fragmento de vetor grande foi purificado por meio de eletroforese de gel de agarose. A etapa seguinte foi a geração de um conjunto de expressão de Cre e isso foi obtido por meio de PCR, utilizando os primers 17 e 18. O modelo de DNA que foi utilizado para amplificação do conjunto de expressão de Cre foi um plasmídeo que continha o gene de comprimento total para o bacteriófago Pl Cre Recombinase, incluindo o seu promotor (Sternberg et al (1986), J. Mol. Biol. 187 (2): 197-212)). Primer 17 (SEQ ID N0 35):

CTACTCATccatqqCATCTTGAGCTTGAGAAAAACC Primer 18 (SEQ ID N0 36):

CATCTTACTqcqqccqcTTATGGCTAATCGCCATCTTC As bases sublinhadas do Primer 17 (primer frontal) hibridizam-se em NT 286-307 da seqüência de acesso GenBank n° X03453, que se encontra a cerca de 200 bp acima no fluxo a partir do códon de início de Cre, enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Ncol que foi adicionado à extremidade 5' do primer. As bases sublinhadas do Primer 18 (primer reverso) unem-se na outra extremidade do quadro de leitura aberta de Cre a nt 1523- 1503 da seqüência de acesso Genbank n° X03453, enquanto as letras minúsculas indicam um local Notl que foi adicionado à extremidade 5' desse primer. O produto de PCR de 1238 bp sofreu digestão dupla com Ncol e Notl e o fragmento de DNA resultante, que contém o quadro de leitura aberta completa para Cre Recombinase e seus supostos promotores (Sternberg et al, 1986, acima), foi purificado por meio de eletroforese de gel de agarose. O conjunto de expressão de Cre foi inserido em seguida entre os locais Ncol e Notl do fragmento de DNA pZB188/Kan que foi descrito acima em uma reação de ligação padrão. Uma parcela da mistura de reação de ligação sofreu eletroporação em E. coli DH10B e as células transformadas foram colocadas em placas sobre meios LB que continham canamicina (50 pg/ml); o crescimento deu-se a 37 °C. DNA de plasmídeo foi isolado de um dos transformadores resistentes a canamicina e esta preparação foi introduzida em seguida em E. coli JM110 (dcm", dam") para obter DNA de plasmídeo não metilado para transformação subsequente de Z mobilis (vide abaixo). Um mapa de plasmídeos do vetor de Expressão de Cre pZB188/Kan-Cre é exibido na Figura 22.

Tratamento de Cre para remover o marcador selecionável do cromossomo de ZW800 e cura do vetor de expressão de Cre:

Cre recombinase de bacteriófago P1 (Cre) é capaz de reconhecer uma seqüência de DNA de 34 bp específica, um "local IoxP", que contém duas repetições invertidas de 13 bp que ladeiam um núcleo assimétrico de 8 bp (Sternberg e Hamilton, 1981, acima; Lee e Saito, acima; Trinh et al, acima). Cre também é capaz de extirpar qualquer fragmento de DNA interveniente que esteja situado entre dois locais IoxP idênticos e a reação de extirpação é muito rápida. Para remover o conjunto Specr do quadro de leitura aberta GFOR, o vetor de Expressão de Cre (pZB188/Kan-Cre) foi introduzido em ZW800. O protocolo de transformação foi essencialmente conforme descrito no Exemplo 5 mas, após o período de recuperação, as células foram colocadas em placas sobre meios MMG que continham 350 mg/ml de canamicina, que é o agente seletivo para o vetor de Expressão de Cre. Os transformadores primários que foram recuperados a partir deste processo não foram mais resistentes a espectinomicina, pois o conjunto Specr que foi removido do cromossomo por Cre é um pedaço circular de DNA que não pode reproduzir-se em Z. mobilis. Após um período de incubação de 48 horas a 30 0C sob condições anaeróbicas, dois dos transformadores primários de KanVSpecs foram submetidos ao processo de cura de plasmídeo Cre. Embora pZB188/Kan-Cre possa reproduzir-se em Z. mobilis, é relativamente fácil curar este plasmídeo por meio do cultivo das células em meio que não contém canamicina. Para curar o vetor de Expressão de Cre na presente invenção, as células foram cultivadas sob temperatura elevada (37 °C) em meios MMG líquidos que não continham canamicina; as células foram transferidas para meios de cultivo novos com a mesma composição a cada 24-36 horas. Após a ocorrência de pelo menos cinqüenta gerações, colônias separadas foram isoladas sobre placas MMG e cinco colônias dos transformadores primários originais foram selecionadas aleatoriamente para caracterização adicional. Conforme antecipado, nenhuma dessas colônias foi capaz de crescer sobre placas MMG que continham canamicina (350 pg/ml) ou espectinomicina (200 Mg/ml). Embora a incapacidade de crescimento sobre canamicina fosse uma boa indicação de que o processo de cura de plasmídeos foi bem sucedido, esta conclusão foi confirmada por meio de PCR de colônia utilizando primers que se hibridizam no conjunto de expressão de Cre. Com base nestes experimentos, três dos derivados de ZW800 curados por plasmídeo e tratados com Cre foram selecionados para caracterização adicional e essas linhagens são denominadas abaixo ZW801-4, ZW801-5 e ZW801-6. Para observar o desempenho dessas linhagens em uma mistura concentrada de glicose e xilose na presença de uma concentração inibidora de acetato, foram realizados experimentos de frascos de agitação. ZW658 e ZW800 foram também incluídos nesta análise. Os cultivos de sementes cresceram a 30 0C até OD6oo de cerca de 3,0 em meios líquidos que continham 75 g/l de glicose, 25 g/l de xilose, 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4 e um inoculado a 10% foi utilizado para os cultivos expderimentais de 15 ml. Estes últimos foram cultivados em tubos de ensaio de 50 ml a 30 0C com suave agitação (150 rpm). O meio de crescimento continha 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4, 5 mM de sorbitol, 40 mM de KHCO3, 95 g/l de glicose, 90 g/l de xilose e 7,7 g/l de acetato; o pH inicial foi ajustado em 5,8 com ácido fosfórico concentrado. Em vários momentos, parcelas dos cultivos foram removidas para análise por HPLC do caldo de fermentação conforme descrito anteriormente no Exemplo 6. Os compostos de interesse para este experimento foram glicose, xilose, etanol e xilitol e todos os valores são relatados em g/l.

Conforme exibido na Tabela 5, ZW658 produziu 66,35 g/l de etanol e deixou para trás 40,6 g/l de xilose residual. ZW658 também produziu 3,19 g/l do subproduto indesejado xilitol, pois ele possui uma enzima GFOR funcional. De forma similar ao observado anteriormente em outros experimentos lado a lado, ZW800 consumiu 17% mais xilose e produziu 6,2% mais etanol que ZW658 e não produziu nenhum xilitol detectável. Embora fossem obtidos resultados levemente melhores com ZW801-4 e ZW801-6, estas diferenças provavelmente encontram-se dentro de erros experimentais e não são estatisticamente significativas. O desempenho relativamente ruim de ZW801-5 que foi observado neste experimento não é compreendido e não foi investigado adicionalmente. Com base nestes resultados, a linhagem ZW801-4 foi selecionada para análise adicional. Tabela 5

Experimentos de Frascos de Agitação com ZW658, ZW800. ZW801-4, ZW801 -5 ε ZW801 -6 em Alto Teor de Açúcar Mais Acetato

Linhagem Horas Glicose Xilose Xilitol Etanol ZW658 0 95,7 89,3 0 3,2 ZW658 15,5 27,75 80,93 0 37,39 ZW658 38 0 42,71 1,85 66,53 ZW658 62 0 40,6 3,19 66,35 ZW800 0 95,7 89,3 0 3,2 ZW800 15,5 30,64 81,36 0 36,05 ZW800 38 0 37,29 0 69,82 ZW800 62 0 32,34 0 70,47 ZW801-4 0 95,7 89,3 0 3,2 ZW801-4 15,5 28,04 80,82 0 37,75 ZW801-4 38 0 36,13 0 70,54 ZW801-4 62 0 30,28 0 71,25 ZW801-5 0 95,7 89,3 0 3,2 ZW801-5 15,5 55,61 85,62 0 21,86 ZW801-5 38 0 46,83 0 64,92 ZW801-5 62 0 39,54 0 66,19 ZW801-6 0 95,7 89,3 0 3,2 ZW801-6 15,5 32,34 82,02 0 34,89 ZW801-6 38 0 36,39 0 70,64 ZW801-6 62 0 29,55 0 71,74

Para confirmar os resultados dos experimentos de frasco de agitação que sugeriram que ZW801-4 apresentou resultados tão bons quanto ZW800, estas duas linhagens foram comparadas sob condições de pH controlado. Os cultivos de semente cresceram a 30 0C em meios que continham 75 g/l de glicose, 25 g/l de xilose, 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4 e 1 g/l de MgSO4. Quando Οϋβοο atingiu cerca de 4,6, parcelas de 17 ml dos cultivos de semente foram utilizadas para inocular os biorreatores com pH controlado que continham 153 ml de meio de cultivo. Os cultivos finais de 170 ml continham 105 g/l de glicose, 100 g/l de xilose, 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4, 5 mM de sorbitol e 7,2 g/l de acetato. O crescimento ocorreu a 33 0C e o pH foi mantido em 5,5 por meio de adição automática de 4 N KOH; a velocidade de mistura foi de cerca de 150 rpm. Em vários momentos, parcelas dos cultivos foram removidas dos biorreatores para análise de HPLC do caldo de fermentação conforme descrito acima e Οϋβοο também foi monitorado. Sob estas condições experimentais, as curvas de crescimento para ZW800 e ZW801-4 puderam ser quase sobrepostas (Fig. 23A). Os períodos de tempo para consumo de glicose e xilose também foram virtualmente idênticos e as duas linhagens produziram a mesma quantidade de etanol com cinética similar (Fig. 23B). Além disso, nenhuma destas linhagens produziu xilitol detectável. Com base nestas observações, concluímos que a remoção do conjunto Specr do quadro de leitura aberta GFOR não restaurou nem restaurou parcialmente a atividade de enzima GFOR e que esta manipulação não prejudicou o desempenho de fermentação. Embora ZW800 e ZW801-4 apresentassem ambos melhor desempenho que a linhagem parental (ZW658), que possui uma enzima GFOR funcional, a linhagem preferida para aplicações comerciais é ZW801-4, pois ela não contém um gene exógeno que confere resistência a um antibiótico. Análise de seqüências de DNA genômico de ZW801-4 forneceu

prova inequívoca que ocorreu o evento de extirpação de Cre correto. A seqüência de nucleotídeos completa da leitura aberta de GFOR rompida em ZW801-4 (do códon de início original até o códon de parada original) é fornecida em SEQ ID N0 37 e a Figura 24 exibe um alinhamento da seqüência mutante traduzida com a proteína GFOR do tipo selvagem; esta última é codificada pelo complemento reverso de nt 683751-685052 do acesso GenBank n° AE008692. Conforme antecipado, a extirpação de Cre do conjunto Specr deixou um único local IoxP do tipo selvagem no meio do quadro de leitura aberta GFOR e este evento de inserção resultou em um códon de parada em quadro que trunca prematuramente a proteína; o local da "cicatriz de lox" é indicado pelos resíduos indicados em cinza. A seqüência de nucleotídeos mutante também não contém cerca de 72 bp da seqüência de nucleotídeos GFOR do tipo selvagem original no mesmo local como resultado do projeto da construção suicida. Listagem de Seqüências

<110> Viitanen, Paul Emptage, Mark Caimi, Perry Li, Xu

McCutchen, Carol

<120> SÍNTESE DE XILITOL MUTANTE DE XILOSE QUE UTILIZA ZIMOMONAS <130> CL3662 <160> 38

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> primer

<4 00> 1

cagtctagag gccgcctagg ccgttcgatc aacaacccga atcc 44

<210> 2

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<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> primer

<4 00> 2

caatttgtcc gtcatgttta ttctcctaac 30

<210> 3

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<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> primer

<4 00> 3

gttaggagaa taaacatgac ggacaaattg 30

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> primer

<4 00> 4

ccagatcgtc tagattacag cagatcgcc

29 <210> 5

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<212> DNA

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cagtctagag gccgcctagg ccgttcgatc aacaacccga atcc

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

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ccagatcgtc tagattacag cagatcgcc

<210> 7 <211> 73 <212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> primer <400> 7

cagggccgcc taggccataa cttcgtatag catacattat acgaagttat cctgtgacgg aagatcactt cgc

<210> 8 <211> 71 <212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> primer <4 00> 8

cagggcctag gcggccataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat cctgaaccga cgaccgggtc g

<210> 9

<211> 6882

<212> DNA

<213> seqüência artificial

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<223> plasmideo pMODPgaptaltktCm <4 00> 9

cggccataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatc ctgaaccgac gaccgggtcg 60 aatttgcttt cgaatttctg ccattcatcc gcttattatc acttattcag gcgtagcacc 120 aggcgtttaa gggcaccaat aactgcctta aaaaaattac gccccgccct gccactcatc 180 gcagtactgt tgtaattcat taagcattct gccgacatgg aagccatcac agacggcatg 240 atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat 300 ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa 360 actcacccag ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt tagggaaata 420 ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa 480 atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt 540 gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa 600 ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg 660 cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata 720 ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat 780 atcaacggtg gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa 840 tctcgataac tcaaaaaata 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<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> plasmideo pMODPgapxylABCm

<400> 12

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<210> 13

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<4 00> 13

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<210> 14

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<210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> seqüência

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<210> 17

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<220>

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<210> 18

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<210> 19

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<210> 25

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<210> 30

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cttcctgttt ttgctcaccc 4200 agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 4260 cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 4320 aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg 4380 gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 4440 agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 4500 aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 4560 gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 4620 ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc 4680 aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 4740 aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc 4800 tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc 4860 agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 4920 ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 4980 ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 5040 ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 5100 acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 5160 agatcctttt

ggtggtttgt

cagagcgcag

gaactctgta

cagtggcgat

gcagcggtcg

caccgaactg

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cgatagttac

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gccacgcttc

ggagagcgca

tttcgccacc

tggaaaaacg

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gcggaagagc

agctggcacg

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cgctaccagc

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tggctgctgc

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tctgacttga

ccagcaacgc

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ccgctcgccg

gcccaatacg

acaggtttcc

ctcattaggc

tgagcggata

gcctgcagg

5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6179

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> seqüência artificial <22 0>

<223> primer

<4 00> 32

gctctagagc agcagattac gcgc

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> primer

<400> 33

acattggcgc gcttagaaaa actcatc

24

27

<210> 34 <211> 2014 <212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> cassete de expressão Ε. coli xylA do pZB4

<400> 34 ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa tcaaaactgg 60 tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac cctttaggga 120 aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga atatatgtgt agaaactgcc 180 ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc tcatggaaaa 240 cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc accgtctttc attgccatac 300 ggaattagcg gccgcgttcg atcaacaacc cgaatcctat cgtaatgatg ttttgcccga 360 tcagcctcaa tcgacaattt tacgcgtttc gatcgaagca gggacgacaa ttggctggga 420 acggtatact ggaataaatg gtcttcgtta tggtattgat gtttttggtg catcggcccc 480 ggcgaatgat ctatatgctc atttcggctt gaccgcagtc ggcatcacga acaaggtgtt 540 ggccgcgatc gccggtaagt cggcacgtta aaaaatagct atggaatata atagctactt 600 aataagttag gagaataaac atgcaagcct attttgacca gctcgatcgc gttcgttatg 660 aaggctcaaa atcctcaaac ccgttagcat tccgtcacta caatcccgac gaactggtgt 720 tgggtaagcg tatggaagag cacttgcgtt ttgccgcctg ctactggcac accttctgct 780 ggaacggggc ggatatgttt ggtgtggggg cgtttaatcg tccgtggcag cagcctggtg 840 aggcactggc gttggcgaag cgtaaagcag atgtcgcatt tgagtttttc cacaagttac 900 atgtgccatt ttattgcttc cacgatgtgg atgtttcccc tgagggcgcg tcgttaaaag 960 agtacatcaa taattttgcg caaatggttg atgtcctggc aggcaagcaa gaagagagcg 1020 gcgtgaagct gctgtgggga acggccaact gctttacaaa ccctcgctac ggcgcgggtg 1080 cggcgacgaa cccagatcct gaagtcttca gctgggcggc aacgcaagtt gttacagcga 1140 tggaagcaac ccataaattg ggcggtgaaa actatgtcct gtggggcggt cgtgaaggtt 1200 acgaaacgct gttaaatacc gacttgcgtc aggagcgtga acaactgggc cgctttatgc 1260 agatggtggt tgagcataaa cataaaatcg gtttccaggg cacgttgctt atcgaaccga 1320 aaccgcaaga accgaccaaa catcaatatg attacgatgc cgcgacggtc tatggcttcc 1380 tgaaacagtt tggtctggaa aaagagatta aactgaacat tgaagctaac cacgcgacgc 1440 tggcaggtca ctctttccat catgaaatag ccaccgccat tgcgcttggc ctgttcggtt 1500 ctgtcgacgc caaccgtggc gatgcgcaac tgggctggga caccgaccag ttcccgaaca 1560 gtgtggaaga gaatgcgctg gtgatgtatg aaattctcaa agcaggcggt ttcaccaccg 1620 gtggtctgaa cttcgatgcc aaagtacgtc gtcaaagtac tgataaatat gatctgtttt 1680 acggtcatat cggcgcgatg gatacgatgg cactggcgct gaaaattgca gcgcgcatga 1740 ttgaagatgg cgagctggat aaacgcatcg cgcagcgtta ttccggctgg aatagcgaat 1800 tgggccagca aatcctgaaa ggccaaatgt cactggcaga tttagccaaa tatgctcagg 1860 aacatcattt gtctccggtg catcagagtg gtcgccagga acaactggaa aatctggtaa 1920 accattatct gttcgacaaa taacggctaa ctgtgcagtc cgttggcccg gttatcggta 1980 gcgataccgg gcattttttt aaggaacgat cgat 2014

<210> 35

<211> 36

<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> primer

<4 00> 35

ctactcatcc atggcatctt gagcttgaga aaaacc

<210> 36

<211> 39

<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> primer

<4 00> 36

catcttactg cggccgctta atggctaatc gccatcttc

<210> 37 <211> 1287 <212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> GFOR que codifica região com inserção e anulação <4 00> 37

atgacgaaca aaatctcgtc ttcagataat ctttccaatg ctgtttcagc aacggatgac aacgcttccc gtacgccaaa tctgacccgt cgcgctctcg ttggtggtgg tgttggactg gccgcagctg gcgccttagc cagtggtctt caggcagcga cgcttcctgc tggtgccagc caggttccga ccacgcctgc aggtcgcccg atgccttacg cgatccgccc gatgccggaa gatcgtcgtt tcggttatgc tatcgtcggt ctgggtaaat atgcccttaa ccagatttta ccgggttttg ccggatgcca gcattcccgc atcgaagctt tggtcagcgg taacgctgaa aaagctaaaa tcgttgccgc tgaatatggc gtcgatcccc gtaaaattta tgattacagc aacttcgaca agatcgctaa agatccaaaa atcgacgctg tttacatcat tttgccaaac

36

39

60 120 180 240 300 360 420 480 tctttgcatg ctgaatttgc tatccgtgct ttcaaagccg gcaagcatgt tatgtgtgaa 540 aagccgatgg caacctctgt tgctgattgt cagcggatga tcgatgcagc caaggctgct 600 aataaaaagc tgatgatcgg ttaccgttgc cactatgatc caatgcaccg tgcagcgatc 660 gcataacttc gtataatgta tgctatacga agttatggta ctcatggccg gcctcagaac 720 gatcctgcac agcagtggcg tctgcgtcgt gaactcgccg gtggcggttc tttgatggat 780 atcggtattt atggcttgaa cggtacccgt tacttgctgg gtgaagaacc gatcgaagtc 840 cgtgcttaca cctacagcga tccgaatgat gaacgtttcg ttgaagtcga agatcgtatt 900 atttggcaga tgcgcttcag aagcggtgct ctgtctcatg gtgcatcttc ttattcgacc 960 acgacgactt cacgtttctc ggtgcagggc gacaaagctg ttctgttgat ggatccggct 1020 accggatatt atcagaattt gatttctgtc cagaccccag gccatgctaa ccagtcgatg 1080 atgccacagt tcatcatgcc agcgaacaac cagttctctg cacagttgga tcatctggct 1140 gaagccgtca tcaataacaa accagttcgt agcccgggtg aagaaggtat gcaggatgtg 1200 cgcctgattc aggccattta tgaagcagct cgtaccggtc gccccgtcaa cacggattgg 1260 ggttatgtcc gtcagggtgg ttattga 1287 <210> 38 <211> 1302 <212> DNA <213> ζ. mobilis <4 00> 38 atgacgaaca aaatctcgtc ttcagataat ctttccaatg ctgtttcagc aacggatgac 60 aacgcttccc gtacgccaaa tctgacccgt cgcgctctcg ttggtggtgg tgttggactg 120 gccgcagctg gcgccttagc cagtggtctt caggcagcga cgcttcctgc tggtgccagc 180 caggttccga ccacgcctgc aggtcgcccg atgccttacg cgatccgccc gatgccggaa 240 gatcgtcgtt tcggttatgc tatcgtcggt ctgggtaaat atgcccttaa ccagatttta 300 ccgggttttg ccggatgcca gcattcccgc atcgaagctt tggtcagcgg taacgctgaa 360 aaagctaaaa tcgttgccgc tgaatatggc gtcgatcccc gtaaaattta tgattacagc 420 aacttcgaca agatcgctaa agatccaaaa atcgacgctg tttacatcat tttgccaaac 480 tctttgcatg ctgaatttgc tatccgtgct ttcaaagccg gcaagcatgt tatgtgtgaa 540 aagccgatgg caacctctgt tgctgattgt cagcggatga tcgatgcagc caaggctgct 600 aataaaaagc tgatgatcgg ttaccgttgc cactatgatc caatgaaccg tgcagcggta 660 aaattgatcc gtgaaaacca gttgggtaaa ctgggcatgg ttaccaccga caactcagac 720 gttatggatc agaacgatcc tgcacagcag tggcgtctgc gtcgtgaact cgccggtggc 780 ggttctttga tggatatcgg tatttatggc ttgaacggta cccgttactt gctgggtgaa 840 gaaccgatcg aagtccgtgc ttacacctac agcgatccga atgatgaacg tttcgttgaa 900 gtcgaagatc gtattatttg gcagatgcgc ttcagaagcg gtgctctgtc tcatggtgca 960 tcttcttatt cgaccacgac gacttcacgt ttctcggtgc agggcgacaa agctgttctg 1020 ttgatggatc cggctaccgg atattatcag aatttgattt ctgtccagac cccaggccat 1080 gctaaccagt cgatgatgcc acagttcatc atgccagcga acaaccagtt ctctgcacag 1140 ttggatcatc tggctgaagc cgtcatcaat aacaaaccag ttcgtagccc gggtgaagaa 1200 ggtatgcagg atgtgcgcct gattcaggcc atttatgaag cagctcgtac cggtcgcccc 1260 gtcaacacgg attggggtta tgtccgtcag ggtggttatt ga 1302

Claims (8)

1. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL, que compreende: a. fornecimento de uma linhagem de Zymomonas recombinante capaz de utilizar xilose para produzir etanol, em que a mencionada linhagem compreende pelo menos uma modificação genética que reduz a atividade de glicose-frutose oxidorreductase; e b. cultivo da linhagem de (a) em um meio que compreende xilose, por meio do quê xilose é convertida em etanol.

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, em que a linhagem de (a) aumenta a conversão de xilose em etanol com relação a uma linhagem de Zymomonas recombinante sem pelo menos uma modificação genética que reduz a atividade de glicose-frutose oxidorreductase.

3. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 2, em que a linhagem de (a) aumenta um ou mais dentre a velocidade, título ou rendimento de conversão de xilose em etanol com relação a uma linhagem de Zymomonas recombinante sem pelo menos uma modificação genética que reduz a atividade de glicose-frutose oxidorreductase.

4. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, em que a linhagem de (a) produz uma quantidade reduzida de xilitol ao metabolizar xilose em etanol em comparação com uma linhagem de Zymomonas sem pelo menos uma modificação genética que reduz a atividade de glicose-frutose oxidorreductase.

5. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 4, em que a linhagem de (a) substancialmente não produz xilitol ao metabolizar xilose em etanol.

6. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, em que a linhagem de Zymomonas recombinante de (a) é selecionada a partir do grupo que consiste de ZW800, ZW801-4 e ZW801-6.

7. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, em que o meio compreende uma mistura de açúcares que inclui xilose e um álcool de açúcar selecionado a partir do grupo que consiste de sorbitol, manitol, galactitol, ribitol e uma de suas misturas, em que a mistura de açúcares encontra-se em uma concentração de pelo menos cerca de 120 g/l e em que o álcool de açúcar encontra-se em uma concentração final que é de cerca de 2 mM a cerca de 100 mM.

8. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 7, em que o álcool de açúcar encontra-se em uma concentração que é de cerca de 5 mM a cerca de 20 mM.