EP2126057A2 - Sekretierte luziferase mluc7 und deren verwendung - Google Patents

Sekretierte luziferase mluc7 und deren verwendung

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EP2126057A2
EP2126057A2 EP08707330A EP08707330A EP2126057A2 EP 2126057 A2 EP2126057 A2 EP 2126057A2 EP 08707330 A EP08707330 A EP 08707330A EP 08707330 A EP08707330 A EP 08707330A EP 2126057 A2 EP2126057 A2 EP 2126057A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
luciferase
luciferases
lui
mluc7
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP08707330A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stefan Golz
Eugene Vysotski
Svetlana Markova
Anna Tumenceva
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AXXAM SpA
Original Assignee
AXXAM SpA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AXXAM SpA filed Critical AXXAM SpA
Publication of EP2126057A2 publication Critical patent/EP2126057A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)

Definitions

  • the invention relates to the nucleotide and amino acid sequence, as well as the activity and use of the secreted luciferase MLuc7, as well as the use of secreted luciferases.
  • Luminescence refers to the emission of photons in the visible spectral range, this being done by excited emitter molecules. In contrast to fluorescence, the energy is not supplied from outside in the form of radiation of shorter wavelength.
  • Chemiluminescence is a chemical reaction that leads to an excited molecule that glows when the excited electrons return to their ground state. When this reaction is catalyzed by an enzyme, it is called bioluminescence.
  • the enzymes involved in the reaction are generally referred to as luciferases.
  • the luciferases are peroxidases or mono- and dioxygenases.
  • the enzyme substrates which form the starting materials for the light-emitting products are called luciferins. They vary from species to species.
  • the quantum efficiency of the systems is between 0.1-0.9 photons per converted
  • Luciferases can be classified according to their origin or their enzymatic properties. Luciferases can also be distinguished by their substrate specificity. The most important substrates include coelenterazines and luciferin, as well as derivatives of both substances.
  • Luciferases which are released from the cytosol into the surrounding environment by the host organism as a recombinant or wiltype protein, are sometimes called secreted luciferases.
  • Table 1 shows an overview of secretory luciferases:
  • the secreted luciferase LuI 64 is also described in Markova et al. Of 2004.
  • Reporter or indicator genes are generally genes whose gene products can easily be detected by simple biochemical or histochemical methods. There are at least two types of reporter genes.
  • Resistance genes are genes whose expression confers on a cell resistance to antibiotics or other substances whose presence in the growth medium leads to cell death when the resistance gene is absent.
  • reporter gene The products of reporter genes are used in genetic engineering as fused or unfused indicators. Among the most common reporter genes is beta-galactosidase (Alam et al., 1990), alkaline phosphatase (Yang et al., 1997, Cullen et al., 1992), luciferases, and other photoproteins (Shinomura, 1985, Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984).
  • Luminescence refers to the emission of photons in the visible spectral range, this being done by excited emitter molecules. In contrast to fluorescence, the energy is not supplied from outside in the form of radiation of shorter wavelength.
  • Chemiluminescence is a chemical reaction that leads to an excited molecule that glows when the excited electrons return to their ground state. When this reaction is catalyzed by an enzyme, it is called bioluminescence.
  • the enzymes involved in the reaction are generally referred to as luciferases.
  • MLuc7 a new luciferase was surprisingly identified (hereinafter referred to as MLuc7) and cloned, whose biochemical and physicochemical properties differed significantly from the previously identified luciferases.
  • the expression of the secreted luciferase MLuc7 turned out surprisingly, that the luciferase aus utilizat an altered temporal resolution of the bioluminescent reaction (kinetics).
  • the kinetics differences are substrate independent for the substrates examined and shown in FIGS. 8 and 9.
  • the course of the bioluminescent reaction for MLuc7 and Lu 164 is shown in FIG. The significantly faster kinetics of MLuc7 can be clearly seen.
  • MLuc7 shows after only a few seconds a drop in the measured luminescence per second as LuI 64. After 60 seconds 70-80% of the integral signal of 300 seconds are already detected. Lu 164 shows a much slower drop of the bioluminescence signal per second, so that even after 300 seconds, a clear signal on background is measurable. MLuc7 is therefore kinetically different from the previously described secreted luciferases from Metridia longa. Due to this property, MLuc7 can surprisingly be used in combination with other coelenterazine-dependent or coelenterazine-independent luciferases, since a kinetic differentiation is possible. activity
  • MLuc7 per second significantly higher than LuI 64. This higher bioluminescence allows a higher sensitivity of the measuring method used, as a lower
  • the invention relates to the use of MLuc7 to improve the sensitivity, the use of low cell counts or low S stratkonzentrationen.
  • the altered kinetic properties of MLuc7 allow a differentiated kinetic evaluation of bioluminescence.
  • different intervals can be used for the evaluation.
  • FIG. 13 shows the summed bioluminescence signals for intervals of 10 seconds each. Within the first 60 seconds (the exact time depends on the amount of used
  • Luciferase and substrate ab shows MLuc7 a significantly higher bioluminescence than LuI 64. After this period, the bioluminescence of MLuc7 decreases faster than LuI 64, so that LuI 64 has a higher bioluminescence signal.
  • FIG. 14 shows the summed bioluminescence of the luciferases MLuc7 and Lu 164 for a period of 300 seconds under the selected experimental conditions.
  • FIG. 15 shows the summed bioluminescence signals for intervals of 60 seconds each.
  • the length and selection of the measurement intervals can therefore be based on the respective experimental conditions and can be used flexibly.
  • the total measuring time can also be flexibly selected on the basis of the data shown.
  • the invention relates to the kinetic evaluation of measurements of the bioluminescent activity of MLuc7.
  • the invention relates to the kinetic evaluation of measurements of the bioluminescence activity of Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lul ⁇ and Lu52.
  • the invention relates to the kinetic evaluation of measurements of the bioluminescence activity of secreted luciferases.
  • the invention relates to the kinetic evaluation of measurements of the bioluminescence activity of proteins according to the invention.
  • the luciferase is particularly suitable for multiplex reactions due to its altered properties.
  • the luciferase MLuc7 shows a significantly faster kinetics compared to other luciferases, which allows a combination with other luminescent or non-luminescent measuring methods (readouts).
  • the luminescent systems do not mutually inhibit each other or outshine the respective signals.
  • the luminescence After activation of the first system (for example, by substrate addition), the luminescence must be returned to the initial level before the second reaction can be started. This is also necessary when both systems use independent substrates.
  • MLuc7 significantly shortens the time between measurements due to its fast kinetics. Inactivation of the reaction is not necessary. Since the luciferase MLuc7 is a secreted luciferase, a combination with intracellular systems (such as Firefly luciferase) is possible.
  • luciferases from Metridia longa are also suitable for combination with intracellular systems such as the firefly luciferase. However, an inactivation step is necessary to lower the residual bioluminescence to a low level.
  • the invention relates to the use of MLuc7 in multiplex approaches in which MLuc7 is used in combination with one or more reporter genes or readouts. According to the invention, the use of Mluc7 in approaches for the measurement of multiple target genes.
  • the invention relates to the use of LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, and Lu52 in multipex approaches in which LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI6 and Lu52 in combination with one or more reporter genes or measurement techniques (readouts) is used. Also useful in the present invention is the use of LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI6 and Lu52 in approaches to measuring multiple target genes.
  • the invention relates to the use of secreted luciferases in multipexen
  • the invention also relates to the use of secreted luciferases in batches for measuring a plurality of target genes.
  • the invention relates to the use of proteins according to the invention in multipex approaches in which proteins according to the invention are used in combination with one or more reporter genes or measurement techniques (readouts).
  • the invention also relates to the use of proteins according to the invention in batches for measuring a plurality of target genes.
  • luciferases Use of the luciferases on the basis of substrates and reaction conditions is possible.
  • the substrates Firefly and Cypridina luciferin are not used under the chosen reaction conditions of all three luciferases or only to a small extent as substrates.
  • the invention relates to the use and combination of different
  • the invention relates to the use and combination of different substrates for producing bioluminescence by LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lul6 and Lu52.
  • the invention relates to the use and combination of different
  • the invention relates to the use and combination of different substrates for producing bioluminescence by proteins according to the invention.
  • Bioluminescence reaction at temperatures between 10 and 50 0 C measured.
  • For this supernatants from a transient transfection of CHO cells with MLuc7 were used.
  • the result shows a dependence of the bioluminescent reaction of MLuc7 on the reaction temperature. This dependence can be used both to optimize and tailor the reaction in reporter gene applications, as well as to distinguish and combine different bioluminescent systems.
  • the invention relates to the use and combination of temperature dependence for the development and optimization of measurement methods for MLuc7.
  • the invention relates to the use and combination of
  • the invention relates to the use and combination of temperature dependence for the development and optimization of measurement methods for secreted luciferases.
  • the invention relates to the use and combination of temperature dependence for the development and optimization of measurement methods for proteins according to the invention.
  • the bioluminescent reaction was measured at KCl concentrations between 1 and 400 mM.
  • the supernatant from a transient transfection of CHO cells with MLuc7 were used.
  • the result shows a dependence of the bioluminescent reaction of MLuc7 on the ion concentration in the reaction medium. This dependence can be both for
  • the invention relates to the use and combination of the ionic dependence of the bioluminescent reaction for the development, optimization and use of measurement methods for MLuc7.
  • the invention relates to the use and combination of the ion-dependence of the bioluminescent reaction for the development, optimization and use of measuring methods for Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lul6 and Lu52.
  • the invention relates to the use and combination of the ion dependence of the bioluminescent reaction for the development, optimization and use of
  • the invention relates to the use and combination of the ion dependence of the bioluminescent reaction for the development, optimization and use of measuring methods for proteins according to the invention.
  • bioluminescent proteins affected by these factors are currently unknown. It is also possible to speculate about a development-stage-specific expression of bioluminescent proteins, but such is to be assumed.
  • a targeted examination of individuals of selected stages of development can therefore lead to the identification of bioluminescent proteins that are not expressed or significantly less expressed in other development stages and are therefore only partially accessible to expression cloning.
  • the invention relates to the study of bioluminescent organisms of specific developmental stages for the identification of novel bioluminescent proteins.
  • RNA from Metridia longa was isolated using the Straight A's mRNA isolation kit (Novagen) according to the manufacturer.
  • the isolated poly A mRNA was detected using the PowerScript Reverse Transcriptase (Clontech) in cDNA using the SMART cDNA Library Construction Kit (Clontech)
  • the vector pTriplEx2 (Clontech) was used, the cDNA fragments were integrated into the Sfil A-B interfaces.
  • the resulting expression vectors were transformed by means of electroporation into E. coli XLI-Blue.
  • the E. coli transformants were added
  • coelenterazine (native) was added to a final concentration of 10 ⁇ M and the bioluminescence determined in a luminometer.
  • the cDNA of the bioluminescence-positive clones was sequenced using the ALFexpress II system according to the manufacturer's instructions (TermoSequenase Cy5 Dye Terminator Kit (GE Healthcare)).
  • the invention relates to the secreted luciferase MLuc7 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the invention also relates to the nucleic acid molecule represented in SEQ ID NO: 1.
  • the invention also relates to functional equivalents of the secreted luciferase
  • MLuc7 Functional equivalents are those proteins that have comparable physicochemical or biochemical properties. Also functional fragments of the MLuc7 protein or for such encoding nucleic acids are according to the invention.
  • mutants of the MLuc7 protein or nucleic acids coding for such are erf ⁇ ndungshiel.
  • the secreted luciferase MLuc7 is suitable as reporter gene for the technique of
  • HCS High content screening
  • the secreted luciferase MLuc7 is suitable as reporter gene for cellular systems especially for receptors, for ion channels, for transporters, for transcription factors or for inducible systems.
  • the secreted luciferase MLuc7 is suitable as reporter gene in bacterial and eukaryotic systems, especially in mammalian cells, in bacteria, in yeasts, in bakulo, in plants
  • the secreted luciferase MLuc7 is suitable as a reporter gene for cellular systems in combination with bioluminescent or chemiluminescent systems especially systems with luciferases, with oxygenases, with phosphatases.
  • the secreted luciferase MLuc7 is suitable as a reporter gene for cellular systems in combination with bioluminescent or chemiluminescent systems especially systems with photoproteins and ionic indicators, especially aequorin, clytin, obelin,
  • the secreted luciferase MLuc7 turns out to be a marker protein, especially in the FACS (fluorescence activated cell sorter) sorting.
  • the secreted luciferase MLuc7 is suitable as a fusion protein especially for receptors, for ion channels, for transporters, for transcription factors, for Proteinases, kinases, phosphodiesterases, hydrolases, peptidases, transferases, membrane proteins, glycoproteins.
  • the secreted luciferase MLuc7 is suitable for immobilization, in particular by antibodies, by biotin, by magnetic or magnetizable carriers.
  • the secreted luciferase MLuc7 is suitable for systems of energy transfer especially the fluorescence resonance energy transfer (FRET), bioluminescence resonance energy transfer (BRET), field effect transistor (FET), fluorescence polarization (FPRF), homogenous time-resolved fluorescence (HTRF) ) Systems.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • BRET bioluminescence resonance energy transfer
  • FET field effect transistor
  • FPRF fluorescence polarization
  • HTRF homogenous time-resolved fluorescence
  • the secreted luciferase MLuc7 is suitable for labeling substrates or
  • the secreted luciferase MLuc7 is suitable for expression in bacterial systems especially for titer determination, as substrates for biochemical systems especially for proteinases and kinases.
  • the secreted luciferase MLuc7 is useful as a marker specifically coupled to antibodies coupled to enzymes coupled to receptors coupled to ion channels and other proteins.
  • the secreted luciferase MLuc7 is suitable as a reporter gene in the pharmacological search for active substances, especially in HTS (High Throughput Screening).
  • the secreted luciferase MLuc7 is suitable as components of detection systems especially for ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), for immunohistochemistry, for Western blot, for confocal microscopy.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the secreted luciferase MLuc7 is suitable as a marker for the analysis of interactions specifically for protein-protein interactions, for DNA
  • RNA-RNA Interactions for RNA-protein interactions (DNA: deoxyribonucleic acid; RNA: ribonucleic acid).
  • the secreted luciferase MLuc7 is useful as a marker or fusion protein for expression in transgenic organisms, especially in mice, in rats, in hamsters and other mammals, in primates, in fish, in worms, in plants.
  • the secreted luciferase MLuc7 is suitable as a marker or fusion protein for the analysis of embryonic development.
  • the secreted luciferase MLuc7 is useful as a marker via a coupling agent specifically via biotin, via NHS (N-hydroxysulfosuccimide), via CN-Br.
  • the secreted luciferase MLuc7 is suitable as a reporter coupled to nucleic acids, especially to DNA, to RNA.
  • the secreted luciferase MLuc7 is suitable as a reporter coupled to proteins or peptides.
  • nucleic acid or the peptide of the coupled protein MLuc7 is suitable as
  • the protein MLuc7 is suitable as a marker of pharmacological formulations especially of infectious agents, of antibodies, of "small molecules”.
  • the protein MLuc7 is suitable for geological investigations especially for ocean, groundwater and river currents.
  • the protein MLuc7 is suitable for expression in expression systems, especially in in vitro translation systems, in bacterial systems, in yeast systems, in Bakulo systems, in viral systems, in eukaryotic systems.
  • the invention also relates to the purification of the protein MLuc7 specifically as a wild-type protein, as a fusion protein, as a mutagenized protein.
  • the invention also relates to the use of MLuc7 in the field of cosmetics, especially bath preparations, lotions, soaps, body colors, toothpaste, body powders.
  • the invention also relates to the use of Mluc7 for coloring foodstuffs, bath additives, ink, textiles, plastics.
  • the invention also relates to the use of Mluc7 for coloring paper, especially greetings cards, paper products, wallpaper, craft articles.
  • the invention also relates to the use of Mluc7 for staining
  • Liquids especially for water pistols, for fountains, for drinks, for ice cream.
  • the invention also relates to the use of Mluc7 for the manufacture of toys, especially finger paint, make-up, water pistols.
  • the invention relates to organisms containing a vector according to the invention.
  • the invention relates to organisms expressing a polypeptide of the invention.
  • the invention relates to organisms expressing a functional equivalent of MLuc7.
  • the invention relates to methods for expression of the fluorescent polypeptides according to the invention in bacteria, eukaryotic cells or in vitro
  • the invention also relates to methods for purifying / isolating a polypeptide of the invention.
  • the invention relates to peptides having more than 5 consecutive amino acids, which are recognized immunologically by antibodies against the fluorescent proteins according to the invention.
  • the invention relates to the use of the fluorescent proteins according to the invention as marker and reporter gene, in particular for the pharmacological
  • the invention relates to the secreted luciferase MLuc7 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a protein MLuc7 characterized in that its
  • Sequence comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 2, as well as functional fragments thereof.
  • the invention further provides a nucleic acid molecule which encodes a protein comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1, as well as functional fragments thereof.
  • a component of the invention is a recombinant RNA or DNA vector which comprises a nucleic acid as described in the preceding section.
  • a component of the invention is a method for expressing a polypeptide according to the invention in bacteria, eukaryotic cells, or in in vitro translation systems.
  • a component of the invention is the use of a nucleic acid according to the invention as marker or reporter gene also in combination with one or more other markers or reporter genes.
  • Also part of the invention is the use of a protein according to the invention as marker or reporter gene also in combination with one or more other markers or reporter gene proteins. Mutants and derivatives of secretory luciferases
  • FIG. 3 shows the alignment of the luciferases MLu7, the metridia luciferases (LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI6 and Lu52) and of the gaussia luciferase.
  • the luciferase MLuc7 represents a significantly shorter polypeptide than the other analyzed luciferases.
  • the luciferases Lu22 and Gaussia luciferase also comprise significantly shorter polypeptides.
  • mutants or derivatives of the luciferases Lu 164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI6, Lu52 and Gaussia luciferase with altered kinetic properties of the luminescence reaction.
  • mutants or derivatives which are changes or deletions in the range of amino acids 23 to 78 of the luciferases LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 and Gaussia luciferase with altered kinetic properties of the luminescence reaction.
  • mutants or derivatives which are changes or deletions in the range of amino acids 23 to 78 of the luciferases Lul64, Lu22, LuAL, Lu39,
  • Lu45, LuI6, Lu52 and Gaussia luciferase with altered biochemical or physicochemical properties of the luminescent reaction.
  • mutants or derivatives are the changes or deletions in the range of amino acids 13 to 88 of the luciferases LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 and Gaussia luciferase with altered kinetic properties of the luminescence reaction.
  • mutants or derivatives are the changes or deletions in the range of the amino acids 13 to 88 of the luciferases LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 and Gaussia luciferase with altered biochemical or physicochemical properties of the luminescence reaction.
  • mutants or derivatives are the changes or deletions in the range of amino acids 33 to 68 of the luciferases LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 and Gaussia luciferase with altered kinetic properties of the luminescence reaction.
  • mutants or derivatives are the changes or deletions in the range of amino acids 33 to 68 of the luciferases LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 and Gaussia luciferase with altered biochemical or physicochemical properties of the luminescence reaction.
  • the invention particularly relates to:
  • a nucleic acid molecule selected from the group consisting of
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence disclosed by SEQ ID NO: 2;
  • nucleic acid molecules comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 1;
  • nucleic acid molecules whose complementary strand hybridizes with a nucleic acid molecule from a) or b) under stringent conditions and which encode luciferases;
  • nucleic acid molecules which differ from those mentioned under c) due to the degeneration of the genetic code
  • nucleic acid molecules which have a sequence identity of at least 70, 75,
  • SEQ ID NO: 1 80, 85, 95%, 98%, 99% to SEQ ID NO: 1 and their protein products are luciferases;
  • nucleic acid molecules which have a sequence identity of at least 65%
  • SEQ ID NO: 1 show and which luciferases encode; g) fragments of the nucleic acid molecules according to a) - f), wherein the fragments encode functional luciferases.
  • a nucleic acid according to item 1 which contains a functional promoter 5 'to the photoprotein coding sequence.
  • oligonucleotides having more than 10 consecutive nucleotides which are identical or complementary to a partial sequence of a nucleic acid molecule according to item 1.
  • reporter gene (s) is the firefly luciferase, or luciferases from the organism Metridia longa.
  • luciferases selected from the group consisting of LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6 and Lu52.
  • SEQ ID NO: 2 (MLuc7 amino acid sequence)
  • MDIKFIF ALVCIALVQ ANPTVNND VNRGKMPGKKLPLEVLIEMEANAFKAGC TRGCLICLSKIKCTAKMKQYLPGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFK EMEPMEQFIAQVDLCADCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPDRCASFADKIQ KEAHNIKGLAGDR
  • SEQ ID NO: 3 (Lul64 - nucleotide sequence - coding)
  • SEQ ID NO: 4 (Lul64 amino acid sequence)
  • FIG. 1 A first figure.
  • FIG. 1 shows the vector map of the construct pcDNA3-MLuc7.
  • FIG. 2 shows the vector map of the construct pASM-MLuc7.
  • FIG. 3 shows an alignment of different secreted luciferases at the amino acid level.
  • FIG. 4 shows the substrate specificity of the luciferases Lu 164, Lu22 and MLuc7.
  • Axis Coelenterazine, Y-axis: relative light units (RLU).
  • RLU relative light units
  • FIG. 5 shows the temperature dependence of the luciferase MLuc7.
  • X-axis temperature in 0 C
  • Y-axis relative light units (RLU).
  • RLU relative light units
  • FIG. 6 shows the dependence of the luciferase MLuc7 on the calcium chloride concentration in the reaction buffer.
  • X-axis KCl concentration in mM
  • Y-axis relative light units (RLU).
  • RLU relative light units
  • FIG. 7 shows the bioluminescence measurement of MLuc7 at a constant MLuc7 amount and different concentrations of coelenterazine.
  • X-axis Coelenterazine concentration in ⁇ M.
  • Y axis : relative light units (RLU).
  • the figure shows the kinetics of the bioluminescent reaction of MLuc7 with three different coelenterazines.
  • X-axis time in seconds.
  • Y axis :: relative light units (RLU).
  • the figure shows the kinetics of the bioluminescent reaction of Lu 164 with three different coelenterazines.
  • X-axis time in seconds.
  • Y axis relative light units (RLU).
  • FIG. 10 shows the result of the bioluminescence measurement of MLuc7 (black) and LuI 64 (gray) for a measurement of 300 seconds with an integration time of 1.5 seconds.
  • X-axis time in seconds.
  • Y axis relative light units (RLU).
  • FIG. 11 shows the result of the bioluminescence measurement of MLuc7 at a constant substrate concentration and decreasing concentration of Mluc7 by dilution of the cell supernatant.
  • X-axis time in seconds.
  • Y axis relative light units (RLU).
  • Figure 12 shows the result of bioluminescence measurement of LuI 64 at a constant substrate concentration and decreasing concentration of Lu 164 by dilution of the cell supernatant.
  • X-axis time in seconds.
  • Y axis relative
  • FIG. 13 shows the result of the kinetic evaluation of the bioluminescence measurement of Mluc7 and LuI 64 in sections of 10 in each case
  • X-axis time in seconds.
  • Y axis relative light units (RLU).
  • FIG. 14 shows the result of the kinetic evaluation of the bioluminescence measurement of Mluc7 and LuI 64 with an integration time of 300
  • X-axis time in seconds.
  • Y axis relative light units (RLU).
  • FIG. 15 shows the result of the kinetic evaluation of the bioluminescence measurement of Mluc7 and LuI 64 in sections of 60 in each case Seconds of integration time.
  • X-axis time in seconds.
  • Y axis relative light units (RLU).
  • Figure 19 shows the representation of the preferred water depth of individuals of the species Metridia longa, depending on the status of development.
  • X axis :
  • the plasmid pcDNA3.1 (+) from Clontech was used for constitutive expression.
  • the vector pASM contains cAMP responsive elements (CRE), which regulate the promoter activity as a function of the cAMP concentration.
  • CRE cAMP responsive elements
  • the derivative of the vector was named pASM-MLuc7.
  • the derivative of the vector pcDNA3 was called pcDNA3-MLuc7.
  • the cloning was carried out using standard molecular biological methods.
  • the vectors pcDNA3-Mluc7 and pASM-MLuc7 were used to express MLuc7 in eukaryotic systems.
  • Fig. 1 shows the plasmid map of the vector pcDNA3-Mluc7.
  • Fig. 2 shows the plasmid map of the vector pASM-MLuc7.
  • the constitutive eukaryotic expression was carried out in CHO cells by transfecting the cells with the expression plasmids pcDNA3-MLuc7, pcDNA3-Lu 164 and pcDNA3 (without cDNA insertion) in transient experiments.
  • 10,000 cells per well in DMEM-Fl 2 medium were plated on 96-well microtiter plates and incubated overnight at 37 ° C.
  • the transfection was carried out using the Fugene 6 kit (Roche) according to the manufacturer's instructions.
  • the transfected cells were incubated overnight at 37 ° C in DMEM-F12 medium.
  • the measurement of the bioluminescence takes place after substrate addition with an imaging
  • buffer A pH 7.4
  • Composition 130mM NaCl, 5mM KCl, 20mM Hepes, 1mM MgC12 x 6H2O and 5mM NaHCC ⁇
  • the transfected cells were selected with 2 mg / ml geneticin and the bioluminescence activity of the clones or supernatants was determined.
  • FIG. 3 shows the alignment of the secreted luciferases at the amino acid level.
  • Cypridina luciferase was not included in the alignment because its sequence identity to the remaining luciferases is too low.
  • Christopoulos TK Verhaegent M, Recombinant Gaussia luciferase. Overexpression, purification, and analytical application of a bioluminescent reporter for DNA hybridization. Anal Chem. 2002, Sep; 74 (17): 4378-85.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sowie die Aktivität und Verwendung der sekretierten Luziferase MLuc7.

Description

Sekretierte Luziferase MLuc7 und deren Verwendung
Die Erfindung betrifft die Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sowie die Aktivität und Verwendung der sekretierten Luziferase MLuc7, sowie der Verwendung von sekretierten Luziferasen.
Luziferasen
Als Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im sichtbaren Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle erfolgt. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie nicht von Außen in Form von Strahlung kürzerer Wellenlänge zugeführt.
Man unterscheidet Chemilumineszenz und Biolumineszenz. Als Chemolumineszenz bezeichnet man eine chemische Reaktion die zu einem angeregten Molekül führt, das selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen in den Grundzustand zurückkehren. Wird diese Reaktion durch ein Enzym katalysiert, spricht man von Biolumineszenz. Die an der Reaktion beteiligten Enzyme werden generell als Luziferasen bezeichnet.
Eine Übersicht über lumineszierende Organismen findet sich bei Wilson & Hastings
1998.
Bei den Luziferasen handelt es sich um Peroxidasen oder Mono- und Dioxygenasen. Die Enzym-Substrate, die die Ausgangssubstanzen für die lichtemittierenden Produkte bilden, heißen Luciferine. Sie sind von Species zu Species unterschiedlich. Die Quantenausbeute der Systeme liegt zwischen 0,1-0,9 Photonen je umgesetztem
Substratmolekül. Luziferasen lassen sich aufgrund ihrer Herkunft oder ihrer enzymatischen Eigenschaften klassifizieren. Luziferasen lassen sich ebenfalls durch ihre Substratspezifität voneinander unterscheiden. Zu den wichtigsten Substraten gehören Coelenterazine und Luciferin, sowie Derivate beider Substanzen.
Luziferase Substrate
Im Folgenden werden die Strukturen einiger Luziferasesubstrate beispielhaft dargestellt :
Coelenterazine
Coelenterazine f
Coelenterazine e
Coelenterazine cp
Coelenterazine h Coelenterazine n
Firefly Luziferin Cypridia Luziferin
Sekretierte Luziferasen
Luziferasen, die vom Wirtsorganismus als rekombinantes- oder wilttyp-Protein aus dem Cytosol ins umgebende Milieu abgegeben werden, bezeichnet mal als sekretierte Luziferasen. Tabelle 1 zeigt eine Übersicht über sekretortische Luziferasen:
Tabelle 1 : Übersicht über sekretierte Luziferasen
Die sekretierte Luziferase LuI 64 ist ebenfalls beschrieben in Markova et al. 2004.
Reportersysteme
Als Reporter- oder Indikatorgen bezeichnet man generell Gene, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer oder histochemischer Methoden leicht nachweisen lassen. Man unterscheidet mindestens 2 Typen von Reportergenen.
1. Resistenzgene. Als Resistenzgene werden Gene bezeichnet, deren Expression einer Zelle die Resistenz gegen Antibiotika oder andere Substanzen verleiht, deren Anwesenheit im Wachstumsmedium zum Zelltod führt, wenn das Resistenzgen fehlt.
2. Reportergen. Die Produkte von Reportergenen werden in der Gentechnologie als fusionierte oder unfusionierte Indikatoren verwendet. Zu den gebräuchlichsten Reportergenen gehört die beta-Galaktosidase (Alam et al., 1990), alkalische Phosphatase (Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), Luciferasen und andere Photoproteine (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984).
Als Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im sichtbaren Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle erfolgt. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie nicht von Außen in Form von Strahlung kürzerer Wellenlänge zugeführt.
Man unterscheidet Chemilumineszenz und Biolumineszenz. Als Chemolumineszenz bezeichnet man eine chemische Reaktion die zu einem angeregten Molekül führt, das selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen in den Grundzustand zurückkehren. Wird diese Reaktion durch ein Enzym katalysiert, spricht man von Biolumineszenz. Die an der Reaktion beteiligten Enzyme werden generell als Luziferasen bezeichnet.
Sekretierte Luziferase MLuc7
Bei der Suche nach neuen Luciferasen aus Metridia longa wurde überraschenderweise eine neue Luziferase identifiziert (im weiteren als MLuc7 genannt) und kloniert, deren biochemische und physikochemische Eigenschaften sich deutlich von den bisher identifizierten Luziferasen unterscheidet. Diese Eigenschaften werden im folgenden beschrieben :
Kinetik
Bei der Expression der sekretierten Luziferase MLuc7 stellte sich überraschenweise heraus, das die Luziferase eine veränderte zeitliche Auflösung der Biolumineszenzreaktion (Kinetik) ausweißt. Die Kinetikunterschiede sind substratunabhängig für die untersuchten und in Figur 8 und 9 gezeigten Substrate. Der Verlauf der Biolumineszenzreaktion für MLuc7 und Lu 164 ist in Figur 10 gezeigt. Deutlich ist die wesentlich schnellere Kinetik von MLuc7 zu erkennen.
MLuc7 zeigt schon nach wenigen Sekunden einen Abfall der zu messenden Lumineszenz pro Sekunde als LuI 64. Nach 60 Sekunden sind bereits 70-80 % des Integralsignals von 300 Sekunden erfaßt. Lu 164 zeigt einen wesentlich langsameren Abfall des Biolumineszenzsignals pro Sekunde, so daß auch noch nach 300 Sekunden ein deutliches Signal über Hintergrund meßbar ist. MLuc7 unterscheidet sich daher kinetisch von den bisher beschriebenen sekretierten Luziferasen von Metridia longa. MLuc7 kann aufgrund dieser Eigenschaft überraschenderweise in Kombination mit anderen Coelenterazin-abhängigen oder Coelenterazin- unabhängigen Luziferasen genutz werden, da eine kinetische Unterscheidung möglich ist. Aktivität
Bei der Expression der sekretierten Luziferase MLuc7 stellte sich überraschenweise heraus, das die Luziferase eine veränderte Aktivitätsverteilung der
Biolumineszenzreaktion aufgrund der veränderten kinetischen Eigenschaften aufweist. Zu Beginn der Biolumineszenzreaktion ist die zu messende Aktivität von
MLuc7 pro Sekunde deutlich höher als von LuI 64. Diese höhere Biolumineszenz ermöglicht eine höhere Sensitivität der verwendeten Meßmethode, da eine geringere
Anzahl an Zellen, eine geringere Aktivierung der MLuc7-Expression oder eine geringer Substratkonzentration eine Messung deutlich über dem Hintergrundsignal ermöglicht.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von MLuc7 zur Verbesserung der Sensitivität, der Verwendung geringer Zellzahlen oder geringer S üb stratkonzentrationen .
Kinetische Auswertung
Die veränderten kinetischen Eigenschaften von MLuc7 ermögliche eine differenzierte kinetische Auswertung der Biolumineszenz. Bei einer konkinuierlichen Messung über (zum Beispiel) 300 Sekunden können verschiedene Intervalle zur Auswertung herangezogen werden. In Figur 13 sind die summierten Biolumineszenzsignale für Intervalle von jeweils 10 Sekunden dargestellt. Innerhalb der ersten 60 Sekunden (der genaue Zeitraum hängt von der Menge an eingesetzter
Luziferase und Substrat ab) zeigt MLuc7 eine deutlich höhere Biolumineszenz als LuI 64. Nach diesem Zeitraum nimmt die Biolumineszenz von MLuc7 schneller ab als LuI 64, so dass LuI 64 ein höheres Biolumineszenzsignal aufweist. Durch die Wahl des Messfensters kann daher zwischen den Luziferasen unterschieden werden. In Figur 14 ist die summierte Biolumineszenz der Luziferasen MLuc7 und Lu 164 für einen Zeitraum von 300 Sekunden unter den gewählten experimentellen Bedingungen dargestellt. In Figur 15 sind die summierten Biolumineszenzsignale für Intervalle von jeweils 60 Sekunden dargestellt. Auch hier kann durch die Wahl des Messfensters zwischen den Luzifersasen unterschieden werden. Die Länge und Auswahl der Messintervalle können sich daher an den jeweiligen Experimenten Bedingungen orientieren und sind flexible einsetzbar. Auch die Gesamtmesszeit ist aufgrund der dargestellten Daten flexible wählbar.
Die Erfindung betrifft die kinetische Auswertung von Messungen der Biolumineszenzaktivität von MLuc7.
Die Erfindung betrifft die kinetische Auswertung von Messungen der Biolumineszenzaktivität von Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lulό und Lu52.
Die Erfindung betrifft die kinetische Auswertung von Messungen der Biolumineszenzaktivität sekretierter Luziferasen.
Die Erfindung betrifft die kinetische Auswertung von Messungen der Biolumineszenzaktivität von erfindungsgemäßen Proteinen.
Multiplexing
Bei der Expression der sekretierten Luziferase MLuc7 stellte sich überraschenweise heraus, das sich die Luziferase aufgrund ihrer veränderten Eigenschaften besonders für Multiplex-Reaktionen eignet. Die Luziferase MLuc7 zeigt im Vergleich zu anderen Luziferasen eine deutlich schnellere Kinetik, wodurch eine Kombination mit anderen lumineszenten oder nicht-lumineszenten Messmethoden (readouts) möglich wird.
Um lumineszente Messverfahren zu kombinieren, ist es notwendig, dass sich die lumineszenten Systeme nicht gegenseitig inhibieren oder die jeweiligen Signale überstrahlen. Nach der Aktivierung des ersten Systems (zum Beispiel durch Substratzugabe) muss die Lumineszenz auf das Ausgangsniveau zurückgegangen sein, bevor die zweite Reaktion gestartet werden kann. Dies ist auch notwendig, wenn beide Systeme unabhängige Substrate verwenden. MLuc7 verkürzt aufgrund ihrer schnellen Kinetik den Zeitraum zwischen den Messung deutlich. Eine Inaktivierung der Reaktion ist nicht notwendig. Da es sich bei der Luziferase MLuc7 um eine sekretierte Luziferase handelt, ist eine Kombination auch mit intrazellulären Systeme (wie zum Beispiel Firefly Luziferase) möglich.
Auch anderere Luziferasen von Metridia longa eignen sich zur Kombination mit intrazellulären Systemen wie der Firefly Luziferase. Allerdings ist ein Inaktivierungsschritt notwendig, um die Restbiolumineszenz auf ein niedriges Niveau abzusenken.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von MLuc7 in multiplexen Ansätzen, bei denen MLuc7 in Kombination mit einem oder mehreren Reportergenen oder Messtechniken (readouts) verwendet wird. Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung von Mluc7 in Ansätzen zur Messung mehrerer Zielgene.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, und Lu52 in multipexen Ansätzen, bei denen LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6 und Lu52 in Kombination mit einem oder mehreren Reportergenen oder Messtechniken (readouts) verwendet wird. Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung von LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6 und Lu52 in Ansätzen zur Messung mehrerer Zielgene.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von sekretierten Luziferasen in multipexen
Ansätzen, bei denen sekretierte Luziferasen in Kombination mit einem oder mehreren Reportergenen oder Messtechniken (readouts) verwendet wird. Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung von sekretierten Luziferasen in Ansätzen zur Messung mehrerer Zielgene.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von erfindungsgemäßen Proteinen in multipexen Ansätzen, bei denen erfindungsgemäße Proteine in Kombination mit einem oder mehreren Reportergenen oder Messtechniken (readouts) verwendet wird. Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung von erfindungsgemäßen Proteinen in Ansätzen zur Messung mehrerer Zielgene.
Substratspezifität
Zur Untersuchung der Substratspezifität von MLuc7 wurden verschiedene Coelenterazine unter Standardbedingungen getestet. Hierzu wurden Überstände aus transienten Transfektionen von CHO Zellen der Luziferasen LuI 64, Lu22 und MLuc7 verwendet. Die Substrate Coelenterazine n und cb werden unter den gewählten Bedingungen schlechter von MLuc7 als von LuI 64 und das Substrat Coelenterazine f besser von Mluc als von Lu 164 umgesetzt zu werden. Die Ergebnisse zeigen beispielhaft, daß eine Optimierung der Reaktions oder
Verwendung der Luziferasen anhand von Substraten und Reaktionbedingungen möglich ist. Die Substrate Firefly und Cypridina-Luziferin werden unter den gewählten Reaktionsbedingungen von allen drei Luziferasen nicht oder nur in einem geringen Umfang als Substrate verwendet.
Die Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination von unterschiedlichen
Substraten zur Erzeugung von Biolumineszenz durch MLuc7.
Die Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination von unterschiedlichen Substraten zur Erzeugung von Biolumineszenz durch LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lul6 und Lu52.
Die Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination von unterschiedlichen
Substraten zur Erzeugung von Biolumineszenz durch sekretierter Luziferasen.
Die Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination von unterschiedlichen Substraten zur Erzeugung von Biolumineszenz durch erfindungsgemäße Proteine.
Temperaturabhängigkeit
Zur Untersuchung der Temperaturabhängigkeit der Reaktion von MLuc7 wurde die
Biolumineszenzreaktion bei Temperaturen zwischen 10 und 50 0C gemessen. Hierzu wurden der Überstand aus einer transienten Transfektion von CHO Zellen mit MLuc7 verwendet. Das Ergebnis zeigt eine Abhängigkeit der Biolumineszenzreaktion von MLuc7 von der Reaktionstemperatur. Diese Abhängigkeit kann sowohl zur Optimierung und Anpassung der Reaktion in Reportergen-Anwendungen, als auch zur Unterscheidung und Kombination verschiedener biolumineszenter Systeme verwendet werden.
Die Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination der Temperaturabhängigkeit zur Entwicklung und Optimierung von Messverfahren für MLuc7.
Die Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination der
Temperaturabhängigkeit zur Entwicklung und Optimierung von Messverfahren für LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6 und Lu52.
Die Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination der Temperaturabhängigkeit zur Entwicklung und Optimierung von Messverfahren für sekretierte Luziferasen.
Die Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination der Temperaturabhängigkeit zur Entwicklung und Optimierung von Messverfahren für erfindungsgemäße Proteine.
Abhängigkeit der Biolumineszenzreaktion von der Ionenkonzentration
Zur Untersuchung der Abhängigkeit der Reaktion von MLuc7 von
Ionenkonzentration, wurde die Biolumineszenzreaktion bei KCl Konzentrationen zwischen 1 und 400 mM gemessen. Hierzu wurden der Überstand aus einer transienten Transfektion von CHO Zellen mit MLuc7 verwendet. Das Ergebnis zeigt eine Abhängigkeit der Biolumineszenzreaktion von MLuc7 von der Ionenkonzentration im Reaktionsmedium. Diese Abhängigkeit kann sowohl zur
Optimierung und Anpassung der Reaktion in Reportergen-Anwendungen, als auch zur Unterscheidung und Kombination verschiedener biolumineszenter Systeme verwendet werden.
Die Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination der Ionenabhängigkeit der Biolumineszenzreaktion zur Entwicklung, Optimierung und Verwendung von Messverfahren für MLuc7.
Die Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination der Ionenabhängigkeit der Biolumineszenzreaktion zur Entwicklung, Optimierung und Verwendung von Messverfahren für Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lul6 und Lu52.
Die Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination der Ionenabhängigkeit der Biolumineszenzreaktion zur Entwicklung, Optimierung und Verwendung von
Messverfahren für sekretierte Luziferasen.
Die Erfindung betrifft die Verwendung und Kombination der Ionenabhängigkeit der Biolumineszenzreaktion zur Entwicklung, Optimierung und Verwendung von Messverfahren für erfindungsgemäße Proteine.
Identifizierung der Luziferase MLuc7
Zur Untersuchung der biolumineszenten Aktivität der Spezies Metridia longa wurden Exemplare im Weißen Meer (Biologische Station Kartesh, Russland) gefangen und in flüssigem Stickstoff gelagert. Um Verunreinigungen oder Kontaminationen mit andern Tier- oder Pflanzenspezies zu verhindern, wurden 200 Exemplare der Entwicklungsstufe V von Metridia longa identifiziert und wie oben beschrieben gelagert. Für Metridia longa werden neben dem Naupilus und der adulten Form weitere fünf Entwicklungsformen beschrieben, wobei die Nomenklatur Formen von CI bis CV mit zunehmender Entwicklungsstufe beschreibt. Die Selektion und Identifizierung erfolgte mit Hilfe von biokularen Mikroskopen und Transferpipetten. Die Exemplare wurden im Weissen Meer in der Region der biologischen Forschungsstation "Kartesh" (Russland) gefangen. Die Wassertiefe in der Individuen von Metridia longa anzutreffen sind, richtet sich unter andrem nach ihrem Entwicklungsstand. In Figur 19 ist diese Abhängigkeit grafisch dargestellt.
Neben jahreszeitlich bedingten Schwankungen, haben Salzgehalt, Temperatur und Nahrungsangebot (Zusammensetzung und Vielfalt), sowie andere Faktoren einen
Einfluss auf den Lebensraum von Metridia longa. Ob Stoffwechselprozesse oder die
Expression von biolumineszenten Proteinen durch diese Faktoren beeinflusst werden, ist zur Zeit nicht bekannt. Auch über eine entwicklungsstufenspezifische Expression von biolumineszenten Proteinen kann nur spekuliert werden, eine solche ist jedoch anzunehmen.
Eine gezielte Untersuchung von Individuen ausgewählter Entwicklungsstufen kann daher zur Identifizierung von biolumineszenten Proteinen führen, die in anderen Entwicklungstufen nicht oder deutlich weniger expremiert werden und daher einer Expressionsklonierung nur bedingt zugänglich sind.
Die Erfindung betrifft die Untersuchung von biolumineszenten Organismen spezifischer Entwicklungsstufen zur Identifizierung neuer biolumineszenter Proteine.
Zur Isolation der RNA aus Metridia longa wurde das Straight A's mRNA Isolation Kit (Firma Novagen) nach Herstellerangaben verwendet. Die isolierte PoIy-A mRNA wurde mit Hilfe der PowerScript Reverse Transcriptase (Firma Clontech) in cDNA, unter Verwendung des SMART cDNA Library Construction Kit (Clontech), nach
Herstellerangaben umgeschrieben. Als Expressionsvektor wurde der Vektor pTriplEx2 (Firma Clontech) verwendet, wobei die cDNA-Fragmente in die Sfil A-B Schnittstellen integriert wurden.
Die erhaltenen Expressionsvektoren wurden mit Hilfe von Elektroporation in E. coli XLl-Blue transformiert. Die E. coli Transformanden wurden unter
Standardbedingungen kultiviert. Die nicht amplifizierte cDNA-Bank wurde mit einer Koloniedichte von etwa 1500 Kolonien pro Platte plattiert und unter Standardbedingungen über Nacht inkubiert. Durch Auflegen einer trockenen Nitrozellulosemembran wurde eine Kopie der Bakterienplatten erzeugt. Die Replikate wurde unter Standardbedingungen inkubiert. Von den Replikaplatten wurden mit Hilfe steriler Glasstäbe die Kolonien gepickt und in LB Medium überführt. Die Kulturen wurden unter Standardbedingungen bis zu einer optischen Dichte von 1 (bei 600 nm) inkubiert. Anschließend erfolgte die Induktion der Genexpression durch Zugabe von IPTG bis zu einer finalen Konzentration von 1 mM, gefolgt von einer Inkubation von einer Stunde bei 37 0C. 3 ml der induzierten Bakterienkulturen wurde durch Zentrifugation geerntet und das
Pellet in 250 μl SM Puffer (100 mM NaCl, 10 mM MgC12, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.01% Gelatine) resuspendiert. Die Bakterien wurde anschließend durch Ultraschallbehandlung bei 0°C aufgeschlossen. Der Rohextrtakt wurde anschließend untersucht.
Hierzu wurde Coelenterazin (native) bis zu einer finalen Konzentration von 10 μM zugegeben und die Biolumineszenz in einem Luminometer bestimmt. Die cDNA der Biolumineszenz-positiven Klone wurde mit Hilfe des ALFexpress II Systems nach Herstellerangaben sequenziert (TermoSequenase Cy5 Dye Terminator Kit (GE Healthcare)).
Überraschenderweise konnte mit Hilfe dieser Methode eine Luziferase aus Metridia longa der Entwicklungstufe V identifiziert werden, die als MLuc7 bezeichnet wurde.
Die Erfindung betrifft die sekretierte Luziferase MLuc7 mit der Aminosäuresequenz repräsentiert durch SEQ ID NO: 2. Ebenfalls betrifft die Erfindung das Nukleinsäuremolekül dargestellt in SEQ ID NO: 1.
Die Erfindung betrifft auch funktionelle Äquivalente der sekretierten Luziferase
MLuc7. Funktionelle Äquivalente sind solche Proteine, die vergleichbare physikochemische oder biochemische Eigenschaften aufweisen. Ebenfalls sind funktionelle Fragmente des MLuc7 Proteins bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren erfindungsgemäß.
Ebenfalls sind Mutanten des MLuc7 Proteins bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren erfϊndungsgemäß.
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Reportergen für die Technik des
„high content Screening" (HCS). HCS steht als Übergriff für moderne Mikroskopie- Technologien zur Zellanalyse. Kennzeichnend für HCS-Verfahren ist die quantitative Erfassung mehrerer Parameter auf zellulärer oder subzellulärer Ebene
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren oder für induzierbare Systeme.
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Reportergen in bakteriellen und eukaryotischen Systemen speziell in Säugerzellen, in Bakterien, in Hefen, in Bakulo, in Pflanzen
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme in Kombination mit biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen speziell Systemen mit Luziferasen, mit Oxygenasen, mit Phosphatasen.
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme in Kombination mit biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen speziell Systemen mit Photoproteine und Ionenindikatoren, speziell Aequorin, Clytin, Obelin,
Berovin und Bolinopsin.
Die sekretierte Luziferase MLuc7 sich als sich als Markerprotein, speziell bei der FACS (Fluorescence activated cell sorter) Sortierung.
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Fusionsproteine speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren, für Proteinasen, für Kinasen, für Phosphodiesterasen, für Hydrolasen, für Peptidasen, für Transferasen, für Membranproteine, für Glykoproteine.
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich zur Immobilisierung speziell durch Antikörper, durch Biotin, durch magnetische oder magnetisierbare Träger.
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich für Systeme des Energietransfers speziell der FRET- (Fluorescence Resonance Energy Transfer) ,BRET- (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET (field effect transistors), FP (fluorescence polarization), HTRF (Homogeneous time-resolved fluorescence) Systemen.
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich zur Markierung von Substraten oder
Liganden speziell für Proteasen, für Kinasen, für Transferasen, für Transporter, für Ionenkanäle und Rezeptoren.
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich zur Expression in bakteriellen Sytemen speziell zur Titerbestimmung, als Substrate für biochemische Systeme speziell für Proteinasen und Kinasen.
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Marker speziell gekoppelt an Antikörper, gekoppelt an Enzyme, gekoppelt an Rezeptoren, gekoppelt an Ionenkanäle und andere Proteine.
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Reportergen bei der pharmakologischen Wirkstoffsuche speziell im HTS (High Throughput Screening).
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Komponenten von Detektionssystemen speziell für ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), für Immunohistochemie, für Western-Blot, für die konfokale Mirkoskopie.
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Marker für die Analyse von Wechselwirkungen speziell für Protein-Protein- Wechselwirkungen, für DNA-
Protein-Wechselwirkungen, für DNA-RNA-Wechselwirkungen, für RNA-RNA- Wechselwirkungen, für RNA-Protein-Wechslewirkungen (DNA : deoxyribonucleic acid; RNA : ribonucleic acid).
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Marker oder Fusionsproteine für die Expression in transgenen Organismen speziell in Mäusen, in Ratten, in Hamstern und anderen Säugetieren, in Primaten, in Fischen, in Würmern, in Pflanzen.
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Marker oder Fusionsprotein zur Analyse der Embryonalentwicklung.
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Marker über einen Kopplungsvermittler speziell über Biotin, über NHS (N-hydroxysulfosuccimide), über CN-Br.
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Reporter gekoppelt an Nukleinsäuren speziell an DNA, an RNA.
Die sekretierte Luziferase MLuc7 eignet sich als Reporter gekoppelt an Proteine oder Peptide.
Die an Nukleinsäure oder das Peptid des gekoppelten Protein MLuc7 eignet sich als
Sonde speziell für Northern-Blots, für Southern-Blots, für Western-Blots, für ELISA, für Nukleinsäuresequenzierungen, für Proteinanalysen, Chip-Analysen.
Das Protein MLuc7 eignet sich als Markierung von pharmakologischen Formulierungen speziell von infektiösen Agentien, von Antikörpern, von „small molecules".
Das Protein MLuc7 eignet sich als für geologische Untersuchungen speziell für Meeres-, Grundwasser- und Flussströmungen.
Das Protein MLuc7 eignet sich zur Expression in Expressionssystemen speziell in in- vitro Translationssystemen, in bakteriellen Systemen, in Hefen Systemen, in Bakulo Systemen, in viralen Systemen, in eukaryotischen Systemen. Die Erfindung betrifft auch die Reinigung des Protein MLuc7 speziell als wildtyp Protein, als Fusionsprotein, als mutagenisiertes Protein.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von MLuc7 auf dem Gebiet der Kosmetik speziell von Badezusätzen, von Lotionen, von Seifen, von Körperfarben, von Zahncreme, von Körperpudern.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Mluc7 zur Färbung speziell von Nahrungsmitteln, von Badezusätzen, von Tinte, von Textilien, von Kunststoffen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Mluc7 zur Färbung von Papier speziell von Grußkarten, von Papierprodukten, von Tapeten, von Bastelartikeln.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Mluc7 zur Färbung von
Flüssigkeiten speziell für Wasserpistolen, für Springbrunnen, für Getränke, für Eis.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Mluc7 zur Herstellung von Spielwaren speziell von Fingerfarbe, von Schminke, Wasserpistolen.
Die Erfindung betrifft Organismen, die einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten.
Die Erfindung betrifft Organismen, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid expremieren.
Die Erfindung betrifft Organismen, die ein funkionelles Äquivalente von MLuc7 expremieren.
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Expression der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Polypeptide in Bakterien, eukaryonti sehen Zellen oder in in vitro
Expressionssystemen.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen Polypeptides. Die Erfindung bezieht sich auf Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen die erfindungsgemäßen fluoreszierende Proteine erkannt werden.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen fluoreszierenden Proteine als Marker- und Reportergen, insbesondere für die pharmakologische
Wirkstoffsuche und Diagnostik.
Die Erfindung betrifft die sekretierte Luziferase MLuc7 mit der Aminosäuresequenz repräsentiert durch SEQ ID NO: 2 und der Nukleotidsequenz repräsentiert durch SEQ ID NO: 1.
Erfindungsgemäß ist ein Protein MLuc7, dadurch gekennzeichnet, dass seine
Sequenz die Sequenz dargestellt in SEQ ID NO: 2 umfasst, sowie funktionelle Fragmente desselben.
Erfindungsgemäß ist des weiteren ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Protein kodiert, dass die Sequenz dargestellt in SEQ ID NO: 1 umfasst, sowie funktionelle Fragmente desselben.
Bestandteil der Erfindung ist ein rekombinanter RNA oder DNA- Vektor, welcher eine Nukleinsäure wie im vorangehenden Abschnitt beschrieben umfasst.
Bestandteil der Erfindung ist ein Verfahren zur Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptides in Bakterien, eukaryontischen Zellen, oder in in vitro Translationssystemen.
Bestandteil der Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure als Marker oder Reportergen auch in Kombination mit einem oder mehreren anderen Marker oder Reportergenen.
Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins als Marker oder Reportergen auch in Kombination mit einem oder mehreren anderen Marker oder Reportergenproteinen.. Mutanten und Derivate sekretorischer Luziferasen
In Figur 3 ist das Alignment der Luziferasen MLu7, der Metridia Luziferasen (LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6 und Lu52) und der Gaussia Luziferase dargestellt. Die Luziferase MLuc7 stellt eine deutlich kürzeres Polypeptid dar, als die übrigen analysierten Luziferasen. Die Luziferasen Lu22 und Gaussia Luziferase umfassen ebenfalls durch deutlich kürzere Polypeptide.
Erfindungsgemäß sind Mutanten oder Derivate der Luziferasen Lu 164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten kinetischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
Erfϊndungsgemäß sind Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 23 bis 78 der Luziferasen LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten kinetischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
Erfϊndungsgemäß sind Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 23 bis 78 der Luziferasen Lul64, Lu22, LuAL, Lu39,
Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten biochemischen oder physikochemischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
Erfindungsgemäß sind Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 13 bis 88 der Luziferasen LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten kinetischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
Erfindungsgemäß sind Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 13 bis 88 der Luziferasen LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten biochemischen oder physikochemischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion. Erfindungsgemäß sind Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 33 bis 68 der Luziferasen LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten kinetischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
Erfindungsgemäß sind Mutanten oder Derivate, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 33 bis 68 der Luziferasen LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten biochemischen oder physikochemischen Eigenschaften der Lumineszenzreaktion.
Die Erfindung betrifft insbesondere:
1. Ein Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ DO NO: 2 umfasst;
b) Nukleinsäuremolekülen, welche die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz umfassen;
c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und welche Luziferasen kodieren; eine stringente Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen kann zum Beispiel in einer wässrigen Lösung, die 0,2 x SSC (Ix Standard saline-citrate = 150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat) enthält, bei 68°C durchgeführt werden (Sambrook et al., 1989);
d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden;
e) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzidentität von mindestens 70, 75,
80, 85, 95%, 98%, 99% zu SEQ ID NO: 1 zeigen, und deren Proteinprodukte Luziferasen sind;
f) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzidentität von mindestens 65% zu
SEQ ID NO: 1 zeigen, und welche Luziferasen kodieren; g) Fragmente der Nukleinsäuremoleküle gemäß a) - f), wobei die Fragmente funktionelle Luziferasen kodieren.
2. Eine Nukleinsäure nach Punkt 1 , welche einen funktionalen Promotor 5' zur das Photoprotein kodierenden Sequenz enthält.
3. Rekombinante DNA oder RNA Vektoren, welche Nukleinsäuren nach Punkt 2 enthalten.
4. Organismen, die einen Vektor gemäß Punkt 3 enthalten.
5. Oligonukleotide mit mehr als 10 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die identisch oder komplementär zu einer Teilsequenz eines Nukleinsäuremoleküls gemäß Punkt 1 sind.
6. Polypeptid, das durch eine Nukleinsäuresequenz nach Punkt 1 kodiert ist.
7. Verfahren zur Expression der Luziferase Polypeptide gemäß Punkt 6 in Bakterien, eukaryotischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.
8. Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines Luziferase Polypeptides gemäß Punkt 6.
9. Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen die Luziferase MLuc7 erkannt werden.
10. Verwendung einer eine Luziferase kodierende Nukleinsäure gemäß den Punkten 1 bis 3 als Marker- oder Reportergen.
1 1. Verwendung einer Luziferase gemäß Punkt 6 als Marker oder Reporter.
12. Antikörper, der spezifisch eine Luziferase gemäß Punkt 6 erkennt.
13. Verwendung gemäß Punkt 10 oder 1 1 , wobei neben der Luziferase MLuc7 mindestens ein weiteres Reportergen eingesetzt wird.
14. Verwendung gemäß Punkt 13, wobei es sich bei dem/den weiteren Reportergen(en) um sekretierte und/oder zelluläre Luziferasen handelt. 15. Verwendung gemäß Punkt 14, wobei es sich bei dem/den weiteren Reportergen(en) um sekretierte Luziferasen handelt.
16. Verwendung gemäß Punkt 14, wobei es sich bei dem/den weiteren Reportergen(en) um die firefly Luziferase, oder um Luziferasen aus dem Organismus Metridia longa handelt.
17. Verwendung gemäß Punkt 15, wobei es sich bei den weiteren sekretierten Luziferasen um Luziferasen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6 und Lu52 handelt.
18. Verfahren gemäß Punkten 10, 11, oder 13, wobei die Lumineszenzmessungen kinetisch ausgewertet werden.
19. Verfahren gemäß Punkten 10, 11, 13 oder 18, wobei mehrere Zielproteine gemessen werden.
20. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten kinetischen Eigenschaften der
Lumineszenzreaktion.
21. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 23 bis 78 und veränderte kinetische Eigenschaften der
Lumineszenzreaktion aufweist.
22. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lul6, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 23 bis 78 und veränderte biochemische oder physikochemische
Eigenschaften der Lumineszenzreaktion aufweist. 23. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen Lu 164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu 16, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 13 bis 88 und veränderte kinetische Eigenschaften der Lumineszenzreaktion aufweist.
24. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 13 bis 88 und veränderte biochemische oder physikochemische Eigenschaften der Lumineszenzreaktion aufweist.
25. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 13 bis 68 und veränderte kinetische Eigenschaften der Lumineszenzreaktion aufweist.
26. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lul6, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 13 bis 68 und veränderte biochemische oder physikochemische Eigenschaften der Lumineszenzreaktion aufweist.
Nukleotid- und Aminosäuresequenzen
SEQ ID NO:1 (MLuc7 - Nukleotidsequenz - kodierend)
5'-
ATGGATATCAAATTTATTTTTGCTCTTGTTTGCATTGCATTGGTCCAGGCCAACCCT ACTGTAAACAATGATGTTAACCGTGGTAAAATGCCTGGGAAAAAATTGCCACTGGAA
GTACTTATAGAAATGGAAGCCAATGCTTTTAAAGCTGGCTGCACCAGGGGATGTCTC
ATTTGTCTTTCAAAAATCAAGTGCACAGCCAAAATGAAGCAGTACATTCCAGGAAGA
TGTCATGATTATGGAGGAGACAAGAAAACTGGACAGGCTGGAATAGTGGGTGCTATT
GTTGACATTCCTGAAATCTCTGGATTTAAGGAGATGGAACCAATGGAGCAGTTCATT GCTCAAGTTGATCTCTGCGCCGACTGCACTACTGGCTGCCTCAAAGGTCTTGCCAAT
GTCAAGTGTTCTGAACTCCTCAAGAAATGGCTGCCAGACAGATGTGCAAGTTTTGCT
GACAAAATTCAAAAAGAAGCGCACAACATCAAGGGTCTTGCTGGAGATCGT-S'
Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von :
SEQ ID NO:2 (MLuc7 - Aminosäuresequenz)
MDIKFIF ALVCIALVQ ANPTVNND VNRGKMPGKKLPLEVLIEMEANAFKAGC TRGCLICLSKIKCTAKMKQYLPGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFK EMEPMEQFIAQVDLCADCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPDRCASFADKIQ KEAHNIKGLAGDR
SEQ ID NO:3 (Lul64 - Nukleotidsequenz - kodierend)
5'-
ATGGATATAAAGGTTGTCTTTACTCTTGTTTTCTCAGCATTGGTTCAGGCAAAATCA ACTGAATTCGATCCTAACATTGACATTGTTGGTTTAGAAGGAAAATTTGGTATAACA AACCTTGAGACGGATTTATTCACAATATGGGAGACAATGGAGGTCATGATCAAAGCA GATATTGCAGATACTGATAGAGCCAGCAACTTTGTTGCAACTGAAACCGATGCTAAC CGTGGAAAAATGCCTGGCAAAAAACTGCCACTGGCAGTTATCATGGAAATGGAAGCC AATGCTTTCAAAGCTGGCTGCACCAGGGGATGCCTTATCTGTCTTTCAAAAATAAAG TGTACAGCCAAAATGAAGGTGTACATTCCAGGAAGATGTCATGATTATGGTGGTGAC AAGAAAACTGGACAGGCAGGAATAGTTGGTGCAATTGTTGACATTCCCGAAATCTCT GGATTTAAGGAGATGGCACCCATGGAACAGTTCATTGCTCAAGTTGAACGTTGCGCT TCCTGCACTACTGGATGTCTCAAAGGTCTTGCCAATGTTAAGTGCTCTGAACTCCTG AAGAAATGGCTGCCTGACAGATGTGCAAGTTTTGCTGACAAGATTCAAAAAGAAGTT CACAATATCAAAGGCATGGCTGGAGATCGTTGA
-3'
Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von :
SEQ ID NO:4 (Lul64 - Aminosäuresequenz)
MDIKWFTLVFSALVQAKSTEFDPNIDIVGLEGKFGITNLETDLFTIWETMEVMIKA DIADTDRASNFVATETDANRGKMPGKKLPLAVIMEMEANAFKAGCTRGCLICLSKIK CTAKMKVYI PGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDI PEI SGFKEMAPMEQFIAQVDRCA
SCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR
SEQ ID NO:5 (MLuc7 - Nukleotidsequenz - klonierte Sequenz)
5'-
TGGTACCCGGGAATTCGGCCATTATGGCCGGGGATTCAGTCAACTGGATCCAAAAGG AAAGGTACTCCAAATATTGCCTGGAGGAAAAATGATATCAAATTTATTTTTGCTCTT
GTTTGCATTGCATTGGTCCAGGCCAACCCTACTGTAAACAATGATGTTAACCGTGGT
AAAATGCCTGGGAAAAAATTGCCACTGGAAGTACTTATAGAAATGGAGCCAATGCTT
TTAAAGCTGGCTGCACCAGGGGATGTCTCATTTGTCTTTCAAAAATCAAGTGCACAG
CCAAAATGAAGCAGTACATTCCAGGAAGATGTCATGATTATGGAGGAGACAAGAAAA CTGGACAGGCTGGAATAGTGGGTGCTATTGTTGACATTCCTGAAATCTCTGGATTTA
AGGAGATGGAACCAATGGAGCAGTTCATTGCTCAAGTTGTCTCTGCGCCGACTGCAC
TACTGGCTGCCTCAAAGGTCTTGCCAATGTCAAGTGTTCTGAACTCCTCAAGAAATG
GCTGCCAGACAGATGTGCAAGTTTTGCTGACAAAATTCAAAAAGAAGCGCACAACAT
CAAGGGTCTTGCTGGAGATCGTTAAATAAACTGAGAAAACAATGGATAACTGGATCA AGATAAGCTAATCTCATGATAAAAAATGGCCAATTTAATTTAAAAATTATGAATTGT
TAATTTTTATGTATGGAATTCCTTAAATATATTCTATGTATTCAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAACATGTCGGCCGCCTCGGCCCAGTCGACTCTAGA
-3Λ Beschreibung der Figuren
Figur 1
Die Figur 1 zeigt die Vektorkarte des Konstruktes pcDNA3-MLuc7.
Figur 2
Die Figur 2 zeigt die Vektorkarte des Konstruktes pASM-MLuc7.
Figur 3
Die Figur 3 zeigt ein Alignment verschiedener sekretierter Luiziferasen auf Aminosäureebene.
Figur 4
Die Figur 4 zeigt die Substratspezifität der Luziferasen Lu 164, Lu22 und MLuc7. X-
Achse: Coelenterazine, Y-Achse : relative Lichteinheiten (relative light units : RLU). Zur Aktivitätsbestimmung wurden jeweils die gleichen Mengen an sekretierter Luziferase aus einer transienten Transfektion von CHO verwendet. Die Coelenterazine wurden parallel zugegeben und die Messung anschließend gestartet.
Figur 5
Die Figur 5 zeigt die Temperaturabhängigkeit der Luziferase MLuc7. X-Achse : Temperatur in 0C, Y-Achse : relative Lichteinheiten (relative light units : RLU). Zur Aktivitätsbestimmung wurden jeweils die gleichen Mengen an sekretierter Luziferase aus einer transienten Transfektion von CHO verwendet. Die angegebene Temperatur entspricht der Reaktionstemperatur. Aufgetragen ist das Integral der
Biolumineszenzmessung von 60 Sekunden.
Figur 6
Die Figur 6 zeigt die Abhängigkeit der Luziferase MLuc7 von der Kalziumchloridkonzentration im Reaktionspuffer. X-Achse : KCl Konzentration in mM, Y-Achse : relative Lichteinheiten (relative light units : RLU). Zur Aktivitätsbestimmung wurden jeweils die gleichen Mengen an sekretierter Luziferase aus einer transienten Transfektion von CHO verwendet. Die angegebene Konzentration entspricht der Konzentration von KCl im Reaktionspuffer. Aufgetragen ist das Integral der Biolumineszenzmessung von 60 Sekunden.
Figur 7
Die Figur 7 zeigt die Biolumineszenzmessung von MLuc7 bei konstanter MLuc7 Menge und unterschiedlichen Coelenterazinkonzentrationen. X-Achse : Coelenterazinekonzentration in μM. Y-Achse : : relative Lichteinheiten (relative light units : RLU).
Figur 8
Die Figur zeigt die Kinetik der Biolumineszenzreaktion von MLuc7 mit drei unterschiedlichen Coelenterazinen. X-Achse : Zeit in Sekunden. Y-Achse : : relative Lichteinheiten (relative light units : RLU). Schwarz : natives Coelenterazine, hell- grau : Coelenterazine f, dunkel-grau : Coelenterazine i.
Figur 9
Die Figur zeigt die Kinetik der Biolumineszenzreaktion von Lu 164 mit drei unterschiedlichen Coelenterazinen. X-Achse : Zeit in Sekunden. Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative light units : RLU). Schwarz : natives Coelenterazine, hell- grau : Coelenterazine f, dunkel-grau : Coelenterazine i.
Figur 10
Die Figur 10 zeigt das Ergebnis der Biolumineszenzmessung von MLuc7 (schwarz) und LuI 64 (grau) für eine Messung von 300 Sekunden mit einer Integrationszeit von 1,5 Sekunden. X-Achse : Zeit in Sekunden. Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative light units : RLU). Figur 11
Die Figur 1 1 zeigt das Ergebnis der Biolumineszenzmessung von MLuc7 bei einer konstanten Substratkonzentration und abnehmender Konzentration an Mluc7 durch Verdünnung des Zeilüberstandes. X-Achse : Zeit in Sekunden. Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative light units : RLU). Legende : Angabe und Zuordnung des
Verdünnungsfaktor (ausgehend vom unverdünnten Überstand).
Figur 12
Die Figur 12 zeigt das Ergebnis der Biolumineszenzmessung von LuI 64 bei einer konstanten Substratkonzentration und abnehmender Konzentration an Lu 164 durch Verdünnung des Zeilüberstandes. X-Achse : Zeit in Sekunden. Y-Achse: relative
Lichteinheiten (relative light units : RLU). Legende : Angabe und Zuordnung des Verdünnungsfaktor (ausgehend vom unverdünnten Überstand).
Figur 13
Die Figur 13 zeigt das Ergebnis der kinetischen Auswertung der Biolumineszenzmessung von Mluc7 und LuI 64 in Abschnitten von jeweils 10
Sekunden Integrationszeit. X-Achse : Zeit in Sekunden. Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative light units : RLU).
Figur 14
Die Figur 14 zeigt das Ergebnis der kinetischen Auswertung der Biolumineszenzmessung von Mluc7 und LuI 64 bei einer Integrationszeit von 300
Sekunden. X-Achse : Zeit in Sekunden. Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative light units : RLU).
Figur 15
Die Figur 15 zeigt das Ergebnis der kinetischen Auswertung der Biolumineszenzmessung von Mluc7 und LuI 64 in Abschnitten von jeweils 60 Sekunden Integrationszeit. X-Achse : Zeit in Sekunden. Y-Achse: relative Lichteinheiten (relative light units : RLU).
Figur 16
Die Figur 19 zeigt die Darstellung der bevorzugten Wassertiefe von Individuen der Spezies Metridia longa in Ahängigkeit vom Entwicklungsstatus. X-Achse :
Wassertiefe in Meter (m);Y-Achse : Entwicklungsstatus; schwarze Balken : 25-65 m, graue Balken : 10-25 m, weiße Balken : 0-10 m. Figur nach Angaben : National Oceanographic Data Center (USA).
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung und Verwendung der Konstrukte
Als Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes wurde das Plasmid pcDNA3.1(+) der Firma Clontech zur konstitutiven Expression verwendet.
Zur Detektion von Veränderungen der intrazellulären cAMP Konzentration, wurde die cDNA von MLuc7 in den Vektor pASM kloniert. Der Vektor pASM enthält cAMP responsive Elemente (CRE), die die Promotoraktivität in Abhängigkeit von der cAMP Konzentration reguliert. Das Derivat des Vektors wurde als pASM- MLuc7 bezeichnet. Das Derivat des Vektors pcDNA3 wurde als pcDNA3-MLuc7 bezeichnet. Die Klonierungen erfolgte unter Verwendung von molekularbiologischen Standardmethoden. Die Vektoren pcDNA3-Mluc7 und pASM-MLuc7 wurde zur Expression von MLuc7 in eukaryotischen Systemen verwendet.
Die Fig. 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-Mluc7.
Die Fig. 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pASM-MLuc7.
Beispiel 2
Eukaryo tische Expression
Die konstitutive eukaryotische Expression erfolgte in CHO-Zellen durch Transfektion der Zellen mit den Expressionsplasmiden pcDNA3-MLuc7, pcDNA3- Lu 164 und pcDNA3 (ohne cDNA Insertion) in transienten Experimenten. Hierzu wurden 10000 Zellen pro Loch in DMEM-Fl 2 Medium auf 96 Loch Mikrotiterplatten plattiert und über Nacht bei 370C inkubiert. Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Fugene 6 Kits (Roche) nach Herstellerangaben. Die transfizierten Zellen wurden über Nacht bei 37°C in DMEM-F 12 Medium inkubiert. Die Messung der Biolumineszenz erfolge nach Substratzugabe mit einem Imaging-
System. Die Messung verdünnter Überstaände erfolgte in Puffer A (pH 7,4) mit der Zusammensetzung : 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM Hepes, 1 mM MgC12 x 6H2O und 5 mM NaHCCβ
Zur Herstellung stabiler Zelllinien wurden die transfizierten Zellen mit 2 mg/ml Geneticin selektioniert und die Biolumineszenzaktivität der Klone bzw. Überstände bestimmt.
Beispiel 3
Sequenzvergleich
Um die Sequenzen der sekretierten Luziferasen vergleichen und darstellen zu können, wurde ein Alignment der Aminosäuresequenzen durchgeführt. Die Figur 3 zeigt das Alignment der sekretierten Luziferasen auf Aminosäureebene. Die
Cypridina Luziferase wurde nicht mit in das Alignment einbezogen, da ihre Sequenzidentität zu den übrigen Luziferasen zu gering ist.
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WO0242470 Al
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Claims

Patentansprüche
1. Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO: 2 umfasst;
b) Nukleinsäuremolekülen, welche die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz umfassen;
c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und welche Luziferasen kodieren;
d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden;
e) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzidentität von mindestens 95 % zu SEQ ID NO: 1 zeigen, und deren Proteinprodukte Luziferasen sind;
f) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzidentität von mindestens 65% zu SEQ BD NO: 1 zeigen, und welche Luziferasen kodieren;
g) Fragmente der Nukleinsäuremoleküle gemäß a)-f), wobei die Fragmente funktionelle Luziferasen kodieren.
2. Nukleinsäure nach Anspruch 1 , welche einen funktionalen Promotor 5' zur das Photoprotein kodierenden Sequenz enthält.
3. Rekombinante DNA oder RNA Vektoren, welche Nukleinsäuren nach Anspruch 2 enthalten.
4. Eukaryontische oder prokaryontische Zelle oder ein nicht humaner Organismus, einen Vektor gemäß Anspruch 3 enthaltend.
5. Oligonukleotide mit mehr als 10 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die identisch oder komplementär zu einer Teilsequenz eines Nukleinsäuremoleküls gemäß
Anspruch 1 sind.
6. Polypeptid, das durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 kodiert ist.
7. Verfahren zur Expression der Luziferase Polypeptide gemäß Anspruch 6 in Bakterien, eukaryoti sehen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.
8. Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines Luziferase Polypeptides gemäß Anspruch 6.
9. Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen die Luziferase MLuc7 erkannt werden.
10. Verwendung einer eine Luziferase kodierende Nukleinsäure gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 als Marker- oder Reportergen.
1 1. Verwendung einer Luziferase gemäß Anspruch 6 als Marker oder Reporter.
12. Antikörper, der spezifisch eine Luziferase gemäß Anspruch 6 erkennt.
13. Verwendung gemäß Anspruch 10 oder 1 1 , wobei neben der Luziferase MLuc7 mindestens ein weiteres Reportergen eingesetzt wird.
14. Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei es sich bei dem/den weiteren Reportergen(en) um sekretierte und/oder zelluläre Luziferasen handelt.
15. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei es sich bei dem/den weiteren Reportergen(en) um sekretierte Luziferasen handelt.
16. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei es sich bei dem/den weiteren Reportergen(en) um die firefly Luziferase, oder um Luziferasen aus dem Organismus Metridia longa handelt.
17. Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei es sich bei den weiteren sekretierten Luziferasen um Luziferasen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lu 164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6 und Lu52 handelt.
18. Verfahren gemäß Ansprüchen 10, 1 1 , oder 13, wobei die Lumineszenzmessungen kinetisch ausgewertet werden.
19. Verfahren gemäß Ansprüchen 10, 1 1, 13 oder 18, wobei mehrere Zielproteine gemessen werden.
20. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lul6, Lu52 und Gaussia Luciferase mit veränderten kinetischen Eigenschaften der
Lumineszenzreaktion.
21. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 23 bis 78 und veränderte kinetische Eigenschaften der
Lumineszenzreaktion aufweist.
22. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen Lul64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lul6, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 23 bis 78 und veränderte biochemische oder physikochemische
Eigenschaften der Lumineszenzreaktion aufweist.
23. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 13 bis 88 und veränderte kinetische Eigenschaften der
Lumineszenzreaktion aufweist.
24. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 13 bis 88 und veränderte biochemische oder physikochemische
Eigenschaften der Lumineszenzreaktion aufweist.
25. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 13 bis 68 und veränderte kinetische Eigenschaften der Lumineszenzreaktion aufweist.
26. Eine Mutante oder ein Derivat einer Luziferase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Luziferasen LuI 64, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, LuI 6, Lu52 und Gaussia Luciferase, die Veränderungen oder Deletionen im Bereich der Aminosäuren 13 bis 68 und veränderte biochemische oder physikochemische Eigenschaften der Lumineszenzreaktion aufweist.
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