CN105585625B - 一种增强型绿色荧光蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种比EGFP更增强型的绿色荧光蛋白GFPspark，其特征在于由SEQ.ID.NO：13所示EGFP的氨基酸序列中包含了Q81K，V164A，I168V这3个位点的突变。本发明还提供了编码所述蛋白质的多核苷酸序列SEQ.ID.NO：6。本发明中增强型绿色荧光蛋白的荧光亮度比EGFP强1.25倍，蛋白成熟速度比EGFP快2.1倍，光成熟速度比EGFP强1.2倍。该增强型荧光蛋白可应用于多个领域的研究，例如作为监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记。用GFPSpark融合目的蛋白基因的表达可以获得更明显的亮度照片，更易于目的蛋白表达的定位和相互作用。

Description

一种增强型绿色荧光蛋白

技术领域

本发明涉及一些新的荧光蛋白，本发明的荧光蛋白是对来自大型多管水母的增强型绿色荧光蛋白多肽(EGFP)的改造，所得新型荧光蛋白与EGFP具有相同的激发和发射光谱，但其荧光强度更强、成熟更快，其特征在于由SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列中Q81K，V164A，I168V位置上至少具有一个氨基酸替换的氨基酸序列所组成。本发明还涉及上述荧光蛋白基因的克隆、表达及应用。

背景技术

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一类存在于包括水母、水媳和珊瑚等腔肠动物的生物发光蛋白，当受到特定光谱激发时，GFP发射绿色荧光。最初是由Chalfie分离自Aequorea Victoria(美国专利5,491,084)。Ward和Chalfie在PCT公布WO95/21191中报道对其氨基酸序列作了修饰以增加其亮度。

在Chalfie等首先异源表达出野生型GFP基因之后不久，美国Tsien研究小组就通过随机突变从表达GFP的大肠杆菌中筛选出了几株荧光强度更强的和/或荧光光谱改变的GFP变体，随后该研究小组及其他研究小组又通过类似方法筛选出一些理化、生物学性质有所改变的变体，如荧光强度增强的GFP(EGFP)、光谱变异的GFP、易表达的GFP。EGFP为增强型GFP荧光蛋白，它是在大型水母GFP的蛋白序列上包含了4个氨基酸的突变(F64L，S65T，A72S和H231L)。该突变可以明显提高在最大激发峰下的摩尔消光系数，将亮度提高2.08倍(表1)。突变GFP的序列，使其蛋白结构更易于成熟，荧光基团也更易于成熟将明显提高荧光蛋白的亮度。

表1：GFP和EGFP蛋白的亮度参数

GFP的变体可作为细胞内基因表达的报告基因，研究基因表达的调控。GFP荧光蛋白的检测极其方便，一旦正确折叠形成晶体，利用蓝光激发就可以检测到它的表达，因此gfp及其变体作为报告基因具有不需要底物和辅助因子的优越性。可以构建各种缺失了启动子或增强子序列的gfp载体，利用它们来作为荧光作为测定组织特异性启动子和特殊的增强子。

利用已知技术易于将编码目的蛋白的核苷酸序列与gfp DNA突变体在氨基末端或羧基末端相连，从而制备融合蛋白。GFP及其变体可作为其他蛋白的分子标记，与其他蛋白融合表达，监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记及疾病诊断等。

为了进一步获得新的荧光强度增强的GFP变体，本发明人采用新型体外突变技术“DNA重排(DNA shuffling)技术”结合“基因突变技术”对现有的增强型EGFP上进行定点饱和突变和随机突变，然后通过DNA重排建库，筛选得到突变体GFPSpark。

发明内容

本发明的一个方面，提供了一种更稳定的增强型荧光蛋白，其特征在于SEQ.ID.NO：13所示氨基酸序列，与EGFP相比，包含了Q81K，V164A，I168V位置上由相应氨基酸替换的序列所组成。与亲本蛋白相比，所述荧光蛋白在37℃条件下表达蛋白成熟更快，产生的荧光强度更高，在哺乳动物细胞中能获得良好表达。

本发明的又一方面，还提供了上述项荧光蛋白与目的基因融合在一起表达，用于检测细胞内基因表达、蛋白定位的标记等用途。该更稳定的增强型荧光蛋白比EGFP能激发出更强的亮度，指导蛋白的表达和细胞定位。

附图说明

图1：HPLC检测EGFP和GFPSpark的纯度，如图所示EGFP(图A)和GFPSpark(图B)的SEC-HPLC结果为94.58％和96.51％，HPLC显示两种蛋白的纯度较好，结构相同，均为单体结构。

图2：SDS-PAGE检测EGFP和GFPSpark的纯度及大小，如图所示EGFP和GFPSpark两种蛋白的纯度较好，大小与预测一致。

图3：GFPSpark蛋白的荧光光谱测定，其中横轴为波长，纵轴为荧光强度，由图可看到，本发明GFPSpark蛋白的激发峰为487nm，发射峰为508nm。

图4：EGFP和GFPSpark的pH稳定性测定，图片显示EGFP的pka为5.0，GFPSpark的pka为4.5。

图5：真核细胞内亚细胞器的pH值情况。

图6：EGFP和GFPSpark的消光系数检测，图片是依据检测进行的曲线拟合计算，EGFP的消光系数为39000，GFPSpark的消光系数为47000。

图7：EGFP和GFPSpark的量子产率检测，图片显示检测时扫描的波谱图。以EGFP的量子产率0.60为参照，计算得到GFPSpark的量子产率为：0.62。

图8：变性后的EGFP和GFPSpark的再折叠检测，EGFP和GFPSpark的荧光基团成熟检测。图A显示EGFP和GFPSpark的再折叠速率分别为：570s和270s；图B显示EGFP和GFPSpark的荧光基团成熟速率分别为：1560s和1305s。

图9：荧光蛋白的光漂白特性检测，图片显示了荧光蛋白在紫外光作用下荧光稳定性的变化趋势。

图10：GFPSpark与目的基因融合表达载体示意图，图A为GFPSpark放在目的基因N端表达的载体示意图，图B为GFPSpark放在目的基因C端表达的载体示意图。

图11：在Hela细胞系中，线粒体蛋白AK4与GFPSpark融合蛋白(图A)和AK4与EGFP融合蛋白(图B)表达荧光图像。

图12：在Hela细胞系中，细胞骨架蛋白TUBB与GFPSpark融合蛋白表达的荧光图像。

图13：在Hela细胞系中，高尔基体蛋白GOLM1与GFPSpark融合蛋白表达的荧光图像。

具体实施方式

实施例1.GFP突变文库的构建：

通过Discovery studio4.0蛋白结构分析软件对EGFP(氨基酸序列见SEQ.ID.NO：1)结构的分析，找出可能影响GFP结构的32个位点，这32个位点是：D20，K27，S31，T39，Y40，F47，I48，V69，S73，Q81，A88，F100，N106，K108，D118，L126，E143，M154，V164，I168，I172，D174，S176，L179，G190，L195，Q205，A207，K215，M219，V225，L232。按照间隔的点突变，将这32个点错开分成8组。分别对每组每个位点的氨基酸序列做饱和突变，这样得到了8组饱和突变的基因库编号为mut1-8；同时用易错PCR方法(error prone PCR)对EGFP基因进行随机突变，得到一组突变基因库，mut-9；将这9组突变基因的PCR混合物采用DNA Shuffling的方法进行随机重组，获得最终的GFP突变片段，插入pET24载体，建立EGFP-DS1文库，筛选荧光强度高的突变型。

Mut1-8库的构建方法为：分别在首尾引物中设计BamHI，PstI位点，上游引物序列是FP-Bam-F：5′GGAGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG 3′(SEQ.ID.NO：2)，下游引物序列FP-Pst-R：5′GGACTGCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG 3′(SEQ.ID.NO：3)。突变氨基酸正向饱和引物设计是“NNK”，反向饱和引物设计是“NNM”，这样每组基因需要设计4对突变引物，以质粒pcDNA3-EGFP为模板(核苷酸序列为SEQ.ID.NO：4)分段扩增，然后用重叠PCR法以首尾引物组合成完整的mut1-mut8突变PCR产物。

Mut9库的构建方法为：同样用FP-Bam-F/FP-Pst-R引物以质粒pcDNA3-EGFP为模板进行易错PCR扩增全长EGFP基因，随机引入突变位点，易错PCR条件为：6mM MgCl₂和5mMMnCl₂存在下，将dATP，dGTP，dCTP，dTTP按不同比例混合[2mM dGTP，2mM dATP，(10，15，20)mM dCTP和(10，15，20)mM dTTP]，进行易错PCR，循环条件为：94℃，5min；94℃30s，55℃30s，72℃50s，30个循环；72℃，5min。

GFP-DS1文库的构建方法为：分别取10ug mut1-8和10ug mut9的PCR产物混合后用DNaseI完全消化成小于300bp的条带，琼脂糖凝胶回收50-200bp间的条带。取200ng胶回收纯化的50-200bp的DNA混合物，加入5ul 10xTaq buffer，2μl dNTP，0.5μl taq酶，进行拼接，循环条件为：94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃50s，25个循环；72℃，5min。取10μl上面的PCR产物，其为模板，加入10μl 10xTaq buffer，4μl dNTP，1μl taq酶和首尾引物2μl 10μMFP-Bam-F/FP-Pst-R，至进行扩增，循环条件为：94℃，5min；94℃30s，60℃30s，72℃50s，30个循环；72℃，5min。扩增完成后，胶回收纯化720bp条带，经BamHI+PstI双酶切后与经同样双酶切的pET24载体进行连接反应，电转XL1-Blue细胞，加入1ml SOC培养基于37℃，180rmp培养40min复苏细胞，取500μl涂LB-AT(Amp与Tet抗性)平皿，平均5μl涂一块平皿，37℃培养14h拿出平皿，放室温观察。剩余部分菌液加入甘油于-20℃保存。

同时用引物FP-Bam-F/FP-Pst-R以质粒pcDNA3-EGFP为模板扩增EGFP基因，胶回收纯化720bp条带，经BamHI+PstI双酶切后，克隆到pET24载体，转化XL1-Blue细胞，取10μl转化产物涂布于LB-AT(Amp与Tet抗性)平皿，做对照克隆用。

实施例2.GFP突变克隆的筛选

配制ZYM-AT自诱导培养基，96孔深孔板，每孔加入200ul ZYM-AT培养基。观察平皿，将较亮的绿色菌落用记号笔圈出来，然后将这些较亮的绿色菌落挑出来接种至96孔板中，每块深孔板的第一孔接入pET24-EGFP，作为对照克隆，一共挑了950个克隆，即10块深孔板，所有深孔板放入37℃，200rpm摇床培养16h。

将过夜表达菌液用PBS稀释5倍(20μl菌液+80μl PBS)，用微孔板检测系统SpectraMax M5进行检测，先用波长扫描对96孔板样品进行粗略扫描，扫描结果显示，所有突变体的激发峰在480-495nm之间，发射峰在500-510nm之间。将激发峰设成485nm，发射峰505nm，对所有样品进行检测，测定每个样品的荧光值。经过大量筛选，获得了15株荧光值比EGFP高1.1倍的突变型，对这15株突变型进行测序。经测序分析，这15株突变型的序列与EGFP的有1-13个氨基酸的突变。

实施例3.GFP二轮DS文库的构建和筛选

分别以上例15株突变型为模板，用FP-Bam-F/FP-Pst-R扩出每个突变株的序列，各取10μg纯化的PCR产物，用DNaseI处理后，胶回收50-200bp的DNA片段，按照实施例1的方法重新组合拼装获得新的EGFP-DS2PCR产物，经BamHI+PstI双酶切后，克隆到pET24载体，转化XL1-Blue细胞，得到pET24-GFP-DS2库。

按照上述相同的筛选方法，对pET24-GFP-DS2库的克隆进行筛选，获得了6株是EGFP 1.4倍荧光值的突变株，对这6株突变型进行测序，结果见表2。

表2：6株突变型信息

实施例4.在哺乳动物细胞中荧光蛋白突变体的表达情况分析

GFP突变型真核表达载体的构建和表达：用引物FP-Bam-F：5′GGAGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG 3′(SEQ.ID.NO：11)和FP-Xba-R：5′GGATCTAGATTACTTGTACAGCTCG TCCATGCCG3′(SEQ.ID.NO：12)分别以这6株突变型和pcDNA3-EGFP为模板扩增荧光蛋白基因，经BamHI+XbaI双酶切构建到真核表达载体pCMV3中，鉴定得到正确荧光蛋白表达质粒。选择HEK-293E、Hela细胞来验证这些荧光蛋白在哺乳动物细胞中的表达情况。HEK-293E、Hela细胞分别用含10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃及5％二氧化碳条件下培养。质粒转染前，将细胞(1×10⁵个细胞/孔)接种于24孔板中，24小时培养后，细胞密度达到70％～90％开始转染。2μg DNA与4μl各用50μl PEI/DNA反应缓冲液(如没有特殊说明，配方均为25mmol/LHepes，150mmol/L NaCl，pH 7.1)稀释，将稀释后的PEI逐滴加入DNA溶液中，立即振荡混匀，室温静置30min后，将混合液加到铺有细胞的24孔板中，摇动混匀后于5％二氧化碳的培养箱中37℃培养。分别于16h、24h、48h、72h用荧光显微镜观察荧光，并拍摄照片。结果试验显示：aGFP4-6在真核细胞中荧光最亮，而且成熟时间最快，16h就能见到荧光。将aGFP4-6(SEQ.ID.NO：13)作为备选克隆，命名为GFPSpark。

实施例5.突变型GFPSpark荧光蛋白性质的测定

1.突变型GFPSpark荧光蛋白的生产：

取pET24-GFPSpark和pET24-EGFP质粒的XL1-Blue保种液，按接种量0.5％接种于装有2ml的MDG培养基的试管中。置于37℃，240rpm摇床中培养过夜。再按接种量1％接种于装有10ml的MDG培养基中，在37℃，240rpm摇床中培养约6h。将培养好的种子按接种量1％接种于装有200ml的ZYM-5052培养基中，在37℃，240rpm摇床中培养过夜。6500rpm离心15min收获菌体(BECKMAN COULTER Avanti@J-26XPI)，按菌体与缓冲液＝1∶20加入裂解缓冲液Buffer A(50mM Tris，pH：8.0，500mMNaCl)，搅拌混匀，高压均质机破碎(ATS)，200Pa两次，800Pa一次，12000rpm离心30min收集上清(BECKMAN COULTER Allegra TM 64RCentrifuge)，0.45um滤膜过滤获得上清液，将样品用恒流泵上buffer A已平衡的Ni柱，再用buffer A平衡UV至基线，分步阶段洗脱，10％～100％ buffer(50mM Tris，pH：8.0，500mMNaCl，500mM Imidazole)，分别收集各个洗脱峰。将SDS-PAGE电泳纯度合格的组分过Sephadex G-25Fine脱盐至PBS。

纯化蛋白采用SEC-HPLC分析蛋白的分子量大小，采用SEC-HPLC分析荧光蛋白的颗粒大小，EGFP的HPLC的出峰时间为16.974分钟，GFPSpark的HPLC的出峰时间为16.988分钟(图1)。该结果显示GFPSpark蛋白和EGFP蛋白一样，均为单体的结构。采用SDS-PAGE电泳分析蛋白条带大小，显示EGFP和GFPSpark分子量大小相同，均为28kb(图2)。

2.GFPSpark荧光蛋白发射峰和激发峰的测定：

采用Varian Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer对GFPSpark的发射光谱进行测定，具体方法如下：1)激发光谱扫描：发射波长设为0，扫描激发光谱A(设激发波长扫描范围为200～700nm)；2)荧光发射光谱：找出吸收最强(或次强)对应的波长作为激发波长，全波长扫描发射光谱(设发射波长扫描范围为激发波长+5nm～700nm)；3)荧光激发光谱：找出吸收最强(或次强)对应的波长作为发射波长，全波长扫描激发光谱；结果测定GFPSpark的最大激发波长487nm与最佳发射波长509nm(图3)。该波长与EGFP的最大激发波长488nm，最大发射波长508nm几乎一致。

3.GFPSpark荧光蛋白pH稳定性测定

pH稳定性测定方法为：配置pH3至pH12的缓冲液备用，用配置好的缓冲液将荧光蛋白稀释至20μg/ml，用荧光蛋白的最大激发波长激发，用最大发射波长检测荧光信号；记录相应pH值下的荧光信号值，将荧光信号最强的值定义为100％，计算出相应pH值下的荧光强度百分比，将50％荧光强度下的pH值定义为pKa。EGFP的pka为5.0，略低于文献表达的5.9值(DMITRIY M，Physiol Rev，2010，90：1103-1163)，GFPSpark的pka为4.5(图4)。该结果表明相比EGFP，GFPSpark的荧光能更好的耐受细胞中各酸性的亚区域环境(图5)，并且GFPSpark的pKa也优于evrogen公司的turboGFP(pKa＝5.2)。

4.GFPSpark荧光蛋白消光系数的测定

依据消光系数的计算公式：e＝A/bc其中e为消光系数；A为吸光度；c为溶液中物质的浓度；b光在溶液中的光程。利用BCA法检测生产的荧光蛋白的浓度，依据测定的浓度，将重组的EGFP和GFPSpark重组蛋白样品用pH8.0的Tris-Cl缓冲液稀释至10ug/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml和160μg/ml。装样于1cm光程比色皿中在SpectraMax M5多功能酶标仪上检测波长为487nm的吸光值；依据检测的吸光值和对应荧光蛋白的摩尔浓度作图，拟合直线，从计算公式中读取消光系数值。图6显示EGFP的消光系数为39000，GFPSpark的消光系数为47000。该结果表明GFPSpark的光吸收比EGFP强1.2倍。

5.GFPSpark荧光蛋白量子产率测定

本研究通过参比法检测荧光蛋白量子产率，参比的蛋白为EGFP，根据文献报道其EGFP的量子产率为0.60(Heim et al.，Current Biology，1996，6(2)：178-182；Mitra etal.，Gene，1996，173(1)，13-17)。量子产率的公式为：Yu＝Ys*Fu/Fs*As/Au；Yu、Ys为待测物质和参比物质的量子产率；Fu、Fs为待测物质和参比物质的积分荧光强度；As，Au为待测物质和参比物质在选定激发波长下的吸光值(A＝ebc)。荧光样品用pH8.0的缓冲液稀释至20μg/ml在选定的激发波长条件下，用1cm光程比色皿中检测吸光值；同时将该样品在选定波长条件下，进行波谱扫描，导出实验数值，整理后作图，进行波谱积分。将检测获得的吸光值，积分荧光强度，参比物的量子产率值带入公式计算获得待测物质的量子产率。计算得到GFPSpark的量子产率为：0.62(图7)。该量子产率也比EGFP为0.6的值高。

6.GFPSpark荧光亮度测定

荧光的亮度由荧光蛋白的消光系数和量子产率2个参数决定，其值等于消光系数×量子产率，根据GFPSpark和EGFP蛋白的测量值计算，GFPSpark的亮度(47000*0.62＝29140)比EGFP的亮度(39000*0.6＝23400)高1.25倍。

7.GFPSpark荧光蛋白荧光蛋白重折叠速率测定

荧光蛋白重折叠实验方法为：荧光蛋白样品在变性缓冲液(8M urea，1mMdithiothreitol)中，95℃.恒温5min变性；变性样品以100倍稀释至复性缓冲液(35mM KCl，2mM MgCl₂，50mM Tris pH 7.5，1mM DTT)。在激发光条件下，检测荧光值随时间的变化，检测至荧光值上升不明显时停止检测；以最大荧光信号值为100％，计算不同时间点的荧光活性百分比。将50％荧光活性比例对应的时间值定义为荧光蛋白重折叠速率。根据该方法，检测EGFP的重折叠速率为570秒，而GFPSpark的重折叠速率为270秒，比EGPF快2.1倍(见图8中的A图)。该结果表明GFPSpark的蛋白成熟速率明显优于EGFP，可在更短的时间内发出荧光。

8.GFPSpark荧光蛋白的荧光成熟速率测定

荧光蛋白荧光成熟实验方法为：荧光蛋白样品在变性缓冲液(8M urea，1mMdithiothreitol，5mM dithionite)中，95℃.恒温5min变性；变性样品冷却至25℃，添加5mMdithionite后，放置5min；重复95℃.恒温5min变性；变性样品以100倍稀释至复性缓冲液(35mM KCl，2mM MgCl₂，50mM Tris pH 7.5，1mM DTT)。在激发光条件下，检测荧光值随时间的变化，检测至荧光值上升不明显时停止检测；以最大荧光信号值为100％，计算不同时间点的荧光活性百分比。将50％荧光活性比例对应的时间值定义为荧光蛋白成熟速率。根据该方法，检测EGFP的荧光基团成熟速率为1560秒，而GFPSpark的荧光基团成熟速率为1305秒，比EGPF快1.2倍(见图8中的B图)。该结果表明GFPSpark的蛋白成熟速率明显优于EGFP，可在更短的时间内发出荧光。

9.GFPSpark荧光蛋白的光漂白特性检测

荧光蛋白的光漂白实验方法为：用pH8.0的Tris-Cl缓冲液配置用50μg/ml的EGFP和GFPSpark样品，样品放置与紫外灯下连续照射，每间隔15h取样检测荧光信号。将初始荧光值作为100％，根据不同时间取样检测的信号计算光漂白样品的荧光信号百分比。以荧光信号百分比和时间作图，分析荧光蛋白强光下的失活情况。结果表明EGFP的光稳定性强于GFPSpark(图9)。

实施例6.荧光蛋白融合蛋白表达载体的构建和表达

将线粒体上蛋白AK4、细胞骨架蛋白TUBB和高尔基体蛋白GOLM1的ORF(无终止密码子)基因序列用各自的特异引物扩增出来，并在上下游引物上分别引入HindIII和NheI位点，通过HindIII+NheI双酶切构建到pCMV3-N-GFPSpark或pCMV3-C-GFPSpark(图10)载体中，使之与GFPSpark形成融合表达形式。将这些融合质粒转染Hela细胞，转染方法同上。表达24h后检测，用共聚焦荧光显微镜观察荧光，并拍摄照片。试验显示：GFPSpark能够与这些基因融合表达，GFPSpark能应用于真核细胞的定位，其荧光亮度比EGFP更强(图11)，而且对融合表达目的基因的折叠没有影响(图12，图13)。

Claims (7)

1.一种增强型绿色荧光蛋白GFPSpark，其特征在于：

a)氨基酸序列为SEQ.ID.NO:13；

b)包含三个位点的氨基酸突变的组合：Q81K,V164A,I168V；

c)具有更强的荧光亮度；

d)具有更快的荧光蛋白和荧光基团的成熟速度。

2.一种定位蛋白细胞器和/或细胞外表达的方法，该方法包括：

a)采用基因工程技术将目的蛋白基因和编码权利要求1所述的增强型绿色荧光蛋白GFPSpark的基因序列SEQ.ID.NO:6融合；

b)将a)的融合基因序列插入到适合的表达载体中；

c)将融合蛋白表达载体转染细胞，并在上述细胞的最适培养条件下培养合适的时间；

d)在权利要求1所述荧光蛋白的最佳激发光谱下观察目的蛋白在细胞中的表达定位。

3.权利要求2所述的方法，其中序列SEQ.ID.NO:6在目的基因的C端或N端进行融合表达。

4.权利要求2所述的方法，其中适用的表达载体为哺乳动物真核表达载体pCMV3。

5.权利要求2所述的方法，其中适用的表达载体选自细菌，昆虫，酵母和慢病毒表达载体。

6.权利要求2所述的方法，其中适用的表达细胞系选自哺乳动物细胞，昆虫细胞，酵母细胞和细菌。

7.权利要求2所述的方法，其用于检测蛋白的表达定位，蛋白间的相互作用，表达元件的功能，细胞器指示功能。

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