Als
Biolumineszenz bezeichnet man das Phänomen der Lichterzeugung durch
Lebewesen. Sie ist das Ergebnis von biochemischen Reaktionen in
Zellen, bei denen die chemische Energie in Form von Lichtquanten abgegeben
wird (sog. kalte Emission durch Chemolumineszenz). Derartig erzeugtes
Licht ist monochromatisch, denn es wird bei einem diskreten Elektronen-Übergang
abgestrahlt, kann aber durch sekundäre Leuchtfarbstoffe (z.B. fluoreszierende
Proteine bei Leuchtquallen der Gattung Aequoria) in längerwellige
Spektralbereiche verschoben werden.
Die
biologische Funktion ist vielfältig:
In der Meerestiefe zwischen 200 und 1000 m (Mesopelagial) leuchten
rund 90% aller Lebewesen. Die Leuchtsignale werden hier zur Partnerwerbung,
Täuschung
und als Köder
eingesetzt. Auch Glühwürmchen und
Leuchtkäfer
nutzen die Lichtsignale zur Partnersuche. Die Bedeutung des Leuchtens
von Bakterien, Pilzen und einzelligen Algen ist dagegen unklar.
Es wird vermutet, dass es zur Koordination von vielen Einzel-Individuen
einer großen
Population eingesetzt wird oder eine Art biologische Uhr darstellt.
Eine
Vielzahl an Coelenteraten ist biolumineszent (Morin et al., 1974).
Diese Organismen emittieren blaues oder grünes Licht. Das 1962 als erstes
Licht produzierendes Protein identifizierte Aequorin aus Aequoria
victoria (Shimomura et al., 1969) emittierte als isoliertes Protein
ein blaues Licht und nicht grünes
Licht wie phänotypisch
beobachtet bei Aequoria victoria. Später konnte das grün fluoreszierende
Protein (GFP) aus Aequoria victoria isoliert werden, das aufgrund
der Anregung durch das Aequorin die Meduse phänotypisch grün erscheinen
lässt (Johnson
et al., 1962; Hastings et al., 1969; Inouye et al., 1994). Als weitere
Photoproteine konnten noch Clytin (Inouye et al., 1993), Mitrocomin
(Fagan et al., 1993) und Obelin (Illarionov et al., 1995) identifiziert
und beschrieben werden.
Tabelle
1: Übersicht über einige
Photoproteine. Angegeben sind der Name, der Organismus aus dem das
Protein isoliert worden ist und die Identifikationsnummer (Acc.
No.) des Datenbankeintrages.
Tabelle
2: Übersicht über einige
Photoproteine. Angegeben sind der Organismus aus dem das Protein
isoliert worden ist, der Name des Photoproteins und eine Auswahl
an Patenten bzw. Anmeldungen.
Biolumineszenz
wird heute in der Technik vielfältig
genutzt, z.B. in Form von Bio-Indikatoren für Umweltverschmutzung oder
in der Biochemie zum empfindlichen Nachweis von Proteinen, zur Quantifizierung
bestimmter Verbindungen oder als sogenannte "Reporter" bei der Untersuchung zellulärer Gen-Regulation.
Die
Photoproteine unterscheiden sich nicht nur aufgrund ihrer Nukleotid-
und Aminosäuresequenz, sondern
auch aufgrund ihrer biochemischen und physikalischen Eigenschaften.
Es
konnte gezeigt werden, dass durch die Veränderung der Aminosäuresequenz
von Photoproteinen die physikalischen und biochemischen Eigenschaften
verändert
werden können.
Beispiele von mutagenisierten Photoproteinen sind in der Literatur
beschrieben (
US 6,495,355 ;
US 5,541,309 ;
US 5,093,240 ; Shimomura et al., 1986).
Die
Lichterzeugung durch die oben genannten Photoproteine erfolgt durch
die Oxidation von Coelenterazin (Haddock et al., 2001; Jones et
al., 1999).
Reportersysteme
Als
Reporter- oder Indikatorgen bezeichnet man generell Gene, deren
Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer oder histochemischer
Methoden leicht nachweisen lassen. Man unterscheidet mindestens
2 Typen von Reportergenen.
- 1. Resistenzgene.
Als Resistenzgene werden Gene bezeichnet, deren Expression einer
Zelle die Resistenz gegen Antibiotika oder andere Substanzen verleiht,
deren Anwesenheit im Wachstumsmedium zum Zelltod führt, wenn
das Resistenzgen fehlt.
- 2. Reportergene. Die Produkte von Reportergenen werden in der
Gentechnologie als fusionierte oder unfusionierte Indikatoren verwendet.
Zu den gebräuchlichsten
Reportergenen gehören
die beta-Galaktosidase (Alam et al., 1990), alkalische Phosphatase
(Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), Luciferasen und andere
Photoproteine (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et
al., 1984).
Als
Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im sichtbaren
Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle erfolgt.
Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie nicht von
Außen
in Form von Strahlung kürzerer
Wellenlänge
zugeführt.
Man
unterscheidet Chemolumineszenz und Biolumineszenz. Als Chemolumineszenz
bezeichnet man eine chemische Reaktion, die zu einem angeregten
Molekül
führt,
das selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen in den Grundzustand
zurückkehren.
Wird diese Reaktion durch ein Enzym katalysiert, spricht man von
Biolumineszenz. Die an der Reaktion beteiligten Enzyme werden generell
als Luziferasen bezeichnet.
Herstellung
der Mutante
Zur
Herstellung der Mutante wurde mit Hilfe molekularbiologische Methoden
die Mutationen an der Position 89 (GenBank #AAA27716; Position 89
von SEQ ID 5) eingefügt.
Hierzu wurde das "Quick
change" Verfahren
der Firma Stratagene (Katalog Nummer #200521; Revision #063001b;
Auflage 2003) verwendet. Als Primer wurden (SEQ ID NO: 3) und (SEQ
ID NO: 4) verwendet. Der Vektor wurde als pET22b-AQ_Y89F bezeichnet.
Aequorin Y89F
In
der Literatur wurden bereits Photoproteine beschrieben, die durch
Austausch einzelner Aminosäuren
verändertete
spektrale oder biochemische Eigenschaften aufwiesen. Zu diesen gehört Obelin
W92F (Vysotski et al., 2003) und Aequorin (Shrestha et al., 2002;
Ohmiya et al., 1993) Das Spektrum von Aequorin wurde im Maximum
mit 470 nm beschrieben (Shimomuro et al., 1966). Eine Übersicht über die
spektralen Eigenschaften von Coelenterazine wurde in Shinomuro (Shimomura
et al., 2000) beschrieben und in 9 gezeigt.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F zeigt die höchste Homologie auf Aminosäureebene
zu Aequorin aus Aequoria Victoria mit einer Identität von 99
%. (gezeigt in Beispiel 8; 8).
Zum Sequenzvergleich wurde das BLAST-Verfahren verwendet (Altschul
et al., 1997).
Die
Erfindung betrifft das Photoprotein Aequorin Y89F mit der Aminosäuresequenz
repräsentiert
durch SEQ ID NO: 2. Ebenfalls betrifft die Erfindung das Nukleinsäuremolekül dargestellt
in SEQ ID NO: 1.
Die
Erfindung betrifft auch funktionelle Äquivalente von Aequorin Y89F.
Funktionelle Äquivalente
sind solche Proteine, die vergleichbare physikochemische Eigenschaften
haben.
Bevorzugt
sind solche Äquivalente,
die ein Maximum im Fluoreszens- oder Biolumineszensspektrum im Bereich
von 480–520
nm, bevorzugt von 485–515
nm, besonders bevorzugt im Bereich von 490–505 nm, oder insbesondere
bei 500 nm aufweisen.
Die
Erfindung betrifft Aequorin Photoproteine, die im Bereich der Aminosäurepositionen
79–99,
84–94, bevorzugt
87–91,
insbesondere 88–90
(bezogen auf GenBank #AAA27716) eine oder mehrere Aminosäuremutationen
aufweisen, welche zu einem veränderten
Fluoreszens- oder Biolumineszensspektrum führen. Desweiteren betrifft
die Erfindung Aequorin Photoproteine, die in der Postion 89 (bezogen
auf GenBank #AAA27716) eine Aminosäuremutation aufweisen, welche
zu einem veränderten
Fluoreszens- oder Biolumineszensspektrum führen. Bevorzugt sind dabei
solche Photoproteine, die ein Maximum im Fluoreszens- oder Biolumineszensspektrum
im Bereich von 480–520
nm, bevorzugt von 485–515
nm, besonders bevorzugt im Bereich von 490–510 nm, 495 bis 505, oder
insbesondere bei 500 nm aufweisen. Hierbei können Aequorin Photoproteine
auch solche Photoproteine sein, welche im Bereich der Aminosäuren 84–94 ein ähnliches
Motif aufweisen wie das verkürzte
Aequorin (GenBank #AAA27716). Als Bereiche mit ähnlichem Motif gelten hier solche
Sequenzen, die in diesem Bereich eine Identität von 80%, bevorzugter Weise
von 90% aufweisen.
Ebenfalls
sind funktionelle Fragmente des Aequorin Y89F Proteins bzw. für solche
kodierende Nukleinsäuren
erfindungsgemäß.
Ebenfalls
sind verkürzte
funktionelle Fragmente weiterer erfindungsgemäßer Proteine bzw. für solche kodierende
Nukleinsäuren
Bestandteil der Erfindung.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme
speziell für
Rezeptoren, für
Ionenkanäle,
für Transporter,
für Transkriptionsfaktoren
oder für
induzierbare Systeme.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich auch als Reportergen durch
Markierung, Identifizierung und Charakterisierung von Zellorganellen
speziell für
Mitochondrien.
Das
Photoprotein von Aequorin Y89F eignet sich auch als Reportergen
zur Bestimmung von Parametern innerhalb und außerhalb von Zellorganellen,
speziell von Mitochondrien, speziell von Kalziumkonzentrationen.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Reportergen in bakteriellen
und eukaryotischen Systemen speziell in Säugerzellen, in Bakterien, in
Hefen, in Bakulo, in Pflanzen.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme
in Kombination mit biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen,
speziell Systemen mit Luziferasen, mit Oxygenasen, mit Phosphatasen.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Fusionsprotein speziell
für Rezeptoren,
für Ionenkanäle, für Transporter,
für Transkriptionsfaktoren,
für Proteinasen,
für Kinasen,
für Phosphodiesterasen,
für Hydrolasen,
für Peptidasen,
für Transferasen,
für Membranproteine
und für
Glykoproteine.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich zur Immobilisierung speziell
durch Antikörper,
durch Biotin, durch magnetische oder magnetisierbare Träger.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Protein für Systeme
des Energietransfers speziell der FRET- (Fluorescence Resonance
Energy Transfer), BRET- (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET
(field effect transistors), FP (fluorescence polarization), HTRF
(Homogeneous time-resolved fluorescence) Systemen.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Markierung von Substraten
oder Liganden speziell für Proteasen,
für Kinasen,
für Transferasen.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich zur Expression in bakteriellen
Sytemen speziell zur Titerbestimmung, als Substrat für biochemische
Systeme speziell für
Proteinasen und Kinasen.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Marker speziell gekoppelt
an Antikörper,
gekoppelt an Enzyme, gekoppelt an Rezeptoren, gekoppelt an Ionenkanäle und andere
Proteine.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Reportergen bei der pharmakologischen
Wirkstoffsuche speziell im HTS (High Throughput Screening).
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Komponente von Detektionssystemen
speziell für ELISA
(enzyme-linked immunosorbent assay), für Immunohistochemie, für Western-Blot,
für die
konfokale Mikroskopie.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Marker für die Analyse
von Wechselwirkungen speziell für
Protein-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-Protein-Wechselwirkungen,
für DNA-RNA-Wechselwirkungen,
für RNA-RNA-
Wechselwirkungen, für
RNA-Protein-Wechselwirkungen (DNA: deoxyribonucleic acid; RNA: ribonucleic
acid;).
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Marker oder Fusionsprotein
für die
Expression in transgenen Organismen speziell in Mäusen, in
Ratten, in Hamstern und anderen Säugetieren, in Primaten, in Fischen,
in Würmern,
in Pflanzen.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Marker oder Fusionsprotein
zur Analyse der Embryonalentwicklung.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Marker über einen
Kopplungsvermittler speziell über Biotin, über NHS
(N-hydroxysulfosuccimide), über
CN-Br.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Reporter gekoppelt an
Nukleinsäuren
speziell an DNA, an RNA.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Reporter gekoppelt an
Proteine oder Peptide.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Reporter zur Messung
von intra- oder extrazellulären Calziumkonzentrationen.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich zur Charakterisierung von
Signalkaskaden in zellulären Systemen.
Das
an Nukleinsäuren
oder Peptiden gekoppelte Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich
als Sonde speziell für
Northern-Blots, für
Southern-Blots, für
Western-Blots, für
ELISA, für
Nukleinsäuresequenzierungen,
für Proteinanalysen,
Chip-Analysen.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich zur Markierung von pharmakologischen
Formulierungen speziell von infektiösen Agentien, von Antikörpern, von „small
molecules".
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich für geologische Untersuchungen
speziell für
Meeres-, Grundwasser- und Flussströmungen.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich zur Expression in Expressionssystemen
speziell in in-vitro Translationssystemen, in bakteriellen Systemen,
in Hefe Systemen, in Bakulo Systemen, in viralen Systemen, in eukaryotischen
Systemen.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich zur Visualisierung von Geweben
oder Zellen bei chirurgischen Eingriffen speziell bei invasiven,
bei nicht-invasiven, bei minimal-invasiven.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich auch zur Markierung von Tumorgeweben
und anderen phänotypisch
veränderten
Geweben speziell bei der histologischen Untersuchung, bei operativen
Eingriffen.
Die
Erfindung betrifft auch die Reinigung des Photoprotein Aequorin
Y89F speziell als Wildtyp Protein, als Fusionsprotein, als mutagenisiertes
Protein.
Das
Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich zur gleichzeitigen Messung
verschiedener Reportergene in einem Expressionsystem (multiplexing).
Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Aequorin
Y89F auf dem Gebiet der Kosmetik speziell von Badezusätzen, von
Lotionen, von Seifen, von Körperfarben,
von Zahncreme, von Körperpudern.
Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Aequorin
Y89F zur Färbung
speziell von Nahrungsmitteln, von Badezusätzen, von Tinte, von Textilien,
von Kunststoffen.
Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Aequorin
Y89F zur Färbung
von Papier speziell von Grußkarten,
von Papierprodukten, von Tapeten, von Bastelartikeln.
Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Aequorin
Y89F zur Färbung
von Flüssigkeiten
speziell für
Wasserpistolen, für
Springbrunnen, für
Getränke,
für Eis.
Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Aequorin
Y89F zur Herstellung von Spielwaren speziell von Fingerfarbe, von
Schminke.
Die
Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die
das Polypeptid offenbart durch SEQ ID NO: 2 bzw funktionelle Äuquivalente
oder funktionelle Fragmente desselben kodieren.
Die
Erfindung bezieht sich des weiteren auf Nukleinsäuremoleküle bzw. funktionelle Äquivalente
oder funktionelle Fragmente derselben, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus
- a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren,
welches die Aminosäuresequenz
offenbart durch SEQ ID NO: 2 beinhaltet;
- b) Nukleinsäuremolekülen, welche
die durch SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz enthalten;
- c) Nukleinsäuremolekülen, deren
komplementärer
Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a)
oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und deren Expressionsprodukt
die biologische Funktion eines Photoproteins aufweisen;
Eine
stringente Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen wird in einer wässrigen
Lösung,
die 0,2 × SSC (1× standard
saline-citrate = 150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat) enthält, bei
68°C durchgeführt (Sambrook
et al., 1989).
- d) Nukleinsäuremolekülen, welche
sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c)
genannten unterscheiden.
Die
Erfindung betrifft die oben genannten Nukleinsäuremoleküle, bei denen die Sequenz einen
funktionalen Promotor 5' zu
der das Photoprotein kodierenden Sequenz bzw. der das Leader- oder
Siganlsequenz kodierenden Sequenz enthält.
Die
Erfindung betrifft auch Nukleinsäuremoleküle wie vorhergehend
beschrieben, die Bestandteil von rekombinanten DNA oder RNA Vektoren
sind.
Die
Erfindung betrifft Organismen, die einen solchen Vektor enthalten.
Die
Erfindung betrifft Photoproteine, die durch die vorhergehend beschriebenen
Nukleotidsequenzen kodiert sind.
Die
Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Expression der erfindungsgemäßen Photoprotein
Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro
Expressionssystemen.
Die
Erfindung betrifft auch Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines
erfindungsgemäßen Photoprotein
Polypeptides.
Die
Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, für Photoproteine
kodierende Nukleinsäuren
als Marker- oder Reportergene, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche
und Diagnostik.
Die
Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Photoproteine
bzw. eine erfindungsgemäße, für ein Photoprotein
kodierende Nukleinsaüre
als Marker oder Reporter bzw. als Marker- oder Reportergen.
Die
Erfindung betrifft die Verwendung des Photoproteins Aequorin Y89F
(SEQ ID NO: 2) oder seiner funktionellen Fragmente oder Äuquivalente
bzw. die Verwendung einer für
das Photoprotein Aequorin Y89F kodierenden Nukleinsäure oder
ihrer funktionellen Fragmente oder Äuquivalente als Marker oder
Reporter bzw. als Marker oder Reportergen insbesondere für die pharmakologische
Wirkstoffsuche und Diagnostik.
Die
Erfindung betrifft die Verwendung der in SEQ ID NO: 1 dargestellten
Nukleinsäure
als Marker- oder Reportergen, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche
und Diagnostik.
Gegenstand
der Erfindung sind auch polyklonale oder monoklonale Antikörper, welche
ein erfindungsgemäßes Polypeptid
erkennen.
Die
Erfindung betrifft auch monoklonale oder polyklonale Antikörper, die
das Photoprotein Aequorin Y89F (SEQ ID NO:2) erkennen.
Die
Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäure wie in den vorangehenden
Absätzen
beschrieben, welche einen funktionalen Promotor 5' zur kodierenden
Sequenz enthält.
Die
Erfindung beinhaltet rekombinante DNA oder RNA Vektoren, welche
die vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren enthalten.
Organismen,
die einen wie vorangehend beschriebenen Vektor enthalten, sind ebenfalls
erfindungsgemäß.
Ein
Polypeptid, das durch eine wie oben beschriebene Nukleinsäuresequenz
kodiert ist, ist ebenfalls Teil der Erfindung.
Erfindungsgemäß ist auch
ein Verfahren zur Expression der vorangehend genannten Polypeptide
in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.
Bestandteil
der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung
eines erfindungsgemäßen Polypeptides.
Die
Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsaüre als Marker-
oder Reportergen.
Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Photoproteins
als Marker oder Reporter.
Bestandteil
der Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polyppeptids
in Kombination mit einer oder mehrerer Luziferasen und/oder einem
oder mehrerer Photoproteine.
Erfindungsgemäß ist ein
Photoprotein oder ein funktionelles Fragment desselben, welches
eine oder mehrere Mutationen in Position 79 bis 99, 85 bis 91, oder
bevorzugt 87 bis 89 bezogen auf SEQ ID NO: 5 besitzt und welches
ein Biolumineszenz bzw Fluoreszenzspektrum mit einem Maximum zwischen
490nm und 510nm aufweist.
Bestandteil
der Erfindung ist ebenfalls ein Photoprotein oder funktionelle Fragmente
desselben, welches eine Mutation in Position 89 bezogen auf SEQ
ID NO: 5 besitzt und welches ein Biolumineszenz bzw. Fluoreszenzspektrum
mit einem Maximum zwischen 490 nm und 510 nm, bevorzugt zwischen
495 nm und 505 nm, besonders bevorzugt zwischen 498 nm und 502 nm
aufweist.
Ebenfalls
erfindungsgemäß ist ein
Nukleinsäuremolekül, welches
eine Sequenz beinhaltet, die für
ein Protein gemäß der beiden
vorangehenden Abschnitte kodiert.
Ein
weiteres Bestandteil der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
eines Photoproteins, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Photoprotein
in der Region definiert durch Position 79 bis 99, bevorzugt 87 bis 91,
besonders bevorzugt 88 bis 90 bezogen auf SEQ ID NO: 5 eine oder
mehrere Mutationen eingeführt
werden, was zu einer Veränderung
des Biolumineszenz oder Fluoreszenzspektrums führt.
Ein
Photoprotein, hergestellt durch ein Verfahren wie im vorangehenden
Abschnitt beschrieben ist ebenfalls erfindungsgemäß.
Expression
der erfindungsgemäßen Photoproteine
Als
Expression bezeichnet man die Produktion eines Moleküls, das
nach dem Einbringen des Gens in eine geeignete Wirtszelle die Transcription
und Translation des in einen Expressionsvektor klonierte Fremdgen erlaubt.
Expressionsvektoren enthalten die für die Expression von Genen
in Zellen von Prokaryonten oder Eukaryonten erforderlichen Kontrollsignale.
Expressionsvektoren
können
prinzipiell auf zwei verschiedene Weisen konstruiert werden. Bei
den sogenannten Transkriptionsfusionen wird das vom einklonierten
Fremdgen codierte Protein als authentisches, biologisch aktives
Protein synthetisiert. Der Expressionsvektor trägt hierzu alle zur Expression
benötigten
5'- und 3'- Kontrollsignale.
Bei
den sogenannten Translationsfusionen wird das vom einklonierten
Fremdgen codierte Protein als Hybridprotein zusammen mit einem anderen
Protein exprimiert, das sich leicht nachweisen lässt. Die zur Expression benötigten 5'- und 3'- Kontrollsignale
inklusive des Startcodons und eventuell ein Teil der für die N-terminalen
Bereiche des zu bildenden Hybridproteins codierenden Sequenzen stammen
vom Vektor. Der zusätzliche
eingeführte
Proteinteil stabilisiert nicht nur in vielen Fällen das vom einklonierten
Fremdgen codierte Protein vor dem Abbau durch zelluläre Proteasen,
sondern lässt
sich auch zum Nachweis und zur Isolierung des gebildeten Hybridproteins
einsetzen. Die Expression kann sowohl transient, als auch stabil
erfolgen. Als Wirtsorganismen eignen sich sowohl Bakterien, Hefen,
Viren als auch eukaryotische Systeme.
Reinigung
der erfindungsgemäßen Photoproteine
Die
Isolierung von Proteinen (auch nach Überexpression) wird häufig als
Proteinreinigung bezeichnet. Zur Proteinreinigung steht eine Vielzahl
an etablierten Methoden und Verfahren zur Verfügung.
Die
Fest-Flüssig-Trennung
ist eine Grundoperation bei Proteinisolierungen. Sowohl bei der
Abtrennung der Zellen vom Kulturmedium als auch bei der Klärung des
Rohextraktes nach Zellaufschluss und Entfernung der Zelltrümmer, bei
der Abtrennung von Niederschlägen
nach Fällungen
usw. ist der Verfahrensschritt erforderlich. Er erfolgt durch Zentrifugation
und Filtration.
Durch
Gewinnung intrazellulärer
Proteine muss die Zellwand zerstört
bzw. durchlässig
gemacht werden. Je nach Maßstab
und Organismus werden dazu Hochdruckhomogenisatoren oder Rührwerkskugel-
bzw. Glasperlenmühlen
eingesetzt. Im Labormaßstab
kommen u.a. mechanische Zellintegrationen und Ultraschallbehandlung
zum Einsatz.
Sowohl
für extrazelluläre als auch
intrazelluläre
Proteine (nach Zellaufschluss) sind verschiedene Fällungsverfahren
mit Salzen (insbesondere Ammoniumsulfat) oder organischen Lösungsmitteln
(Alkohole, Aceton) eine schnelle und effiziente Methode zur Konzentration
von Proteinen. Bei der Reinigung intrazellulärer Proteine ist die Entfernung
der löslichen
Nukleinsäuren
erstrebenswert (Fällung
z.B. mit Streptomycin- oder Protaminsulfat). Bei der Gewinnung extrazellulärer Proteine
werden häufig
Träger
(z.B. Stärke,
Kieselgur) vor Zugabe der Fällungsmittel
zugesetzt, um besser handhabbare Niederschläge zu erhalten.
Für die Feinreinigung
stehen zahlreiche chromatographische und Verteilungsverfahren zur
Verfügung (Absorptions-
und Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Affinitätschromatographie,
Elektrophoresen). Eine Säulenchromatographie
wird auch im technischen Maßstab
angewandt. Für
den Labormaßstab
ist vor allem die Affinitätschromatographie
von Bedeutung, die Reinigungsfaktoren bis zu mehreren 100 pro Schritt
ermöglicht.
Extrazelluläre Proteine
fallen in relativ verdünnten
Lösungen
an. Sie müssen
ebenso wie extrazelluläre Proteine
vor ihrer weiteren Verwendung konzentriert werden. Neben den schon
erwähnten
Verfahren hat sich – auch
im industriellen Maßstab – die Ultrafiltration
bewährt.
Anorganische
Salze als Begleitstoffe von Proteinen sind für spezifische Anwendungen häufig unerwünscht. Sie
können
u.a. durch Gelfiltration, Dialyse und Diafiltration entfernt werden.
Zahlreiche Proteine kommen als Trockenpräparate zum Einsatz. Als Trocknungsverfahren
sind die Vakuum-, Gefrier- und Sprühtrocknung von Bedeutung.
Nukleotid- und Aminosäuresequenzen
Das
Photoprotein Aequorin Y89F wird durch die folgende Nukleotidsequenz
kodiert (SEQ ID NO: 1):
Daraus
ergibt sich eine Aminosäuresequenz
von (SEQ ID NO: 2):
Primer
- (SEQ ID NO: 3):
- 5'-GAATGGCCTGAATTTATCGAAGGATGGAA-3'
- (SEQ ID NO: 4):
- 5'-TTCCATCCTTCGATAAATTCAGGCCATTC-3'
Das
Photoprotein Aequorin (Genbank: AAA27716 ) besitzt folgende Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO: 5). Die Position 89 ist fett gedruckt und unterstrichen.
Diese
Sequenzen finden sich im Sequenzlisting wieder. Kurze Beschreibung
der Figuren
1: Die 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors
pET22b-AQ_Y89F.
2: Die 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors
pcDNA3-AQ_Y89F
3: Die 3 zeigt das Ergebnis der eukaryotischen
Expression von Aequorin Y89F in CHO Zellen. Der Versuchsablauf erfolgte
wie in Beispiel 4 beschrieben. (Y = relative light units, RLU; Y
= ATP log conc./mol/l)
4: Die 4 zeigt die kinetische Analyse des expremierten
Photoproteins AQ_Y89F. [Y= relative light units (RLU); X= Sekunden]
5: Die 5 zeigt das Aligment von Aequorin und
Aequorin Y89F auf Aminosäureebene
6: Die 6 zeigt das Aligment von Aequorin und
Aequorin Y89F auf Nukleinsäureebene
7: Die 7 zeigt die Biolumineszenz nach spektraler
Analyse des Photoproteins Aequorin Y89F. [X = Wellenlänge in nm/Y
= Intensität]
8: Die 8 zeigt die Fluoreszenz nach spektraler
Analyse des Photoproteins Aequorin Y89F. [X = Wellenlänge in nm/Y
= Intensität]
9: Die 9 zeigt die spektralen Eigenschaften
von Coelenterazine (aus Shimomura et al. 2000)
Beispiele
Beispiel 1
Zur
Herstellung der Mutante wurde mit Hilfe molekularbiologische Methoden
die Mutationen an der Position 89 (des verkürtzen Aequorins; GenBank #AAA27716)
eingefügt.
Hierzu wurde das "Quick
change" Verfahren
der Firma Stragene (USA) verwendet. Als Primer wurden (SEQ ID NO:
3) und (SEQ ID NO: 4) verwendet. Der Vektor wurde als pET22b-AQ_Y89F
bezeichnet.
Die 1 zeigt die Plasmidkarte
des Vektors pET22b-AQ_Y89F.
Beispiel 2
Als
Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes
wurde das Plasmid pcDNA3.1(+) der Firma Clontech verwendet. Das
Derivat des Vektors wurde als pcDNA3-AQ_Y89F bezeichnet. Der Vektor pcDNA3-AQ_Y89F
wurde zur Expression von Aequorin Y89F in eukaryotischen Systemen
verwendet.
Die 2 zeigt die Plasmidkarte
des Vektors pcDNA3-AQ_Y89F.
Beispiel 3
Bakterielle
Expression
Die
bakterielle Expression erfolgte in E. coli durch Transformation
der Bakterien mit den Expressionsplasmids pET22b-AQ_Y89F. Die transformierten
Bakterien wurden in LB-Medium bei 37°C für 3 Stunden inkubiert und die
Expression nach Herstellerangaben (Novagen) induziert. Die induzierten
Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet, in 50 mM Tris/HCl
(pH 9,0) + 5 mM EDTA resuspendiert und durch Ultraschall aufgeschlossen.
Das Lysat wurde anschliessend für
15 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute (16000 rcf) zentrifugiert
und der Überstand
abgenommen. Der Überstand
(Verdünnungen
1:5; 1:10; 1:20 und 1:50 mit Tris/HCl pH 9,0)) wurde 3 Stunden mit
Coelenterazin (10E-07 M Coelenterazine in Tris/HCl pH 9,0) im dunkeln inkubiert.
Direkt nach der Zugabe von 5 mM Calziumchlorid wurde die Biolumineszenz
im Luminometer gemessen. Die Integrationszeit der Messung betrug
40 Sekunden.
Beispiel 4
Eukaryotische
Expression
Die
konstitutive eukaryotische Expression erfolgte in CHO-Zellen durch
Transfektion der Zellen mit den Expressionsplasmiden pcDNA3-AQ_Y89F
und pcDNA3.1(+) in transienten Experimen ten. Hierzu wurden 10000
Zellen pro Loch in DMEM-F12 Medium auf 96 Loch Mikrotiterplatten
plattiert und über
Nacht bei 37°C inkubiert.
Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Fugene 6 Kits (Roche) nach
Herstellerangaben. Die transfizierten Zellen wurden über Nacht
bei 37°C
in DMEM-F12 Medium
inkubiert. Anschliessend wurde das Medium entfernt und durch 50 μl Coelenterazin
(10E-07 M Coelenterazine in PBS) ersetzt. Die Zellen wurden für 3 Stunden
bei 37°C
inkubiert und anschliessend ATP (Adenosintriphosphat) bis zu einer
Finalkonzentration von 1 μM
zugegeben. Die Messung wurde direkt nach der Zugabe im Luminometer
gestartet. Die Integrationszeit betrug 1 Sekunde, bei einer Gesamtmessdauer
von 60 Sekunden.
Die 3 zeigt die Ergebnisse der
Biolumineszenzmessung von Aequorin Y89F in CHO Zellen.
Beispiel 5
BLAST
Ergebnis
einer BLAST-Analyse von Aequorin Y89F auf der Aminosäureebene.
Beispiel 6
BLAST
Ergebnis
einer BLAST-Analyse von Aequorin Y89F auf Nukleinsäureebene:
Beispiel 7
Die 6 zeigt das Alignment von
Aequorin Y89F mit Aequorin (wildtype; wt) auf Nukleinsäureebene.
Beispiel 8
Die 7 zeigt das Alignment von
Aequorin Y89F mit Aequorin (wildtype; wt) auf Aminosäureebene.
Beispiel 9
Kinetische Analyse von
Aequorin Y89F
Zur
kinetischen Analyse der Biolumineszenz von Aequorin Y89F, wurden
CHO (Chinese Hamster Ovarian Cells) Zellen mit pcDNA3-AQ_Y89F bzw.
pcDNA3 (ohne integrierte cDNA) transient transfiziert. Die Transfektion
und Messung erfolgte wie unter Beispiel 4 beschrieben. Die Messdaten
wurden für
einen Zeitraum von 60 Sekunden mit einer Integrationszeit von 1
Sekunde erhoben.
Die 4 zeigt die Ergebnisse der
kinetischen Analyse von Aequorin Y89F.
Beispiel 10
Spektrale Analyse von
Aequorin Y89F
Zur
spektralen Analyse der Biolumineszenz und Fluoreszens von Aequorin
Y89F, wurden das Photoprotein in Bakterien expremiert (Beispiel
3) und die Analyse im Spektrometer durchgeführt.
Die 7 zeigt die Ergebnisse der
spektralen Analyse von Aequorin Y89F.
Literatur/Patente
-
US 6,495,355
-
US 5,541,309
-
US 5,093,240
- US-0908909
-
US 6,152,358
- JP-0176125
- GB-0024357
- WO03006497
- WO200168824
- Alam J, Cook JL. Reporter genes: application to the study of
mammalian gene transcription. Anal Biochem. 1990 Aug 1;188(2):245–54
- Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui
Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997); Gapped
BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs;
Nucleic Acids Res. 25:3389–3402
- Chiesa A, Rapizzi E, Tosello V, Pinton P, de Virgilio M, Fogarty
KE, Rizzuto R. Recombinant aequorin and green fluorescent protein
as valuable tools in the study of cell signalling. Biochem J. 2001
Apr 1;355(Pt 1):1–12.
- Claros, M.G., Vincens, P. (1996); Computational method to predict
mitochondrially imported proteins and their targeting segeunces.
Eur. J. Biochem 241, 779–786.
- Cullen Bryan R., Malim Michael H., Secreted placental alkaline
phosphatase as a eukaryotic reporter gene. Methods in Enzymology.
216:362ff
- Fagan TF, Ohmiya Y, Blinks JR, Inouye S, Tsuji FI. Cloning,
expression and sequence analysis of cDNA for the Ca(2+)-binding
photoprotein, mitrocomin. FEBS Lett. 1993 Nov 1;333(3):301–5
- Hastings, J.W. and Morin, J.G. (1969) Comparative biochemistry
of calcium-activated photoproteins from the ctenophore, Mnemiopsis
and the coelenterates Aequorea, Obelia, and Pelagia. Biol. Bull.
137, 402.
- Haddock SH, Rivers TJ, Robison BH. Can coelenterates make coelenterazine?
Dietary requirement for luciferin in cnidarian bioluminescence.
Proc Natl Acad Sci U S A 2001 Sep 25;98(20):11148–51
- Inouye S, Tsuji FI. (1994) Aequorea green fluorescent protein.
Expression of the gene and fluorescence characteristics of the recombinant
protein. FEBS Lett 1994 Mar 21;341(2-3):277–80
- Inouye S, Tsuji FI. Cloning and sequence analysis of cDNA for
the Ca(2+)-activated photoprotein, clytin. FEBS Lett. 1993 Jan 11;315(3):343–6.
- Illarionov BA, Bondar VS, Illarionova VA, Vysotski ES. Sequence
of the cDNA encoding the Ca(2+)-activated photoprotein obelin from
the hydroid polyp Obelia longissima. Gene. 1995 Feb 14;153(2):273–4.
- Jones K, Hibbert F, Keenan M. Glowing jellyfish, luminescence
and a molecule called coelenterazine. Trends Biotechnol 1999 Dec;17(12):477–81
- Johnson, F.H., Shimomura, O., Saiga, Y., Gershman, L.C., Reynolds,
G.T., and Waters, J.R. (1962) Quantum efficiency of Cypridina luminescence,
with a note on that of Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 60, 85–103.
- Morin, J.G. and Hastings, J.W. (1971) Biochemistry of the bioluminescence
of colonial hydroids and other coelenterates. J. Cell. Physiol.
77, 305–311.
- Ohmiya Y, Tsuji FI. Bioluminescence of the Ca(2+)-binding photoprotein,
aequorin, after histidine modification. FEBS Lett. 1993 Apr 12;320(3):267–70.
- Phillips GN. Structure and dynamics of green fluorescent protein.
Curr Opin Struct Biol. 1997 Dec;7(6):821–7
- Sambrook, J., Fritsch, E. Maniatis, T. 1989, Molecular cloning.
A laboratory manual Vol 1–3,
Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press
- Shimomura O, Johnson FH. Properties of the bioluminescent protein
aequorin. Biochemistry. 1969 Oct;8(10):3991–7
- Shimomura O., Bioluminescence in the sea: photoprotein systems.
Symp Soc Exp Biol. 1985;39:351–72
- Shimomura, O. and Teranishi K. (2000) Luminescence 15, 51–58.
- Shimomura O. Isolation and properties of various molecular forms
of aequorin. Biochem J. 1986 Mar 1;234(2):271–7.
- Shimomura, O. and Johnson, F.H. (1966) in: Bioluminescence in
Progress (Johnson, F.H. and Haneda, Y., Eds.) pp. 496–521, Princeton
University Press, Princeton, NJ.
- Shrestha S, Paeng IR, Deo SK, Daunert S. Cysteine-free mutant
of aequorin as a photolabel in immunoassay development. Bioconjug
Chem. 2002 Mar-Apr;13(2):269–75
- Snowdowne KW, Borle AB. Measurement of cytosolic free calcium
in mammalian cells with aequorin. Am J Physiol. 1984 Nov;247(5 Pt
1):C396–408.
- Vysotski ES, Liu ZJ, Markova SV, Blinks JR, Deng L, Frank LA,
Herko M, Malikova NP, Rose JP, Wang BC, Lee J. Violet bioluminescence
and fast kinetics from W92F obelin: structurebased proposals for
the bioluminescence triggering and the identification of the emitting
species. Biochemistry. 2003 May 27;42(20):6013–24.
- Ward, W.W. (1998) Biochemical and physical properties of green
fluorescent protein. In: Green Fluorescent Protein: Properties,
Applications, and Protocols (Chalfie, M. and Kain, S., eds) pp.
45–70.
Wiley-Liss, Inc.
- Yang Te-Tuan, Sinai Parisa, Kitts Paul A. Kain Seven R., Quantification
of gene expression with a secreted alkaline phosphatase reporter
system. Biotechnique. 1997 23(6) 1110ff
