CN109134644B - 远红光荧光蛋白及其融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种远红光荧光蛋白，所述远红光荧光蛋白包括BDFP近红外荧光蛋白的氨基酸序列，并且包括在第120位氨基酸处的突变，且在第113位氨基酸处不发生突变，其中，所述BDFP近红外荧光蛋白的氨基酸序列如SED ID NO：2所示。本发明进一步公开了一种包括所述远红光荧光蛋白的融合荧光蛋白。本发明还公开了一种编码所述远红光荧光蛋白或融合荧光蛋白的核酸，及包括该核酸的载体。

Description

远红光荧光蛋白及其融合蛋白
技术领域
本发明属于荧光标记物领域。具体地，本发明涉及一种远红光荧光蛋白，编码该远红光荧光蛋白的核酸及载体。
背景技术
远红光(FR)或近红外光(NIR)在动物组织中光吸收和光散射较低，有较高的穿透性，是穿透皮肤等大部分组织的能力最大的光谱区域。具有这类发光色素基团的荧光蛋白更适宜于动物活体组织的深层成像，是活体成像更为理想的荧光标记物。
目前该类荧光标记物主要有两种，分子量大小均在35kD左右。一种源自绿色荧光蛋白(GFP)，能自催化形成发色团，但是光谱范围有一定局限性，最大荧光发射波长一般在670nm左右，例如标记物TagRFP675。另一种源自存在于细菌中的受体蛋白，细菌光敏色素蛋白(BphP)。BphP主要利用线性四吡咯结构的胆绿素(BV)作为发色团；同时胆绿素BV广泛存在于真核生物体内，这意味着BphP类荧光标记物可应用于活的动物细胞和组织，且无需任何酶或外源辅助因子。BphP类标记物的代表有iFP系列和iRFP系列，荧光发射波长范围为670nm～720nm，比如IFP2.0最大荧光发射波长714nm。
但是现有可激发出远红光或近红外光的荧光蛋白的分子量较大，活体检测时易聚集沉淀，而且不耐受极端环境，适用场合有限。
藻胆蛋白(phycobiliprotein)存在远红光范围的荧光发射，机制与细菌光敏色素蛋白(BphP)类似，主要源自于非共价结合的藻蓝胆素(PCB)。典型的藻胆蛋白类荧光标记物例如ApcA、smURFP、ApcF2，它们的最大荧光发射波长为698nm。
Ding W L等人基于藻胆蛋白体的核心亚基ApcF2的序列，进行基因改造后得到了几种新的荧光藻胆蛋白并将其命名为BDFP，这些BDFP蛋白可共价结合胆绿素BV，性能比ApcF2稳定(Ding W L,Miao D,Hou Y N,et al.Small monomeric and highly stablenear-infrared fluorescent markers derived from the thermophilicphycobiliprotein,ApcF2[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular CellResearch,2017,1864(10):1877-1886)。另外，这些BDFP蛋白的分子量较小，约15kD，最大荧光发射波长为710nm左右。
虽然Ding W L等人得到的BDFP蛋白很好地弥补了现有的远红光或近红外光的荧光蛋白的上述缺点，但是这些蛋白荧光发射波长比较单一(均在710nm左右)，因此不能有效地组合使用。因此通过基因工程改造，得到亮度更高、光谱性质更为多样和优异的荧光蛋白，具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一在于通过同源序列比对，选择保守功能位点，并确定目标突变位点。
本发明的另一目的在于提供一种发射出远红光的经基因改造的藻胆蛋白及其融合蛋白。
本发明的又一目的在于提供一种编码本发明的经基因改造的藻胆蛋白及其融合蛋白的核酸或载体。
在本发明的一个方面中，提供了一种远红光荧光蛋白，所述远红光荧光蛋白包括BDFP近红外荧光蛋白的氨基酸序列，并且包括在第120位氨基酸处的突变，且在第113位的氨基酸处不发生突变。所述BDFP近红外荧光蛋白的氨基酸序列可以如SED ID NO:2所示。
上述BDFP近红外荧光蛋白来源于截短的藻胆蛋白ApcF2。本发明的BDFP近红外荧光蛋白包括ApcF2的第20～169位氨基酸或由ApcF2的第20～169位氨基酸构成，并且包括位点突变S46T、I51V、N72C、Y82C、Y92M、N136K、V160I和V161A。
如无特殊说明，本发明中的氨基酸位置以藻胆蛋白ApcF2的氨基酸序列为基础进行编码。
本文的藻胆蛋白ApcF2指来源于ChroococcidiopsisthermalisPCC 7203的ApcF2。优选地，本发明的藻胆蛋白ApcF2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地，本发明所述的远红光荧光蛋白还可以包括在第28、52、54、61、83、103、116、136、143和/或151位的氨基酸处的突变。
进一步地，在本发明所述的远红光荧光蛋白中，第120位亮氨酸可以突变为半胱氨酸。进一步地，在本发明所述的远红光荧光蛋白中，第28位赖氨酸可以突变为谷氨酸。进一步地，在本发明的远红光荧光蛋白中，第52位缬氨酸可以突变为丙氨酸。进一步地，在本发明的远红光荧光蛋白中，第54位苏氨酸可以突变为丙氨酸。进一步地，在本发明的远红光荧光蛋白中，第61位谷氨酰胺可以突变为亮氨酸。进一步地，在本发明的远红光荧光蛋白中，第83位缬氨酸可以突变为苏氨酸。进一步地，在本发明的远红光荧光蛋白中，第103位丝氨酸可以突变为甘氨酸。进一步地，在本发明的远红光荧光蛋白中，第116位苏氨酸可以突变为甲硫氨酸。进一步地，在本发明的远红光荧光蛋白中，第136位天冬酰胺可以突变为精氨酸。进一步地，在本发明的远红光荧光蛋白中，第143位缬氨酸可以突变为丙氨酸。进一步地，在本发明的远红光荧光蛋白中，第151位的苏氨酸可以突变为丙氨酸。
优选地，本发明所述的远红光荧光蛋白的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:3所示。或者，本发明所述的远红光荧光蛋白的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:4所示。或者，本发明所述的远红光荧光蛋白的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:5所示。或者，本发明所述的远红光荧光蛋白的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:6所示。或者，本发明所述的远红光荧光蛋白的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:7所示。
在本发明的另一方面中，提供了一种融合荧光蛋白，所述融合荧光蛋白包括本发明的上述远红光荧光蛋白。
进一步地，所述融合荧光蛋白还可以包括另一远红光荧光蛋白。优选地，所述另一远红光荧光蛋白可以为GFP类、BphP类和/或BDFP类荧光蛋白。最优选地，所述另一远红光荧光蛋白可以为BDFP远红光荧光蛋白，例如本发明的上述远红光荧光蛋白
或者，所述融合荧光蛋白可以进一步包括非远红光荧光蛋白，所述非远红光荧光蛋白可以为近红外光荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、蓝绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和/或橙色荧光蛋白。
所述非远红光荧光蛋白可以为GFP类、BphP类和/或BDFP类荧光蛋白。例如，所述非远红光荧光蛋白可以为EBFP、ECFP、mCerulean、TFP、GFP、eGFP、EYFP、FRP、TagRFP或BDFP近红光荧光蛋白。该BDFP近红光荧光蛋白的氨基酸序列可以如SED ID NO:2所示。
在本发明的融合荧光蛋白中，各荧光蛋白之间可以通过连接子连接。优选地，所述连接子由5～80个氨基酸构成，例如由5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个氨基酸构成。更优选地，所述连接子由5～70个，优选5～60、5～55、5～50、5～45、5～40、5～35或10～35个氨基酸构成。
在本发明的又一方面中，提供了一种编码上述远红光荧光蛋白或上述融合荧光蛋白的核酸。
在本发明的又一方面中，提供了一种包括上述核酸的载体。
本发明的经基因改造的BDFP远红光荧光蛋白的分子量较小，能与色素共价结合，性能稳定，耐受极端环境。
现有的BDFP近红光荧光蛋白的最大荧光发射峰在710nm附近(近红外光)。本发明通过位点突变，得到的BDFP蛋白的荧光发射峰发生蓝移，最大荧光发射波长在670nm附近(远红光)。因此，本发明通过位点突变得到的BDFP远红光荧光蛋白可以与现有的非远红光荧光蛋白(例如BDFP近红光荧光蛋白)组合使用，对细胞、组织等以进行双重或多重荧光标记。
另外，本发明的BDFP远红光荧光蛋白还可以与另一远红光或非远红光荧光蛋白一起构建融合荧光蛋白，以提升活体细胞检测时的有效亮度，或者进行组合荧光标记。进一步地，本发明的BDFP远红光荧光蛋白与现有的BDFP近红光荧光蛋白的串联融合蛋白不仅具有显著提高的有效亮度，而且还具备大范围的Stokes位移等特点，可用于荧光共振能量转移的相互作用研究等。
附图说明
图1示出了ApcB、ApcF2、BDFP1.1、BDFP1.2、BDFP1.6的同源序列对比图。
图2示出了突变体体BDFP1.1、v3或v12(BDFP1.3)在HEK 293T细胞内的荧光显微镜成像图像。各突变体分别与eGFP(FPs:IRES:eGFP)在HEK 293T细胞内共表达。显微镜成像参数，绿色通道(λex＝470/40nm,λem＝510/40nm)，远红光通道(λex＝630/20nm,λem＝690/50nm)，近红外光通道(λex＝630/20nm,λem＝690/50nm)；数据采集时间，BDFP1.1、v3为30s，v12(BDFP1.3)为5s。
图3示出了在哺乳动物活细胞内表达人源蛋白与突变体BDFP1.3或BDFP1.1的融合蛋白的荧光显微镜图像。(a)广域显微镜(wf)和结构化照明显微镜(SIM，超分辨率显微镜)成像图：在HeLa细胞中表达BDFP1.3与微管蛋白(α-tubulin)的融合蛋白，在U-2OS细胞中表达BDFP1.3与肌动蛋白(β-actin)的融合蛋白。(b)远红光(BDFP1.3)和近红外光(BDFP1.1)的双色成像图：远红光成像图(左列)滤光片设置(λex＝630/20nm，λem＝667/30nm)，近红外光成像图(中间列)滤光片设置(λex＝685/20，λem＝740/40nm)；双色合成覆盖图(右列)。比例尺：10μm。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域技术人员来说，在不脱离本发明基本原理的前提下，可以做出若干改进，这些改进也视为在本发明的范围内。下面分通过具体实施方式对本发明进行详细说明。但是，应当理解，本发明并不限定于以下的具体实施方式。本发明的保护范围由权利要求书来定义，在其范围内，可以对本发明下述实施方式进行任意改变和组合。
下面将结合具体实施例，进一步解释本发明。
材料和方法
1.载体
pET28(或pET30)和pACYCDuet(Novagen)是T7启动子表达载体。pACYCDuet经设计，能够用于双目的基因序列在大肠杆菌(E.coli)内共同转化表达。表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)是带有CMV启动子的哺乳动物类表达载体。
在HEK 293T细胞内进行筛选时，使用表达载体pcDNA3.1，融合表达序列为BDFP:IRES:eGFP。作亮度对比时，可基于eGFP的荧光亮度，对BDFP蛋白的荧光亮度进行修正。
2.突变
突变起始模板为BDFP1.1(如SEQ ID NO.2所示，即ApcF2(20-169)-S46T/I51V/N72C/Y82C/Y92M/N136K/V160I/V161A)。
位点特异性和位点饱和诱变(20个氨基酸全部使用引物混合物来编码)使用Zheng等人(L.Zheng,U.Baumann,J.L.Reymond,An efficient one-step site-directed andsite-saturation mutagenesis protocol,Nucleic Acid Res.32(2004)e115)的有效一步式方案来进行。随机诱变通过易错PCR来进行，所使用的条件导致每1000个碱基对(bp)产生高达16个突变的频率(O.Griesbeck,G.S.Baird,R.E.Campbell,D.A.Zacharias,R.Y.Tsien,Reducing theenvironmental sensitivity of yellow fluorescentprotein.Mechanism and applications,J.Biol.Chem.276(2001)29188–29194)。
通过随机诱变得到的基因文库，被克隆至pET28载体质粒上。然后该质粒将与产生胆色素(BV)的质粒pACYC-ho1，一起转化进入大肠杆菌BL21(DE3)。细胞先在37℃条件下琼脂平板培养10h，然后在17℃条件下培养48h。诱导剂采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，浓度0.05mM。平板上的强荧光克隆，是采用型号Qpix 420的菌落挑选系统(Molecular Devices)，红光激发通道设置628/65nm/，远红光荧光通道设置692/65nm。每个文库挑选到的具有高亮度荧光的克隆，将会用作下一轮的易错PCR模板。
3.大肠杆菌内的重组蛋白的表达
将带有编码荧光蛋白的pET表达载体转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Novagen)后，再将载体pACYC-ho1转化到同一菌株中。将经转化的BL21细胞在18℃，培养在补充有卡那霉素(20μg/ml)和氯霉素(17μg/ml)LB培养基中。当O.D值达到0.4～0.6时，使用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达5～16小时，然后在4℃，12,000×g离心3min，收集细胞，经水冲洗2次，短期保存在4℃或者置于-20℃长期保存。
4.蛋白的纯化与定量
将湿菌体悬浮在冰预冷的起始缓冲液[磷酸钾缓冲液(KPB,20mM,pH 7.2)，氯化钠(NaCl,0.5M)]中。经50W功率超声(JY92-II,宁波新芝生物科技股份有限公司，中国)破碎，5分钟。悬浮液在4℃，12000×g离心60分钟。得到的上清液经Ni2+亲和层析柱(AmershamBiosciences)纯化，其中使用起始缓冲液[磷酸钾(KPB,20mM,pH 7.2)上样，使用额外含有0.5M咪唑的缓冲液进行洗脱。收集到的样品，用起始缓冲液(pH 7.2)透析至少两次。通过Bradford法测定蛋白浓度，使用牛血清白蛋白作为标准品进行校正。
5.哺乳动物细胞的培养
将HEK 293T、HeLa或U-2OS细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen)中，将CHO-K1细胞培养在含10％胎牛血清的F-12K培养基中。使用
Figure GDA0001834919030000061
2000(Invitrogen)进行转染。转染时，
Figure GDA0001834919030000062
2000与DNA以3:1(μl:μg)的比率在无血清培养基Opti-
Figure GDA0001834919030000063
中混合10分钟后，立即加入到要转染的细胞中。5～6h后，更换新鲜的DMEM培养基。
6.活体细胞成像(体内成像)
在20mm玻璃细胞培养皿(Nest)内完成瞬时转染，24h后开始进行活体细胞成像。成像前先用1mL PBS冲洗两次，然后用DEME培养基(无酚红)冲洗一次。成像设备为倒置显微镜Nikon Ti，配有cool-snap HQ2CCD相机和Nikon Plan Fluor ELWD 20 0.45-DIC L-WD物镜。激发和发射设置如下：eGFP为绿色通道，λex＝470/40,λem＝510/40nm；远红光荧光蛋白为远红光通道，λex＝630/20，λem＝690/50nm。图片使用ImageJ软件(National Institutesof Health)进行分析和处理。
7.广域和超分辨率显微镜检查
在室温，通过独立模式，使用配有100×1.49NA油浸物镜的ECLIPSE Ti-E倒置尼康显微镜上的尼康结构化照明系统，获取广域和结构化照明显微镜(SIM)照片。使用640nm的半导体激光器(100mW,CUBE 640-100C,COHERENT)激发FR荧光。使用受NIS-Elements AR软件(尼康)控制的电子倍增CCD相机(Andor iXon3 DU897)进行数据采集。使用NIS-ElementsAR对图像进行处理。
8.同源序列比对
BDFP荧光蛋白结构比对，在SWISS-MODEL远程服务器上完成。采用的模板序列为钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)的藻胆蛋白ApcB(pdb code:1ALL)，对比软件为Swiss-PDBViewer，版本4.1。采用PyMOL(http://www.pymol.org/)创建蛋白结构图。采用Clustal(http://www.clustal.org/)创建完成蛋白序列比对图。
9.光谱分析
通过分光光度计(DU800，Beckman-Coulter)来检测色素蛋白的紫外-可见吸收光谱。荧光蛋白的消光系数是依据胆色素BV在390nm处的吸收系数ε＝39,900M-1cm-1，进行参比换算的。
通过荧光分光光度计(F320，天津港东科技发展股份有限公司)来检测荧光光谱。参考已知的iRFP670荧光蛋白(ΦF＝0.122)检测荧光量子产率ΦF，样品检测环境为磷酸钾盐溶液(20mM,pH 7.2，KPB)。
本领域技术人员应理解的是，对于本文未作具体说明的分子生物学实验方法，可参照《分子克隆实验指南》(第四版，M.R.格林和J.萨姆布鲁克著)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。所用试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例
实施例1.同源序列比对分析
图1示出了几个同源序列的对比，其中ApcF2及其衍生序列BDFP1.1均来自ChroococcidiopsisthermalisPCC 7203；ApcB来自钝顶螺旋藻Spirulina platensis，该藻种不适应远红光和近红外光生长环境。从图1可以看出，L113在ApcB、ApcF2和BDFP1.1之间是高度保守的。
在BDFP1.1序列(SEQ ID NO:2)基础上，对L120进行定点饱和诱变；筛选得到的突变体通过易错PCR反应，进行持续的随机突变，建立突变体文库。采用体外光谱性质检测和活体细胞成像的方法，按照以下筛选标准，对突变体文库中的突变体进行筛选：与BDFP1.1相比，目标突变体最大荧光发射波长发生明显蓝移，但仍大于660nm；同时与已知荧光蛋白标记iRFP670(ε·Φfl＝10.2mM-1cm-1)相比，分子亮度相当。
通过筛选，首先得到5个突变体。对这5个突变体进行测序，测序结果发现它们分别具有如下表1中所示的氨基酸突变。
表1.源自荧光蛋白BDFP1.1的突变体
突变体 序列号 序列变异
v3 SEQ ID NO:3 L120C
v9 SEQ ID NO:4 K28E/Q61L//L120C/N136R/V143A/T151A
v10 SEQ ID NO:5 V83T/S103G/T116M/L120C/T151A
v11 SEQ ID NO:6 V52A/T54A/L120C/V143A/
v12(BDFP1.3) SEQ ID NO:7 K28E/T54A/L120C/
在大肠杆菌中表达这5个突变体，然后通过Ni2+亲和层析纯化表达的各突变体并进行蛋白定量。将等量的突变体蛋白置于检测溶液磷酸钾缓冲液(KPB，20mM,pH 7.0)和0.5MNaCl中。荧光发射光谱的激发光波长为620nm；分子亮度对比参照物为iRFP670(ε·Φfl＝10.2mM-1cm-1)。检测该5个突变体的光谱性质，结果如下表2所示。
从表2的结果可以看出，BDFP1.1的最大发射峰约为707nm；突变体v3、v9、v10、v11和v12(BDFP1.3)的最大发射波长约为675nm，且分子亮度是BDFP1.1的2.5至3.8倍，也就是说突变体v3、v9、v10、v11和v12(BDFP1.3)的分子亮度得到显著提高，且最大发射峰发生显著蓝移，能够与BDFP1.1区分开，从而能够对细胞或组织进行双重标记。
Figure GDA0001834919030000091
实施例2.检测各荧光蛋白在活的HEK 293T细胞内的有效亮度
将分别表达突变体BDFP1.1、v3或v12(BDFP1.3)的核酸(FPs:IRES:eGFP)构建在表达载体pcDNA3.1中，然后瞬时转染到HEK 293T细胞内，使用倒置荧光显微镜观察荧光亮度。结果示于图2中。
图2示出了分别在绿色通道和FR或NIR通道下观察到的荧光图像。可以看到BDFP1.1、v3或v12(BDFP1.3)均发出绿色荧光，BDFP1.1和v12(BDFP1.3)发出红色荧光，与其相比，v3的红色荧光较弱。
实施例3.突变体v12(BDFP1.3)与已知荧光蛋白的光谱性质及在HEK 293T细胞内的有效亮度的对比
在大肠杆菌中表达的荧光蛋白经Ni2+亲和层析纯化，然后检测它们的光谱性质。检测溶液环境为KPB(20mM,pH 7.0)和0.5M NaCl；荧光发射光谱的激发光波长为660nm。分子亮度的对比参照物为iRFP670(ε·Φfl＝10.2mM-1cm-1)。另外，比较了各突变体在HEK293T细胞中的有效荧光(远红光)。结果示于下表3中。
从表3可以看出，BDFP1.1的发射波长为707nm，而BDFP1.3的发射波长为675nm。因此，BDFP1.3可以与BDFP1.1组合使用，进行双重荧光标记。
另外，BDFP1.3在HEK 293T中有效亮度，每BV为4.8，每kDa为10.0。这表明BDFP1.3的有效亮度与BDFP1.1相当。
Figure GDA0001834919030000111
实施例4.检测突变体v12(BDFP1.3)在哺乳动物细胞内的有效亮度
在HeLa细胞中表达BDFP1.3与微管蛋白(α-tubulin)的融合蛋白，在U-2OS细胞中表达BDFP1.3与肌动蛋白(β-actin)的融合蛋白，在广域显微镜(wf)和结构化照明显微镜(SIM)下观察，结果示于图3a中。
从图3a可以看出，BDFP1.3与微管蛋白或肌动蛋白的融合蛋白在广域显微镜和结构化照明显微镜下均能发出强荧光。
实施例5.检测突变体v12(BDFP1.3)与BDFP1.1的双重标记
在HeLa细胞中共表达融合蛋白BDFP1.3-线粒体导入序列(MTS)和BDFP1.3-核定位序列(NLS)，在荧光显微镜下进行双色成像，结果示于图3b中。
从图3b可以看出，通过不同的滤光片，BDFP1.3与BDFP1.1能够得到具有不同荧光效果的图像。这表明BDFP1.3发出的远红外光，能够与BDFP1.1的近红外光组合使用，对细胞或组织进行双重标记。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中农业大学, 广州天宝颂原生物科技开发有限公司
<120> 远红光荧光蛋白及其融合蛋白
<130> P18GZ1NN03251CN
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 169
<212> PRT
<213> Chroococcidiopsis thermalis
<400> 1
Met Gln Asp Lys Leu Thr Ser Val Ala Lys Asn Cys Asp Leu Thr Gly
1 5 10 15
Ser Ser Leu Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Phe Leu Ala
20 25 30
Asp Gly Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Ser Asn Ala
35 40 45
Ala Glu Ile Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro
50 55 60
Glu Leu Val Ser Pro Gly Gly Asn Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn
65 70 75 80
Met Tyr Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Tyr Cys Ser Tyr Ala
85 90 95
Ile Val Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Asp Glu Arg Leu Leu Ala Gly
100 105 110
Leu Arg Asp Thr Phe Asn Ser Leu Gly Ile Pro Leu Gly Pro Thr Ala
115 120 125
Arg Ser Ile Gln Leu Met Lys Asn Ile Val Lys Glu Lys Leu Val Thr
130 135 140
Ala Gly Met Thr Asn Ile Thr Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Val
145 150 155 160
Val Arg Glu Ile Ser Glu Thr Glu Ile
165
<210> 2
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BDFP1.1
<400> 2
Met Ala Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Phe Leu Ala Asp
1 5 10 15
Gly Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala
20 25 30
Glu Val Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro Glu
35 40 45
Leu Val Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Met
50 55 60
Cys Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Val Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Asp Glu Arg Leu Leu Ala Gly Leu
85 90 95
Arg Asp Thr Phe Asn Ser Leu Gly Ile Pro Leu Gly Pro Thr Ala Arg
100 105 110
Ser Ile Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Val Thr Ala
115 120 125
Gly Met Thr Asn Ile Thr Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala
130 135 140
Arg Glu Ile Ser Glu Thr Glu Ile
145 150
<210> 3
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> v3
<400> 3
Met Ala Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Phe Leu Ala Asp
1 5 10 15
Gly Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala
20 25 30
Glu Val Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro Glu
35 40 45
Leu Val Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Met
50 55 60
Cys Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Val Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Asp Glu Arg Leu Leu Ala Gly Leu
85 90 95
Arg Asp Thr Phe Asn Ser Cys Gly Ile Pro Leu Gly Pro Thr Ala Arg
100 105 110
Ser Ile Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Val Thr Ala
115 120 125
Gly Met Thr Asn Ile Thr Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala
130 135 140
Arg Glu Ile Ser Glu Thr Glu Ile
145 150
<210> 4
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> v9
<400> 4
Met Ala Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Glu Glu Phe Leu Ala Asp
1 5 10 15
Gly Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala
20 25 30
Glu Val Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Leu Glu Tyr Pro Glu
35 40 45
Leu Val Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Met
50 55 60
Cys Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Val Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Asp Glu Arg Leu Leu Ala Gly Leu
85 90 95
Arg Asp Thr Phe Asn Ser Cys Gly Ile Pro Leu Gly Pro Thr Ala Arg
100 105 110
Ser Ile Gln Leu Met Lys Arg Ile Val Lys Glu Lys Leu Ala Thr Ala
115 120 125
Gly Met Thr Asn Ile Ala Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala
130 135 140
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145 150
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<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> v10
<400> 5
Met Ala Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Phe Leu Ala Asp
1 5 10 15
Gly Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala
20 25 30
Glu Val Val Lys Thr Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro Glu
35 40 45
Leu Val Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Met
50 55 60
Cys Thr Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Val Ala Gly Asp Ala Gly Val Leu Asp Glu Arg Leu Leu Ala Gly Leu
85 90 95
Arg Asp Met Phe Asn Ser Cys Gly Ile Pro Leu Gly Pro Thr Ala Arg
100 105 110
Ser Ile Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Val Thr Ala
115 120 125
Gly Met Thr Asn Ile Ala Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala
130 135 140
Arg Glu Ile Ser Glu Thr Glu Ile
145 150
<210> 6
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 6
Met Ala Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Phe Leu Ala Asp
1 5 10 15
Gly Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala
20 25 30
Glu Val Ala Lys Ala Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro Glu
35 40 45
Leu Val Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Met
50 55 60
Cys Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Val Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Asp Glu Arg Leu Leu Ala Gly Leu
85 90 95
Arg Asp Thr Phe Asn Ser Cys Gly Ile Pro Leu Gly Pro Thr Ala Arg
100 105 110
Ser Ile Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Ala Thr Ala
115 120 125
Gly Met Thr Asn Ile Thr Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala
130 135 140
Arg Glu Ile Ser Glu Thr Glu Ile
145 150
<210> 7
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> v12
<220>
<221> LIPID
<222> (1)..(152)
<400> 7
Met Ala Asn Arg Glu Val Val Glu Thr Leu Glu Glu Phe Leu Ala Asp
1 5 10 15
Gly Glu Lys Arg Val Gln Val Ala Gly Val Ile Gly Thr Asn Ala Ala
20 25 30
Glu Val Val Lys Ala Ala Val Ser Leu Leu Phe Gln Glu Tyr Pro Glu
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Leu Val Ser Pro Gly Gly Cys Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Asn Met
50 55 60
Cys Val Arg Asp Met Asn Tyr Phe Leu Arg Met Cys Ser Tyr Ala Ile
65 70 75 80
Val Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Asp Glu Arg Leu Leu Ala Gly Leu
85 90 95
Arg Asp Thr Phe Asn Ser Cys Gly Ile Pro Leu Gly Pro Thr Ala Arg
100 105 110
Ser Ile Gln Leu Met Lys Lys Ile Val Lys Glu Lys Leu Val Thr Ala
115 120 125
Gly Met Thr Asn Ile Thr Phe Val Asp Glu Pro Phe Asp Tyr Ile Ala
130 135 140
Arg Glu Ile Ser Glu Thr Glu Ile
145 150

Claims (10)

1.一种远红光荧光蛋白，其特征在于，所述远红光荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：3、4、5或6所示。
2.一种融合荧光蛋白，其特征在于，所述融合荧光蛋白包括如权利要求1所述的远红光荧光蛋白。
3.根据权利要求2所述的融合荧光蛋白，其特征在于，所述融合荧光蛋白进一步包括另一远红光荧光蛋白。
4.根据权利要求3所述的融合荧光蛋白，其特征在于，所述另一远红光荧光蛋白为权利要求1所述的远红光荧光蛋白。
5.根据权利要求2所述的融合荧光蛋白，其特征在于，所述融合荧光蛋白进一步包括非远红光荧光蛋白，所述非远红光荧光蛋白为近红外光荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、蓝绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和/或橙色荧光蛋白。
6.根据权利要求2～5中任一项所述的融合荧光蛋白，其特征在于，各荧光蛋白之间通过连接子连接。
7.根据权利要求6所述的融合荧光蛋白，其特征在于，所述连接子由5～80个氨基酸构成。
8.根据权利要求7所述的融合荧光蛋白，其特征在于，所述连接子由5～70个氨基酸构成。
9.一种编码如权利要求1所述的远红光荧光蛋白，或者如权利要求2～8中任一项所述的融合荧光蛋白的核酸。
10.一种包括如权利要求9所述的核酸的载体。
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Synthetic construct far-red fluorescent protein BDFP1.3 gene, partial cds，GenBank: KY465661.1;Ding,W. 等;《Genbank Database》;20180701;ORIGIN部分 *

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