CN109734815A - 一种增强型荧光蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种增强型荧光蛋白，包括：以引物E1、E2克隆EGFP基因后，利用引物上的Bsa Ⅰ、Not Ⅰ酶切位点将片段制备出粘性末端；利用连接酶将基因插入相应的SUMO载体，获得的重组载体pSUMO‑EGFP；将构建好的pSUMO‑EGFP转化Rosetta(DE3)；挑取单克隆于LB培养基，氨苄青霉素120mg/L，37℃培养过夜；在纯化后的SUMO‑EGFP内加入用于引导SUMO‑EGFP表达的信号肽序列或信号肽序列的突变序列或信号肽序列的嵌合序列，得到增强型的SUMO‑EGFP。增强型荧光蛋白可应用于多个领域的研究，例如作为监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种增强型荧光蛋白。
背景技术
荧光蛋白作为分子标签，在分析生物技术和细胞内分子示踪方面具有广泛的应用。尤其是在细胞分子影像的应用方面，可以通过融合蛋白技术，将荧光蛋白融合到细胞内的某个靶标蛋白上，以标记和分析靶标蛋白在细胞内的定位、分布和运动以及与其他细胞内分子的相互作用。荧光标签众多，如何选择荧光蛋白更好的显示靶标蛋白的示踪和功能，主要考虑以下几个方面：1)荧光蛋白表达亮度高，无毒性；2)荧光蛋白具有很好的光稳定性；3)不能选择多聚体的荧光蛋白；4)荧光蛋白不能对表达细胞或组织环境因素敏感；5)要有多通道，不相互干扰的荧光蛋白。
红色荧光蛋白drFP583(DsRed)是从Discosomasp.分离得到的(Matzetal.，NatureBiotech.17：969-973(1999)，Grossetal.，Proc.Nat′LAcad.Sci.USA97：11990-11995(2000))，其优点显而易见：可与GFP系列荧光蛋白共用，且激发和发射波长更长，细胞内成像背景低，能够与现有的共聚焦和宽视场显微镜滤光片等具有很好的包容性，红光的穿透性尤其适用于对活体动物组织的成像，因而红色荧光蛋白显得尤为重要。在哺乳动物细胞中，无论是自发荧光还是对红光区的光吸收都大为减少，因此红色荧光探针的发展对于检测厚标本和活体动物成像都是非常重要的。在后续的荧光使用中，逐渐在荧光蛋白的单体化，适应多细胞区域表达，荧光稳定性等多方面对红色荧光蛋白有了更多的需求，而DsRed为4聚体蛋白，高度聚集的形式不利于与蛋白融合表达来观察蛋白的表达定位，功能等的能力，因此开展了更大规模的红色荧光蛋白突变体筛选工作。但将DsRed突变为单体后，其光稳定性大大缩短，无法满足共聚焦的成像要求，并且由于改变了发光体的结构，容易形成更多不同颜色差异的红色荧光蛋白。因此，目前红色荧光蛋白进化的焦点集中在两个目标上，第一完善当前己有的单体红色荧光蛋白，使得它们的荧光特性或稳定性等特征进一步优化；第二是开发能发红光的荧光蛋白，甚至是发射波段处于远红外区的荧光蛋白。短短数年，对红色荧光蛋白的一系列研究，极大地丰富了荧光蛋白的光谱多样性，为细胞内的多色标记提供了更多的荧光标签。
发明内容
本发明提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种增强型荧光蛋白，增强型荧光蛋白可应用于多个领域的研究，例如作为监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记。
根据本发明实施例的第一个方面，提供一种增强型荧光蛋白，包括：
以引物E1、E2克隆增强绿色荧光蛋白EGFP基因后，利用引物上的BsaⅠ、NotⅠ酶切位点将片段制备出粘性末端；利用连接酶将基因插入相应的SUMO载体，获得的重组载体pSUMO-EGFP；
将构建好的pSUMO-EGFP转化Rosetta(DE3)；挑取单克隆于LB培养基，氨苄青霉素120mg/L，37℃培养过夜；将过夜培养物以1∶80的比例接种至0.6L的LB培养基中，35℃培养至OD600为0.4时，加入IPTG使其终浓度达0.20mmol/L，30℃继续培养5h后，离心收获菌体，得到SUMO-EGFP融合蛋白；
收获的菌体以缓冲液重悬，进行超声破碎；5℃、10000×g离心，留取细菌裂解上清并进行纯化，得到纯化后的SUMO-EGFP融合蛋白；
在纯化后的SUMO-EGFP融合蛋白内加入用于引导SUMO-EGFP融合蛋白表达的信号肽序列或信号肽序列的突变序列或信号肽序列的嵌合序列，得到增强型的SUMO-EGFP融合蛋白。
作为优选的，所述信号肽序列的突变序列或信号肽序列的嵌合序列与所述信号肽序列同源性高于20％。
作为优选的，所述的信号肽序列或信号肽序列的突变序列或信号肽序列的嵌合序列与SUMO-EGFP序列拼接形成融合荧光蛋白。
本发明提出一种增强型荧光蛋白，包括：以引物E3、E2克隆EGFP基因后，利用引物上的BsaⅠ、NotⅠ酶切位点将片段制备出粘性末端；利用连接酶将基因插入相应的SUMO载体，获得的重组载体pSUMO-EGFP；将构建好的pSUMO-EGFP转化Rosetta(DE3)；挑取单克隆于LB培养基，氨苄青霉素120mg/L，37℃培养过夜；纯化后得到SUMO-EGFP；在纯化后的SUMO-EGFP内加入用于引导SUMO-EGFP表达的信号肽序列或信号肽序列的突变序列或信号肽序列的嵌合序列，得到增强型的SUMO-EGFP。增强型荧光蛋白可应用于多个领域的研究，例如作为监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本实施例中提出一种增强型荧光蛋白，包括：
以引物E3、E2克隆增强绿色荧光蛋白EGFP基因后，利用引物上的BsaⅠ、NotⅠ酶切位点将片段制备出粘性末端；利用连接酶将基因插入相应的SUMO载体，获得的重组载体pSUMO-EGFP；
将构建好的pSUMO-EGFP转化Rosetta(DE3)；挑取单克隆于LB培养基，氨苄青霉素120mg/L，37℃培养过夜；将过夜培养物以1∶80的比例接种至0.6L的LB培养基中，35℃培养至OD600为0.4时，加入IPTG使其终浓度达0.20mmol/L，30℃继续培养5h后，离心收获菌体，得到SUMO-EGFP融合蛋白；
收获的菌体以缓冲液重悬，进行超声破碎；5℃、10000×g离心，留取细菌裂解上清并进行纯化，得到纯化后的SUMO-EGFP融合蛋白；
在纯化后的SUMO-EGFP融合蛋白内加入用于引导SUMO-EGFP融合蛋白表达的信号肽序列或信号肽序列的突变序列或信号肽序列的嵌合序列，得到增强型的SUMO-EGFP融合蛋白。
在本实施例中，菌种大肠杆菌Escherichia coli DH5α，Rosetta(DE3)用于质粒扩增及蛋白表达。
本实施例中所用的引物如下表所示：
表1 E1、E2引物
作为优选的，所述信号肽序列的突变序列或信号肽序列的嵌合序列与所述信号肽序列同源性高于20％。
作为优选的，所述的信号肽序列或信号肽序列的突变序列或信号肽序列的嵌合序列与SUMO-EGFP序列拼接形成融合荧光蛋白。
本发明提出一种增强型荧光蛋白，包括：以引物E3、E2克隆EGFP基因后，利用引物上的BsaⅠ、NotⅠ酶切位点将片段制备出粘性末端；利用连接酶将基因插入相应的SUMO载体，获得的重组载体pSUMO-EGFP；将构建好的pSUMO-EGFP转化Rosetta(DE3)；挑取单克隆于LB培养基，氨苄青霉素120mg/L，37℃培养过夜；纯化后得到SUMO-EGFP；在纯化后的SUMO-EGFP内加入用于引导SUMO-EGFP表达的信号肽序列或信号肽序列的突变序列或信号肽序列的嵌合序列，得到增强型的SUMO-EGFP。增强型荧光蛋白可应用于多个领域的研究，例如作为监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的实施例的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明的实施例进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明的实施例各实施例技术方案的范围。
Claims (3)
1.一种增强型荧光蛋白，其特征在于，包括：
以引物E1、E2克隆增强绿色荧光蛋白EGFP基因后，利用引物上的BsaⅠ、NotⅠ酶切位点将片段制备出粘性末端；利用连接酶将基因插入相应的SUMO载体，获得的重组载体pSUMO-EGFP；
将构建好的pSUMO-EGFP转化Rosetta(DE3)；挑取单克隆于LB培养基，氨苄青霉素120mg/L，37℃培养过夜；将过夜培养物以1∶80的比例接种至0.6L的LB培养基中，35℃培养至OD600为0.4时，加入IPTG使其终浓度达0.20mmol/L，30℃继续培养5h后，离心收获菌体，得到SUMO-EGFP融合蛋白；
收获的菌体以缓冲液重悬，进行超声破碎；5℃、10000×g离心，留取细菌裂解上清并进行纯化，得到纯化后的SUMO-EGFP融合蛋白；
在纯化后的SUMO-EGFP融合蛋白内加入用于引导SUMO-EGFP融合蛋白表达的信号肽序列或信号肽序列的突变序列或信号肽序列的嵌合序列，得到增强型的SUMO-EGFP融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的增强型荧光蛋白，其特征在于，所述信号肽序列的突变序列或信号肽序列的嵌合序列与所述信号肽序列同源性高于20％。
3.根据权利要求1所述的增强型荧光蛋白，其特征在于，所述的信号肽序列或信号肽序列的突变序列或信号肽序列的嵌合序列与SUMO-EGFP序列拼接形成融合荧光蛋白。
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