KR101973275B1 - 루마진 단백질과 리보플라빈 생합성 유전자를 이용한 형광 미생물의 제조 - Google Patents
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Abstract
포토박테리움 레이오그나티(Photobacterium leiognathi) 유래의 루마진 단백질 유전자와 luxC 프로모터, 그리고 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론을 포함하는 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드 및 생물 발광 분석방법에 관한 것이다.
ribE로 부터 발현되는 아미노산 중에서 두 번째 잔기인 페닐알라닌을 알라닌으로 돌연변이 시키는 경우 루마진 리간드인 6,7 다이메틸 8-리비틸루마진(6,7 dimethyl 8-ribityllumazine)이 과다생산된다. 루마진 단백질과 상기 루마진 리간드가 결합하는 경우, 루마진 단백질에 비하여 더 강한 형광을 띠게 되므로, 루마진 단백질의 전체 또는 N 말단 부위를 암호화하는 유전자와 리보플라빈 생합성 유전자 및 luxC 프로모터를 함께 발현시켜 표지(reporter) 미생물로써 활용 가능하다.
ribE로 부터 발현되는 아미노산 중에서 두 번째 잔기인 페닐알라닌을 알라닌으로 돌연변이 시키는 경우 루마진 리간드인 6,7 다이메틸 8-리비틸루마진(6,7 dimethyl 8-ribityllumazine)이 과다생산된다. 루마진 단백질과 상기 루마진 리간드가 결합하는 경우, 루마진 단백질에 비하여 더 강한 형광을 띠게 되므로, 루마진 단백질의 전체 또는 N 말단 부위를 암호화하는 유전자와 리보플라빈 생합성 유전자 및 luxC 프로모터를 함께 발현시켜 표지(reporter) 미생물로써 활용 가능하다.
Description
본 발명은 포토박테리움 레이오그나티(Photobacterium leiognathi) 유래의 루마진 단백질 유전자 및 luxC 프로모터, 그리고 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론을 포함하는 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드 및 생물 발광 분석방법에 관한 것이다.
생물발광(Bioluminescence)은 일종의 광화학반응으로서, 특정 환경에서 외부의 빛 에너지 공급 없이 독자적으로 빛을 내는 것을 일컬으며 어떤 유기화합물이 효소의 작용으로 산화되면서 방출되는 에너지가 빛 에너지 형태로 체외로 나오는 현상이다. 생체분자영상(in vivo molecular imaging)이란, 분자/세포생물학을 생체영상(non-invasive in vivo imaging)으로 응용하여 생체 내에서 일어나는 분자수준의 변화를 영상화하는 기법으로 분자/세포생물학과 첨단 영상기술이 융합된 분야이다. 분자영상은 생체조직을 손상시키지 않는 비침습적인 방법으로 반복 영상화할 수 있어 실험실에서 이루어지는 기초연구를 임상에 적용시킬 수 있게 하는 이행적 연구(translational research)에 있어서 중요한 위치를 차지하고 있다.
생체발광(in vivo bioluminescence) 영상 분석으로 관찰하고자 하는 생물학적 대상물(박테리아, 종양세포, 면역세포, 유전자 등)은 빛을 발생시키는 효소(luciferase) 혹은 형광 단백질을 암호화하는 보고유전자(reporter gene)로 표지되어야 한다.
녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)은 진핵세포에서의 유전자 발현 및 단백질 상호작용에 관한 연구에 있어 많이 활용되긴 하지만, 원핵세포에서만 발현되는 시스템을 찾을 필요가 있다. 따라서 해양 발광 미생물로부터 유래하며 형광을 내는 루마진 단백질에 대한 연구가 요구되어 왔다.
발광 미생물 유래의 리보플라빈 오페론의 ribE는 리보플라빈 합성효소, ribB는 DHBP 합성효소를, ribH는 루마진 합성효소를, ribA는 GTP 시클로가수분해효소 Ⅱ를 암호화한다. lux 오페론의 luxA와 luxB는 발광효소(Luciferase)를 암호화 하며 luxL은 루마진 단백질을 암호화한다(Juey-Wen Lin et al. Riboflavin Synthesis Genes ribE, ribB, ribH, ribA Reside in the lux Operon of Photobacterium leiognathi 284, 587-595, 2001). ribE로 부터 발현되는 아미노산 중에서 두 번째 잔기인 페닐알라닌을 알라닌으로 돌연변이 시키는 경우, 루마진 리간드가 리보플라빈으로 전환되는 과정이 봉쇄되어 루마진 리간드인 6,7 다이메틸 8-리비틸루마진(6,7 dimethyl 8-ribityllumazine)이 과다 생산된다.
이에 본 발명자들은 루마진 단백질(LumP)과 루마진 리간드가 결합하는 경우, 루마진에 비하여 더 강한 형광을 띠게 되는 것에 착안하여 세포 내에서 빛이 나 세포 내 동력학을 연구하는 데 쓰여질 표지(reporter) 미생물을 발굴하고자 노력하였다. 그 결과, 루마진 단백질의 전체(W-LumP) 또는 N 말단 부위를 암호화하는 유전자(N-LumP)와 루마진 리간드인 6,7 다이메틸 8-리비틸루마진(6,7 dimethyl 8-ribityllumazine)이 과다 생산되는 리보플라빈 생합성 유전자가 함께 있는 재조합플라스미드(recombinant plasmid)를 제조하였으며, 또한 루마진 단백질 유전자의 과다 발현을 유도하기 위해 포토박테리움 레이오그나티(Photobacterium leiognathi ) luxC promoter가 삽입된 재조합 플라스미드 (recombinant plasmid)를 제조하여 P. leiognathi의 luxC 프로모터를 함께 발현시키는 경우 단백질과 루마진 유도체가 결합하여 형광세기가 강화된다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명자들은 루마진 단백질과 리보플라빈생합성 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 포토박테리움 레이오그나티(Photobacterium leiognathi) 유래의 루마진 단백질 유전자 및 luxC 프로모터, 그리고 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론을 포함하는 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 플라스미드로 형질전환된 생물 발광용 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 생물 발광용 형질 전환체의 형광세기를 측정하는 단계를 포함하는 생물 발광 분석 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 포토박테리움 레이오그나티(Photobacterium leiognathi) 유래의 루마진 단백질 유전자 및 luxC 프로모터, 그리고 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론을 포함하는 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 루마진 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 N-LumP 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 W-LumP 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 리보플라빈 오페론 중 ribE는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 발현하는 것 일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 luxC 프로모터는 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 것 일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 플라스미드로 형질 전환된, 생물 발광용 형질전환체를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 a) 상기 형질 전환체를 배양하는 단계; 및 b) 상기 단계 a)에서 배양한 형질전환체 배양 배지의 형광 세기를 측정하는 단계; 를 포함하는 생물 발광 분석 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 단계 b)의 형광 세기 측정은, 400㎚ 내지 460㎚의 여기파장(excitation wavelength)으로 빛을 조사하여 470㎚ 내지 550㎚의 발광파장(emission wavelength)을 갖는 형광파장을 측정하는 것 일 수 있다.
따라서, 본 발명은 포토박테리움 레이오그나티(Photobacterium leiognathi) 유래의 루마진 단백질 유전자 및 luxC 프로모터, 그리고 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론을 포함하는 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드를 제공한다.
ribE로 부터 발현되는 아미노산 중에서 두 번째 잔기인 페닐알라닌을 알라닌으로 돌연변이 시키는 경우 루마진 리간드인 6,7 다이메틸 8-리비틸루마진(6,7 dimethyl 8-ribityllumazine)이 과다 생산된다. 루마진 단백질과 상기 루마진 리간드가 결합하는 경우, 루마진에 비하여 더 강한 형광을 띠게 되므로, 루마진 단백질의 전체(W-LumP) 또는 N 말단 부위(N-LumP)를 암호화하는 유전자와 리보플라빈 생합성 유전자 및 luxC 프로모터를 함께 발현시켜 표지(reporter) 미생물로써 활용 가능하다.
도 1은 포토박테리움 레이오그나티(Photobacterium leiognathi)의 lux 오페론 구조를 나타낸다.
도 2는 pRFN4 벡터 원형 및 루마진 단백질과 luxC의 프로모터가 삽입된 pRFN4 벡터를 나타낸다.
도 3은 E.coli Xl-1 형질전환체의 형광세기를 측정한 결과를 나타낸다. 각 시료는 E.coli Xl-1(Xl-1, 이하 대조군 1), pRFN4가 포함된 E.coli Xl-1(pRFN4 in Xl-1, 이하 대조군 2), Pl-W-LumP를 발현하는 E.coli Xl-1(Pl-W-LumP of pRFN4 in Xl-1, 이하 실험군 1) 및 Pl-N-LumP를 발현하는 E.coli Xl-1(Pl-N-LumP of pRFN4 in Xl-1, 이하 실험군 2)를 사용하였다 ;
도 3a는 410㎚ 파장에서 형광분광광도계로 측정한 결과이다.
도 3b는 410㎚ 파장에서 다기능효소면역분석기로 측정한 결과이다
도 4는 E.coli Xl-1 및 43R의 형질전환체의 형광세기를 측정한 결과를 나타낸다. 각 시료는 E.coli 43R(43R, 이하 대조군 3), pRFN4가 포함된 E.coli 43R(pRFN4 in 43R, 이하 대조군 4), Pl-W-LumP를 발현하는 E.coli 43R(Pl-W-LumP of pRFN4 in 43R, 이하 실험군 3), Pl-N-LumP를 발현하는 E.coli 43R(Pl-N-LumP of pRFN4 in 43R, 이하 실험군 4)를 사용하였다 ;
도 4a는 여기파장을 410㎚로 하여 형광분광광도계로 측정한 결과이며; 및
도 4b는 여기파장을 450㎚로 하여 형광분광광도계로 측정한 결과이다.
도 2는 pRFN4 벡터 원형 및 루마진 단백질과 luxC의 프로모터가 삽입된 pRFN4 벡터를 나타낸다.
도 3은 E.coli Xl-1 형질전환체의 형광세기를 측정한 결과를 나타낸다. 각 시료는 E.coli Xl-1(Xl-1, 이하 대조군 1), pRFN4가 포함된 E.coli Xl-1(pRFN4 in Xl-1, 이하 대조군 2), Pl-W-LumP를 발현하는 E.coli Xl-1(Pl-W-LumP of pRFN4 in Xl-1, 이하 실험군 1) 및 Pl-N-LumP를 발현하는 E.coli Xl-1(Pl-N-LumP of pRFN4 in Xl-1, 이하 실험군 2)를 사용하였다 ;
도 3a는 410㎚ 파장에서 형광분광광도계로 측정한 결과이다.
도 3b는 410㎚ 파장에서 다기능효소면역분석기로 측정한 결과이다
도 4는 E.coli Xl-1 및 43R의 형질전환체의 형광세기를 측정한 결과를 나타낸다. 각 시료는 E.coli 43R(43R, 이하 대조군 3), pRFN4가 포함된 E.coli 43R(pRFN4 in 43R, 이하 대조군 4), Pl-W-LumP를 발현하는 E.coli 43R(Pl-W-LumP of pRFN4 in 43R, 이하 실험군 3), Pl-N-LumP를 발현하는 E.coli 43R(Pl-N-LumP of pRFN4 in 43R, 이하 실험군 4)를 사용하였다 ;
도 4a는 여기파장을 410㎚로 하여 형광분광광도계로 측정한 결과이며; 및
도 4b는 여기파장을 450㎚로 하여 형광분광광도계로 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이, 루마진 단백질과 리보플라빈 오페론을 포함하는 재조합 플라스미드를 제조하여 생물 발광 분석용으로 제공하는 것에 대하여는 현재까지 연구되거나 보고된 바가 없다.
본 발명에 따른 포토박테리움 레이오그나티(Photobacterium leiognathi) 유래의 루마진 단백질 유전자 및 luxC 프로모터, 그리고 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론을 포함하는 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드은, 형질전환된 경우 생물 발광을 측정하는데 효과적이다.
따라서, 본 발명은 포토박테리움 레이오그나티(Photobacterium leiognathi) 유래의 루마진 단백질 유전자 및 luxC 프로모터, 그리고 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론을 포함하는 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 플라스미드로 형질 전환된, 생물 발광용 형질전환체를 제공할 수 있다.
본 발명의 루마진 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 N-LumP 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 W-LumP 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, N-LumP는 루마진 단백질의 N 말단을 의미하며, W-LumP는 전체 루마진 단백질을 의미한다. 구체적으로, W-LumP의 서열번호 2에서 1 번째 부터 112 번째 아미노산 서열이 N-LumP의 아미노산 서열(서열번호 1)에 해당한다.
본 발명의 리보플라빈 오페론 중 ribE는 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자일 수 있다. 상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 야생형(Wild type)의 ribE에서 두 번째 잔기인 페닐알라닌을 알라닌으로 돌연변이 시킨 서열이다. 보다 구체적으로, 상기 리보플라빈 오페론 중 ribE는 서열번호 5의 염기서열에서 4번째부터 6번째 염기서열이 알라닌을 암호화할 수 있는 염기서열로 변형되는 것이 바람직하다. ribE로 부터 발현되는 아미노산 중에서 두 번째 잔기인 페닐알라닌을 알라닌으로 돌연변이 시키는 경우 루마진 리간드가 리보플라빈으로 전환되는 과정이 봉쇄되어 루마진 리간드인 6,7 다이메틸 8-리비틸루마진(6,7 dimethyl 8-ribityllumazine)이 과다생산된다.
본 발명의 luxC 프로모터는 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 포토박테리움 레이오그나티(Photobacterium leiognathi)의 lux 오페론의 구조 및 pRFN4의 구조를 확인하고, 루마진 단백질 및 luxC 프로모터를 도입한 pRFN4의 구조를 확인하였다(도 1, 도 2).
또한, 본 발명자들은 형질전환된 대장균 Xl-1의 형광세기를 측정한 결과, W-lumP를 포함한 형질전환체가 가장 강한 형광세기를 갖는 것을 확인하였다(도 3).
또한, 본 발명자들은 대장균 Xl-1 및 대장균 43R의 형질전환체의 형광세기를 측정한 결과, N-LumP를 포함한 대장균 43R 형질전환체가 가장 강한 형광세기를 갖는 것을 확인하였다(도 4).
따라서, luxC 프로모터, 루마진 단백질 및 리보플라빈 오페론으로 구성된 재조합 플라스미드로 형질전환된 형질전환체는 생물 발광 분석용으로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 a) 상기 형질 전환체를 배양하는 단계; 및 b) 상기 단계 a)에서 배양한 형질전환체 배양 배지의 형광 세기를 측정하는 단계; 를 포함하는 생물 발광 분석 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 상기 단계 b)의 형광 세기 측정은, 400 ㎚ 내지 460 ㎚의 여기파장(excitation wavelength), 구체적으로는 410 ㎚ 내지 450 ㎚의 여기파장으로 빛을 조사하여 470 ㎚ 내지 570 ㎚의 발광파장(emission wavelength), 구체적으로는 480 ㎚ 내지 550 ㎚, 더욱 구체적으로는 500 ㎚ 내지 540 ㎚의 발광파장을 갖는 형광파장을 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
따라서, 본 발명은 루마진 단백질과 루마진 리간드가 결합하는 경우 루마진 단백질에 비하여 강한 형광을 나타내므로, 상기 형질전환체를 포함하는 형질전환체는 표지(reporter) 미생물로 활용 가능하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
재조합 플라스미드의 제조
본 발명의 형질전환에 사용하기 위하여 루마진 단백질을 코드하는 유전자와 리보플라빈 생합성 유전자를 포함하는 벡터를 제조하였다.
구체적으로, 오페론 주형 유전자를 제공하기 위한 플라스미드로서 고초균(Bacillus subtilis)의 리보플라빈 생합성 오페론이 삽입되어 있는 pRFN4 재조합 플라스미드를 사용하였다. 이때, 리보플라빈 오페론 내의 ribE 유전자로부터 발현되는 아미노산 중에서 두 번째 잔기인 페닐알라닌을 알라닌으로 돌연변이 시켰다. 다음으로, 루마진 단백질은 포토박테리움 레이오그나티(Photobacterium leiognathi )로부터 유래한 서열번호 1의 N-말단 루마진 단백질(N-terminal lumazine protien, N-LumP) 또는 서열번호 2의 전체 루마진 단백질(whole lumazine protein, W-LumP)을 사용하였다. 루마진 단백질을 암호화하는 유전자의 증폭을 위하여 pPhl36 플라스미드 및 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 사용하였으며, 이때 사용된 프라이머는 아래 [표 1]과 같다. 또한 P . leiognathi 유래의 luxC 프로모터를 삽입하였다. 루마진 단백질을 암호화하는 유전자, pRFN4 및 luxC 프로모터를 EcoRI 과 BamH1로 절단한 뒤 라이게이션(ligation) 하였다.
| 유전자 | 프라이머 서열 | 서열번호 | |
| Pl-LumP | 정방향 | 5'-GGAGACCACAACGAATTCCCTCTA G-3' | 7 |
| Pl-N-LumP | 역방향 | 5'-CAGAAAACCTGGGATCCTTCTATTCTATTGC-3' | 8 |
| Pl-W-LumP | 역방향 | 5'-GCTTGGGCTGGATCCGTTAATCACTAC-3’ | 9 |
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 벡터를 제조하였다.
재조합 플라스미드를 포함하는 형질전환체의
형광세기
측정
[실시예 1]에서 제조한 재조합 플라스미드를 포함하는 형질전환체의 형광세기를 측정하고자 하였다.
구체적으로, [실시예 1]에서 제조한 재조합 플라스미드들을 E.coli Xl-1에 형질전환 시켰다. 버퍼 A(Buffer A; 트리스아미노메테인(Tris-HCl) 50 mM, 디티오트레이톨(Dithiothreitol, DTT) 0.5 mM, 에틸렌다이아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) 0.5 mM, pH 7.2)를 사용하여 여기파장(excitation wavelength)을 410 ㎚으로 하여 형광분광광도계(fluorescence spectrometer; Perkin Elmer LS 45)로 측정하였다. 또한, 상기 형질전환체들의 형광세기를 인산완충식염수(phosphate-buffered saline buffer, PBS buffer; pH 7.4)를 사용하여 여기파장을 410 nm의 파장에서 다기능효소면역분석기(HTS multi label reader)로 측정하였다.
이때, 각 시료는 E. coli Xl-1(Xl-1, 이하 대조군 1), pRFN4가 포함된 E. coli Xl-1(pRFN4 in Xl-1, 이하 대조군 2), E. coli 43R(43R, 이하 대조군 3), pRFN4가 포함된 E. coli 43R(pRFN4 in 43R, 이하 대조군 4), Pl-W-LumP를 발현하는 E. coli Xl-1(Pl-W-LumP of pRFN4 in Xl-1, 이하 실험군 1) 및 Pl-N-LumP를 발현하는 E. coli Xl-1(Pl-N-LumP of pRFN4 in Xl-1, 이하 실험군 2), Pl-W-LumP를 발현하는 E. coli 43R(Pl-W-LumP of pRFN4 in 43R, 이하 실험군 3), Pl-N-LumP를 발현하는 E. coli 43R(Pl-N-LumP of pRFN4 in 43R, 이하 실험군 4)를 사용하였다.
그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이 실험군 2의 형광세기가 대조군 1의 형광세기에 비하여 22배 강한 것으로 나타났다. 또한, 도 3b에서 나타난 바와 같이 실험군 2의 형광세기가 대조군 1의 형광세기에 비하여 4배 이상 강한 것으로 나타났다.
재조합플라스미드를 포함하는 형질전환체별 형광세기 비교
[실시예 1]에서 제조된 재조합플라스미드를 포함하는 형질전환체의 종류 및 파장 길이별로 형광세기를 측정하고자 하였다.
구체적으로, [실시예 1]에서 제조한 재조합 플라스미드들을 E.coli Xl-1 또는 43R에 형질전환 시켰다. 버퍼 A(Buffer A; 트리스아미노메테인(Tris-HCl) 50 mM, 디티오트레이톨(Dithiothreitol, DTT) 0.5 mM, 에틸렌다이아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) 0.5 mM, pH 7.2)를 사용하여 여기파장을 410 ㎚ 및 450 ㎚의 파장에서 형광분광광도계(fluorescence spectrometer; Perkin Elmer LS 45)로 측정하였다.
그 결과, 도 4에서 나타나는 바와 같이 410 ㎚ 및 450 ㎚의 여기파장 모두 실험군 4의 형광세기가 가장 강한 것으로 나타났다.
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<213> Photobacterium leiognathi
<400> 1
Met Phe Arg Gly Ile Val Gln Gly Arg Gly Val Ile Arg Ser Ile Ser
1 5 10 15
Lys Ser Glu Asp Ser Gln Arg His Gly Ile Ala Phe Pro Glu Gly Met
20 25 30
Phe Gln Leu Val Asp Val Asp Thr Val Met Leu Val Asn Gly Cys Ser
35 40 45
Leu Thr Val Val Arg Ile Leu Gly Asp Met Val Tyr Phe Asp Ile Asp
50 55 60
Gln Ala Leu Gly Thr Thr Thr Phe Asp Gly Leu Lys Glu Gly Asp Gln
65 70 75 80
Val Asn Leu Glu Ile His Pro Lys Phe Gly Glu Val Val Gly Arg Gly
85 90 95
Gly Leu Thr Gly Asn Ile Lys Gly Thr Ala Leu Val Ala Ala Ile Glu
100 105 110
<210> 2
<211> 190
<212> PRT
<213> Photobacterium leiognathi
<400> 2
Met Phe Arg Gly Ile Val Gln Gly Arg Gly Val Ile Arg Ser Ile Ser
1 5 10 15
Lys Ser Glu Asp Ser Gln Arg His Gly Ile Ala Phe Pro Glu Gly Met
20 25 30
Phe Gln Leu Val Asp Val Asp Thr Val Met Leu Val Asn Gly Cys Ser
35 40 45
Leu Thr Val Val Arg Ile Leu Gly Asp Met Val Tyr Phe Asp Ile Asp
50 55 60
Gln Ala Leu Gly Thr Thr Thr Phe Asp Gly Leu Lys Glu Gly Asp Gln
65 70 75 80
Val Asn Leu Glu Ile His Pro Lys Phe Gly Glu Val Val Gly Arg Gly
85 90 95
Gly Leu Thr Gly Asn Ile Lys Gly Thr Ala Leu Val Ala Ala Ile Glu
100 105 110
Glu Asn Asp Ala Gly Phe Ser Val Leu Ile Asp Ile Pro Lys Gly Leu
115 120 125
Ala Glu Asn Leu Thr Val Lys Asp Asp Ile Gly Ile Asp Gly Ile Ser
130 135 140
Leu Pro Ile Thr Asp Met Ser Asp Ser Ile Ile Thr Leu Asn Tyr Ser
145 150 155 160
Arg Asp Leu Leu Ala Ser Thr Asn Ile Ala Ser Leu Ala Lys Asp Val
165 170 175
Lys Val Asn Val Glu Ile Leu Asn Glu Trp Leu Thr Asp Pro
180 185 190
<210> 3
<211> 103
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ribE_F2A_mutant
<400> 3
Met Ala Thr Gly Ile Ile Glu Glu Thr Gly Thr Ile Glu Ser Met Lys
1 5 10 15
Lys Ala Gly His Ala Met Ala Leu Thr Ile Lys Cys Ser Lys Ile Leu
20 25 30
Glu Asp Val His Leu Gly Asp Ser Ile Ala Val Asn Gly Ile Cys Leu
35 40 45
Thr Val Thr Asp Phe Thr Lys Asn Gln Phe Thr Val Asp Val Met Pro
50 55 60
Glu Thr Val Lys Ala Thr Ser Leu Asn Asp Leu Thr Lys Gly Ser Lys
65 70 75 80
Val Asn Leu Glu Arg Ala Met Ala Ala Asn Gly Arg Phe Gly Gly His
85 90 95
Phe Val Ser Gly His Val Asp
100
<210> 4
<211> 1405
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 4
atggaagagt attatatgaa gctggcctta gatcttgcga agcagggcga aggacagacc 60
gaatccaatc cgctcgtcgg cgctgttgtc gtaaaggacg gacaaattgt cggaatgggc 120
gcccatttaa aatatggtga agctcatgca gaagttcatg ccatccatat ggctggagca 180
catgcagagg gtgccgacat ttacgttaca ctcgaaccgt gcagccatta cggaaaaaca 240
ccgccatgtg cagaattgat tatcaactct ggtatcaaaa gagtgttcgt ggcgatgaga 300
gatcctaatc cgcttgtggc tggaagaggg atcagcatga tgaaagaagc tggcattgag 360
gtaagggaag gcatcctggc agaccaggcg gagaggctga atgaaaaatt tctgcacttt 420
atgaggacag gccttccgta cgtcacgcta aaagcggctg ccagccttga cggcaagata 480
gctaccagca cgggtgacag caaatggatc acgtcagagg ctgcaagaca ggatgctcag 540
caatacagga aaacacacca aagcatttta gtcggagttg gcacagtgaa agccgacaat 600
ccgagcttaa cctgcagact gccgaatgta acaaaacagc cggttcgggt catacttgat 660
accgtactct cgattcctga ggacgctaaa gtgatttgcg atcaaatagc gccgacatgg 720
atttttacga cggcacgcgc agacgaggaa aagaaaaaac ggctttcagc tttcggagtg 780
aacatattta cacttgaaac cgagcgcatt caaattcctg atgttttgaa gatcctagcg 840
gaagaaggca tcatgtcggt gtatgtggaa ggcggttcag ctgttcacgg aagctttgtc 900
aaagaaggct gttttcaaga aatcatcttc tattttgccc ctaaactaat cggaggaacg 960
catgctccca gcttaatctc cggtgaaggt tttcaatcaa tgaaagatgt ccccttatta 1020
caattcactg atataaccca aatcggccgt gatatcaaac tgacggcaaa accgacaaag 1080
gaataggatg gtgatcatgt ttacaggaat tatcgaagaa acaggcacaa tcgaatccat 1140
gaaaaaagca gggcatgcaa tggccttaac tattaaatgc tcaaagattt tagaggatgt 1200
tcatcttggc gacagcattg cagtgaacgg catttgtctg actgtcactg attttacaaa 1260
aaatcaattc acagtggatg ttatgcctga aacagtcaaa gctacgtcac tgaatgattt 1320
aacaaaagga agcaaagtaa atctggaaag agcgatggcg gcaaacggcc gtttcggagg 1380
ccatttcgtc tcaggccatg tcgac 1405
<210> 5
<211> 309
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 5
atgtttacag gaattatcga agaaacaggc acaatcgaat ccatgaaaaa agcagggcat 60
gcaatggcct taactattaa atgctcaaag attttagagg atgttcatct tggcgacagc 120
attgcagtga acggcatttg tctgactgtc actgatttta caaaaaatca attcacagtg 180
gatgttatgc ctgaaacagt caaagctacg tcactgaatg atttaacaaa aggaagcaaa 240
gtaaatctgg aaagagcgat ggcggcaaac ggccgtttcg gaggccattt cgtctcaggc 300
catgtcgac 309
<210> 6
<211> 213
<212> DNA
<213> Photobacterium leiognathi
<400> 6
gaattctaaa aaaatcagaa agattaaata taaaaatatt aaattaaaaa ctgattttat 60
taatagtgtg accaaaatct cgaatagaaa aaagaaaaaa taaattagtt atcacatcca 120
tatttcttta tctaatctga ttcagctagc tcatgcggca tagtttatac cgaaactaca 180
tactcagcat gtgcgaatac caaaggagaa ttc 213
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pl-LumP_primer_F
<400> 7
ggagaccaca acgaattccc tctag 25
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pl-N-LumP_primer_R
<400> 8
cagaaaacct gggatccttc tattctattg c 31
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pl-W-LumP_primer_R
<400> 9
gcttgggctg gatccgttaa tcactac 27
Claims (8)
- a) 포토박테리움 레이오그나티(Photobacterium leiognathi) 유래의 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 luxC 프로모터;
b) 포토박테리움 레이오그나티(Photobacterium leiognathi) 유래의 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 N-LumP 루마진 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 W-LumP 루마진 단백질을 코딩하는 유전자; 및
c) 고초균(Bacillus subtilis) 유래의 돌연변이된 리보플라빈 오페론;
을 포함하며 상기 리보플라빈 오페론 중 ribE는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 코딩하는 생물 발광 유도용 재조합 플라스미드.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 재조합 플라스미드로 형질전환된, 생물 발광용 형질 전환체.
- a) 제6항에 따른 형질전환체를 배양하는 단계; 및
b) 상기 단계 a)에서 배양한 형질 전환체 배양 배지의 형광세기를 측정하는 단계; 를 포함하는 생물 발광 분석방법으로서,
상기 단계 b)의 형광세기의 측정은, 410㎚ 내지 450㎚의 여기파장(excitation wavelength)으로 빛을 조사하여 470㎚ 내지 550㎚의 발광파장(emission wavelength)을 갖는 형광파장을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물 발광 분석방법.
- 삭제
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170130155A KR101973275B1 (ko) | 2017-10-11 | 2017-10-11 | 루마진 단백질과 리보플라빈 생합성 유전자를 이용한 형광 미생물의 제조 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170130155A KR101973275B1 (ko) | 2017-10-11 | 2017-10-11 | 루마진 단백질과 리보플라빈 생합성 유전자를 이용한 형광 미생물의 제조 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190040694A KR20190040694A (ko) | 2019-04-19 |
| KR101973275B1 true KR101973275B1 (ko) | 2019-04-29 |
Family
ID=66282506
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020170130155A KR101973275B1 (ko) | 2017-10-11 | 2017-10-11 | 루마진 단백질과 리보플라빈 생합성 유전자를 이용한 형광 미생물의 제조 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101973275B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011106001A2 (en) | 2010-02-25 | 2011-09-01 | Bioglow Inc. | Autoluminescent plants including the bacterial lux operon and methods of making same |
-
2017
- 2017-10-11 KR KR1020170130155A patent/KR101973275B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011106001A2 (en) | 2010-02-25 | 2011-09-01 | Bioglow Inc. | Autoluminescent plants including the bacterial lux operon and methods of making same |
Non-Patent Citations (12)
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| European Journal of Biochemistry (1997) 245:790-796 |
| Journal of Bacteriology (2015) 197(23):3676-3685 |
| Korean Journal of Microbiology (2013) 49(2):205-210 |
| NCBI GenBank: AY386222.1 (2004.10.06.)* |
| NCBI GenBank: CAA39879.1 (2016.07.26.)* |
| NCBI GenBank: EF536344.1 (2016.07.26.)* |
| The Journal of Organic Chemistry (2004) 69:5588-5594* |
| The Korean Journal of Microbiology (2005) 41(4):306-311 |
| The Korean Journal of Microbiology (2011) 47(1):14-21 |
| 강경숙, "Biochemical Properties of N-Terminal Domain of Lumazine Protein from Photobacterium leiognathi", 석사학위논문, 충남대학교 (2008) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20190040694A (ko) | 2019-04-19 |
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