CN109734787B - 一种用于快速检测克隆效率的红色荧光蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于快速检测克隆效率的红色荧光蛋白，通过对野生型红色荧光蛋白DsRed2进行改造，获得发生氨基酸突变的新型红色荧光蛋白。新型红色荧光蛋白可以在较短的时间内显色，从而实现克隆的快速而直观的检测。

Description

一种用于快速检测克隆效率的红色荧光蛋白

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种用于快速检测克隆效率的红色荧光蛋白。

背景技术

DNA重组(DNA recombination)是利用连接酶将不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合的过程。在分子生物学研究工作中，重组DNA技术(recombinantDNAtechnology)，是最基本的实验内容，也经常是研究工作的第一步，应用非常广泛。通过连接反应将目的基因插入到适当的载体构成重组DNA分子，然后转化进入适当的宿主细胞，在宿主细胞中进行无性增殖，获得大量的目的基因或DNA片段，此过程称为基因克隆(genecloning)。重组的DNA分子也能够在宿主细胞中进行表达，获得相应的蛋白质的表达，进而可以开展各种相关的研究，如基因的结构、功能、调控研究以及基因产品的研发应用。

重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。从理论上说，筛选方法就是区别含有重组体的宿主菌与含有空载体的非重组菌，即需排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。如果不能区分，不能获得重组克隆，研究工作将无法继续；或者，重组克隆的筛选进展缓慢，成为影响实验研究顺利高效进展的障碍，并且较大地增加研究成本。因此，人们一直在努力改进基因克隆这一基本技术环节，希望建立一种快速、简便、直接地判断重组克隆的载体、宿主和判断方法体系。

重组克隆的筛选方法有很多种，常用的筛选方法有两类。一类是针对遗传表型改变进行筛选法，以β-半乳糖苷酶系统筛选法为代表。另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern印迹杂交、PCR、菌落(或噬菌斑)原位杂交以及基因序列测定筛选等方法。但是上述方法或者周期较长，流程繁琐，成本高，或者酶切质量低，均不能快速高效的实现重组克隆的判断。

红色荧光蛋白是从海葵中分离出的一种新荧光蛋白基因，可以在紫外线的激发下发出红色荧光，是目前发现的具有最长激发波长与发射波长的自然发光荧光蛋白，并且它的背景干扰较小，目前已被广泛地应用于动物、植物和酵母等真核细胞内基因表达的报告基因。但大部分需要借助荧光显微镜才可观察，难以直接观察到红色现象。随着研究的深入，人们发现红色荧光蛋白DsRed2的发色团只有在寡聚化的情况下才能形成并发挥作用，寡聚化在成熟过程中起着重要的作用，但是DsRed2却成熟缓慢以及不完全，无法作为快速的报告基因应用。如何优化红色荧光蛋白，加快红色荧光蛋白的结构成熟，成为快速高效的实现重组克隆的判断的关键。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种简单、直观、快速、高效判断基因重组的报告基因，在不添加诱导剂的情况下，构建出可通过菌落颜色判断出重组克隆的新型载体。

本发明的第一方面提供了一种红色荧光蛋白，所述荧光蛋白包括对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第98、119、135、146位中的一个或多个位点进行修饰。

进一步，SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第98、119、135、146位中的至少一个被置换为SEQ ID NO.4所示的第98、119、135、146位的相应氨基酸。

进一步，所述荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第二方面提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白含有本发明第一方面所述的红色荧光蛋白。

本发明的第三方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的红色荧光蛋白。

本发明的第四方面提供了一种载体，所述载体包含本发明第三方面所述的核酸分子。

本发明的第五方面提供了一种重组细胞，所述重组细胞包含本发明第四方面所述的载体。

本发明的第六方面提供了本发明第一方面所述的红色荧光蛋白在活体成像中的应用。

本发明的第七方面提供了一种一种筛选快速检测克隆载体的突变基因的方法，包括：

1)依据真核表达质粒pDesRed2的序列将DNA翻译成氨基酸；

2)按照密码子偏好性进行密码子优化，全基因合成获得原核表达的序列；

3)构建能够组成型表达DesRed2的表达质粒；

4)将优化的DesRed2基因克隆到线性化的表达质粒中；

5)致错PCR突变红色荧光蛋白区域；

6)克隆致错PCR产物；

7)筛选和鉴定突变片段；

8)对突变片段进行测序分析。

本发明的第八方面提供了一种快速检测克隆的方法，包括：

1)将目的蛋白基因和本发明第三方面所述的核酸分子融合；

2)将融合蛋白的基因序列插入到适合的表达载体中；

3)将融合蛋白表达载体转染细胞或活体，进行培养，观察显色情况。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种红色荧光蛋白，所述红色荧光蛋白作为报告基因构建载体，可以快速、简便、高效、直观的判断重组克隆，而无需使用诱导剂。

具体的实施方式

本发明利用全基因合成的方法，按照大肠杆菌的优势密码子设计新的DesRed2红色荧光蛋白基因，通过添加组成型启动子与DesRed2基因组成一个表达元件，对DesRed2红色荧光蛋白基因进行错配聚合酶链式反应来随机改变红色荧光蛋白基因的DNA序列，筛选获得能够在16小时内显色的基因序列，从而利用该序列实现重组克隆的快速、直观的判断。

本发明中的红色荧光蛋白是指与野生型DesRed2相比具有一个或多个氨基酸修饰的DesRed2氨基酸序列。所述修饰可以具有“保守”修饰，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如用异亮氨酸替代亮氨酸。较为罕见地，变体可以具有“非保守”修饰，例如，用色氨酸替换甘氨酸。类似的微小变化也可以包括氨基酸缺失或插入，或同时包括这两者。

作为优选的实施方案，本发明的红色荧光蛋白包括对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第98、119、135、146位中的一个或多个位点进行修饰，所述修饰可以是删除、取代或插入；优选的，所述修饰是取代。

作为优选的实施方案，本发明的红色荧光蛋白具有一个或多个如下的取代：N98K，I119L，V135A，S146G。

作为一种优选的实施方案，本发明的红色荧光蛋白具有如下的取代：N98K，I119L，V135A，S146G。

本发明提供了一种融合蛋白，其含有本发明所述的红色荧光蛋白，因为本发明提供的红色荧光蛋白能较快的显色，因此，可通过基因工程的技术将其与其他目的蛋白进行融合，或者将红色荧光蛋白标记其他的目的蛋白。通过对荧光蛋白的成像，实现目标蛋白的准确研究。

本发明提供了一种分离的核酸分子，该核酸分子可编码上述的荧光蛋白。根据密码子的简并性，在荧光蛋白的氨基酸序列确定的情况下，其相应的编码核酸序列也存在多种情况，均属于本发明的保护范围。需要说明的是，这类核酸分子的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供了含有上述核酸分子的载体。载体可以是克隆载体或表达载体等，优选为表达载体。本发明对表达载体没有特别的限制，但可以是能在包括哺乳动物细胞(例如，人、猴、兔、大鼠、仓鼠或小鼠细胞)、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和细菌细胞(如大肠杆菌(E.coli))在内的真核或原核细胞内复制和/或表达多核苷酸的载体。较佳地，它可以是载体，包括至少一选择性标记，可操作地连接到合适的启动子，以致可以在宿主细胞内表达多核苷酸。例如，载体可以包括导入噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或反转录病毒载体的多核苷酸。

本发明中的用于导入载体的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞，上述细胞包含(但并不限于)细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌；酵母细胞；真菌细胞如毕赤酵母；昆虫细胞如果蝇或夜蛾Sf9细胞；动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞，SP2/0，人淋巴样母细胞，COS，NSO，293T，Bowes黑素瘤细胞，HT-1080，BHK(幼仓鼠肾细胞)，HEK(人胚肾细胞)，PERC.6(人视网膜细胞)等；和植物细胞。在本领域中可使用本领域的技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞。

术语“导入”是指将包括编码单克隆抗体的多核苷酸的载体递送入宿主细胞。此导入可以通过本领域中已知的各种方法，包括磷酸钙-DNA共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，聚凝胺介导的转染，电穿孔，显微注射，脂质体介导的转染，脂质体融合，脂转染和原生质体融合进行。此外，转染是指用病毒颗粒通过感染将期望材料递送入细胞。此外，该载体可以通过基因轰击导入宿主细胞。在本发明中，导入与转染可以互换使用。

本发明的重组细胞接着可以用于表达以及培养目的，可以使用任何适当的培养技术，包括但是不局限于静置培养、转瓶培养、腹水流体、中空纤维型生物反应盒、模块化小型发酵罐、搅拌槽、微载体培养、陶瓷芯灌注等等。

本发明提供了一种筛选快速检测克隆载体的突变基因的方法，包括：

1)依据真核表达质粒pDesRed2的序列将DNA翻译成氨基酸；

2)按照密码子偏好性进行密码子优化，全基因合成获得原核表达的序列；

3)构建能够组成型表达DesRed2的表达质粒；

4)将优化的DesRed2基因克隆到线性化的表达质粒中；

5)致错PCR突变红色荧光蛋白区域；

6)克隆致错PCR产物；

7)筛选和鉴定突变片段；

8)对突变片段进行测序分析。

作为一种优选的实施方式，所述序列在大肠杆菌中表达，因此将氨基酸序列按照大肠杆菌密码子的偏好性进行密码子优化，在本发明的具体实施方式中，优化后的DesRed2的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，优化后的的DesRed2的密码子适应指数为CAI＝0.94,碱基GC％＝43.55％。

作为一种实施方式，能够组成型表达DesRed2的表达质粒为重组的pUC57表达质粒，所述质粒包括组成型启动子和增强型转录终止子，优化后的DesRed2基因克隆在启动子和转录终止子之间的没切位点中，使得DesRed2基因在组成型启动子的作用下进行组成型表达。

作为一种优选的实施方式，所述启动子为CP25，核酸序列如SEQ ID NO.6所示。

作为一种优选的实施方式，所述增强型转录终止子为Lamda T0，核酸序列如SEQID NO.7所示。

在本发明中，可以使用本领域的任何随机突变的方法来引入突变，包括(但不限于)人工合成兼并引物引入随机突变；用化学致突剂引入随机突变；使用致突菌株，通过将基因在该菌株中传代引入随机突变；利用Taq聚合酶的错配倾向，通过错配PCR引入随机突变。作为一种优选的实施方式，引入突变的方法为错配PCR或致错PCR，通过设计错配PCR引物，进行致错PCR扩增。作为更为优选的实施方式，致错PCR体系包括：10mM Tris-HCl，50mMKCl，0.1％Triton X-100，5.5mM的MgCl₂，1mM的MnCl₂，0.2mM的dATP，0.2mM的dGTP，1mM的dCTP，1mM的dTTP。

在本发明中，进行突变片段的筛选和鉴定时，将转化后细菌铺板在含有氨苄青霉素的LB固体平板上，置于37℃恒温箱中培养，12-20小时后观察菌落的颜色变化，挑选显色最快和最红的菌落进行培养。

本发明提供了一种快速检测克隆的方法，包括：

1)将目的基因与本发明所述的红色荧光蛋白基因融合；

2)将融合蛋白的基因序列插入到合适的表达载体中；

3)将融合蛋白表达载体转染细胞或活体，进行培养，观察显色情况。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例 红色荧光蛋白突变的构建和筛选

1、根据WT-DesRed2的序列(序列来源于pDesRed2-N1)将DNA翻译成氨基酸，DNA序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、表达序列的优化及合成

将氨基酸序列按照大肠杆菌密码子偏好性进行优化，全基因合成获得原核表达的序列，如SEQ ID NO.3所示。

优化前的密码子适应指数为CAI＝0.64，碱基GC％＝63.95％，适合在哺乳动物细胞中表达。优化后的DesRed2(OP-DesRed2)的密码子适应指数为CAI＝0.94碱基GC％＝43.55％，适合在大肠杆菌中表达，优化后的氨基酸序列同野生型的序列进行比对，没有发生变化。

3、构建能够组成型表达DesRed2的pUC57-CP25T表达质粒

将组成型CP25启动子(序列如SEQ ID NO.6所示)和Lamda T0增强型转录终止子(序列如SEQ ID NO.7所示)进行全基因合成，CP25T的序列如SEQ ID NO.8所示，重组克隆在pUC57simple载体中，构建成pUC57-CP25T表达质粒(序列如SEQ ID NO.9所示)。

4、根据OP-DesRed2基因的序列设计引物reRedFor和reRedRev(引物序列如SEQ IDNO.10～11所示)，合成OP-DesRed2基因，将合成的OP-DesRed2基因通过同源重组的方法克隆到用HindIII线性化的pUC57-CP25T载体中，构建重组质粒pUC57-CP25T-OP-DesRed2(序列如SEQ ID NO.12所示)。

5、致错PCR突变红色荧光蛋白区域

同样用reRedFor和reRedRev引物以质粒pUC57-CP25T-OP-DesRed2为模板进行易错PCR扩增全长DsRed随机突变基因库，随机引入突变位点。

致错PCR条件：10mM TrisHCl，50mM KCl，0.1％Triton X-100，5.5mM的MgCl₂，1mM的MnCl₂，0.2mM的dATP，0.2mM的dGTP，1mM的dCTP，1mM的dTTP，pH8.3。

6、致错PCR产物的克隆

琼脂糖凝胶回收致错PCR方法产生的DNA片段，同源重组方法将DNA片段克隆到用HindIII线性化的pUC57-CP25T载体中，转化大肠杆菌Mach1T1中。

7、突变片段的筛选和鉴定

将转化后细菌铺板在含有氨苄青霉素的LB固体平板上，置于37℃恒温箱中培养，12-20小时后观察菌落的颜色变化，挑选在16h显色明显的菌落摇菌培养。

8、突变片段的测序分析

提取显色最快和最红的菌落的质粒，进行测序。测序结果显示，该质粒发生了4个位点的突变，N98K，I119L，V135A，S146G，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核酸序列如SEQID NO.5所示。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 博迈德生物科技（固安）有限公司

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agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 1800

cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 1860

cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 1920

ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 1980

taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 2040

tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 2100

ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 2160

atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 2220

gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 2280

tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 2340

cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 2400

taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 2460

ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 2520

ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 2580

cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 2640

ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 2700

gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 2760

gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 2820

aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 2880

ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtc 2934

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agaattaaag aggagaaatt aagca 25

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caggagtcca agctcagcta atta 24

<210> 12

<211> 3618

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accagatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ggagatcggt acttcgcgaa 420

tgcgtcgaga tgctttggca gtttattctt gacatgtagt gagggggctg gtataatcac 480

atagtactgt tcgggatcct taagaatggg tctagaatta aagaggagaa attaagcaag 540

cttatggcaa gcagtgaaaa tgtgattacc gaattcatgc gttttaaagt tcgtatggaa 600

ggtaccgtga atggccatga atttgaaatt gaaggtgaag gtgaaggccg cccgtatgaa 660

ggtcataata ccgtgaaact gaaagttacc aaaggtggtc cgctgccgtt tgcatgggat 720

attctgagcc cgcagtttca gtatggtagt aaagtttatg ttaagcatcc ggcagatatt 780

ccggattata aaaaactgag ctttccggaa ggttttaaat gggaacgtgt tatgaatttt 840

gaggatggtg gtgtggcaac cgtgacccag gatagcagcc tgcaggatgg ctgttttatc 900

tataaagtga aattcatcgg cgtgaatttt ccgagtgatg gtccggttat gcagaaaaag 960

actatgggct gggaagcaag taccgaacgt ctgtatccgc gtgatggcgt tctgaaaggt 1020

gaaacccata aagcactgaa actgaaagat ggtggtcatt atctggtgga attcaaaagt 1080

atctatatgg caaaaaagcc ggttcagctg ccgggttatt attatgttga tgccaaactg 1140

gatatcacca gtcataatga agattatacc attgtggaac agtatgaacg taccgaaggt 1200

cgtcatcatc tgtttctgta aaagcttaat tagctgagct tggactcctg ttgatagatc 1260

cagtaatgac ctcagaactc catctggatt tgttcagaac gctcggttgc cgccgggcgt 1320

tttttattgg tgagaatcca tcggatgccg ggaccgacga gtgcagaggc gtgcaagcga 1380

gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc 1440

cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct 1500

aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 1560

agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt 1620

ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 1680

ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 1740

tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 1800

tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 1860

gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 1920

ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 1980

tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 2040

agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 2100

atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 2160

acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 2220

actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 2280

tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 2340

tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga 2400

tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca 2460

tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat 2520

caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg 2580

cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt 2640

agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag 2700

acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc 2760

gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag 2820

ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca 2880

tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa 2940

ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga 3000

tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata 3060

attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca 3120

agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg 3180

ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg 3240

ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg 3300

cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag 3360

gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac 3420

tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca 3480

tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag 3540

tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta 3600

tcacgaggcc ctttcgtc 3618

Claims (6)

1.一种红色荧光蛋白，其特征在于，所述荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种融合蛋白，其特征在于，含有权利要求1所述的红色荧光蛋白。

3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的红色荧光蛋白。

4.一种载体，其特征在于，包含权利要求3所述的核酸分子。

5.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求4所述的载体。

6.一种快速检测克隆效率的方法，其特征在于，包括：

1）将目的基因与权利要求3所述的核酸分子融合；

2）将融合蛋白的基因序列插入到适合的表达载体中；

3）将融合蛋白表达载体转染细胞或活体，进行培养，观察显色情况。