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Die
Erfindung betrifft die Nukleotid- und Aminosäuresequenz,
sowie die Aktivität und Verwendung der sekretierten Luziferase
MLuc7, sowie der Verwendung von sekretierten Luziferasen.
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Luziferasen
-
Als
Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im sichtbaren
Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle
erfolgt. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie
nicht von Außen in Form von Strahlung kürzerer
Wellenlänge zugeführt.
-
Man
unterscheidet Chemilumineszenz und Biolumineszenz. Als Chemolumineszenz
bezeichnet man eine chemische Reaktion die zu einem angeregten Molekül
führt, das selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen
in den Grundzustand zurückkehren. Wird diese Reaktion durch
ein Enzym katalysiert, spricht man von Biolumineszenz. Die an der
Reaktion beteiligten Enzyme werden generell als Luziferasen bezeichnet.
-
Eine Übersicht über
lumineszierende Organismen findet sich bei Wilson & Hastings 1998.
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Bei
den Luziferasen handelt es sich um Peroxidasen oder Mono- und Dioxygenasen.
Die Enzym-Substrate, die die Ausgangssubstanzen für die
lichtemittierenden Produkte bilden, heißen Luciferine.
Sie sind von Species zu Species unterschiedlich. Die Quantenausbeute
der Systeme liegt zwischen 0,1–0,9 Photonen je umgesetztem
Substratmolekül.
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Luziferasen
lassen sich aufgrund ihrer Herkunft oder ihrer enzymatischen Eigenschaften
klassifizieren. Luziferasen lassen sich ebenfalls durch ihre Substratspezifität
voneinander unterscheiden. Zu den wichtigsten Substraten gehören
Coelenterazine und Luciferin, sowie Derivate beider Substanzen.
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Luziferase Substrate
-
Im
Folgenden werden die Strukturen einiger Luziferasesubstrate beispielhaft
dargestellt: Coelenterazine
Coelenterazine
f
Coelenterazine
e
Coelenterazine
cp
Coelenterazine
h
Coelenterazine
n
Firefly
Luziferin
Cypridia
Luziferin
-
Sekretierte Luziferasen
-
Luziferasen,
die vom Wirtsorganismus als rekombinantes- oder wilttyp-Protein
aus dem Cytosol ins umgebende Milieu abgegeben werden, bezeichnet
mal als sekretierte Luziferasen. Tabelle 1 zeigt eine Übersicht über
sekretortische Luziferasen:
| Luziferase | Organismus | Refenenz |
| Lu164 | Metridia
longa | WO0242470 A1 |
| Lu22 | Metridia
longa | WO0242470 A1 |
| LuAL | Metridia
longa | WO0242470 A1 |
| Lu39 | Metridia
longa | WO0242470 A1 |
| Lu45 | Metridia
longa | WO0242470 A1 |
| Lu16 | Metridia
longa | WO0242470 A1 |
| Lu52 | Metridia
longa | WO0242470 A1 |
| Cypridina
Luziferase | Cypridina
Hilgendorfii | Tsuji
et al. 1974 |
| Gaussia
Luziferase | Gaussia
princeps | Christopoulos
et al. 2002 |
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Die
sekretierte Luziferase Lu164 ist ebenfalls beschrieben in Markova
et al. 2004.
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Reportersysteme
-
Als
Reporter- oder Indikatorgen bezeichnet man generell Gene, deren
Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer oder histochemischer
Methoden leicht nachweisen lassen. Man unterscheidet mindestens
2 Typen von Reportergenen.
- 1. Resistenzgene.
Als Resistenzgene werden Gene bezeichnet, deren Expression einer
Zelle die Resistenz gegen Antibiotika oder andere Substanzen verleiht,
deren Anwesenheit im Wachstumsmedium zum Zelltod führt,
wenn das Resistenzgen fehlt.
- 2. Reportergen. Die Produkte von Reportergenen werden in der
Gentechnologie als fusionierte oder unfusionierte Indikatoren verwendet.
Zu den gebräuchlichsten Reportergenen gehört die
beta-Galaktosidase (Alam et al., 1990), alkalische
Phosphatase (Yang et al., 1997; Cullen
et al., 1992), Luciferasen und andere Photoproteine (Shinomura,
1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne
et al., 1984).
-
Als
Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im sichtbaren
Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle
erfolgt. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie
nicht von Außen in Form von Strahlung kürzerer
Wellenlänge zugeführt.
-
Man
unterscheidet Chemilumineszenz und Biolumineszenz. Als Chemolumineszenz
bezeichnet man eine chemische Reaktion die zu einem angeregten Molekül
führt, das selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen
in den Grundzustand zurückkehren.
-
Wird
diese Reaktion durch ein Enzym katalysiert, spricht man von Biolumineszenz.
Die an der Reaktion beteiligten Enzyme werden generell als Luziferasen
bezeichnet.
-
Sekretierte Luziferase MLuc7
-
Bei
der Suche nach neuen Luciferasen aus Metridia longa wurde überraschenderweise
eine neue Luziferase identifiziert (im weiteren als MLuc7 genannt)
und kloniert, deren biochemische und physikochemische Eigenschaften
sich deutlich von den bisher identifizierten Luziferasen unterscheidet.
Diese Eigenschaften werden im folgenden beschrieben:
-
Kinetik
-
Bei
der Expression der sekretierten Luziferase MLuc7 stellte sich überraschenweise
heraus, das die Luziferase eine veränderte zeitliche Auflösung
der Biolumineszenzreaktion (Kinetik) ausweißt. Die Kinetikunterschiede
sind substratunabhängig für die untersuchten und
in 8 und 9 gezeigten Substrate. Der Verlauf
der Biolumineszenzreaktion für MLuc7 und Lu164 ist in 10 gezeigt.
Deutlich ist die wesentlich schnellere Kinetik von MLuc7 zu erkennen.
MLuc7 zeigt schon nach wenigen Sekunden einen Abfall der zu messenden
Lumineszenz pro Sekunde als Lu164. Nach 60 Sekunden sind bereits
70–80% des Integralsignals von 300 Sekunden erfaßt.
Lu164 zeigt einen wesentlich langsameren Abfall des Biolumineszenzsignals
pro Sekunde, so daß auch noch nach 300 Sekunden ein deutliches
Signal über Hintergrund meßbar ist. MLuc7 unterscheidet
sich daher kinetisch von den bisher beschriebenen sekretierten Luziferasen
von Metridia longa. MLuc7 kann aufgrund dieser Eigenschaft überraschenderweise
in Kombination mit anderen Coelenterazin-abhängigen oder
Coelenterazin-unabhängigen Luziferasen genutz werden, da
eine kinetische Unterscheidung möglich ist.
-
Aktivität
-
Bei
der Expression der sekretierten Luziferase MLuc7 stellte sich überraschenweise
heraus, das die Luziferase eine veränderte Aktivitätsverteilung
der Biolumineszenzreaktion aufgrund der veränderten kinetischen
Eigenschaften aufweist. Zu Beginn der Biolumineszenzreaktion ist
die zu messende Aktivität von MLuc7 pro Sekunde deutlich
höher als von Lu164. Diese höhere Biolumineszenz
ermöglicht eine höhere Sensitivität der
verwendeten Meßmethode, da eine geringere Anzahl an Zellen,
eine geringere Aktivierung der MLuc7-Expression oder eine geringer
Substratkonzentration eine Messung deutlich über dem Hintergrundsignal
ermöglicht.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung von MLuc7 zur Verbesserung der
Sensitivität, der Verwendung geringer Zellzahlen oder geringer
Substratkonzentrationen.
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Kinetische Auswertung
-
Die
veränderten kinetischen Eigenschaften von MLuc7 ermögliche
eine differenzierte kinetische Auswertung der Biolumineszenz. Bei
einer konkinuierlichen Messung über (zum Beispiel) 300
Sekunden können verschiedene Intervalle zur Auswertung
herangezogen werden. In 13 sind
die summierten Biolumineszenzsignale für Intervalle von
jeweils 10 Sekunden dargestellt. Innerhalb der ersten 60 Sekunden
(der genaue Zeitraum hängt von der Menge an eingesetzter
Luziferase und Substrat ab) zeigt MLuc7 eine deutlich höhere Biolumineszenz
als Lu164. Nach diesem Zeitraum nimmt die Biolumineszenz von MLuc7
schneller ab als Lu164, so dass Lu164 ein höheres Biolumineszenzsignal
aufweist. Durch die Wahl des Messfensters kann daher zwischen den
Luziferasen unterschieden werden. In 14 ist
die summierte Biolumineszenz der Luziferasen MLuc7 und Lu164 für
einen Zeitraum von 300 Sekunden unter den gewählten experimentellen
Bedingungen dargestellt.
-
In 15 sind
die summierten Biolumineszenzsignale für Intervalle von
jeweils 60 Sekunden dargestellt. Auch hier kann durch die Wahl des
Messfensters zwischen den Luzifersasen unterschieden werden. Die Länge
und Auswahl der Messintervalle können sich daher an den
jeweiligen Experimenten Bedingungen orientieren und sind flexible
einsetzbar. Auch die Gesamtmesszeit ist aufgrund der dargestellten
Daten flexible wählbar.
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Die
Erfindung betrifft die kinetische Auswertung von Messungen der Biolumineszenzaktivität
von MLuc7.
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Die
Erfindung betrifft die kinetische Auswertung von Messungen der Biolumineszenzaktivität
von Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 und Lu52.
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Die
Erfindung betrifft die kinetische Auswertung von Messungen der Biolumineszenzaktivität
sekretierter Luziferasen.
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Die
Erfindung betrifft die kinetische Auswertung von Messungen der Biolumineszenzaktivität
von erfindungsgemäßen Proteinen.
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Multiplexing
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Bei
der Expression der sekretierten Luziferase MLuc7 stellte sich überraschenweise
heraus, das sich die Luziferase aufgrund ihrer veränderten
Eigenschaften besonders für Multiplex-Reaktionen eignet.
Die Luziferase MLuc7 zeigt im Vergleich zu anderen Luziferasen eine
deutlich schnellere Kinetik, wodurch eine Kombination mit anderen
lumineszenten oder nicht-lumineszenten Messmethoden (readouts) möglich
wird.
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Um
lumineszente Messverfahren zu kombinieren, ist es notwendig, dass
sich die lumineszenten Systeme nicht gegenseitig inhibieren oder
die jeweiligen Signale überstrahlen. Nach der Aktivierung
des ersten Systems (zum Beispiel durch Substratzugabe) muss die
Lumineszenz auf das Ausgangsniveau zurückgegangen sein,
bevor die zweite Reaktion gestartet werden kann. Dies ist auch notwendig, wenn
beide Systeme unabhängige Substrate verwenden. MLuc7 verkürzt
aufgrund ihrer schnellen Kinetik den Zeitraum zwischen den Messung
deutlich. Eine Inaktivierung der Reaktion ist nicht notwendig. Da
es sich bei der Luziferase MLuc7 um eine sekretierte Luziferase
handelt, ist eine Kombination auch mit intrazellulären
Systeme (wie zum Beispiel Firefly Luziferase) möglich.
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Auch
anderere Luziferasen von Metridia longa eignen sich zur Kombination
mit intrazellulären Systemen wie der Firefly Luziferase.
Allerdings ist ein Inaktivierungsschritt notwendig, um die Restbiolumineszenz auf
ein niedriges Niveau abzusenken.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung von MLuc7 in multiplexen Ansätzen,
bei denen MLuc7 in Kombination mit einem oder mehreren Reportergenen
oder Messtechniken (readouts) verwendet wird. Erfindungsgemäß ist
auch die Verwendung von Mluc7 in Ansätzen zur Messung mehrerer
Zielgene.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung von Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45,
Lu16, und Lu52 in multipexen Ansätzen, bei denen Lu164,
Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 und Lu52 in Kombination mit einem oder
mehreren Reportergenen oder Messtechniken (readouts) verwendet wird.
Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung von Lu164,
Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 und Lu52 in Ansätzen zur Messung
mehrerer Zielgene.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung von sekretierten Luziferasen in
multipexen Ansätzen, bei denen sekretierte Luziferasen
in Kombination mit einem oder mehreren Reportergenen oder Messtechniken
(readouts) verwendet wird. Erfindungsgemäß ist
auch die Verwendung von sekretierten Luziferasen in Ansätzen zur
Messung mehrerer Zielgene.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung von erfindungsgemäßen
Proteinen in multipexen Ansätzen, bei denen erfindungsgemäße
Proteine in Kombination mit einem oder mehreren Reportergenen oder
Messtechniken (readouts) verwendet wird.
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Erfindungsgemäß ist
auch die Verwendung von erfindungsgemäßen Proteinen
in Ansätzen zur Messung mehrerer Zielgene.
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Substratspezifität
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Zur
Untersuchung der Substratspezifität von MLuc7 wurden verschiedene
Coelenterazine unter Standardbedingungen getestet. Hierzu wurden Überstände
aus transienten Transfektionen von CHO Zellen der Luziferasen Lu164,
Lu22 und MLuc7 verwendet. Die Substrate Coelenterazine n und cb
werden unter den gewählten Bedingungen schlechter von MLuc7
als von Lu164 und das Substrat Coelenterazine f besser von Mluc als
von Lu164 umgesetzt zu werden. Die Ergebnisse zeigen beispielhaft,
daß eine Optimierung der Reaktions oder Verwendung der
Luziferasen anhand von Substraten und Reaktionbedingungen möglich
ist. Die Substrate Firefly und Cypridina-Luziferin werden unter
den gewählten Reaktionsbedingungen von allen drei Luziferasen
nicht oder nur in einem geringen Umfang als Substrate verwendet.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination von unterschiedlichen
Substraten zur Erzeugung von Biolumineszenz durch MLuc7.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination von unterschiedlichen
Substraten zur Erzeugung von Biolumineszenz durch Lu164, Lu22, LuAL,
Lu39, Lu45, Lu16 und Lu52.
-
Die
Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination von unterschiedlichen
Substraten zur Erzeugung von Biolumineszenz durch sekretierter Luziferasen.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination von unterschiedlichen
Substraten zur Erzeugung von Biolumineszenz durch erfindungsgemäße
Proteine.
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Temperaturabhängigkeit
-
Zur
Untersuchung der Temperaturabhängigkeit der Reaktion von
MLuc7 wurde die Biolumineszenzreaktion bei Temperaturen zwischen
10 und 50°C gemessen. Hierzu wurden der Überstand
aus einer transienten Transfektion von CHO Zellen mit MLuc7 verwendet.
Das Ergebnis zeigt eine Abhängigkeit der Biolumineszenzreaktion
von MLuc7 von der Reaktionstemperatur. Diese Abhängigkeit
kann sowohl zur Optimierung und Anpassung der Reaktion in Reportergen-Anwendungen,
als auch zur Unterscheidung und Kombination verschiedener biolumineszenter
Systeme verwendet werden.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination der Temperaturabhängigkeit
zur Entwicklung und Optimierung von Messverfahren für MLuc7.
-
Die
Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination der Temperaturabhängigkeit
zur Entwicklung und Optimierung von Messverfahren für Lu164,
Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 und Lu52.
-
Die
Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination der Temperaturabhängigkeit
zur Entwicklung und Optimierung von Messverfahren für sekretierte
Luziferasen.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination der Temperaturabhängigkeit
zur Entwicklung und Optimierung von Messverfahren für erfindungsgemäße
Proteine.
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Abhängigkeit der
Biolumineszenzreaktion von der Ionenkonzentration
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Zur
Untersuchung der Abhängigkeit der Reaktion von MLuc7 von
Ionenkonzentration, wurde die Biolumineszenzreaktion bei KCl Konzentrationen
zwischen 1 und 400 mM gemessen. Hierzu wurden der Überstand
aus einer transienten Transfektion von CHO Zellen mit MLuc7 verwendet.
Das Ergebnis zeigt eine Abhängigkeit der Biolumineszenzreaktion
von MLuc7 von der Ionenkonzentration im Reaktionsmedium. Diese Abhängigkeit
kann sowohl zur Optimierung und Anpassung der Reaktion in Reportergen-Anwendungen,
als auch zur Unterscheidung und Kombination verschiedener biolumineszenter
Systeme verwendet werden.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination der Ionenabhängigkeit
der Biolumineszenzreaktion zur Entwicklung, Optimierung und Verwendung
von Messverfahren für MLuc7.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination der Ionenabhängigkeit
der Biolumineszenzreaktion zur Entwicklung, Optimierung und Verwendung
von Messverfahren für Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16
und Lu52.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination der Ionenabhängigkeit
der Biolumineszenzreaktion zur Entwicklung, Optimierung und Verwendung
von Messverfahren für sekretierte Luziferasen.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination der Ionenabhängigkeit
der Biolumineszenzreaktion zur Entwicklung, Optimierung und Verwendung
von Messverfahren für erfindungsgemäße
Proteine.
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Identifizierung der Luziferase MLuc7
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Zur
Untersuchung der biolumineszenten Aktivität der Spezies
Metridia longa wurden Exemplare im Weißen Meer (Biologische
Station Kartesh, Russland) gefangen und in flüssigem Stickstoff
gelagert. Um Verunreinigungen oder Kontaminationen mit andern Tier-
oder Pflanzenspezies zu verhindern, wurden 200 Exemplare der Entwicklungsstufe
V von Metridia longa identifiziert und wie oben beschrieben gelagert.
Für Metridia longa werden neben dem Naupilus und der adulten
Form weitere fünf Entwicklungsformen beschrieben, wobei die
Nomenklatur Formen von CI bis CV mit zunehmender Entwicklungsstufe
beschreibt. Die Selektion und Identifizierung erfolgte mit Hilfe
von biokularen Mikroskopen und Transferpipetten. Die Exemplare wurden
im Weissen Meer in der Region der biologischen Forschungsstation
"Kartesh" (Russland) gefangen.
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Die
Wassertiefe in der Individuen von Metridia longa anzutreffen sind,
richtet sich unter andrem nach ihrem Entwicklungsstand. In 19 ist diese Abhängigkeit grafisch
dargestellt.
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Neben
jahreszeitlich bedingten Schwankungen, haben Salzgehalt, Temperatur
und Nahrungsangebot (Zusammensetzung und Vielfalt), sowie andere
Faktoren einen Einfluss auf den Lebensraum von Metridia longa. Ob
Stoffwechselprozesse oder die Expression von biolumineszenten Proteinen
durch diese Faktoren beeinflusst werden, ist zur Zeit nicht bekannt.
Auch über eine entwicklungsstufenspezifische Expression
von biolumineszenten Proteinen kann nur spekuliert werden, eine
solche ist jedoch anzunehmen.
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Eine
gezielte Untersuchung von Individuen ausgewählter Entwicklungsstufen
kann daher zur Identifizierung von biolumineszenten Proteinen führen,
die in anderen Entwicklungstufen nicht oder deutlich weniger expremiert
werden und daher einer Expressionsklonierung nur bedingt zugänglich
sind.
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Die
Erfindung betrifft die Untersuchung von biolumineszenten Organismen
spezifischer Entwicklungsstufen zur Identifizierung neuer biolumineszenter
Proteine.
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Zur
Isolation der RNA aus Metridia longa wurde das Straight A's mRNA
Isolation Kit (Firma Novagen) nach Herstellerangaben verwendet.
Die isolierte Poly-A mRNA wurde mit Hilfe der PowerScript Reverse
Transcriptase (Firma Clontech) in cDNA, unter Verwendung des SMART
cDNA Library Construction Kit (Clontech), nach Herstellerangaben
umgeschrieben. Als Expressionsvektor wurde der Vektor pTriplEx2
(Firma Clontech) verwendet, wobei die cDNA-Fragmente in die SfiI
A-B Schnittstellen integriert wurden.
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Die
erhaltenen Expressionsvektoren wurden mit Hilfe von Elektroporation
in E. coli XL1-Blue transformiert. Die E. coli Transformanden wurden
unter Standardbedingungen kultiviert.
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Die
nicht amplifizierte cDNA-Bank wurde mit einer Koloniedichte von
etwa 1500 Kolonien pro Platte plattiert und unter Standardbedingungen über
Nacht inkubiert. Durch Auflegen einer trockenen Nitrozellulosemembran
wurde eine Kopie der Bakterienplatten erzeugt. Die Replikate wurde
unter Standardbedingungen inkubiert. Von den Replikaplatten wurden
mit Hilfe steriler Glasstäbe die Kolonien gepickt und in
LB Medium überführt. Die Kulturen wurden unter
Standardbedingungen bis zu einer optischen Dichte von 1 (bei 600
nm) inkubiert. Anschließend erfolgte die Induktion der
Genexpression durch Zugabe von IPTG bis zu einer finalen Konzentration
von 1 mM, gefolgt von einer Inkubation von einer Stunde bei 37°C.
3 ml der induzierten Bakterienkulturen wurde durch Zentrifugation
geerntet und das Pellet in 250 μl SM Puffer (100 mM NaCl,
10 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.01% Gelatine) resuspendiert.
Die Bakterien wurde anschließend durch Ultraschallbehandlung
bei 0°C aufgeschlossen. Der Rohextrtakt wurde anschließend
untersucht.
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Hierzu
wurde Coelenterazin (native) bis zu einer finalen Konzentration
von 10 μM zugegeben und die Biolumineszenz in einem Luminometer
bestimmt. Die cDNA der Biolumineszenz-positiven Klone wurde mit
Hilfe des ALFexpress II Systems nach Herstellerangaben sequenziert
(TermoSequenase Cy5 Dye Terminator Kit (GE Healthcare)).
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Überraschenderweise
konnte mit Hilfe dieser Methode eine Luziferase aus Metridia longa
der Entwicklungstufe V identifiziert werden, die als MLuc7 bezeichnet
wurde.
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Die
Erfindung betrifft die sekretierte Luziferase MLuc7 mit der Aminosäuresequenz
repräsentiert durch SEQ ID NO: 2. Ebenfalls betrifft die
Erfindung das Nukleinsäuremolekül dargestellt
in SEQ ID NO: 1.
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Die
Erfindung betrifft auch funktionelle Äquivalente der sekretierten
Luziferase MLuc7. Funktionelle Äquivalente sind solche
Proteine, die vergleichbare physikochemische oder biochemische Eigenschaften
aufweisen.
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Ebenfalls
sind funktionelle Fragmente des MLuc7 Proteins bzw. für
solche kodierende Nukleinsäuren erfindungsgemäß.
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Ebenfalls
sind Mutanten des MLuc7 Proteins bzw. für solche kodierende
Nukleinsäuren erfindungsgemäß.
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Reportergen für
die Technik des „high content screening" (HCS). HCS steht
als Übergriff für moderne Mikroskopie-Technologien
zur Zellanalyse. Kennzeichnend für HCS-Verfahren ist die
quantitative Erfassung mehrerer Parameter auf zellulärer
oder subzellulärer Ebene
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Reportergen für
zelluläre Systeme speziell für Rezeptoren, für
Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren
oder für induzierbare Systeme.
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Reportergen in bakteriellen
und eukaryotischen Systemen speziell in Säugerzellen, in
Bakterien, in Hefen, in Bakulo, in Pflanzen
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Reportergen für
zelluläre Systeme in Kombination mit biolumineszenten oder
chemolumineszenten Systemen speziell Systemen mit Luziferasen, mit
Oxygenasen, mit Phosphatasen.
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Reportergen für
zelluläre Systeme in Kombination mit biolumineszenten oder
chemolumineszenten Systemen speziell Systemen mit Photoproteine
und Ionenindikatoren, speziell Aequorin, Clytin, Obelin, Berovin
und Bolinopsin.
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 sich als sich als Markerprotein, speziell
bei der FACS (Fluorescence activated cell sorter) Sortierung.
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Fusionsproteine speziell
für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für
Transporter, für Transkriptionsfaktoren, für Proteinasen,
für Kinasen, für Phosphodiesterasen, für
Hydrolasen, für Peptidasen, für Transferasen,
für Membranproteine, für Glykoproteine.
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich zur Immobilisierung speziell
durch Antikörper, durch Biotin, durch magnetische oder
magnetisierbare Träger.
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich für Systeme des
Energietransfers speziell der FRET-(Fluorescence Resonance Energy
Transfer), BRET-(Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET
(field effect transistors), FP (fluorescence polarization), HTRF
(Homogeneous time-resolved fluorescence) Systemen.
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich zur Markierung von Substraten
oder Liganden speziell für Proteasen, für Kinasen,
für Transferasen, für Transporter, für
Ionenkanäle und Rezeptoren.
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich zur Expression in bakteriellen
Sytemen speziell zur Titerbestimmung, als Substrate für
biochemische Systeme speziell für Proteinasen und Kinasen.
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Marker speziell gekoppelt
an Antikörper, gekoppelt an Enzyme, gekoppelt an Rezeptoren,
gekoppelt an Ionenkanäle und andere Proteine.
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Reportergen bei der
pharmakologischen Wirkstoffsuche speziell im HTS (High Throughput
Screening).
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Komponenten von Detektionssystemen
speziell für ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay),
für Immunohistochemie, für Western-Blot, für
die konfokale Mirkoskopie.
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Marker für
die Analyse von Wechselwirkungen speziell für Protein-Protein-Wechselwirkungen,
für DNA-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-RNA-Wechselwirkungen,
für RNA-RNA- Wechselwirkungen, für RNA-Protein-Wechslewirkungen
(DNA: deoxyribonucleic acid; RNA: ribonucleic acid).
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Marker oder Fusionsproteine
für die Expression in transgenen Organismen speziell in
Mäusen, in Ratten, in Hamstern und anderen Säugetieren,
in Primaten, in Fischen, in Würmern, in Pflanzen.
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Marker oder Fusionsprotein
zur Analyse der Embryonalentwicklung.
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Marker über
einen Kopplungsvermittler speziell über Biotin, über
NHS (N-hydroxysulfosuccimide), über CN-Br.
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Reporter gekoppelt
an Nukleinsäuren speziell an DNA, an RNA.
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Die
sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Reporter gekoppelt
an Proteine oder Peptide.
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Die
an Nukleinsäure oder das Peptid des gekoppelten Protein
MLuc7 eignet sich als Sonde speziell für Northern-Blots,
für Southern-Blots, für Western-Blots, für
ELISA, für Nukleinsäuresequenzierungen, für Proteinanalysen,
Chip-Analysen.
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Das
Protein MLuc7 eignet sich als Markierung von pharmakologischen Formulierungen
speziell von infektiösen Agentien, von Antikörpern,
von „small molecules".
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Das
Protein MLuc7 eignet sich als für geologische Untersuchungen
speziell für Meeres-, Grundwasser- und Flussströmungen.
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Das
Protein MLuc7 eignet sich zur Expression in Expressionssystemen
speziell in in-vitro Translationssystemen, in bakteriellen Systemen,
in Hefen Systemen, in Bakulo Systemen, in viralen Systemen, in eukaryotischen
Systemen.
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Die
Erfindung betrifft auch die Reinigung des Protein MLuc7 speziell
als wildtyp Protein, als Fusionsprotein, als mutagenisiertes Protein.
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Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung von MLuc7 auf dem Gebiet
der Kosmetik speziell von Badezusätzen, von Lotionen, von
Seifen, von Körperfarben, von Zahncreme, von Körperpudern.
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Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung von Mluc7 zur Färbung
speziell von Nahrungsmitteln, von Badezusätzen, von Tinte,
von Textilien, von Kunststoffen.
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Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung von Mluc7 zur Färbung
von Papier speziell von Grußkarten, von Papierprodukten,
von Tapeten, von Bastelartikeln.
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Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung von Mluc7 zur Färbung
von Flüssigkeiten speziell für Wasserpistolen,
für Springbrunnen, für Getränke, für
Eis.
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Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung von Mluc7 zur Herstellung
von Spielwaren speziell von Fingerfarbe, von Schminke, Wasserpistolen.
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Die
Erfindung betrifft Organismen, die einen erfindungsgemäßen
Vektor enthalten.
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Die
Erfindung betrifft Organismen, die ein erfindungsgemäßes
Polypeptid expremieren.
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Die
Erfindung betrifft Organismen, die ein funkionelles Äquivalente
von MLuc7 expremieren.
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Die
Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Expression der erfindungsgemäßen
fluoreszierenden Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen
oder in in vitro Expressionssystemen.
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Die
Erfindung betrifft auch Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines
erfindungsgemäßen Polypeptides.
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Die
Erfindung bezieht sich auf Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden
Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper
gegen die erfindungsgemäßen fluoreszierende Proteine
erkannt werden.
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen
fluoreszierenden Proteine als Marker- und Reportergen, insbesondere
für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.
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Die
Erfindung betrifft die sekretierte Luziferase MLuc7 mit der Aminosäuresequenz
repräsentiert durch SEQ ID NO: 2 und der Nukleotidsequenz
repräsentiert durch SEQ ID NO: 1.
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Erfindungsgemäß ist
ein Protein MLuc7, dadurch gekennzeichnet, dass seine Sequenz die
Sequenz dargestellt in SEQ ID NO: 2 umfasst, sowie funktionelle
Fragmente desselben.
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Erfindungsgemäß ist
des weiteren ein Nukleinsäuremolekül, welches
ein Protein kodiert, dass die Sequenz dargestellt in SEQ ID NO:
1 umfasst, sowie funktionelle Fragmente desselben.
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Bestandteil
der Erfindung ist ein rekombinanter RNA oder DNA-Vektor, welcher
eine Nukleinsäure wie im vorangehenden Abschnitt beschrieben
umfasst.
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Bestandteil
der Erfindung ist ein Verfahren zur Expression eines erfindungsgemäßen
Polypeptides in Bakterien, eukaryontischen Zellen, oder in in vitro
Translationssystemen.
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Bestandteil
der Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen
Nukleinsäure als Marker oder Reportergen auch in Kombination
mit einem oder mehreren anderen Marker oder Reportergenen.
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Bestandteil
der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung eines erfindungsgemäßen
Proteins als Marker oder Reportergen auch in Kombination mit einem
oder mehreren anderen Marker oder Reportergenproteinen..
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Mutanten und Derivate sekretorischer
Luziferasen
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In 3 ist
das Alignment der Luziferasen MLu7, der Metridia Luziferasen (Lu164,
Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 und Lu52) und der Gaussia Luziferase
dargestellt. Die Luziferase MLuc7 stellt eine deutlich kürzeres
Polypeptid dar, als die übrigen analysierten Luziferasen.
Die Luziferasen Lu22 und Gaussia Luziferase umfassen ebenfalls durch
deutlich kürzere Polypeptide.
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Erfindungsgemäß sind
Mutanten oder Derivate der Luziferasen Lu164, Lu22, LuAL, Lu39,
Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten
kinetischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
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Erfindungsgemäß sind
Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen
im Bereich der Aminosäuren 23 bis 78 der Luziferasen Lu164,
Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten
kinetischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
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Erfindungsgemäß sind
Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen
im Bereich der Aminosäuren 23 bis 78 der Luziferasen Lu164,
Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten
biochemischen oder physikochemischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
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Erfindungsgemäß sind
Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen
im Bereich der Aminosäuren 13 bis 88 der Luziferasen Lu164,
Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten
kinetischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
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Erfindungsgemäß sind
Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen
im Bereich der Aminosäuren 13 bis 88 der Luziferasen Lu164,
Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten
biochemischen oder physikochemischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
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Erfindungsgemäß sind
Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen
im Bereich der Aminosäuren 33 bis 68 der Luziferasen Lu164,
Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten
kinetischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
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Erfindungsgemäß sind
Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen
im Bereich der Aminosäuren 33 bis 68 der Luziferasen Lu164,
Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten
biochemischen oder physikochemischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
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Die
Erfindung betrifft insbesondere:
- 1. Ein Nukleinsäuremolekül,
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
- a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid
kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ
ID NO: 2 umfasst;
- b) Nukleinsäuremolekülen, welche die in SEQ
ID NO: 1 dargestellte Sequenz umfassen;
- c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer
Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder
b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und welche Luziferasen
kodieren; eine stringente Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen
kann zum Beispiel in einer wässrigen Lösung, die
0,2 × SSC (1× standard saline-citrate = 150 mM
NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat) enthält, bei 68°C
durchgeführt werden (Sambrook et al., 1989);
- d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf
Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten
unterscheiden;
- e) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzidentität
von mindestens 70, 75, 80, 85, 95%, 98%, 99% zu SEQ ID NO: 1 zeigen,
und deren Proteinprodukte Luziferasen sind;
- f) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzidentität
von mindestens 65% zu SEQ ID NO: 1 zeigen, und welche Luziferasen
kodieren;
- g) Fragmente der Nukleinsäuremoleküle gemäß a)–f),
wobei die Fragmente funktionelle Luziferasen kodieren.
- 2. Eine Nukleinsäure nach Punkt 1, welche einen funktionalen
Promotor 5' zur das Photoprotein kodierenden Sequenz enthält.
- 3. Rekombinante DNA oder RNA Vektoren, welche Nukleinsäuren
nach Punkt 2 enthalten.
- 4. Organismen, die einen Vektor gemäß Punkt
3 enthalten.
- 5. Oligonukleotide mit mehr als 10 aufeinanderfolgenden Nukleotiden,
die identisch oder komplementär zu einer Teilsequenz eines
Nukleinsäuremoleküls gemäß Punkt
1 sind.
- 6. Polypeptid, das durch eine Nukleinsäuresequenz nach
Punkt 1 kodiert ist.
- 7. Verfahren zur Expression der Luziferase Polypeptide gemäß Punkt
6 in Bakterien, eukaryotischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.
- 8. Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines Luziferase Polypeptides
gemäß Punkt 6.
- 9. Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren,
die immunologisch durch Antikörper gegen die Luziferase
MLuc7 erkannt werden.
- 10. Verwendung einer eine Luziferase kodierende Nukleinsaüre
gemäß den Punkten 1 bis 3 als Marker- oder Reportergen.
- 11. Verwendung einer Luziferase gemäß Punkt
6 als Marker oder Reporter.
- 12. Antikörper, der spezifisch eine Luziferase gemäß Punkt
6 erkennt.
- 13. Verwendung gemäß Punkt 10 oder 11, wobei
neben der Luziferase MLuc7 mindestens ein weiteres Reportergen eingesetzt
wird.
- 14. Verwendung gemäß Punkt 13, wobei es sich
bei dem/den weiteren Reportergen(en) um sekretierte und/oder zelluläre
Luziferasen handelt.
- 15. Verwendung gemäß Punkt 14, wobei es sich
bei dem/den weiteren Reportergen(en) um sekretierte Luziferasen
handelt.
- 16. Verwendung gemäß Punkt 14, wobei es sich
bei dem/den weiteren Reportergen(en) um die firefly Luziferase,
oder um Luziferasen aus dem Organismus Metridia longa handelt.
- 17. Verwendung gemäß Punkt 15, wobei es sich
bei den weiteren sekretierten Luziferasen um Luziferasen ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16
und Lu52 handelt.
- 18. Verfahren gemäß Punkten 10, 11, oder 13,
wobei die Lumineszenzmessungen kinetisch ausgewertet werden.
- 19. Verfahren gemäß Punkten 10, 11, 13 oder
18, wobei mehrere Zielproteine gemessen werden.
- 20. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen Lu164, Lu22, LuAL,
Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten
kinetischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
- 21. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen Lu164, Lu22, LuAL,
Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen
oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 23 bis 78 und
veränderte kinetische Eigenschaften der Lumineszenzreaktion
aufweist.
- 22. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen Lu164, Lu22, LuAL,
Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen
oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 23 bis 78 und
veränderte biochemische oder physikochemische Eigenschaften
der Lumineszenzreaktion aufweist.
- 23. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen Lu164, Lu22, LuAL,
Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen
oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 13 bis 88 und
veränderte kinetische Eigenschaften der Lumineszenzreaktion
aufweist.
- 24. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen Lu164, Lu22, LuAL,
Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen
oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 13 bis 88 und
veränderte biochemische oder physikochemische Eigenschaften
der Lumineszenzreaktion aufweist.
- 25. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen Lu164, Lu22, LuAL,
Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen
oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 13 bis 68 und
veränderte kinetische Eigenschaften der Lumineszenzreaktion
aufweist.
- 26. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen Lu164, Lu22, LuAL,
Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen
oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 13 bis 68 und
veränderte biochemische oder physikochemische Eigenschaften
der Lumineszenzreaktion aufweist.
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Nukleotid- und Aminosäuresequenzen
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SEQ
ID NO: 1 (MLuc7 – Nukleotidsequenz – kodierend)
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Daraus
ergibt sich eine Aminosäuresequenz von: SEQ
ID NO: 2 (MLuc7 – Aminosäuresequenz)
SEQ
ID NO: 3 (Lu164 – Nukleotidsequenz – kodierend)
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Daraus
ergibt sich eine Aminosäuresequenz von: SEQ
ID NO: 4 (Lu164 – Aminosäuresequenz)
SEQ
ID NO: 5 (MLuc7 – Nukleotidsequenz – klonierte
Sequenz)
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Beschreibung der Figuren
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Die 1 zeigt
die Vektorkarte des Konstruktes pcDNA3-MLuc7.
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Die 2 zeigt
die Vektorkarte des Konstruktes pASM-MLuc7.
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Die 3 zeigt
ein Alignment verschiedener sekretierter Luiziferasen auf Aminosäureebene.
-
Die 4 zeigt
die Substratspezifität der Luziferasen Lu164, Lu22 und
MLuc7. X-Achse: Coelenterazine, Y-Achse: relative Lichteinheiten
(relative light units: RLU). Zur Aktivitätsbestimmung wurden
jeweils die gleichen Mengen an sekretierter Luziferase aus einer
transienten Transfektion von CHO verwendet. Die Coelenterazine wurden
parallel zugegeben und die Messung anschließend gestartet.
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Die 5 zeigt
die Temperaturabhängigkeit der Luziferase MLuc7. X-Achse:
Temperatur in °C, Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative
light units: RLU). Zur Aktivitätsbestimmung wurden jeweils
die gleichen Mengen an sekretierter Luziferase aus einer transienten
Transfektion von CHO verwendet. Die angegebene Temperatur entspricht
der Reaktionstemperatur. Aufgetragen ist das Integral der Biolumineszenzmessung
von 60 Sekunden.
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Die 6 zeigt
die Abhängigkeit der Luziferase MLuc7 von der Kalziumchloridkonzentration
im Reaktionspuffer. X-Achse: KCl Konzentration in mM, Y-Achse: relative
Lichteinheiten (relative light units: RLU). Zur Aktivitätsbestimmung
wurden jeweils die gleichen Mengen an sekretierter Luziferase aus
einer transienten Transfektion von CHO verwendet. Die angegebene
Konzentration entspricht der Konzentration von KCl im Reaktionspuffer.
Aufgetragen ist das Integral der Biolumineszenzmessung von 60 Sekunden.
-
Die 7 zeigt
die Biolumineszenzmessung von MLuc7 bei konstanter MLuc7 Menge und
unterschiedlichen Coelenterazinkonzentrationen. X-Achse: Coelenterazinekonzentration
in μM. Y-Achse:: relative Lichteinheiten (relative light
units: RLU).
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Die 8 zeigt
die Kinetik der Biolumineszenzreaktion von MLuc7 mit drei unterschiedlichen
Coelenterazinen. X-Achse: Zeit in Sekunden. Y-Achse:: relative Lichteinheiten
(relative light units: RLU). Schwarz: natives Coelenterazine, hellgrau:
Coelenterazine f, dunkel-grau: Coelenterazine i.
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Die 9 zeigt
die Kinetik der Biolumineszenzreaktion von Lu164 mit drei unterschiedlichen
Coelenterazinen. X-Achse: Zeit in Sekunden. Y-Achse: relative Lichteinheiten
(relative light units: RLU). Schwarz: natives Coelenterazine, hellgrau:
Coelenterazine f, dunkel-grau: Coelenterazine i.
-
Die 10 zeigt
das Ergebnis der Biolumineszenzmessung von MLuc7 (schwarz) und Lu164
(grau) für eine Messung von 300 Sekunden mit einer Integrationszeit
von 1,5 Sekunden. X-Achse: Zeit in Sekunden. Y-Achse: relative Lichteinheiten
(relative light units: RLU).
-
Die 11 zeigt
das Ergebnis der Biolumineszenzmessung von MLuc7 bei einer konstanten
Substratkonzentration und abnehmender Konzentration an Mluc7 durch
Verdünnung des Zellüberstandes. X-Achse: Zeit
in Sekunden. Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative light units:
RLU). Legende: Angabe und Zuordnung des Verdünnungsfaktor
(ausgehend vom unverdünnten Überstand).
-
Die 12 zeigt
das Ergebnis der Biolumineszenzmessung von Lu164 bei einer konstanten
Substratkonzentration und abnehmender Konzentration an Lu164 durch
Verdünnung des Zellüberstandes. X-Achse: Zeit
in Sekunden. Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative light units:
RLU). Legende: Angabe und Zuordnung des Verdünnungsfaktor
(ausgehend vom unverdünnten Überstand).
-
Die 13 zeigt
das Ergebnis der kinetischen Auswertung der Biolumineszenzmessung
von Mluc7 und Lu164 in Abschnitten von jeweils 10 Sekunden Integrationszeit.
X-Achse: Zeit in Sekunden. Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative
light units: RLU).
-
Die 14 zeigt
das Ergebnis der kinetischen Auswertung der Biolumineszenzmessung
von Mluc7 und Lu164 bei einer Integrationszeit von 300 Sekunden.
X-Achse: Zeit in Sekunden. Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative
light units: RLU).
-
Die 15 zeigt
das Ergebnis der kinetischen Auswertung der Biolumineszenzmessung
von Mluc7 und Lu164 in Abschnitten von jeweils 60 Sekunden Integrationszeit.
X-Achse: Zeit in Sekunden. Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative
light units: RLU).
-
16
Die 19 zeigt die Darstellung der bevorzugten
Wassertiefe von Individuen der Spezies Metridia longa in Ahängigkeit
vom Entwicklungsstatus. X-Achse: Wassertiefe in Meter (m); Y-Achse:
Entwicklungsstatus; schwarze Balken: 25–65 m, graue Balken:
10–25 m, weiße Balken: 0–10 m. Figur
nach Angaben: National Oceanographic Data Center (USA).
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Beispiele
-
Beispiel 1
-
Herstellung und Verwendung der Konstrukte
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Als
Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes
wurde das Plasmid pcDNA3.1(+) der Firma Clontech zur konstitutiven
Expression verwendet. Zur Detektion von Veränderungen der
intrazellulären cAMP Konzentration, wurde die cDNA von
MLuc7 in den Vektor pASM kloniert. Der Vektor pASM enthält
cAMP responsive Elemente (CRE), die die Promotoraktivität
in Abhängigkeit von der cAMP Konzentration reguliert. Das
Derivat des Vektors wurde als pASM-MLuc7 bezeichnet. Das Derivat
des Vektors pcDNA3 wurde als pcDNA3-MLuc7 bezeichnet. Die Klonierungen
erfolgte unter Verwendung von molekularbiologischen Standardmethoden.
Die Vektoren pcDNA3-Mluc7 und pASM-MLuc7 wurde zur Expression von MLuc7
in eukaryotischen Systemen verwendet.
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Die 1 zeigt
die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-Mluc7.
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Die 2 zeigt
die Plasmidkarte des Vektors pASM-MLuc7.
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Beispiel 2
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Eukaryotische Expression
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Die
konstitutive eukaryotische Expression erfolgte in CHO-Zellen durch
Transfektion der Zellen mit den Expressionsplasmiden pcDNA3-MLuc7,
pcDNA3-Lu164 und pcDNA3 (ohne cDNA Insertion) in transienten Experimenten.
Hierzu wurden 10000 Zellen pro Loch in DMEM-F12 Medium auf 96 Loch
Mikrotiterplatten plattiert und über Nacht bei 37°C
inkubiert. Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Fugene 6 Kits
(Roche) nach Herstellerangaben. Die transfizierten Zellen wurden über
Nacht bei 37°C in DMEM-F12 Medium inkubiert. Die Messung
der Biolumineszenz erfolge nach Substratzugabe mit einem Imaging-System.
Die Messung verdünnter Überstaände erfolgte
in Puffer A (pH 7,4) mit der Zusammensetzung: 130 mM NaCl, 5 mM
KCl, 20 mM Hepes, 1 mM MgCl2 × 6H2O und 5 mM NaHCO3
-
Zur
Herstellung stabiler Zelllinien wurden die transfizierten Zellen
mit 2 mg/ml Geneticin selektioniert und die Biolumineszenzaktivität
der Klone bzw. Überstände bestimmt.
-
Beispiel 3
-
Sequenzvergleich
-
Um
die Sequenzen der sekretierten Luziferasen vergleichen und darstellen
zu können, wurde ein Alignment der Aminosäuresequenzen
durchgeführt. Die 3 zeigt
das Alignment der sekretierten Luziferasen auf Aminosäureebene.
Die Cypridina Luziferase wurde nicht mit in das Alignment einbezogen,
da ihre Sequenzidentität zu den übrigen Luziferasen
zu gering ist.
-
Literatur/Patente
-
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Coelenterazine e
Coelenterazine cp
Coelenterazine h
Coelenterazine n
Firefly Luziferin
Cypridia Luziferin
