CN104178463A - 一种制备增强型单体细菌荧光素酶luxAB的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备增强型单体细菌荧光素酶luxAB的方法，先获得目的基因；构建重组表达载体；获得含重组表达质粒的表达菌种；诱导靶蛋白的表达及蛋白的纯化；检测纯化的增强型单体细菌荧光素酶的活性。本发明利用融合型荧光素酶其独特的优势，将luxA和luxB基因异二聚体荧光素酶基因融合并经过易错PCR突变和化学随机突变，筛选得到9个荧光强度增强的突变体，然后经过shuffling技术，得到一个增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB，将其克隆到表达载体pET28a上，转化至BL21(DE3)菌株中表达，并用温和破碎法裂解细胞，纯化表达产物，得到增强型单体细菌荧光素酶，本发明的方法过程简单、生长周期短、成本低廉、易于纯化、酶活性损失小，性能稳定，具有重要的实际应用价值。

Description

一种制备增强型单体细菌荧光素酶luxAB的方法
技术领域
本发明属于细菌荧光素酶制备领域，尤其涉及一种制备增强型单体细菌荧光素酶luxAB的方法。
背景技术
发光细菌由于其独特的生理特性，在环境监测中被作为测定环境中毒物的指标，荧光素酶在细菌发光的过程中起到至关重要的作用。
荧光素酶(英文名称：Luciferase)是生物体内催化荧光素或者脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。
荧光素酶具有灵敏性高、特异性好、反应迅速、操作简便、应用广泛，且对生物体无毒害作用等诸多优点，荧光素酶越来越多的应用于医学、分子生物学、环境监测等相关领域。其中有一种为细菌体内的荧光素酶。在相应化学反应中，荧光的产生是来自于荧光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷(ATP)。没有荧光素酶的情况下，荧光素与氧气反应的速率非常慢，发光基因(lux gene)系统中包括结构基因luxC，D，A，B，E和调节基因luxI和luxR等。从不同发光细菌中分离得到的发光基因其种类和数量有所差异，在lux操纵子中，luxA和luxB是紧密相连的。
以明亮发光杆菌(Photorhabdus luminescens)为例，luxA基因中含有1083bp，luxB基因中含有984bp，luxA和luxB基因分别编码细菌荧光素酶异二聚体的α(催化亚基，40kD)和β(调节亚基，36kD)亚基，只有两个亚基共存时才有活性，当将luxA和luxB基因融合表达后形成的单体蛋白仍然具有与野生型异二聚体蛋白相当的发光活性，经密码子优化后该融合蛋白在真核生物中也具有很高的活性。luxC含有1431bp，编码的蛋白质含有477个氨基酸，分子量为55kD；luxD编码的蛋白质分子量为33kD；luxE编码的蛋白质分子量为42kD。在明亮发光杆菌中还发现有luxF基因，它通常位于luxB和luxE之间，其编码的蛋白质分子量为26kD左右，但luxF基因在弧菌属和异短杆菌属中的发光基因系统中尚未被发现。在以上所有菌株的操纵子中，这些基因的顺序都相同，均为lux CDAB(F)E。
发光机理的研究表明，不同种类的发光细菌的发光机理是相同的，是由特异性的荧光酶(LE)、还原性的黄素(FMNH2)、八碳以上长链脂肪醛(RCHO)、氧分子(O2)所参与的复杂反应，大致历程如下：
概括的说就是，细菌生物发光反应是由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为490nm处的蓝绿光。
由于luxA和luxB基因融合型单体蛋白和非融合型二聚体蛋白均可在真核生物细胞系中功能表达，但是融合型荧光素酶的荧光强度受到限制，融合型荧光素酶的荧光活性比非融合型荧光素酶的活性降低40-50倍。
目前细菌荧光素酶的制备大多采用常规方法，以发光细菌为原料进行生产，这就要受到地域和季节的限制，且繁殖周期长，养殖成本高，后处理还要经过离心分离，硫胺分部，柱层析纯化等多个化学提取步骤，过程繁琐，且应用面比较窄。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种制备增强型单体细菌荧光素酶luxAB的方法，旨在解决现有技术制备细菌荧光素酶受到地域和季节的限制，且繁殖周期长，养殖成本高，后处理还要经过离心分离，硫胺分部，柱层析纯化等多个化学提取步骤，过程繁琐，且应用面比较窄的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种制备增强型单体细菌荧光素酶luxAB的方法，该方法包括以下步骤：
获得目的基因；
构建重组表达载体；
获得含重组表达质粒的表达菌种；
诱导靶蛋白的表达及蛋白的纯化；
检测纯化的增强型单体细菌荧光素酶的活性。
进一步、获得目的基因采用PCR方法；
采用PCR方法获得目的基因的具体步骤为：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物，在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，PCR循环获得所需基因片段。
进一步、构建重组表达载体的具体步骤为：
步骤一、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit；
步骤二、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下与载体连接。
进一步、获得含重组表达质粒的表达菌种的具体步骤为：
步骤一、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的抗Amp、蓝白斑标志作筛选，挑取单斑，碱裂解法抽提质粒，双酶切初步鉴定；
步骤二、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作；
步骤三、以重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21(DE3)的感受态菌株中。
进一步、诱导蛋白表达的方法为：
步骤一、从带有重组质粒的表达菌株平板上挑取单菌落，接种于5ml的LB培养基中，加入5ulAmp(50mg/ml)，过夜摇菌；
步骤二、按照1∶50的比例，从步骤一得到的菌液中，取1ml菌液接种于50ml LB培养基中，加入50ul Amp(50mg/ml)，扩大培养3h；
步骤三、扩大培养后的菌液中加入50ul IPTG(24mg/ml)，过夜低温26℃诱导蛋白的表达。
进一步、取过夜诱导的菌液，经过处理后采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶检测表达结果，凝胶浓度为12％。
本发明提供的制备增强型单体细菌荧光素酶luxAB的方法，利用融合型荧光素酶其独特的优势，将luxA和luxB基因异二聚体荧光素酶基因融合并经过易错PCR突变和化学随机突变，筛选得到9个荧光强度增强的突变体，然后经过shuffling技术，得到一个增强型单体细菌荧光素酶基因luxAB，将其克隆到表达载体pET28a上，转到BL21(DE3)菌株中表达，并用温和破碎法纯化表达产物，得到增强型单体细菌荧光素酶，本发明提供的制备增强型单体细菌荧光素酶的方法过程简单、生长周期短、成本低廉、易于纯化、酶活性损失小，性能稳定，具有重要的实际应用价值。
附图说明
图1是本发明实施例提供的制备增强型单体细菌荧光素酶luxAB的方法流程图；
图2是本发明实施例提供的luxAB增强型单体细菌荧光素酶表达载体的构建过程示意图；
图3是本发明实施例提供的SDS-PAGE分析融合与未融合蛋白表达结果示意图；泳道M为marker；泳道1、3、5均是未诱导样品；2、4、6均是诱导样品；2、6是增强型单体细菌荧光素酶的纯化样品；4为未融合的异二聚体细菌荧光素酶作为对照。
具体实施方式：
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1示出了本发明提供的。为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。
如图1所示，本发明的实施例提供的制备增强型单体细菌荧光素酶luxAB的方法包括以下步骤：
获得目的基因；
构建重组表达载体；
获得含重组表达质粒的表达菌种；
诱导靶蛋白的表达及蛋白的纯化；
检测纯化的增强型单体细菌荧光素酶的活性。
作为本发明实施例的一优化方案，获得目的基因采用PCR方法；
采用PCR方法获得目的基因的具体步骤为：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物，在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，PCR循环获得所需基因片段。
作为本发明实施例的一优化方案，构建重组表达载体的具体步骤为：
步骤一、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit，也可以采用冻融法回收载体片段；
步骤二、PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下与载体连接。
作为本发明实施例的一优化方案，获得含重组表达质粒的表达菌种的具体步骤为：
步骤一、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的抗Amp、蓝白斑标志作筛选，挑取单斑，碱裂解法抽提质粒，双酶切初步鉴定；
步骤二、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作；
步骤三、以重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21(DE3)的感受态菌株中。
作为本发明实施例的一优化方案，诱导蛋白表达的方法为：
步骤一、从带有重组质粒的表达菌株平板上挑取单菌落，接种于5ml的LB培养基中，加入5ul Amp，过夜摇菌；
步骤二、按照1∶50的比例，从步骤一得到的菌液中，取1ml菌液接种于50ml LB培养基中，加入50ul Amp，扩大培养3h；
步骤三、扩大培养后的菌液中加入50ul IPTG(24mg/ml)，过夜低温26℃诱导蛋白的表达。
作为本发明实施例的一优化方案，取过夜诱导的菌液80ul，加入5*SDS-PAGE Loading Buffer20ul，经过100℃处理十分钟后，SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶检测表达结果，凝胶浓度为12％。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
本发明实施例提供的制备增强型单体细菌荧光素酶luxAB的方法包括以下步骤：
S101：获得目的基因；
S102：构建重组表达载体；
S103：获得含重组表达质粒的表达菌种；
S104：诱导靶蛋白的表达及蛋白的纯化；
S105：检测纯化的增强型单体细菌荧光素酶的活性。
本发明实施例提供的制备增强型单体细菌荧光素酶luxAB的方法的具体方法结合下面提供的实施例予以说明。
一.材料与方法
1.分子生物学试剂
各种限制性内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司，T4 DNA连接酶为New England Biolab公司产品，DNA分子量标准：MakerIII和DL5000+2000购自天根生物科技(北京)有限公司。
本发明中用到的抗生素浓度如下：氨苄青霉素50μg/mL，卡那霉素50μg/mL，培养大肠杆菌一律采用LB培养基：10％蛋白胨，5％酵母膏，10％NaCl；
IPTG贮备液：2g IPTG溶于10mL蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤除菌，分装成1mL/份，-20℃保存。
2.材料：
大肠杆菌E.coli DH5α、BL21(DE3)菌株购买自天根生物科技北京有限公司；pDM4-lux Box(含有luxCDABE基因序列)由英国诺丁汉大学购买；质粒pBluescipt II、pET28a购自大连宝生物公司；质粒pKT25；pDM4天根生物科技北京有限公司。
3.克隆构建
本发明中所有克隆均采用此方法构建。首先以获得的增强型单体细菌荧光素酶序列pBlue-luxAB为模板扩增目的基因。PCR的反应体系为50μL：去离子水(ddH2O)33.5μL，10×PCR buffer 5μL，dNTPs(2mM each)5μL，MgSO4(25mM)2μL，正反向引物(10μM)各1.5μL，模板DNA 0.5μL，KOD-Plus-(1U/μL)1μL。PCR程序为：94℃，3min；(94℃，15s；60℃ to 50℃，30s，每个循环降低0.5℃；68℃，0.5min)×20；(94℃，15s；50℃，30s；68℃，0.5min)×10。PCR产物用含0.5μg/mL溴化乙锭(EB)的1％琼脂糖凝胶进行电泳分离，电泳条件为：
1×TAE缓冲液，电压5V/cm，电泳40min。在紫外灯下切下目的条带，用上海生工凝胶回收试剂盒进行胶回收，回收操作方法见试剂盒说明书。
扩增产物50μL双酶切反应体系包括：PCR产物20μL，buffer 5μL，限制性内切酶各1μL；载体50μL酶切体系：8μL载体质粒，buffer 5μL，限制性内切酶各1μL，最后用ddH2O补足体积至50μL。酶切后回收。连接反应：连接体系包括目的片段6.5μL，酶切后的载体2.5μL，
T4 buffer 1μL，T4 DNA连接酶0.3μL，充分混匀后16°过夜连接。
4.感受态的制备及转化方法
本发明中所有E.coli感受态制备及转化均采用Ca2+转化方法进行。10μL连接产物加入到100μL E.coli DH5α钙转感受态细胞并轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，再冰浴3min，加入1mL新鲜LB培养基，置恒温摇床中37℃ 80rpm复苏45min，5000rpm离心3min，去除800μL上清，用剩余的培养基重悬菌体后涂含有Amp的LB平板，37℃培养过夜。
二、操作步骤
(一)获得目的基因
1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点)，PCR循环获得所需基因片段。引物序列如下：
LuxA-F-BamHI      CGCGGATCCATGAAATTTGGAAACTTTTTGC
LuxB-R-SalI       ACGCGTCGACTTAGGTATATTCCATGTGGTACTTC
(二)构建重组表达载体
1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体，如图2所示。
(三)获得含重组表达质粒的表达菌种
1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。
3、以重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21(DE3)的感受态菌株中。
三、鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌BL21中大量表达
1、从带有重组质粒的表达菌株平板上挑取单菌落，接种于5ml的LB培养基中，加入5ul Amp(50mg/ml)，过夜摇菌；
2、按照1∶50的比例，从步骤一得到的菌液中，取1ml菌液接种于50ml LB培养基中，加入50ul Amp(50mg/ml)，扩大培养3h；
3、扩大培养后的菌液，取出10ml，不加IPTG，作为空白对照。剩余的40ml菌液中加入40ul IPTG(24mg/ml)，诱导蛋白表达。两者在低温26℃，200rpm的条件下过夜诱导。
4、用50ml离心管收集菌体，8000rpm，离心3min。注意配平。
5、倒掉上清，加入40ml左右的ddH2O洗菌体一遍，12000rpm，离心2min。注意要将菌体充分打散。
6、倒掉上清，用枪头将上清吸干净。根据菌体的浓度，加入适量的PBSbuffer悬浮菌体。
7、菌体破碎：我们使用BugBuster Protein Extraction Reagent(BugBuster蛋白抽提试剂)，温和破啐E.coli BL21(DE3)细胞壁并释放LuxAB蛋白，可以替代机械方法，如弗氏压啐或超声处理等激烈处理，具有简单，快速，低成本的特点，以保证低温，蛋白不易变性。使用时10000*g离心10min，然后收集沉淀，每克菌体中加入5ml的BugBuster蛋白抽提试剂，并同时加入溶菌酶每克菌体5KU，DNaseI终浓度为125U/g菌体，在摇床中慢速消化20min。
8、12000rpm，离心3min，分离上清和沉淀。
9、在沉淀中加入250ul 1×SDS Loading buffer，取200ul上清，加入50ul5×SDS Loading buffer，在恒温加热器上100℃加热10min。
10、加热后的样品冷却到室温后，12000rpm，离心2min。
11、取上清40ul点样，按照一中的方法进行SDS-PAGE检测。点样顺序是：对照的上清，沉淀，样品的上清，沉淀。
12、根据SDS-PAGE结果，判断目的蛋白是以包涵体还是以可溶性蛋白的形式产生。如果蛋白在沉淀中大量表达，则形成包涵体，需要改变诱导表达条件，得知蛋白在上清中表达，则是形成可溶性蛋白。
SDS-PAGE分析方法为：
1.根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶，获得的增强型单体细菌荧光素酶片段大小为2109bp，表达的蛋白大小为77.3kDa，所以选择凝胶浓度为12％，聚丙烯酰胺凝胶的制备方法参照下表：
蛋白分子量(kDa) 凝胶浓度(％)
4-40 20
12-45 15
10-70 12
15-100 10
25-200 8
分离胶(两块)配方
按表中所列顺序从上到下加试剂，加完TEMED后，轻轻摇匀液体，一块胶加7ml溶液。加完后，用1mLddH2O封住分离胶液面，在室温(37℃)凝结30min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倾倒水层，用滤纸条将残余的水吸干。
2.制作浓缩胶
浓缩胶(两块)配方
胶配好后混匀，灌胶2ml，插梳子时根据点样量和浓缩胶长短调整梳子插入的深度，于室温(37℃)凝胶30min。
四、纯化目的蛋白(整个过程要尽量保持在4℃进行)
大量诱导目的蛋白，准备400ml过夜诱导的菌液，用BugBuster ProteinExtraction Reagent(BugBuster蛋白抽提试剂)，温和破啐E.coli BL21(DE3)细胞壁并释放LuxAB蛋白，收集上清。
His纯化柱的柱床保存在20％的乙醇中，使用之前，先用吸管将柱床轻轻加入到柱子中，打开柱子，流出乙醇，使柱床沉积下来。
加入10ml PBS buffer，洗柱床3遍，使得柱床重新平衡。
将准备好的样品加入到柱子中，每次加入5-10ml样品，使样品结合在柱子上，用PBS buffer洗柱子3遍，每次用10ml，去除柱子中非特异性结合的蛋白。
加入5ml洗脱液，将目的蛋白洗脱出来，用1.5ml离心管收集流出来的样品，每管接0.5ml样，一共收集4管，
最后用PBS buffer洗柱子3遍，使纯化柱活化方便下次使用。
五、纯化后蛋白的浓度及其纯度检测：
用BioTek Epoch微孔板分光光度计检测蛋白质的浓度和纯度记录下读数，然后将样品冻于-20℃冰箱中。
样品 260/280值 含量mg/ml
1 0.72 0.07
2 0.67 0.31
3 0.68 0.27
4 0.67 0.25
六、纯化后增强型单体细菌荧光素酶蛋白活性检测：
增强型单体细菌荧光素酶蛋白的底物是长链脂肪醛，本发明实施例用十二醛作为底物，我们通过20/20 Luminometer发光检测仪(Promega公司)检测纯化后荧光素酶的活性，取六个1.5ml的离心管，分别编号1、2、3、4、十二醛、空白字样。然后将纯化后四管蛋白分别取出200ul，依次加入到1、2、3、4内，空白管内加入200uldd水，十二醛字样的管内加入200ul十二醛底物，作为对照，然后分别在1、2、3、4、十二醛、空白管中加入4ul的底物十二醛、0.1mM NAD(P)H和4mM FMN，充分摇匀在供给充分的氧气之后，依次检测蛋白的活性，检测结果见表1。
表1
样品 蛋白编号 活性 RLU
1 23718
2 224798
3 57436
4 27537
对照(十二醛) 87
对照(dd水) 69
表1通过20/20 Luminometer发光检测仪(Promega公司)检测纯化后四个样品荧光素酶的活性，结果显示，第二管蛋白的浓度最高，而且蛋白活性也最强，其中对照(十二醛和dd水)为活性检测的背景值。
七、纯化后的增强型单体细菌荧光素酶的应用：
通对纯化后荧光素酶蛋白活性的检测，我们可以看出蛋白活性受影响不大，可以将纯化后的样品做单克隆抗体，也可以应用于环境监测。
用增强型单体细菌荧光素酶蛋白luxAB检测溶液中重金属Mn和Co的浓度对蛋白酶活性的影响。
从检测结果我们可以看出增强型单体细菌荧光素酶经过纯化之后，活性并没有收到很大的影响，而且该酶对重金属离子比较敏感，随着浓度的增加，蛋白活性明显降低，我们可以利用此特征来检测未知溶液中重金属的含量，检测结果准确，简易，方便。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种制备增强型单体细菌荧光素酶luxAB的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
获得目的基因；
构建重组表达载体；
获得含重组表达质粒的表达菌种；
诱导靶蛋白的表达及蛋白的纯化；
检测纯化的增强型单体细菌荧光素酶的活性。
2.如权利要求1所述的制备增强型单体细菌荧光素酶luxAB的方法，其特征在于，获得目的基因采用PCR方法；
采用PCR方法获得目的基因的具体步骤为：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物，在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，PCR循环获得所需基因片段。
3.如权利要求1所述的制备增强型单体细菌荧光素酶luxAB的方法，其特征在于，构建重组表达载体的具体步骤为：
步骤一、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit；
步骤二、PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下与载体连接。
4.如权利要求1所述的制备增强型单体细菌荧光素酶luxAB的方法，其特征在于，获得含重组表达质粒的表达菌种的具体步骤为：
步骤一、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的抗Amp、蓝白斑标志作筛选，挑取单斑，碱裂解法抽提质粒，双酶切初步鉴定；
步骤二、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作；
步骤三、以重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21(DE3)的感受态菌株中。
5.如权利要求1所述的制备增强型单体细菌荧光素酶luxAB的方法，其特征在于，诱导蛋白表达的方法为：
步骤一、从带有重组质粒的表达菌株平板上挑取单菌落，接种于5ml的LB培养基中，加入5ulAmp，过夜摇菌；
步骤二、按照1∶50的比例，从步骤一得到的菌液中，取1ml菌液接种于50ml LB培养基中，加入50ulAmp，扩大培养3h；
步骤三、扩大培养后的菌液中加入50ul IPTG(24mg/ml)，过夜低温26℃诱导蛋白的表达。
6.如权利要求1所述的制备增强型单体细菌荧光素酶luxAB的方法，特征在于，取过夜诱导的菌液80ul，加入5*SDS-PAGE Loading Buffer20ul，经过100℃处理十分钟后，采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶检测表达结果，凝胶浓度为12％。
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