DE102005022146A1

DE102005022146A1 - Isoliertes Photoprotein AQdecay sowie dessen Verwendung

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Publication number: DE102005022146A1
Application number: DE102005022146A
Authority: DE
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2005-05-13
Filing date: 2005-05-13
Publication date: 2006-11-23
Also published as: JP2008539741A; EP1881992A2; CN101223188A; KR20080021018A; WO2006122650A2; TW200716177A; US20090203888A1; WO2006122650A3; CA2608004A1

Abstract

Die Erfindung betrifft das Photoprotein AQdecay, dessen Nukleotid- und Aminosäuresequenz sowie die Aktivität und Verwendung des Photoproteins AQdecay.

Description

Die Erfindung betrifft das Photoprotein AQdecay, dessen Nukleotid- und Aminosäureseguenz, sowie die Aktivität und Verwendung des Photoproteins AQdecay.
Photoproteine
Als Biolumineszenz bezeichnet man das Phänomen der Lichterzeugung durch Lebewesen. Sie ist das Ergebnis von biochemischen Reaktionen in Zellen, bei denen die chemische Energie in Form von Lichtquanten abgegeben wird (sog. kalte Emission durch Chemolumineszenz). Derartig erzeugtes Licht ist monochromatisch, denn es wird bei einem diskreten Elektronen-Übergang abgestrahlt, kann aber durch sekundäre Leuchtfarbstoffe (z.B. fluoreszierende Proteine bei Leuchtquallen der Gattung Aequoria) in längerwellige Spektralbereiche verschoben werden.
Die biologische Funktion ist vielfältig: In der Meerestiefe zwischen 200 und 1000 m (Mesopelagial) leuchten rund 90% aller Lebewesen. Die Leuchtsignale werden hier zur Partnerwerbung, Täuschung und als Köder eingesetzt. Auch Glühwürmchen und Leuchtkäfer nutzen die Lichtsignale zur Partnersuche. Die Bedeutung des Leuchtens von Bakterien, Pilzen und einzelligen Algen ist dagegen unklar. Es wird vermutet, dass es zur Koordination von vielen Einzel-Individuen einer großen Population eingesetzt wird oder eine Art biologische Uhr darstellt.

Eine Vielzahl an Coelenteraten ist biolumineszent (Morin et al., 1974). Diese Organismen emittieren blaues oder grünes Licht. Das 1962 als erstes Licht produzierendes Protein identifizierte Aequorin aus Aequoria victoria (Shimomura et al., 1969) emittierte als isoliertes Protein ein blaues Licht und nicht grünes Licht wie phänotypisch beobachtet bei Aequoria victoria. Später konnte das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Aequoria victoria isoliert werden, das aufgrund der Anregung durch das Aequorin die Meduse phänotypisch grün erscheinen lässt (Johnson et al., 1962; Hastings et al., 1969; Inouye et al., 1994). Als weitere Photoproteine konnten noch Clytin (Inouye et al., 1993), Mitrocomin (Fagan et al., 1993) und Obelin (Illarionov et al., 1995) identifiziert und beschrieben werden.

Tabelle 1: Übersicht über einige Photoproteine. Angegeben sind der Name, der Organismus aus dem das Protein isoliert worden ist und die Identifikationsnummer (Acc. No.) des Datenbankeintrages.

Tabelle 2: Übersicht über einige Photoproteine. Angegeben sind der Organismus aus dem das Protein isoliert worden ist, der Name des Photoproteins und eine Auswahl an Patenten bzw. Anmeldungen.

Biolumineszenz wird heute in der Technik vielfältig genutzt, z.B. in Form von Bio-Indikatoren für Umweltverschmutzung oder in der Biochemie zum empfindlichen Nachweis von Proteinen, zur Quantifizierung bestimmter Verbindungen oder als sogenannte "Reporter" bei der Untersuchung zellulärer Gen-Regulation.

Die Photoproteine unterscheiden sich nicht nur aufgrund ihrer Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sondern auch aufgrund ihrer biochemischen und physikalischen Eigenschaften.

Es konnte gezeigt werden, dass durch die Veränderung der Aminosäuresequenz von Photoproteinen die physikalischen und biochemischen Eigenschaften verändert werden können. Beispiele von mutagenisierten Photoproteinen sind in der Literatur beschrieben ( US 6,495,355 ; US 5,541,309 ; US 5,093,240 ; Shimomura et al., 1986).

Die Lichterzeugung durch die oben genannten Photoproteine erfolgt durch die Oxidation von Coelenterazin (Haddock et al., 2001; Jones et al., 1999).

Reportersysteme

Als Reporter- oder Indikatorgen bezeichnet man generell Gene, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer oder histochemischer Methoden leicht nachweisen lassen. Man unterscheidet mindestens 2 Typen von Reportergenen.

1. Resistenzgene. Als Resistenzgene werden Gene bezeichnet, deren Expression einer Zelle die Resistenz gegen Antibiotika oder andere Substanzen verleiht, deren Anwesenheit im Wachstumsmedium zum Zelltod führt, wenn das Resistenzgen fehlt.
2. Reportergene. Die Produkte von Reportergenen werden in der Gentechnologie als fusionierte oder unfusionierte Indikatoren verwendet. Zu den gebräuchlichsten Reportergenen gehören die beta-Galaktosidase (Alam et al., 1990), alkalische Phosphatase (Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), Luciferasen und andere Photoproteine (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984).

Als Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im sichtbaren Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle erfolgt. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie nicht von Außen in Form von Strahlung kürzerer Wellenlänge zugeführt.

Man unterscheidet Chemolumineszenz und Biolumineszenz. Als Chemolumineszenz bezeichnet man eine chemische Reaktion, die zu einem angeregten Molekül führt, das selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen in den Grundzustand zurückkehren. Wird diese Reaktion durch ein Enzym katalysiert, spricht man von Biolumineszenz. Die an der Reaktion beteiligten Enzyme werden generell als Luziferasen bezeichnet.

Herstellung der Mutante

Zur Herstellung der Mutante wurde mit Hilfe molekularbiologische Methoden die Mutationen an der Position 89 [Y89F] (GenBank #AAA27716; Position 89 von SEQ ID 5) und Porsition 139 [Y139F] (GenBank #AAA27716; Position 139 von SEQ ID 5) eingefügt. Hierzu wurde das "Quick change" Verfahren der Firma Stratagene (Katalog Nummer #200521; Revision #063001b; Auflage 2003) verwendet. Als Primer wurden (SEQ ID NO:3) und (SEQ ID NO:4) verwendet. Der Vektor wurde als pET22b-AQdecay bezeichnet.

AQdecay

In der Literatur wurden bereits Photoproteine beschrieben, die durch Austausch einzelner Aminosäuren verändertete spektrale oder biochemische Eigenschaften aufwiesen. Zu diesen gehört Obelin W92F (Vysotski et al., 2003) und Aequorin (Shrestha et al., 2002; Ohmiya et al., 1993)

Die Aequorin Mutante AQdecay zeigt eine zeitlich veränderte Lichtfreisetzung verglichen mit dem Photoprotein Aequorin oder anderen Photoproteinen.

Die für die zeitliche Veränderung der Lichtfreisetzung verantwortliche Mutation an Position 139 wurde mit einer Mutation an Position 89 kombiniert. Die Veränderung an Position 89 wurde bereits beschrieben und führt zu einer Veränderung der spektralen Eigenschaften des Photoproteins. Die gewählte Kombination zeigt neben der zeitlich veränderten Lichtfreisetzung auch veränderte spektrale Eigenschaften. Eine Kombination mit Austauschen anderer Aminosäuren mit der Veränderung an Position 139 ist möglich. Auch die Kombination der Veränderung an Position 139 mit der wildtyp Sequenz des übrigen Photoproteins Aequorin ist möglich.

Das Photoprotein AQdecay zeigt überraschenderweise eine bisher noch nicht beschriebene verlangsamte Kinetik der Lichtfreisetzung bzw. Lumineszenz. Diese Eigenschaft ermöglicht die Verwendung des Photoproteins neben den üblichen Einsatzmöglichkeiten speziell für die Untersuchung von Reaktionen oder Mechanismen mit sehr schnellen Kalziumfreisetzungen in eukaryotischen Zellen oder anderen Systemen. Die Kinetik der Lichtfreisetzung von bisher beschriebenen Photoproteinmutanten oder Photoprotein Wildtypproteinen wird als "flash" Kinetik beschrieben, da das Licht nach Aktivierung (z.B. mit Kalzium) in kürzester Zeit freigesetzt wird und die Reaktion anschließend zum Stilstand kommt oder zumindest deutlich schwächer wird. Zur Messung dieser schnellen Kinetik sind besondere Messinstrumente erforderlich. Die beschriebene Photoproteinmutante AQdecay bzw. dessen Äquivalente ermöglicht nicht nur die Verwendung anderer Messinstrumente oder Messverfahren, sondern vor allem die Untersuchung von sehr schnellen Kinetiken. Diese Kinetiken können z.B. bei Ionenkanälen der Familie P2X auftreten.

Das Spektrum von Aequorin wurde im Maximum mit 470 nm beschrieben (Shimomuro et al., 1966). Eine Übersicht über die spektralen Eigenschaften von Coelenterazine wurde in Shinomuro (Shimomura et al., 2000) beschrieben.

Das Photoprotein AQdecay zeigt die höchste Homologie auf Aminosäureebene zu Aequorin aus Aequoria Victoria mit einer Identität von 99 % (gezeigt in Beispiel 8). Zum Sequenzvergleich wurde das BLAST-Verfahren verwendet (Altschul et al., 1997).

Die Erfindung betrifft das Photoprotein AQdecay mit der Aminosäuresequenz repräsentiert durch SEQ ID NO:2. Ebenfalls betrifft die Erfindung das Nukleinsäuremolekül dargestellt in SEQ ID NO:1.

Die Erfindung betrifft auch funktionelle Äquivalente von AQdecay. Funktionelle Äquivalente sind solche Proteine, die vergleichbare physikochemische Eigenschaften haben.

Die Erfindung betrifft Aequorin Photoproteine, die im Bereich der Aminosäurepositionen 129–149, 124–134, bevorzugt 137–141, insbesondere 138–140 (bezogen auf GenBank #AAA27716) eine oder mehrere Aminosäuremutationen aufweisen, welche zu einem veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz führen. Desweiteren betrifft die Erfindung Aequorin Photoproteine, die in der Postion 139 (bezogen auf GenBank #AAA27716) eine Aminosäuremutation aufweisen, welche zu einem veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz führen. Hierbei können Aequorin Photoproteine auch solche Photoproteine sein, welche im Bereich der Aminosäuren 134–145 ein ähnliches Motif aufweisen wie das verkürzte Aequorin (GenBank #AAA27716). Als Bereiche mit ähnlichem Motif gelten hier solche Sequenzen, die in diesem Bereich eine Identität von 80%, bevorzugter Weise von 90% aufweisen.

Die Erfindung betrifft Kombinationen von Aequorin Photoproteinen, die im Bereich der Aminosäurepositionen 79–99, 84–94, bevorzugt 87–91, insbesondere 88–90 (bezogen auf GenBank #AAA27716) eine oder mehrere Aminosäuremutationen aufweisen, welche zu einem veränderten Fluoreszens- oder Biolumineszensspektrum führen, mit Mutationen im Bereich Aminosäureposition 139. Desweiteren betrifft die Erfindung Kombinationen von Aequorin Photoproteinen, die in der Postion 89 (bezogen auf GenBank #AAA27716) eine Aminosäuremutation aufweisen, welche zu einem veränderten Fluoreszens- oder Biolumineszensspektrum führen, mit Mutationen im Bereich Aminosäureposition 139. Bevorzugt sind dabei solche Photoproteine, die ein Maximum im Fluoreszens- oder Biolumineszensspektrum im Bereich von 480–520 nm, bevorzugt von 485–515nm, besonders bevorzugt im Bereich von 490–510 nm, 495 bis 505, oder insbesondere bei 500 nm aufweisen. Hierbei können Aequorin Photoproteine auch solche Photoproteine sein, welche im Bereich der Aminosäuren 84–94 ein ähnliches Motif aufweisen wie das verkürzte Aequorin (GenBank #AAA27716). Als Bereiche mit ähnlichem Motif gelten hier solche Sequenzen, die in diesem Bereich eine Identität von 80%, bevorzugter Weise von 90% aufweisen.

Ebenfalls sind funktionelle Fragmente des AQdecay Proteins bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren erfindungsgemäß.

Ebenfalls sind verkürzte funktionelle Fragmente weiterer erfindungsgemäßer Proteine bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren Bestandteil der Erfindung.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren oder für induzierbare Systeme.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich auch als Reportergen durch Markierung, Identifizierung und Charakterisierung von Zellorganellen speziell für Mitochondrien.

Das Photoprotein von AQdecay eignet sich auch als Reportergen zur Bestimmung von Parametern innerhalb und ausserhalb von Zellorganellen, speziell von Mitochondrien, speziell von Kalziumkonzentrationen.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich als Reportergen in bakteriellen und eukaryotischen Systemen speziell in Säugerzellen, in Bakterien, in Hefen, in Bacculo, in Pflanzen.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme in Kombination mit biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen, speziell Systemen mit Luziferasen, mit Oxygenasen, mit Phosphatasen.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich als Fusionsprotein speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren, für Proteinasen, für Kinasen, für Phosphodiesterasen, für Hydrolasen, für Peptidasen, für Transferasen, für Membranproteine und für Glykoproteine.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich zur Immobilisierung speziell durch Antikörper, durch Biotin, durch magnetische oder magnetisierbare Träger.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich als Protein für Systeme des Energietransfers speziell der FRET- (Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET- (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET (field effect transistors), FP (fluorescence polarization), HTRF (Homogeneous time-resolved fluorescence) Systemen.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich als Markierung von Substraten oder Liganden speziell für Proteasen, für Kinasen, für Transferasen.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich zur Expression in bakteriellen Sytemen speziell zur Titerbestimmung, als Substrat für biochemische Systeme speziell für Proteinasen und Kinasen.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich als Marker speziell gekoppelt an Antikörper, gekoppelt an Enzyme, gekoppelt an Rezeptoren, gekoppelt an Innenkanäle und andere Proteine.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich als Reportergen bei der pharmakologischen Wirkstoffsuche speziell im HTS (High Throughput Screening).

Das Photoprotein AQdecay eignet sich als Reportergen bei der Charakterisierung, Identifizierung und Untersuchung von Ionenkanälen, speziell des Typs p2x, TRP, SCN, KCN, CNG, ACCN.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich als Komponente von Detektionssystemen speziell für ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), für Immunohistochemie, für Western-Blot, für die konfokale Mikroskopie.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich als Macker für die Analyse von Wechselwirkungen speziell für Protein-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-RNA-Wechselwirkungen, für RNA-RNA- Wechselwirkungen, für RNA-Protein-Wechselwirkungen (DNA: deoxyribonucleic acid; RNA: ribonucleic acid;).

Das Photoprotein AQdecay eignet sich als Marker oder Fusionsprotein für die Expression in transgenen Organismen speziell in Mäusen, in Ratten, in Hamstern. und anderen Säugetieren, in Primaten, in Fischen, in Würmern, in Pflanzen.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich als Marker oder Fusionsprotein zur Analyse der Embryonalentwicklung.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich als Marker über einen Kopplungsvermittler speziell über Biotin, über NHS (N-hydroxysulfosuccimide), über CN-Br.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich als Reporter gekoppelt an Nukleinsäuren speziell an DNA, an RNA.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich als Reporter gekoppelt an Proteine oder Peptide.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich als Reporter zur Messung von intra- oder extrazellulären Calziumkonzentrationen.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich zur Charakterisierung von Signalkaskaden in zellulären Systemen.

Das an Nukleinsäuren oder Peptiden gekoppelte Photoprotein AQdecay eignet sich als Sonde speziell für Northern-Blots, für Southern-Blots, für Western-Blots, für ELISA, für Nukleinsäuresequenzierungen, für Proteinanalysen, Chip-Analysen.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich zur Markierung von pharmakologischen Formulierungen speziell von infektiösen Agentien, von Antikörpern, von „small molecules".

Das Photoprotein AQdecay eignet sich für geologische Untersuchungen speziell für Meeres-, Grundwasser- und Flussströmungen.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich zur Expression in Expressionssystemen speziell in in-vitro Translationssystemen, in bakteriellen Systemen, in Hefe Systemen, in Bacculo Systemen, in viralen Systemen, in eukaryotischen Systemen.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich zur Visualisierung von Geweben oder Zellen bei chirurgischen Eingriffen speziell bei invasiven, bei nicht-invasiven, bei minimal-invasiven.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich auch zur Markierung von Tumorgeweben und anderen phänotypisch veränderten Geweben speziell bei der histologischen Untersuchung, bei operativen Eingriffen.

Die Erfindung betrifft auch die Reinigung des Photoprotein AQdecay speziell als wildtyp Protein, als Fusionsprotein, als mutagenisiertes Protein.

Das Photoprotein AQdecay eignet sich zur gleichzeitigen Messung verschiedener Reportergene in einem Expressionsystem (multiplexing).

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein AQdecay auf dem Gebiet der Kosmetik speziell von Badezusätzen, von Lotionen, von Seifen, von Körperfarben, von Zahncreme, von Körperpudern.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein AQdecay zur Färbung speziell von Nahrungsmitteln, von Badezusätzen, von Tinte, von Textilien, von Kunststoffen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein AQdecay zur Färbung von Papier speziell von Grußkarten, von Papierprodukten, von Tapeten, von Bastelartikeln.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein AQdecay zur Färbung von Flüssigkeiten speziell für Wasserpistolen, für Springbrunnen, für Getränke, für Eis.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein AQdecay zur Herstellung von Spielwaren speziell von Fingerfarbe, von Schminke.

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die das Polypeptid offenbart durch SEQ ID NO:2 bzw funktionelle Äuquivalente oder funktionelle Fragmente desselben kodieren.

Die Erfindung bezieht sich des weiteren auf Nukleinsäuremoleküle bzw. funktionelle Äquivalente oder funktionelle Fragmente derselben, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO:2 beinhaltet;
b) Nukleinsäuremolekülen, welche die durch SEQ ID NO:1 dargestellte Sequenz enthalten;
c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und deren Expressionsprodukt die biologische Funktion eines Photoproteins aufweisen; Eine stringente Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen wird in einer wässrigen Lösung, die 0,2 x SSC (1x standard saline-citrate = 150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat) enthält, bei 68 °C durchgeführt (Sambrook et al., 1989).
d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden.

Die Erfindung betrifft die oben genannten Nukleinsäuremoleküle, bei denen die Sequenz einen funktionalen Promotor 5' zu der das Photoprotein kodierenden Sequenz bzw. der das Leader- oder Siganlsequenz kodierenden Sequenz enthält.

Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuremoleküle wie vorhergehend beschrieben, die Bestandteil von rekombinanten DNA oder RNA Vektoren sind.

Die Erfindung betrifft Organismen, die einen solchen Vektor enthalten.

Die Erfindung betrifft Photoproteine, die durch die vorhergehend beschriebenen Nukleotidsequenzen kodiert sind.

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Expression der erfindungsgemäßen Photoprotein Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen Photoprotein Polypeptides.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, für Photoproteine kodierende Nukleinsäuren als Marker- oder Reportergene, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Photoproteine bzw. eine erfindungsgemäße, für ein Photoprotein kodierende Nukleinsaüre als Marker oder Reporter bzw. als Marker- oder Reportergen.

Die Erfindung betrifft die Verwendung des Photoproteins AQdecay (SEQ ID NO:2) oder seiner funktionellen Fragmente oder Äuquivalente bzw. die Verwendung einer für das Photoprotein AQdecay kodierenden Nukleinsäure oder ihrer funktionellen Fragmente oder Äquivalente als Marker oder Reporter bzw. als Marken oder Reportergen insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleinsäure als Marker- oder Reportergen, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.

Gegenstand der Erfindung sind auch polyklonale oder monoklonale Antikörper, welche ein erfindungsgemäßes Polypeptid erkennen.

Die Erfindung betrifft auch monoklonale oder polyklonale Antikörper, die das Photoprotein AQdecay (SEQ ID NO:2) erkennen.

Die Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäure wie in den vorangehenden Absätzen beschrieben, welche einen funktionalen Promotor 5' zur kodierenden Sequenz enthält.

Die Erfindung beinhaltet rekombinante DNA oder RNA Vektoren, welche die vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren enthalten.

Organismen, die einen wie vorangehend beschriebenen Vektor enthalten, sind ebenfalls erfindungsgemäß.

Ein Polypeptid, das durch eine wie oben beschriebene Nukleinsäuresequenz kodiert ist, ist ebenfalls Teil der Erfindung.

Erfindungsgemäß ist auch ein Verfahren zur Expression der vorangehend genannten Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.

Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen Polypeptides.

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsaüre als Marker- oder Reportergen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Photoproteins als Marker oder Reporter.

Bestandteil der Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polyppeptids in Kombination mit einer oder mehrerer Luziferasen und/oder einem oder mehrerer Photoproteine.

Erfindungsgemäß ist ein Photoprotein oder ein funktionelles Fragment desselben, welches eine oder mehrere Mutationen im Bereich der 129–149, 124–134, bevorzugt 137–141, insbesondere 138–140 (bezogen auf GenBank #AAA27716) besitzt und welches ein verändertes speziell verlangsamtes Biolumineszenzsignal aufweist.

Ebenfalls erfindungsgemäß ist ein Nukleinsäuremolekül, welches eine Sequenz beinhaltet, die für ein Protein gemäß der beiden vorangehenden Abschnitte kodiert.

Ein weiteres Bestandteil der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Photoproteins, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Photoprotein in der Region definiert durch Position 129–149, 124–134, bevorzugt 137–141, insbesondere 138–140 bezogen auf GenBank #AAA27716 eine oder mehrere Mutationen eingeführt werden, was zu einer Veränderung der Biolumineszenz führt.

Ein Photoprotein, hergestellt durch ein Verfahren wie im vorangehenden Abschnitt beschrieben ist ebenfalls erfindungsgemäß.

Die Erfindung betrifft auch andere Photoproteine, die durch eine oder mehrere Veränderungen in der Aminosäuresequenz eine veränderte Kinetik der Lichtfreisetzung aufweisen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung anderer veränderter Photoproteine für die beschriebenen Verwendungen des Photoproteins AQdecay.

Photoproteine mit veränderter Kinetik der Lichtfreisetzung, besonders einer verlängsamten Lichfreisetzung oder verlängerten Zeitspanne, in der Licht freigesetzt wird, eignen sich besonders als Reportergene in zellbasierten Verfahren, speziell in der pharmakologischen Wirkstoffsuche und Charakterisierung, speziell in der Diagnostik.

Photoproteine mit veränderter Kinetik der Lichtfreisetzung, besonders einer verlängsamten Lichfreisetzung oder verlängerten Zeitspanne, in der Licht freigesetzt wird, eignen sich besonders zur Untersuchung von Ionenkanälen.

Die Erfindung betrifft auch kodonoptimierte Varianten der erfindungsgemäßen Proteine zur Veränderung der biochemischen oder physikochemischen Eigenschaften, speziell der verbesserten Expression, speziell der veränderten Stabilität.

Die Erfindung betrifft auch Fusionen der erfindungsgenäßen Proteine mit Erkennungspeptiden zum Transport oder Lokalisierung der erfindungsgemäßen Proteinen in Zellorganellen oder Kompartimenten.

Die Erfindung betrifft auch Varianten der erfindungsgemäßen Proteine, die zu einer Veränderung der spektralen Eigenschaften, der Lumineszenzintensität, der Substratspezifität, der Verwendung von Cofaktoren, der Kalziumaffinität oder anderer physikochemischen oder biochemischen Eigenschaften führen.

Expression der erfindungsgemäßen Photoproteine

Als Expression bezeichnet man die Produktion eines Moleküls, das nach dem Einbringen des Gens in eine geeignete Wirtszelle die Transcription und Translation des in einen Expressionsvektor klonierte Fremdgen erlaubt. Expressionsvektoren enthalten die für die Expression von Genen in Zellen von Prokaryonten oder Eukaryonten erforderlichen Kontrollsignale.

Expressionsvektoren können prinzipiell auf zwei verschiedene Weisen konstruiert werden. Bei den sogenannten Transkriptionsfusionen wird das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein als authentisches, biologisch aktives Protein synthetisiert. Der Expressionsvektor trägt hierzu alle zur Expression benötigten 5'- und 3'-Kontrollsignale.

Bei den sogenannten Translationsfusionen wird das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein als Hybridprotein zusammen mit einem anderen Protein exprimiert, das sich leicht nachweisen lässt. Die zur Expression benötigten 5'- und 3'-Kontrollsignale inklusive des Startcodons und eventuell ein Teil der für die N-terminalen Bereiche des zu bildenden Hybridproteins codierenden Sequenzen stammen vom Vektor. Der zusätzliche eingeführte Proteinteil stabilisiert nicht nur in vielen Fällen das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein vor dem Abbau durch zelluläre Proteanen, sondern lässt sich auch zum Nachweis und zur isolierung des gebildeten Hybridproteins einsetzen. Die Expression kann sowohl transient, als auch stabil erfolgen. Als Wirtsorganismen eignen sich sowohl Bakterien, Hefen, Viren als auch eukaryotische Systeme.

Reinigung der erfindungsgemäßen Photoproteine

Die Isolierung von Proteinen (auch nach Überexpression) wird häufig als Proteinreinigung bezeichnet. Zur Proteinreinigung steht eine Vielzahl an etablierten Methoden und Verfahren zur Verfügung.

Die Fest-Flüssig-Trennung ist eine Grundoperation bei Proteinisolierungen. Sowohl bei der Abtrennung der Zellen vom Kulturmedium als auch bei der Klärung des Rohextraktes nach Zellaufschluss und Entfernung der Zelltrümmer, bei der Abtrennung von Niederschlägen nach Fällungen usw. ist der Verfahrensschritt erforderlich. Er erfolgt durch Zentrifugation und Filtration.

Durch Gewinnung intrazellulärer Proteine muss die Zellwand zerstört bzw. durchlässig gemacht werden. Je nach Maßstab und Organismus werden dazu Hochdruckhomogenisatoren oder Rührwerkskugel- bzw. Glasperlenmühlen eingesetzt. Im Labormaßstab kommen u.a. mechanische Zellintegrationen und Ultraschallbehandlung zum Einsatz.

Sowohl für extrazelluläre als auch intrazelluläre Proteine (nach Zellaufschluss) sind verschiedene Fällungsverfahren mit Salzen (insbesondere Ammoniumsulfat) oder organischen Lösungsmitteln (Alkohole, Aceton) eine schnelle und effiziente Methode zur Konzentration von Proteinen. Bei der Reinigung intrazellulärer Proteine ist die Entfernung der löslichen Nukleinsäuren erstrebenswert (Fällung z.B. mit Streptomycin- oder Protaminsulfat). Bei der Gewinnung extrazellulärer Proteine werden häufig Träger (z.B. Stärke, Kieselgur) vor Zugabe der Fällungsmittel zugesetzt, um besser handhabbare Niederschläge zu erhalten.

Für die Feinreinigung stehen zahlreiche chromatographische und Verteilungsverfahren zur Verfügung (Absorptions- und Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, Elektrophoresen). Eine Säulenchromatographie wird auch im technischen Maßstab angewandt. Für den Labormaßstab ist vor allem die Affinitätschromatographie von Bedeutung, die Reinigungsfaktoren bis zu mehreren 100 pro Schritt ermöglicht.

Extrazelluläre Proteine fallen in relativ verdünnten Lösungen an. Sie müssen ebenso wie extrazelluläre Proteine vor ihrer weiteren Verwendung konzentriert werden. Neben den schon erwähnten Verfahren hat sich – auch im industriellen Maßstab – die Ultrafiltration bewährt.

Anorganische Salze als Begleitstoffe von Proteinen sind für spezifische Anwendungen häufig unerwünscht. Sie können u.a. durch Gelfiltration, Dialyse und Diafiltration entfernt werden. Zahlreiche Proteine kommen als Trockenpräparate zum Einsatz. Als Trocknungsverfahren sind die Vakuum-, Gefrier- und Sprühtrocknung von Bedeutung.

Nukleotid- und Aminosäuresequenzen

Das Photoprotein AQdecay wird durch die folgende Nukleotidsequenz kodiert (SEQ ID NO:1):

Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von (SEQ ID NO:2):

Primer:

(SEQ ID NO:3): 5'- GAATGGCCTGAATTTATCGAAGGATGGAA-3'
(SEQ ID NO:4): 5'- TTCCATCCTTCGATAAATTCAGGCCATTC-3'
(SEQ ID NO:5): 5'- GAATGGAAAGCATTCACCAAATCTGCTG-3'
(SEQ ID NO:6): 5'- CAGCAGATTTGGTGAATGCTTTCCATTC-3'

Das Photoprotein Aequorin (Genbank: AAA27716) besitzt folgende Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:7). Die Position 89 und 139 sind fett gedruckt und unterstrichen.

Diese Sequenzen finden sich im Sequenzlisting wieder.

Kurze Beschreibung der Figuren

1: Die 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pET22b-AQdecay.

2: Die 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-AQdecay

3: Die 3 zeigt das Ergebnis der eukaryotischen Expression von AQdecay in CHO Zellen. Der Versuchsablauf erfolgte wie in Beispiel 4 beschrieben. (Y = relative light units, RLU; X = ATP log conc./mol/l)

4: Die 4 zeigt das Ergebnis der bakteriellen Expression von AQdecay. Der Versuchsablauf erfolgte wie in Beispiel 3 beschrieben. (Y = relative light units, RLU; X = Zeit in Sekunden; schwarze Kurve: AQdecay; graue Kurve: wildtyp Aequorin)

5: Die 5 zeigt die Biolumineszenz-Kinetik von AQdecay (Expression in CHO Zellen). Der Versuchsablauf erfolgte wie in Beispiel 4 beschrieben. (Y = relative light units, RLU; X = Zeit in Sekunden; schwarze Kurve: AQdecay; graue Kurve: wildtyp Aequorin)
Beispiel 1
Zur Herstellung der Mutante wurde mit Hilfe molekularbiologische Methoden die Mutationen an der Position 132 (des verkürtzen Aequorins; GenBank #AAA27716) eingefügt. Hierzu wurde das "Quick change" Verfahren der Firma Stragene (USA) verwendet. Als Primer wurden (SEQ ID NO:3) und (SEQ ID NO:4) verwendet. Die Insertion der cDNA erfolgte in die Schnittstelle NdeI/XhoI des Vektors pET22b (Novagen). Der Vektor wurde als pET22b-AQdecay bezeichnet.
Die 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pET22b-AQdecay.
Beispiel 2
Als Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes wurde das Plasmid pcDNA3.1(+) der Firma Clontech verwendet. Das Derivat des Vektors wurde als pcDNA3-AQdecay bezeichnet. Der Vektor pcDNA3-AQdecay wurde zur Expression von AQdecay in eukaryotischen Systemen verwendet.
Die 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-AQdecay.
Beispiel 3
Bakterielle Expression
Die bakterielle Expression erfolgte in E. coli durch Transformation der Bakterien mit den Expressionsplasmids pET22b-AQdecay. Die transformierten Bakterien wurden in LB-Medium bei 37°C für 3 Stunden inkubiert und die Expression nach Herstellerangaben (Novagen) induziert. Die induzierten Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet, in 50 mM Tris/HCl (pH 9,0) + 5 mM EDTA resuspendiert und durch Ultraschall aufgeschlossen. Das Lysat wurde anschliessend für 15 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute (16000 rcf) zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Der Überstand (Verdünnungen 1:5; 1:10; 1:20 und 1:50 mit Tris/HCl pH 9,0)) wurde 3 Stunden mit Coelenterazin (10E-07 M Coelenterazine in Tris/HCl pH 9,0) im dunkeln inkubiert. Direkt nach der Zugabe von 5 mM Calziumchlorid wurde die Biolumineszenz im Luminometer gemessen. Die Integrationszeit der Messung betrug 40 Sekunden.
Die 4 zeigt die Kinetik der Biolumineszenzmessung von AQdecay in Bakterien.
Beispiel 4
Eukaryotische Expression
Die konstitutive eukaryotische Expression erfolgte in CHO-Zellen durch Transfektion der Zellen mit den Expressionsplasmiden pcDNA3-AQdecay und pcDNA3.1(+) in transienten Experimenten. Hierzu wurden 10000 Zellen pro Loch in DMEM-F12 Medium auf 96 Loch Mikrotiterplatten plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Fugene 6 Kits (Roche) nach Herstellerangaben. Die transfizierten Zellen wurden über Nacht bei 37°C in DMEM-F12 Medium inkubiert. Anschliessend wurde das Medium entfernt und durch 50 μl Coelenterazin (10E-07 M Coelenterazine in PBS) ersetzt. Die Zellen wurden für 24 Stunden bei 28 °C inkubiert und anschliessend ATP (Adenosintriphosphat) bis zu einer Finalkonzentration von 1 μM zugegeben. Die Messung wurde direkt nach der Zugabe im Luminometer gestartet. Die Integrationszeit betrug 1 Sekunde, bei einer Gesamtmessdauer von 60 Sekunden.
Die 3 zeigt die Ergebnisse der Biolumineszenzmessung von AQdecay in CHO Zellen.
Die 5 zeigt die Kinetik der Biolumineszenzmessung von AQdecay in CHO Zellen
Beispiel 5
BLAST
Ergebnis einer BLAST-Analyse von AQdecay auf der Aminosäureebene.

>emb|CAC93774.1| unnamed protein product [Aequorea victoria] Length = 196, Score = 410 bits (1054), Expect = e-113, Identities = 1941196 (98%), Positives = 196/196 (100%)
>pir||A26623 aequorin-1 precursor – hydromedusa (Aequorea victoria) sp|P07164|AEQ1_AEQVI Aequorin 1 precursor gb|AAA27716.1| aequorin 1 precursor Length = 196, Score = 410 bits (1054), Expect = e-113, Identities = 194/196 (98%), Positives = 196/196 (100%)
>gb|AAB14842.1| Sequence 1 from patent US 5541309 gb|AAA55424.1| Sequence 2 from Patent EP 0187519 Length = 196, Score = 407 bits (1046), Expect = e-113, Identities = 193/196 (98%), Positives = 195/196 (99%)
>gb|AAB14845.1| Sequence 4 from patent US 5541309 Length = 196, Score = 405 bits (1041), Expect = e-112, Identities = 192/196 (97%), Positives = 194/196 (98%)
>gb|AAB14846.1| Sequence 5 from patent US 5541309 Length = 196, Score = 405 bits (1040), Expect = e-112, Identities = 192/196 (97%), Positives = 194/196 (98%)
>gb|AAB14844.1| Sequence 3 from patent US 5541309 Length = 196, Score = 405 bits (1040), Expect = e-112, Identities = 192/196 (97%), Positives = 194/196 (98%)
>emb|CAC93778.1| unnamed protein product [Aequorea victoria] Length = 196, Score = 402 bits (1034), Expect = e-111, Identities = 191/196 (97%), Positives = 193/196 (98%)
>dbj|BAC81730.1| apoaequorin [Aequorea victoria] Length = 196, Score = 401 bits (1031), Expect = e-111, Identities = 189/196 (96%), Positives = 195/196 (99%)
>emb|CAC93779.1| unnamed protein product [Aequorea victoria] Length = 196, Score = 400 bits (1029), Expect = e-111, Identities = 190/196 (96%), Positives = 192/196 (97%)
>emb|CAC93780.1| unnamed protein product [Aequorea victoria] Length = 196, Score = 400 bits (1028), Expect = e-110, Identities = 190/196 (96%), Positives = 192/196 (97%)
>pdb|1SL8|A Chain A, Calcium-Loaded Apo-Aequorin From Aequorea Victoria Length = 191, Score = 395 bits (1015), Expect = e-109, Identities = 187/190 (98%), Positives = 189/190 (99%)
>gb|AAB14843.1| Sequence 2 from patent US 5541309 Length = 189, Score = 394 bits (1011), Expect = e-108, Identities = 186/189 (98%), Positives = 188/189 (99%)
>emb|CAC93777.1| unnamed protein product [Aequorea victoria] Length = 189, Score = 391 bits (1005), Expect = e-108, Identities = 185/189 (97%), Positives = 187/189 (98%)
>emb|CAC93781.1| unnamed protein product [Aequorea victoria] Length = 189, Score = 391 bits (1004), Expect = e-108, Identities = 184/189 (97%), Positives = 187/189 (98%)
>emb|CAC93775.1| unnamed protein product [Aequorea victoria] Length = 196, Score = 384 bits (985), Expect = e-105, Identities = 176/196 (89%), Positives = 192/196 (97%)
>dbj|BAC81731.1| apoaequorin [Aequorea victoria] Length = 196, Score = 384 bits (985), Expect = e-105, Identities = 176/196 (89%), Positives = 192/196 (97%)

Beispiel 6
BLAST
Ergebnis einer BLAST-Analyse von AQdecay auf Nukleinsäureebene

>gb|M16103.1|AEVAEQA A.victoria (jellyfish) aequorin 1 mRNA, complete cds Length = 672, Score = 1104 bits (557), Expect = 0.0, Identities = 569/573 (99%)
>dbj|AB103337.1| Aequorea victoria mRNA for apoaequorin, clone:UTAEQ04 Length = 591, Score = 961 bits (485), Expect = 0.0, Identities = 551/573 (96%)
>dbj|AB103338.1| Aequorea victoria mRNA for apoaequorin, clone:UTAEQ09 Length = 591, Score = 739 bits (373), Expect = 0.0, Identities = 523/573 (91%)
>gb|L29571.1|AEVAQ440X Aequorea victoria aequorin (AQ440) mRNA, complete cds Length = 925, Score = 731 bits (369), Expect = 0.0, Identities = 522/573 (91%)
>gb|M11394.1|AEVAEQD Aequorea victoria (jellyfish) aequorin mRNA, complete cds Length = 861, Score = 731 bits (369), Expect = 0.0, Identities = 522/573 (91%)
>dbj|AB103336.1| Aequorea victoria mRNA for apoaequorin, clone:UTAEQ01 Length = 591, Score = 724 bits (365), Expect = 0.0, Identities = 521/573 (90%)
>dbj|AB103339.1| Aequorea victoria mRNA for apoaequorin, clone:UTAEQ11 Length = 591, Score = 716 bits (361), Expect = 0.0, Identities = 520/573 (90%)
>gb|AY601106.1| Aequorea victoria aequorin mRNA, complete cds Length = 600, Score = 716 bits (361), Expect = 0.0, Identities = 517/569 (90%)
>gb|AY604002.1| Aequorea victoria clone AEQ_V44A modified aequorin mRNA, complete cds Length = 600, Score = 708 bits (357), Expect = 0.0, Identities = 516/569 (90%)
>gb|AY604001.1| Aequorea victoria clone AEQ_Q168R modified aequorin mRNA, complete cds Length = 600, Score = 708 bits (357), Expect = 0.0, Identities = 516/569 (90%)
>gb|AY604000.1| Aequorea victoria clone AEQN26D modified aequorin mRNA, complete cds Length = 600, Score = 708 bits (357), Expect = 0.0, Identities = 516/569 (90%)
>gb|AY603999.1| Aequorea victoria clone AEQ_L170I modified aequorin mRNA, complete cds Length = 600, Score = 708 bits (357), Expect = 0.0, Identities = 516/569 (90%)
>gb|AY603998.1| Aequorea victoria clone AEQ_F149S modified aequorin mRNA, complete cds Length = 600, Score = 708 bits (357), Expect = 0.0, Identities = 516/569 (90%)
>gb|AY603997.1| Aequorea victoria clone AEQ_E35G modified aequorin mRNA, complete cds Length = 600, Score = 708 bits (357), Expect = 0.0, Identities = 516/569 (90%)
>gb|AY603996.1| Aequorea victoria clone AEQ_E128G modified aequorin mRNA, complete cds Length = 600, Score = 708 bits (357), Expect = 0.0, Identities = 516/569 (90%)
>gb|AY603995.1| Aequorea victoria clone AEQ_D153G modified aequorin mRNA, complete cds Length = 600, Score = 708 bits (357), Expect = 0.0, Identities = 516/569 (90%)
>gb|AY603994.1| Aequorea victoria clone AEQ_D117G modified aequorin mRNA, complete cds Length = 600, Score = 708 bits (357), Expect = 0.0, Identities = 516/569 (90%)
>gb|AY603993.1| Aequorea victoria clone AEQ-Q168A-L170V modified aequorin mRNA, complete cds Length = 600, Score = 676 bits (341), Expect = 0.0, Identities = 512/569 (89%)

Beispiel 7
Die 7 zeigt das Alignment von AQdecay mit Aequorin (wildtype; wt) auf Aminosäureebene.
Beispiel 8
Kinetische Analyse von AQdecay expremiert in Bakterien
Zur kinetischen Analyse der Biolumineszenz von AQdecay, E. coli BL21 (DE3) mit pET22b-AQdecay bzw. pET22b (ohne integrierte cDNA) transformiert. Die Anzucht und Aufschluss der Bakterien erfolgte wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Messdaten wurden für einen Zeitraum von 60 Sekunden mit einer Integrationszeit von 1 Sekunde erhoben.
Die 4 zeigt die Ergebnisse der kinetischen Analyse von AQdecay in Bakterien.
Beispiel 9
Kinetische Analyse von AQdecay in expremiert in CHO Zellen
Zur kinetischen Analyse der Biolumineszenz von AQdecay, wurden CHO (Chinese Hamster Ovarian Cells) Zellen mit pcDNA3-AQdecay bzw. pcDNA3 (ohne integrierte cDNA) transient transfiziert. Die Transfektion und Messung erfolgte wie unter Beispiel 4 beschrieben. Die Messdaten wurden für einen Zeitraum von 60 Sekunden mit einer Integrationszeit von 1 Sekunde erhoben.
Die 5 zeigt die Ergebnisse der kinetischen Analyse von AQdecay in CHO Zellen.
Beispiel 10
Verwendung von AQdecay in multiplexing Experimenten
Das Photoprotein Agdecay eignet sich als Komponente von multiplexing Readout-Verfahren, in denen mehrere Reportergene (z.B. Luziferasen oder Photoproteine) in einem experimentellen Ansatz verwendet werden. Hierzu wurden AQdecay expremierende CHO-Zellen im Verhältnis 1:1 (oder 1:2, 1:3, ..) mit CHO Zellen gemischt, die das wildtyp Aequorin expremierten. Die Zelle, die das wildtyp Aequorin expremierten, expremierten zusätzlich einen G-Protein gekoppelten Rezeptor (z.B. Neuromedin U Rezeptor 2). Die Zellmischung wurde auf 96, 384 oder 1536 Loch-Mikrotiterplatten ausgebracht und für 24 Stunden bei 37 °C inkubiert.
Anschließend wurden die Zellen mit Coelenterazine beladen (wie unter Beispiel 4 beschrieben). Durch die Zugabe des G-Protein Rezeptor Agonisten kommt es zur intrazellulären Kalziumfreisetzung, die durch das wildtyp Aequorin ausgelesen werden kann (Lichtfreisetunzung durch wildtyp Aequorin). Durch die anschliessende Zugabe eines Agonisten, der einen CHO endogenen Rezeptor aktiviert (z. B. ATP), kann das AQdecay des zweiten Zelltyps aktiviert werden.
Beispiel 11
Lokalisierung von AQdecay in Zellorganellen oder Kompartimenten
Das Photoprotein AQdecay oder dessen Äquivalente eignet sich zur Fusion mit Peptiden, Leadersequenzen, Translokationssignalen, Proteinen oder Proteinfragmenten zum Transport oder Lokalisierung in speziellen Zellkompartimenten oder Organellen. Für einen Transport und der anschliessenden Lokalisation des Photoproteins AQdecay wurde das erfindungsgemäße Photoprotein mit dem Peptid MSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLPPEGKL fusioniert. Die Fusion des Peptides vor die Aminosäuresequenz von AQdecay führt zu einer Translokation des Fusionsproteins in die Mitochodrien der eukaryotischen Wirtszelle. Das mitrochondrial lokalisierte Photoprotein AQdecay kann zur Messung der Kalziumkonzentration innerhalb der Mitochondrien verwendet werden. Die Fusion des beschriebenen Peptides vor die Aminosäuresequenz des AQdecay Photoproteins erfolgte auf Nukleinsäureebene mit Hilfe von molekularbiologischen Standardmethoden.
Literatur/Patente

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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Nukleinsäuremolekül oder ein funktionelles Fragment desselben, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO:2 beinhaltet; b) Nukleinsäuremolekülen, welche die in SEQ ID NO:1 dargestellte Sequenz beinhalten; c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und deren Expressionsprodukte die biologische Funktion eines Photoproteins aufweisen; d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden.
Polypeptid oder ein funktionelles Fragment desselben, das durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 kodiert ist und die Eigenschaft eines Photoproteins besitzt.
Photoprotein oder ein funktionelles Fragment desselben, welches eine oder mehrere Mutationen in Position 129 bis 149 bezogen auf SEQ ID NO:7 besitzt und welches eine veränderte zeitliche Biolumineszenz aufweist.
Photoprotein oder ein funktionelles Fragment desselben, welches eine Mutation in Position 139 bezogen auf SEQ ID NO:7 besitzt und welches eine veränderte zeitliche Biolumineszenz aufweist.
Nukleinsäuremolekül, welches eine Sequenz beinhaltet, die für ein Protein gemäß Ansprüchen 3 und 4 kodiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 5, welche einen funktionalen Promotor 5' zur kodierenden Sequenz enthält.
Rekombinanter DNA oder RNA Vektor, welcher Nukleinsäuren nach Anspruch 6 enthält.
Organismus, einen Vektor gemäß Anspruch 7 enthaltend.
Oligonukleotid mit mehr als 10 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die identisch oder komplementär zu einer Teilsequenz eines Nukleinsäuremoleküls gemäß Anspruch 1 oder 5 sind.
Verfahren zur Expression der Polypeptide gemäss Anspruch 2, 3, oder 4 in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.
Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines gemäß Anspruch 10 expremierten Photoprotein Polypeptides.
Verwendung einer Nukleinsaüre gemäß den Ansprüchen 1 oder 5 als Marker- oder Reportergen.
Verwendung einer Nukleinsaüre gemäß den Ansprüchen 1 oder 5 als Marker- oder Reportergen in Kombination mit anderen Reportergenen.
Verfahren zur Herstellung eines Photoproteins, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Photoprotein in der Region definiert durch Position 137 bis 141 bezogen auf SEQ ID NO:7 eine oder mehrere Mutationen eingeführt werden, was zu einer Veränderung der zeitlichen Biolumineszenz führt.
Photoprotein, hergestellt durch ein Verfahren gemäß Anspruch 14.
Verwendung eines Photoproteins gemäß Anspruch 2, 3, 4 oder 15 als Marker oder Reporter.
Verwendung eines Photoproteins gemäß Anspruch 2, 3, 4 oder 15 als Marker oder Reporter in Kombination mit anderen Reportergenen.
Eine Variante des Photoproteins Aequorin, welche eine veränderte zeitliche Bioluminszenz aufweist.