KR20090116733A - 분비형 루시페라아제 ＭＬｕｃ7 및 그의 용도 - Google Patents

분비형 루시페라아제 ＭＬｕｃ7 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분비형 루시페라아제 MLuc7의 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열, 및 그의 활성 및 용도에 관한 것이다.
Figure P1020097016396
루시페라아제, MLuc7.

Description

분비형 루시페라아제 ＭＬｕｃ7 및 그의 용도{Secreted luciferase MLuc7 and use thereof}
본 발명은 분비형 MLuc7 루시페라아제의 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열 및 활성 및 그의 용도 및 분비형 루시페라아제의 용도에 관한 것이다.
루시페라아제
발광(luminescence)은 가시광선 스펙트럼 범위에서 광자의 방출을 의미하고, 상기 방출은 여기된 방출자(emitter) 분자에 의한 것이다. 형광과 대조적으로, 이때 에너지는 보다 짧은 파장의 발광의 형태로 외부로 공급되지 않는다.
화학발광(chemiluminescence)과 생물발광(bioluminescence)이 구별된다. 화학발광은 여기된 전자가 바닥 상태(ground state)로 복귀될 때 자체적으로 발광하는 여기된 분자들을 초래하는 화학 반응을 의미한다. 이 반응이 효소에 의해 촉매되는 경우, 이 반응은 생물발광으로 불린다. 상기 반응에 관련된 효소는 일반적으로 루시페라아제(luciferase)로 지칭된다.
발광 개체의 개요를 Wilson & Hastings 1998에서 볼 수 있다.
루시페라아제는 퍼옥시다아제(peroxidase) 또는 모노옥시게나아제(monooxygenase) 및 디옥시게나아제이다. 발광 산물을 위한 출발 기질인 효소의 기질은 루시페린(luciferin)으로 불린다. 그들은 종(species) 간에 상이하다. 루시페라아제 시스템의 양자 수율(quantum yield)은 전환된 기질 분자당 0.1 내지 0.9개의 광자이다.
루시페라아제는 그들의 기원 또는 효소적 특성에 근거하여 분류될 수 있다. 또한, 루시페라아제는 그들의 기질 특이성에 의해 상호간에 구별될 수 있다. 가장 중요한 기질은 코엘렌테라진(coelenterazine) 및 루시페린, 및 또한 상기 두 물질의 유도체를 포함한다.
루시페라아제 기질
일부 루시페라아제 기질의 구조가 예로서 하기에 도시된다:
코엘렌테라진(Coelenterazine)
Figure 112009047890540-PCT00001
코엘렌테라진 f
Figure 112009047890540-PCT00002
코엘렌테라진 e
Figure 112009047890540-PCT00003
코엘렌테라진 cp
Figure 112009047890540-PCT00004
코엘렌테라진 h
Figure 112009047890540-PCT00005
코엘렌테라진 n
Figure 112009047890540-PCT00006
반딧불이(firefly) 루시페린
Figure 112009047890540-PCT00007
사이프리디나(Cypridia) 루시페린
Figure 112009047890540-PCT00008
분비형 루시페라아제
숙주 개체에 의해 세포질로부터 주변 매질로 재조합 단백질 또는 야생형 단백질의 형태로 분비된 루시페라아제는 분비형 루시페라아제(secreted luciferase)로 지칭된다. 표 1은 분비형 루시페라아제에 대한 개요를 제공한다.
루시페라아제 개체 참조
Lu164 메트리디아 론가 (Metridia longa) WO0242470 A1
Lu22 메트리디아 론가 WO0242470 A1
LuAL 메트리디아 론가 WO0242470 A1
Lu39 메트리디아 론가 WO0242470 A1
Lu45 메트리디아 론가 WO0242470 A1
Lu16 메트리디아 론가 WO0242470 A1
Lu52 메트리디아 론가 WO0242470 A1
사이프리디나 루시페라아제 사이프리디나 힐겐도르피 (Cypridina Hilgendorfii) Tsuji et al. 1974
가우시아 루시페라아제 가우시아 프린세프스 (Gaussia princeps) Christopoulos et al. 2002
표 1: 분비형 루시페라아제의 개요
분비형 Lu164 루시페라아제는 마찬가지로 Markova et al. 2004에 개시된다.
리포터 시스템
리포터 유전자 또는 표지 유전자(indicator gene)는 일반적으로 그 유전자 산물이 간단한 생화학적 방법 또는 조직화학적 방법에 의해 용이하게 검출될 수 있는 유전자를 의미한다. 2 종류 이상의 리포터 유전자가 구분된다.
1. 내성 유전자(resistance gene). 내성 유전자는 세포에 그 발현이 상기 내성 유전자의 부재시 성장 배지 중의 존재가 세포 사망을 초래하는 항생제 또는 다른 물질에 대한 내성을 부여하는 것인 유전자를 의미한다.
2. 리포터 유전자(reporter gene). 리포터 유전자의 산물은 유전 공학에서 융합 표지 또는 비-융합 표지(fused or non-fused indicator)로 이용된다. 가장 일반적으로 이용되는 리포터 유전자는 베타-갈락토시다아제(Alam et al., 1990), 알칼리 포스파타아제(Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), 루시페라아제 및 기타 광단백질(Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984)을 포함한다.
발광은 가시광선 스펙트럼 범위에서 광자의 방출을 의미하고, 상기 방출은 여기된 방출자 분자에 의한 것이다. 형광과 대조적으로, 이때 에너지는 보다 짧은 파장의 발광의 형태로 외부로 공급되지 않는다.
화학발광과 생물발광이 구별된다. 화학발광은 여기된 전자가 바닥 상태(ground state)로 복귀될 때 자체적으로 발광하는 여기된 분자들을 초래하는 화학 반응을 의미한다. 이 반응이 효소에 의해 촉매되는 경우, 이 반응은 생물발광으 로 불린다. 상기 반응에 관련된 효소는 일반적으로 루시페라아제(luciferase)로 지칭된다.
분비형 MLuc7 루시페라아제
놀랍게도, 메트리디아 론가(Metridia longa)로부터 새로운 루시페라아제를 스크리닝하면서, 신규한 루시페라아제(이하에서 MLuc7로 지칭됨)를 확인하고 클로닝하였으며, 그의 생화학적 및 물리화학적 특성은 이전에 확인된 루시페라아제와 명확하게 상이하다. 이 특성들이 하기에 기재된다:
반응속도(Kinetics)
분비형 MLuc7 루시페라아제를 발현하는 경우, 상기 루시페라아제는 놀랍게도 생물발광 반응의 변형된 시간 분해능(time resolution)을 갖는 것으로 확인되었다(반응속도). 반응속도 차이는 연구된 기질에 대해 기질-독립적이었고 도 8 및 도 9에 도시된다. 도 10은 MLuc7과 Lu164에 대한 생물발광 반응의 진행을 도시한다. MLuc7의 훨씬 더 빠른 반응속도가 명확하게 표시된다. MLuc7은 Lu164 대비, 수초 후에도, 초당 측정된 발광의 감소를 보인다. 60초 후에, 300초의 통합 신호(integral signal)의 70-80%가 기록되었다. Lu164는 초당 생물발광 신호의 훨씬 더 늦은 감소를 보여서, 300초 후에도 백그라운드 대비 측정가능한 명확한 신호를 가져온다. 따라서, MLuc7은 메트리디아 론가의 이전에 개시된 분비형 루시페라아제와 반응속도론적으로 상이하다. 이 특성 때문에, MLuc7은 놀랍게도 다른 코엘렌테라젠-의존적 루시페라아제 또는 코엘렌테라젠-독립적 루시페라아제와 함게 이용될 수 있으며, 이는 반응속도적 구별(kinetic distinction)이 가능하기 때문이다.
활성
분비형 MLuc7 루시페라아제를 발현하는 경우, 상기 루시페라아제는 놀랍게도 변화된 반응속도적 특성 때문에 생물발광 반응의 변화된 활성 분포를 갖는 것으로 발견되었다. 생물발광 반응의 개시 시에, 초당 측정되는 MLuc7 활성은 Lu164의 활성보다 훨씬 더 높다. 이와 같은 보다 높은 생물발광이 이용된 측정 방법의 보다 높은 민감도를 가능하게 하며, 이는 더 적은 수의 세포, MLuc7 발현의 보다 낮은 활성화 또는 보다 낮은 기질 농도가 측정값이 뚜렷하게 백그라운드 신호를 초과할 수 있게 하기 때문이다.
본 발명은 민감도의 개선, 적은 수의 세포 또는 낮은 기질 농도의 이용을 위한 MLuc7의 용도에 관한 것이다.
반응속도 평가(Kinetic evaluation)
MLuc7의 변화된 반응속도 특성이 생물발광의 구별된 반응속도 평가를 가능하게 한다. (예를 들면) 300초 동안의 연속적 측정으로, 다양한 간격들이 평가를 위해 이용될 수 있다. 도 13은 각 경우, 10초의 구간들에 대한 생물발광 신호 합계를 도시한다. MLuc7은 최초 60초 내에서 Lu164보다 훨씬 더 높은 생물발광을 보인다(정확한 시간 기간은 사용된 루시페라아제와 기질의 양에 의해 결정된다). 이 기간 후에, MLuc7의 생물발광은 Lu164의 생물발광보다 더 빠르게 감소하여, Lu164가 더 높은 생물발광 신호를 갖는 결과가 초래된다. 따라서, 측정 창(measurement window)을 선택하는 것에 의해 루시페라아제들을 구별할 수 있다. 도 14는 선택된 실험 조건 하에서 300초의 기간 동안 MLuc7 루시페라아제와 Lu164 루시페라아제의 생물발광 함계를 도시한다.
도 15는 각 경우 60초의 간격들에 대한 생물발광 신호 합계를 도시한다. 여기에서도, 루시페라아제들은 측정 창을 선택하는 것에 의해 구별될 수 있다. 따라서, 측정 간격의 길이 및 선택이 특정한 실험 조건에 조화되고 유연성 있는 방식으로 이용될 수 있다. 도시된 데이터 때문에, 총 측정 시간도 유연한 방식으로 선택될 수 있다.
본 발명은 MLuc7의 생물발광 활성의 측정값의 반응속도적 평가에 관한 것이다.
본 발명은 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 및 Lu52의 생물발광 활성의 측정값의 반응속도적 평가에 관한 것이다.
본 발명은 분비형 루시페라아제의 생물발광 활성의 측정값의 반응속도적 평가에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 단백질의 생물발광 활성의 측정값의 반응속도적 평가에 관한 것이다.
다중화(Multiplexing)
분비형 MLuc7 루시페라아제를 발현하는 경우, 상기 루시페라아제는 놀랍게도 그의 변화된 특성들 때문에 다중 반응(multiplex reaction)에 특히 적합하다는 것이 발견되었다. MLuc7 루시페라아제는 다른 루시페라아제에 비해 명확하게 더 빠른 반응 속도를 보여서, 그에 의해 다른 발광 측정 또는 비-발광(non-luminescent) 측정 방법(판독)과 조합될 수 있다.
발광 측정 방법을 조합하기 위해, 발광 시스템은 상호 간에 저해하거나 또는 특정한 신호보다 더 많은 광을 방출하지 않아야 한다. 제1 시스템을 활성화시킨 후(예를 들면, 기질의 첨가에 의해), 제2 반응이 개시될 수 있기 전에 발광이 출발 수준으로 복귀되었어야 한다. 두 시스템이 모두 독립적인 기질을 이용하는 경우, 이것이 또한 필요하다. 빠른 반응속도 때문에, MLuc7은 측정 간의 시간을 현저하게 단축한다. 반응의 불활성화는 필요하지 않다. MLuc7 루시페라아제는 분비형 루시페라아제이기 때문에, 세포내 시스템(예를 들면, 반딧불이 루시페라아제)과 조합될 수 있다.
다른 메트리디아 론가 루시페라아제도 반딧불이 루시페라아제와 같은 세포내 시스템과 조합될 수 있다. 그러나, 이는 잔류 생물발광을 낮은 수준으로 저하시키기 위해 불활성화 단계를 요구한다.
본 발명은 MLuc7과 하나 이상의 리포터 유전자 또는 측정 기법(판독(readout))의 조합이 이용되는 것인 다중 반응 믹스(multiplex reaction mix)에서 MLuc7의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 복수 개의 표적 유전자를 측정하기 위한 반응 믹스에서 MLuc7의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 및 Lu52와 하나 이상의 리포터 유전자 또는 측정 기법(판독)의 조합이 이용되는 것인 다중 반응 믹스에서 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 및 Lu52의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 복수 개의 표적 유전자를 측정하기 위한 반응 믹스에서 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 및 Lu52의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 분비형 루시페라아제와 하나 이상의 리포터 유전자 또는 측정 기법(판독)의 조합이 이용되는 것인 다중 반응 믹스에서 분비형 루시페라아제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 복수 개의 표적 유전자를 측정하기 위한 반응 믹스에서 분비형 루시페라아제의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 단백질과 하나 이상의 리포터 유전자 또는 측정 기법(판독)의 조합이 이용되는 것인 다중 반응 믹스에서 본 발명에 따른 단백질의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 복수 개의 표적 유전자를 측정하기 위한 반응 믹스에서 본 발명에 따른 단백질의 용도에 관한 것이다.
기질 특이성
표준 조건 하에서 다양한 코엘렌테라진을 분석하는 것에 의해 MLuc7 기질 특이성을 연구하였다. 이는 Lu164, Lu22 및 MLuc7 루시페라아제에 의한 CHO 세포의 일시적 형질감염(transient transfection)으로부터의 상층액을 이용하는 것을 포함했다. 선택된 조건 하에서, 기질 코엘렌테라진 n 및 cb는 Lu164보다 MLuc7에 의해 더 부진하게 전환되고, 기질 코엘렌테라진 f는 Lu164보다 MLuc7에 의해 더 잘 전환된다. 상기 결과는 예로서, 반응이 최적화될 수 있거나, 또는 루시페라아제가 기질 및 반응 조건에 근거하여 이용될 수 있다는 것을 보여주었다. 선택된 반응 조건 하에서, 반딧불이 루시페린 및 사이프리디나 루시페린 기질이 모든 3개의 루시페라아제에 의해 낮은 정도로만 기질로서 이용된다.
본 발명은 MLuc7에 의한 생물발광을 생성하기 위한 상이한 기질의 이용 및 조합에 관한 것이다.
본 발명은 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 및 Lu52에 의한 생물발광을 생성하기 위한 상이한 기질의 이용 및 조합에 관한 것이다.
본 발명은 분비형 루시페라아제에 의한 생물발광을 생성하기 위한 상이한 기질의 이용 및 조합에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 단백질에 의한 생물발광을 생성하기 위한 상이한 기질의 이용 및 조합에 관한 것이다.
온도 의존성
10 내지 50℃의 온도에서 생물발광 반응을 측정하는 것에 의해 MLuc7 반응의 온도 의존성을 연구하였다. 이는 MLuc7에 의한 CHO 세포의 일시적 형질감염으로부터의 상층액을 이용하는 것을 포함했다. 그 결과는 MLuc7 생물발광 반응이 반응 온도의 함수라는 것을 나타냈다. 이 의존성은 리포터 유전자 적용에서 상기 반응을 최적화하고 적응시키기 위해 및 다양한 생물발광 시스템을 구별하고 조합하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명은 MLuc7의 측정방법을 개발하고 최적화하기 위한 온도 의존성의 이용 및 조합에 관한 것이다.
본 발명은 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 및 Lu52의 측정방법을 개발하고 최적화하기 위한 온도 의존성의 이용 및 조합에 관한 것이다.
본 발명은 분비형 루시페라아제의 측정방법을 개발하고 최적화하기 위한 온도 의존성의 이용 및 조합에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 단백질의 측정방법을 개발하고 최적화하기 위한 온도 의존성의 이용 및 조합에 관한 것이다.
이온 농도의 함수인 생물발광 반응
1 내지 400 mM의 KCl 농도에 의한 생물발광 반응을 측정하는 것에 의해 이온 농도의 함수인 MLuc7 반응을 연구하였다. 이는 MLuc7에 의한 CHO 세포의 일시적 형질감염으로부터의 상층액을 이용하는 것을 포함했다. 그 결과는 MLuc7 생물발광 반응이 반응 매질(reaction medium) 중 이온 농도의 함수라는 것을 나타냈다. 이 의존성은 리포터 유전자 적용에서 상기 반응을 최적화하고 적응시키기 위해 및 다양한 생물발광 시스템을 구별하고 조합하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명은 MLuc7의 측정방법을 개발하고 최적화하고 이용하기 위한 생물발광 반응의 이온 의존성의 이용 및 조합에 관한 것이다.
본 발명은 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 및 Lu52의 측정방법을 개발하고 최적화하고 이용하기 위한 생물발광 반응의 이온 의존성의 이용 및 조합에 관한 것이다.
본 발명은 분비형 루시페라아제의 측정방법을 개발하고 최적화하고 이용하기 위한 이온 의존성의 이용 및 조합에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 단백질의 측정방법을 개발하고 최적화하고 이용하기 위한 생물발광 반응의 이온 의존성의 이용 및 조합에 관한 것이다.
MLuc7 루시페라아제의 확인
메트리디아 론가 종의 생물발광 활성을 연구하기 위해, 백해(White Sea)(생물학 기지 Kartesh, Russia)에서 표본을 채취하고 액체 질소에 보관하였다. 다른 동물 또는 식물 종에 의한 오염을 방지하기 위해, 메트리디아 론가의 발생 단계 V의 200개의 표본을 확인하고 전술된 바와 같이 보관하였다. "Naupilus" 및 성체 형태 외에, 발생 단계의 진행에 따라 CI부터 CV까지의 형태를 갖는 또 다른 5개의 메트리디아 론가의 발생 형태가 개시되었고, 상기 명명법에 의해 기재되었다. 선택 및 확인은 쌍안 현미경 및 트랜스퍼 피펫(transfer pippet)을 이용하여 수행하였다. 표본은 생물학 연구 기지 "Kartesh"(러시아)의 지역에 있는 백해에서 채취하였다.
메트리디아 론가 개체들은 특히 그들의 발생 상태에 따른 깊이에서 발견될 수 있다. 이 의존성이 도 19에 도시된다.
계절에따른 변화 외에, 염 함량, 온도 및 먹이 사슬(조성 및 다양성) 및 기타 인자들이 메트리디아 론가의 서식지에 영향을 미친다. 이 인자들이 생물발광 단백질의 대사 과정 또는 발현에 영향을 미치는지 여부는 알려져 있지 않다. 생물발광 단백질의 발생 단계-특이적 발현이 또한 추측될 수 있고 예상될 수 있다.
따라서, 선택된 발생 단계의 개체들의 특정한 연구가 다른 발생 단계에서 현저하게 더 낮은 정도로 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않고, 따라서, 제한적으로 발현 클로닝(expression cloning)에 접근가능한 생물발광 단백질의 식별을 가져올 수 있다.
본 발명은 신규한 생물발광 단백질을 확인하기 위한 특정한 발생 단계의 생물발광 개체의 연구에 관한 것이다.
제조사의 설명서에 따라, Straight A의 mRNA Isolation Kit(Novagen)를 이용하여 메트리디아 론가로부터 RNA를 분리하였다. 분리된 폴리-A mRNA를 PowerScript Reverse Transcriptase(Clontech) 및 SMART cDNA Library Construciton Kit(Clontech)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 cDNA로 전사시켰다. 사용된 발현 벡터는 pTriplEx2(Clontech)였고, cDNA 단편들을 SfiI A-B 절단 부위에 삽입시켰다.
수득된 발현 벡터를 전기 천공에 의해 대장균 XL1-Blue에 형질전환시켰다. 대장균 형질전환체를 표준 조건 하에 배양하였다.
비-증폭(non-amplified) cDNA 라이브러리를 플레이트 당 약 1500개의 콜로니의 콜로니 밀도로 플레이팅하고 표준 조건 하에 밤새 인큐베이션시켰다. 건조된 니트로셀룰로오스 막을 적용하는 것에 의해 세균 플레이트의 카피를 생성하였다. 레플리카(replica)를 표준 조건 하에 인큐베이션시켰다. 멸균된 유리 막대(glass rod)를 이용하여 상기 레플리카 플레이트로부터 콜로니를 채취(pick)하여 LB 배지로 옮겼다. 배양물을 표준 조건 하에 (600 nm)에서 1의 OD(optical density)까지 인큐베이션시켰다. 그 후, 최종 농도 1 mM까지 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하고 뒤이어 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 유전자 발현이 유도된 세균 배양액 3 ml를 원심분리에 의해 수집하고, 펠렛을 250 ㎕의 SM 완충액(100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.01% 젤라틴)에 재현탁시켰다. 그 후, 세균을 0℃에서 초음파 처리에 의해 파쇄시켰다. 그 후, 조 추출물(crude extract)를 연구하였다.
이 목적을 위해, 코엘렌테라진(원형(native))을 10 μM의 최종 농도까지 첨가하고 발광측정기(luminometer)에 의해 생물발광을 측정하였다. 생물발광-양성 클론의 cDNA에 대해, 제조사의 설명서에 따라(TermoSequence Cy5 Dye Terminator Kit(GE Healthcare)) ALFexpress II 시스템을 이용하여 그 서열을 결정하였다.
놀랍게도, 이 방법을 이용하여 MLuc7으로 지칭된, 발생 단계 V의 메트리디아 론가 루시페라아제를 확인할 수 있었다.
본 발명은 서열번호 2에 의해 표시된 아미노산 서열을 갖는 분비형 MLuc7 루시페라아제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열번호 1로 표시된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 분비형 MLuc7 루시페라아제의 기능적 동등물(functional equivalent)에 관한 것이다. 기능적 동등물은 유사한 물리화학적 또는 생화학적 특성을 갖는 단백질이다.
본 발명은 또한 MLuc7 단백질의 기능성 단편 및 그와 같은 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 MLuc7 단백질의 돌연변이체 및 그와 같은 돌연변이체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 "고효율 스크리닝(high content screening)"(HCS) 기법을 위한 리포터 유전자로서 적합하다. HCS는 세포 분석을 위한 현대 현미경 기법에 대한 일반적인 용어이다. HCS 방법은 세포 또는 세포내(subcellular) 수준에서 복수 개의 파라미터를 정량적으로 기록하는 것을 특징으로 한다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 세포 시스템, 특히, 수용체, 이온 채널, 수송체(transporter), 전사 인자 또는 유도성 시스템(inducible system)을 위한 리포터 유전자로서 적합하다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 세균 및 진핵세포 시스템, 특히, 포유동물 세포, 세균, 효모, 바큘로(bakulo), 식물에서 리포터 유전자로서 적합하다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 생물발광 또는 화학발광 시스템, 특히, 루시페라아제를 갖는 시스템, 옥시게나아제를 갖는 시스템, 포스파타아제를 갖는 시스템과 조합된, 세포 시스템을 위한 리포터 유전자로서 적합하다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 생물발광 또는 화학발광 시스템, 특히, 광단백질 및 이온 표지(ion indicator)를 갖는 시스템, 특히, 애쿠오린(aequorin), 클리틴(clytin), 오벨린(obelin), 베로빈(berovin) 및 볼리노프신(bolinopsin)을 갖는 시스템과 조합된, 세포 시스템을 위한 리포터 유전자로서 적합하다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 마커 단백질, 특히, FACS(fluorescence-activated cell sorter) 분류를 위한 마커 단백질로서 적합하다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 융합단백질, 특히, 수용체, 이온 채널, 수송체, 전사 인자, 단백질 분해효소(proteinase), 키나아제, 포스포디에스테라아제, 히드롤라아제, 펩티다아제, 트랜스퍼라아제, 막 단백질, 당단백질을 위한 융합 단백질로서 적합하다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 고정화(immobilisation), 특히, 항체, 비오틴, 자성 지지체 또는 자화성(magnetisable) 지지체에 의한 고정화를 위해 적합하다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 에너지 전달 시스템, 특히, FRET(fluorescence resonance energy transfer), BRET(bioluminescence resonance energy transfer), FET(field effect transistor), FP(fluorescence polarisation), HTRF(homogeneous time-resolved fluorescece) 시스템을 위해 적합하다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 기질 또는 리간드, 특히, 프로테아제, 키나아제, 트랜스퍼라아제, 수송체, 이온 채널 및 수용체를 위한 기질 또는 리간드를 표지화하기 위해 적합하다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 세균 시스템에서의 발현을 위해, 특히, 생화학적 시스템, 특히, 단백질분해효소 및 키나아제에 대한 기질로서, 역가(titer)를 결정하기 위해 적합하다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 마커로서, 특히, 항체에 결합되거나, 효소에 결합되거나, 수용체에 결합되거나, 이온 채널 및 기타 단백질에 결합된 마커로서 적합하다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 약리학적 약물 스크리닝, 특히, HTS(high throughput screening)에서 리포터 유전자로서 적합하다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 검출 시스템, 특히, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 공초점 현미경 관찰(confocal microscopy)을 위한 검출 시스템의 성분으로서 적합하다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 상호작용, 특히, 단백질-단백질 상호작용, DNA-단백질 상호작용, DNA-RNA 상호작용, RNA-RNA 상호작용, RNA-단백질 상호작용을 분석하기 위한 마커로서 적합하다(DNA: deoxyribonucleic acid; RNA: ribonucleic acid).
분비형 MLuc7 루시페라아제는 형질전환 개체, 특히, 마우스, 랫트, 햄스터 및 기타 포유동물, 영장류, 어류, 벌레, 식물에서 발현을 위한 마커 또는 융합 단백질로서 적합하다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 배아 발생(embryonic development)을 분석하기 위한 마커 또는 융합 단백질로서 적합하다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 결합 매개체(coupling mediator), 특히, 비오틴, NHS(N-hydroxysulphosuccinimide), CN-Br을 통한 마커로서 적합하다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 핵산, 특히, DNA, RNA에 결합된 리포터로서 적합하다.
분비형 MLuc7 루시페라아제는 단백질 또는 펩티드에 결합된 리포터로서 적합하다.
결합된(coupled) MLuc7 단백질의 핵산 또는 펩티드는 프로브로서, 특히, 노던 블롯, 서던 블롯, 웨스턴 블롯, ELISA, 핵산 서열결정 반응, 단백질 분석, 칩 분석을 위한 프로브로서 적합하다.
MLuc7 단백질은 약리학적 제제(pharmacological formulation), 특히, 감염체(infectious agent), 항체, 소형 분자의 표지(lable)로서 적합하다.
MLuc7 단백질은 지질학적 연구, 특히, 바다, 지하수 및 강 흐름의 연구를 위해 적합하다.
MLuc7 단백질은 발현 시스템, 특히, 인 비트로 번역 시스템(in vitro translation system), 세균 시스템, 효모 시스템, 바큘로 시스템, 바이러스 시스템, 진핵세포 시스템에서의 발현을 위해 적합하다.
본 발명은 또한 MLuc7 단백질을 특히, 야생형 단백질, 융합 단백질, 돌연변이된 단백질로 정제하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 또한 미용 분야, 특히, 욕조 첨가제(bath additive), 로션, 비누, 바디 페인트(body paint), 치약, 바디 파우더(body powder) 분야에서의 MLuc7의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 염색, 특히, 식품, 욕조 첨가제, 잉크, 섬유, 플라스틱의 염색을 위한 MLuc7의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 종이, 특히, 인사용 카드(greetings card), 종이 제품, 벽지, 수공예품의 염색을 위한 MLuc7의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 액체, 특히, 물총(water pistol), 분수(fountain), 음료, 얼음의 염색을 위한 MLuc7의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 장난감, 특히, 핑거페인트(fingerpaint), 메이크-업, 물총의 제조를 위한 MLuc7의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 벡터를 갖는 개체에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현하는 개체에 관한 것이다.
본 발명은 MLuc7의 기능적 동등물을 발현하는 개체에 관한 것이다.
본 발명은 세균, 진핵 세포, 또는 인-비트로 발현 시스템에서 본 발명에 따른 형광 폴리펩티드를 발현하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드를 정제/분리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 형광 단백질에 대한 항체에 의해 면역학적으로 인식되는 5개보다 많은 수의 연속된 아미노산을 갖는 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 형광 단백질의, 특히 약리학적 약물 스크리닝 및 진단을 위한 마커 유전자 및 리포터 유전자로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 서열번호 2에 의해 표시된 아미노산 서열을 갖는 분비형 MLuc7 루시페라아제 및 서열번호 1에 의해 표시된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, MLuc7 단백질은 그의 서열이 서열번호 2로 표시된 서열 및 그의 기능성 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 서열번호 1로 표시된 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 및 그의 기능성 단편에 관한 것이다.
전술된 단락에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 재조합 RNA 또는 DNA 벡터는 본 발명의 일부이다.
세균, 진핵 세포, 또는 인-비트로 번역 시스템에서 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현하는 방법은 본 발명의 일부이다.
본 발명에 따른 핵산의, 하나 이상의 다른 마커 또는 리포터 유전자와 조합된, 마커 또는 리포터 유전자로서의 용도도 본 발명의 일부이다.
본 발명에 따른 단백질의, 하나 이상의 다른 마커 또는 리포터 유전자 단백질과 조합된, 마커 또는 리포터 유전자로서의 용도도 본 발명의 일부이다.
분비형 루시페라아제의 돌연변이체 및 유도체
도 3은 루시페라아제 MLuc7, 메트리디아 루시페라아제(Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 및 Lu52) 및 가우시아 루시페라아제의 정렬(alignment)을 도시한다. MLuc7 루시페라아제는 분석된 다른 루시페라아제보다 현저하게 더 짧은 폴리펩티드이다. 루시페라아데, Lu22 및 가우시아 루시페라아제도 마찬가지로 현저하게 더 짧은 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명은 발광 반응에서 변화된 반응속도 특성을 갖는, 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 발광 반응에서 변화된 반응속도 특성을 갖는, 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제의 23번 아미노산 내지 78번 아미노산 영역에서의 변형 또는 결실인 돌연변이체 또는 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 발광 반응에서 변화된 생화학적 또는 물리화학적 특성을 갖는, 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제의 23번 아미노산 내지 78번 아미노산 영역에서의 변형 또는 결실인 돌연변이체 또는 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 발광 반응에서 변화된 반응속도 특성을 갖는, 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제의 13번 아미노산 내지 88번 아미노산 영역에서의 변형 또는 결실인 돌연변이체 또는 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 발광 반응에서 변화된 생화학적 또는 물리화학적 특성을 갖는, 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제의 13번 아미노산 내지 88번 아미노산 영역에서의 변형 또는 결실인 돌연변이체 또는 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 발광 반응에서 변화된 반응속도 특성을 갖는, 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제의 33번 아미노산 내지 68번 아미노산 영역에서의 변형 또는 결실인 돌연변이체 또는 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 발광 반응에서 변화된 생화학적 또는 물리화학적 특성을 갖는, 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제의 33번 아미노산 내지 68번 아미노산 영역에서의 변형 또는 결실인 돌연변이체 또는 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 특히 하기에 관한 것이다:
1. 하기로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 분자:
a) 서열번호 2에 의해 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;
b) 서열번호 1로 표시된 서열을 포함하는 핵산 분자;
c) 상보적 가닥이 엄격한(stringent) 조건 하에서 상기 a) 또는 b)의 핵산 분자와 혼성화되고 루시페라아제를 코딩하는 핵산 분자로서, 핵산 분자의 엄격한 혼성화는 예를 들면, 0.2 x SSC(1 x 표준-염수-시트레이트(standard saline-citrate) = 150 mM NaCl, 15 mM 트리소디움 시트레이트)를 포함하는 수용액에서 68℃에서 수행될 수 있는 것(Sambrook et al., 1989)인 핵산 분자;
d) 유전적 코드의 축퇴성 때문에 상기 c)의 핵산 분자와 상이한 핵산 분자:
e) 서열번호 1과 70, 75, 80, 85, 95%, 98%, 99% 이상 동일한 서열을 가지며 루시페라아제를 코딩하는 핵산 분자;
f) 서열번호 1과 65% 이상 동일한 서열을 가지며 루시페라아제를 코딩하는 핵산 분자; 및
g) 기능성 루시페라아제(functional luciferase)를 코딩하는, 상기 a) 내지 f)에 따른 핵산 분자의 단편.
2. 상기 1에 있어서, 상기 광단백질(photoprotein)-코딩 서열의 5'에 기능성 프로모터(functional promoter 5')를 포함하는 것인 핵산 분자.
3, 상기 2의 핵산을 포함하는 재조합 DNA 또는 RNA 벡터.
4. 상기 3에 따른 벡터를 포함하는, 개체.
5. 상기 1에 따른 핵산 분자의 부분서열(subsequence)과 동일하거나 또는 상기 부분서열에 상보적인 10개보다 많은 수의 연속된 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드.
6. 상기 1의 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드.
7. 세균, 진핵 세포, 또는 인-비트로 발현 시스템에서 상기 6에 따른 루시페라아제 폴리펩티드를 발현시키는 방법.
8. 상기 6에 따른 루시페라아제 폴리펩티드를 정제/분리하는 방법.
9. MLuc7 루시페라아제에 대한 항체에 의해 면역학적으로 인식되는 5개보다 많은 수의 연속된 아미노산을 갖는 펩티드.
10. 상기 1 내지 3에 따른 루시페라아제-코딩 핵산의 마커 유전자 또는 리포터 유전자로서의 용도.
11. 상기 6에 따른 루시페라아제의 마커 또는 리포터로서의 용도.
12. 상기 6에 따른 루시페라아제를 특이적으로 인식하는 항체.
13. 상기 10 또는 11에 있어서, 상기 MLuc7 루시페라아제 외에, 하나 이상의 추가적인 리포터 유전자가 이용되는 것인 용도.
14. 상기 13에 있어서, 상기 추가적인 리포터 유전자(들)는 분비형 루시페라아제 및/또는 세포내 루시페라아제(cellular luciferase)인 것인 용도.
15. 상기 14에 있어서, 상기 추가적인 리포터 유전자(들)는 분비형 루시페라아제인 것인 용도.
16. 상기 14에 있어서, 상기 추가적인 리포터 유전자는 반딧불이 루시페라아제 또는 개체 메트리디아 론가(Metridia longa)로부터 유래된 루시페라아제인 것인 용도.
17. 상기 15에 있어서, 상기 추가적인 분비형 루시페라아제는 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 및 Lu52로 구성된 군으로부터 선택된 루시페라아제인 것인 용도.
18. 상기 10, 11 또는 13에 있어서, 발광 측정값은 반응 속도에 의해(kinetically) 평가되는 것인 방법.
19. 상기 10, 11, 13 또는 18에 있어서, 복수 개의 표적 단백질이 측정되는 것인 방법.
20. 발광 반응의 변화된 반응속도(kinetic) 특성을 갖는, 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아(Gaussia) 루시페라아제로 구성된 군으로부터 선택된 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체.
21. 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제로 구성된 군으로부터 선택된 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체로서, 상기 돌연변이체 또는 유도체는 23번 내지 78번 아미노산의 영역에서 변형 또는 결실을 가지며 발광 반응의 변화된 반응속도 특성을 갖는 것인 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체.
22. 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제로 구성된 군으로부터 선택된 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체로서, 상기 돌연변이체 또는 유도체는 23번 내지 78번 아미노산의 영역에서 변형 또는 결실을 가지며 발광 반응의 변화된 생화학적 또는 물리화학적 특성을 갖는 것인 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체.
23. 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제로 구성된 군으로부터 선택된 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체로서, 상기 돌연변이체 또는 유도체는 13번 내지 88번 아미노산의 영역에서 변형 또는 결실을 가지며 발광 반응의 변화된 반응속도 특성을 갖는 것인 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체.
24. 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제로 구성된 군으로부터 선택된 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체로서, 상기 돌연변이체 또는 유도체는 13번 내지 88번 아미노산의 영역에서 변형 또는 결실을 가지며 발광 반응의 변화된 생화학적 또는 물리화학적 특성을 갖는 것인 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체.
25. 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제로 구성된 군으로부터 선택된 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체로서, 상기 돌연변이체 또는 유도체는 13번 내지 68번 아미노산의 영역에서 변형 또는 결실을 가지며 발광 반응의 변화된 반응속도 특성을 갖는 것인 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체.
26. 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제로 구성된 군으로부터 선택된 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체로서, 상기 돌연변이체 또는 유도체는 13번 내지 68번 아미노산의 영역에서 변형 또는 결실을 가지며 발광 반응의 변화된 생화학적 또는 물리화학적 특성을 갖는 것인 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열
서열번호 1(MLuc7 - 뉴클레오티드 서열-코딩)
Figure 112009047890540-PCT00009
이는 하기의 아미노산 서열을 가져온다:
서열번호 2(MLuc7 - 아미노산 서열)
Figure 112009047890540-PCT00010
서열번호 3(Lu164-뉴클레오티드 서열- 코딩)
Figure 112009047890540-PCT00011
Figure 112009047890540-PCT00012
이는 하기의 아미노산 서열을 가져온다:
서열번호 4(Lu164 - 아미노산 서열)
Figure 112009047890540-PCT00013
서열번호 5(MLuc7 - 뉴클레오티드 서열 -클로닝된 서열)
Figure 112009047890540-PCT00014
도 1
도 1은 pcDNA3-MLuc7 구조물(construct)의 벡터 맵을 도시한다.
도 2
도 2는 pASM-MLuc7 구조물의 벡터 맵을 도시한다.
도 3
도 3은 아미노산 수준에서 다양한 분비형 루시페라아제의 정렬을 도시한다.
도 4
도 4는 Lu164, Lu22 및 MLuc7 루시페라아제의 기질 특이성을 도시한다. X 축: 코엘렌테라진, Y 축: RLU(Relative Light Unit). 활성은 각 경우에 CHO의 일시 적 형질감염으로부터 유래된 분비형 루시페라아제의 동일한 양을 이용하여 결정되었다. 코엘렌테라진은 동시에 첨가되고 뒤이어 측정이 개시되었다.
도 5
도 5는 MLuc7 루시페라아제의 온도 의존성을 도시한다. X 축: 온도(℃), Y 축: RLU(Relative Light Unit). 활성은 각 경우에 CHO의 일시적 형질감염으로부터 유래된 분비형 루시페라아제의 동일한 양을 이용하여 결정되었다. 표시된 온도는 반응 온도에 해당한다. 60초의 생물발광 측정값의 적분값이 도시된다.
도 6
도 6은 MLuc7 루시페라아제의 반응 완충액 중 염화칼륨 농도에 대한 의존성을 도시한다. X 축: KCl 농도(mM), Y 축: RLU(Relative Light Unit). 활성은 각 경우에 CHO의 일시적 형질감염으로부터 유래된 분비형 루시페라아제의 동일한 양을 이용하여 결정되었다. 표시된 농도는 반응 완충액 중 염화칼륨 농도에 해당한다. 60초의 생물발광 측정값의 적분값이 도시된다.
도 7
도 7은 일정한 양의 MLuc7과 상이한 코엘렌테라진 농도에 의한 MLuc7의 생물발광 측정값을 도시한다. X 축: 코엘렌테라진(μM), Y 축: RLU(Relative Light Unit).
도 8
도 8은 3개의 상이한 코엘렌테라진에 의한 MLuc7 생물발광의 반응속도(kinetics)를 도시한다. X 축: 시간(초), Y 축: RLU(Relative Light Unit). 흑 색: 원형의 코엘렌테라진, 연회색: 코엘렌테라진 f, 진회색: 코엘렌테라진 i.
도 9
도 9는 3개의 상이한 코엘렌테라진에 의한 Lu164 생물발광의 반응속도를 도시한다. X 축: 시간(초), Y 축: RLU(Relative Light Unit). 흑색: 원형의 코엘렌테라진, 연회색: 코엘렌테라진 f, 진회색: 코엘렌테라진 i.
도 10
도 10은 1.5초의 통합(integration) 시간에 의한 300초의 측정 동안 MLuc7(흑색) 및 Lu164(회색)의 생물발광 측정의 결과이다. X 축: 시간(초), Y 축: RLU(Relative Light Unit).
도 11
도 11은 일정한 기질 농도 및 세포 상층액의 희석에 따른 감소되는(decreasing) MLuc7 농도에서 MLuc7의 생물발광 측정의 결과를 도시한다. X 축: 시간(초), Y 축: RLU(Relative Light Unit). 박스(box): 희석 인자(dilution factor)의 표시 및 할당(희석되지 않은 상층액으로부터 개시됨).
도 12
도 12는 일정한 기질 농도 및 세포 상층액의 희석에 따른 감소되는 Lu164 농도에서 Lu164의 생물발광 측정의 결과를 도시한다. X 축: 시간(초), Y 축: RLU(Relative Light Unit). 박스: 희석 인자의 표시 및 할당(희석되지 않은 상층액으로부터 개시됨)
도 13
도 13은 각각 10초의 통합 시간의 세그먼트에서 MLuc7 및 Lu164 생물발광 측정값의 반응속도 측정의 결과를 도시한다. X 축: 시간(초), Y 축: RLU(Relative Light Unit).
도 14
도 14는 300초의 통합 시간 하에 MLuc7 및 Lu164 생물발광 측정값의 반응속도 측정의 결과를 도시한다. X 축: 시간(초), Y 축: RLU(Relative Light Unit).
도 15
도 15는 각각 60초의 통합 시간의 세그먼트에서 MLuc7 및 Lu164 생물발광 측정값의 반응속도 측정의 결과를 도시한다. X 축: 시간(초), Y 축: RLU(Relative Light Unit).
도 16
도 16은 발생 상태(developmental state)의 함수로서 메트리디아 론가 종의 개체에 의해 선호된 수심을 도시한다. X 축: 수심(m); Y 축: 발생 상태; 흑색 막대: 25-65 m, 회색 막대: 10-25 m, 백색 막대: 0-10 m. 수치는 국립 해양 데이터 센터(National Oceanographic Data Center)(USA)에 의한 정보에 따른다.
실시예 1
구조물의 제조 및 이용
하기에 기재된 구조물을 제조하기 위해 사용된 벡터는 구성적 발현(constitutive expression)을 위한 pcDNA3.1(+) 플라스미드(Clontech)였다. 세포 내 cAMP 농도의 변화를 검출하기 위해, MLuc7 cDNA를 pASM 벡터에 클로닝하였다. 상기 pASM 벡터는 cAMP 농도의 함수로 프로모터 활성을 조절하는 cAMP-반응성 요소(CRE)를 포함한다. 상기 벡터의 유도체는 pASM-MLuc7으로 지칭된다. 분자-생물학적 표준 방법을 이용하여 클로닝 반응을 수행하였다. 진핵세포 시스템에서 MLuc7을 발현하기 위해 pcDNA3-MLuc7 및 pASM-MLuc7 벡터를 사용하였다.
도 1은 pcDNA3-MLuc7 벡터의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 2는 pASM-MLuc7 벡터의 플라스미드 맵을 도시한다.
실시예 2
진핵세포 발현(eukaryotic expression)
임시 실험(transient experiment)에서 CHO 세포를 발현 플라스미드 pcDNA3-MLuc7, pcDNA3-Lu164 및 pcDNA3(cDNA 삽입 불포함)에 의해 형질감염시키는 것에 의해 구성적 진핵세포 발현을 CHO 세포에서 수행하였다. 이 목적을 위해, DMEM-F12 배지 중 웰 당 10 000개의 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 제조사의 설명서에 따라, Fugene 6 키트(Roche)를 이용하여 형질감염을 수행하였다. 형질감염된 세포들을 DMEM-F12 배지에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 생물발광은 기질의 첨가 후에, 이미징 시스템을 이용하여 측정하였다. 하기의 조성을 갖는 완충액 A(pH 7.4)에서 희석된 상층액을 측정하였다: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM Hepes, 1 mM MgCl2 x 6 H2O 및 5 mM NaHCO3.
형질감염된 세포를 2 mg/ml 게네티신(geneticin)에 의해 선택하고 각각 클론과 상층액의 생물발광 활성을 결정하는 것에 의해 안정한 세포주를 제조하였다.
실시예 3
서열 비교
분비형 루시페라아제의 서열을 비교하고 도시할 수 있도록 하기 위해 아미노산 서열 정렬을 수행하였다. 도 3은 아미노산 수준에서 분비형 루시페라아제의 정렬을 도시한다. 사이프리디나 루시페라아제는 다른 루시페라아제와의 서열 동일성이 너무 낮기 때문에, 상기 정렬에 포함시키지 않았다.
문헌/특허
Figure 112009047890540-PCT00015
Figure 112009047890540-PCT00016
SEQUENCE LISTING <110> Bayer Healthcare AG <120> secreted luciferase Mluc 7 and use thereof <130> 1199PCT <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 507 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Metridia longa <400> 1 atggatatca aatttatttt tgctcttgtt tgcattgcat tggtccaggc caaccctact 60 gtaaacaatg atgttaaccg tggtaaaatg cctgggaaaa aattgccact ggaagtactt 120 atagaaatgg aagccaatgc ttttaaagct ggctgcacca ggggatgtct catttgtctt 180 tcaaaaatca agtgcacagc caaaatgaag cagtacattc caggaagatg tcatgattat 240 ggaggagaca agaaaactgg acaggctgga atagtgggtg ctattgttga cattcctgaa 300 atctctggat ttaaggagat ggaaccaatg gagcagttca ttgctcaagt tgatctctgc 360 gccgactgca ctactggctg cctcaaaggt cttgccaatg tcaagtgttc tgaactcctc 420 aagaaatggc tgccagacag atgtgcaagt tttgctgaca aaattcaaaa agaagcgcac 480 aacatcaagg gtcttgctgg agatcgt 507 <210> 2 <211> 169 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Metridia longa <400> 2 Met Asp Ile Lys Phe Ile Phe Ala Leu Val Cys Ile Ala Leu Val Gln 1 5 10 15 Ala Asn Pro Thr Val Asn Asn Asp Val Asn Arg Gly Lys Met Pro Gly 20 25 30 Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Ile Glu Met Glu Ala Asn Ala Phe 35 40 45 Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser Lys Ile Lys 50 55 60 Cys Thr Ala Lys Met Lys Gln Tyr Ile Pro Gly Arg Cys His Asp Tyr 65 70 75 80 Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gln Ala Gly Ile Val Gly Ala Ile Val 85 90 95 Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly Phe Lys Glu Met Glu Pro Met Glu Gln 100 105 110 Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Ala Asp Cys Thr Thr Gly Cys Leu 115 120 125 Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Glu Leu Leu Lys Lys Trp Leu 130 135 140 Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe Ala Asp Lys Ile Gln Lys Glu Ala His 145 150 155 160 Asn Ile Lys Gly Leu Ala Gly Asp Arg 165 <210> 3 <211> 660 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Metridia longa <400> 3 atggatataa aggttgtctt tactcttgtt ttctcagcat tggttcaggc aaaatcaact 60 gaattcgatc ctaacattga cattgttggt ttagaaggaa aatttggtat aacaaacctt 120 gagacggatt tattcacaat atgggagaca atggaggtca tgatcaaagc agatattgca 180 gatactgata gagccagcaa ctttgttgca actgaaaccg atgctaaccg tggaaaaatg 240 cctggcaaaa aactgccact ggcagttatc atggaaatgg aagccaatgc tttcaaagct 300 ggctgcacca ggggatgcct tatctgtctt tcaaaaataa agtgtacagc caaaatgaag 360 gtgtacattc caggaagatg tcatgattat ggtggtgaca agaaaactgg acaggcagga 420 atagttggtg caattgttga cattcccgaa atctctggat ttaaggagat ggcacccatg 480 gaacagttca ttgctcaagt tgaacgttgc gcttcctgca ctactggatg tctcaaaggt 540 cttgccaatg ttaagtgctc tgaactcctg aagaaatggc tgcctgacag atgtgcaagt 600 tttgctgaca agattcaaaa agaagttcac aatatcaaag gcatggctgg agatcgttga 660 <210> 4 <211> 219 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Metridia longa <400> 4 Met Asp Ile Lys Val Val Phe Thr Leu Val Phe Ser Ala Leu Val Gln 1 5 10 15 Ala Lys Ser Thr Glu Phe Asp Pro Asn Ile Asp Ile Val Gly Leu Glu 20 25 30 Gly Lys Phe Gly Ile Thr Asn Leu Glu Thr Asp Leu Phe Thr Ile Trp 35 40 45 Glu Thr Met Glu Val Met Ile Lys Ala Asp Ile Ala Asp Thr Asp Arg 50 55 60 Ala Ser Asn Phe Val Ala Thr Glu Thr Asp Ala Asn Arg Gly Lys Met 65 70 75 80 Pro Gly Lys Lys Leu Pro Leu Ala Val Ile Met Glu Met Glu Ala Asn 85 90 95 Ala Phe Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser Lys 100 105 110 Ile Lys Cys Thr Ala Lys Met Lys Val Tyr Ile Pro Gly Arg Cys His 115 120 125 Asp Tyr Gly Gly Asp Lys Lys Thr Gly Gln Ala Gly Ile Val Gly Ala 130 135 140 Ile Val Asp Ile Pro Glu Ile Ser Gly Phe Lys Glu Met Ala Pro Met 145 150 155 160 Glu Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Arg Cys Ala Ser Cys Thr Thr Gly 165 170 175 Cys Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Lys Cys Ser Glu Leu Leu Lys Lys 180 185 190 Trp Leu Pro Asp Arg Cys Ala Ser Phe Ala Asp Lys Ile Gln Lys Glu 195 200 205 Val His Asn Ile Lys Gly Met Ala Gly Asp Arg 210 215 <210> 5 <211> 789 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Metridia longa <400> 5 tggtacccgg gaattcggcc attatggccg gggattcagt caactggatc caaaaggaaa 60 ggtactccaa atattgcctg gaggaaaaat gatatcaaat ttatttttgc tcttgtttgc 120 attgcattgg tccaggccaa ccctactgta aacaatgatg ttaaccgtgg taaaatgcct 180 gggaaaaaat tgccactgga agtacttata gaaatggagc caatgctttt aaagctggct 240 gcaccagggg atgtctcatt tgtctttcaa aaatcaagtg cacagccaaa atgaagcagt 300 acattccagg aagatgtcat gattatggag gagacaagaa aactggacag gctggaatag 360 tgggtgctat tgttgacatt cctgaaatct ctggatttaa ggagatggaa ccaatggagc 420 agttcattgc tcaagttgtc tctgcgccga ctgcactact ggctgcctca aaggtcttgc 480 caatgtcaag tgttctgaac tcctcaagaa atggctgcca gacagatgtg caagttttgc 540 tgacaaaatt caaaaagaag cgcacaacat caagggtctt gctggagatc gttaaataaa 600 ctgagaaaac aatggataac tggatcaaga taagctaatc tcatgataaa aaatggccaa 660 tttaatttaa aaattatgaa ttgttaattt ttatgtatgg aattccttaa atatattcta 720 tgtattcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaacatg tcggccgcct cggcccagtc 780 gactctaga 789

Claims (26)

  1. 하기로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 분자:
    a) 서열번호 2에 의해 표시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자;
    b) 서열번호 1로 표시된 서열을 포함하는 핵산 분자;
    c) 상보적 가닥이 엄격한(stringent) 조건 하에서 상기 a) 또는 b)의 핵산 분자와 혼성화되고 루시페라아제를 코딩하는 핵산 분자;
    d) 유전적 코드의 축퇴성 때문에 상기 c)의 핵산 분자와 상이한 핵산 분자:
    e) 서열번호 1과 95% 이상 동일한 서열을 가지며 루시페라아제를 코딩하는 핵산 분자;
    f) 서열번호 1과 65% 이상 동일한 서열을 가지며 루시페라아제를 코딩하는 핵산 분자; 및
    g) 기능성 루시페라아제(functional luciferase)를 코딩하는, 상기 a) 내지 f)에 따른 핵산 분자의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 광단백질(photoprotein)-코딩 서열의 5'에 기능성 프로모터를 포함하는 것인 핵산 분자.
  3. 제2항의 핵산을 포함하는 재조합 DNA 또는 RNA 벡터.
  4. 제3항에 따른 벡터를 포함하는, 진핵세포 또는 원핵세포 또는 인간을 제외한 개체(non-human organism).
  5. 제1항에 따른 핵산 분자의 부분서열(subsequence)과 동일하거나 또는 상기 부분서열에 상보적인 10개보다 많은 수의 연속된 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드.
  6. 제1항의 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드.
  7. 세균, 진핵 세포, 또는 인-비트로 발현 시스템에서 제6항에 따른 루시페라아제 폴리펩티드를 발현시키는 방법.
  8. 제6항에 따른 루시페라아제 폴리펩티드를 정제/분리하는 방법.
  9. MLuc7 루시페라아제에 대한 항체에 의해 면역학적으로 인식되는 5개보다 많은 수의 연속된 아미노산을 갖는 펩티드.
  10. 제1항 내지 제3항에 따른 루시페라아제-코딩 핵산의 마커 유전자 또는 리포터 유전자로서의 용도.
  11. 제6항에 따른 루시페라아제의 마커 또는 리포터로서의 용도.
  12. 제6항에 따른 루시페라아제를 특이적으로 인식하는 항체.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 MLuc7 루시페라아제 외에, 하나 이상의 추가적인 리포터 유전자가 이용되는 것인 용도.
  14. 제13항에 있어서, 상기 추가적인 리포터 유전자는 분비형 루시페라아제 및/또는 세포내 루시페라아제(cellular luciferase)인 것인 용도.
  15. 제14항에 있어서, 상기 추가적인 리포터 유전자는 분비형 루시페라아제인 것인 용도.
  16. 제14항에 있어서, 상기 추가적인 리포터 유전자는 반딧불이 루시페라아제 또는 개체 메트리디아 론가(Metridia longa)로부터 유래된 루시페라아제인 것인 용도.
  17. 제15항에 있어서, 상기 추가적인 분비형 루시페라아제는 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16 및 Lu52로 구성된 군으로부터 선택된 루시페라아제인 것인 용도.
  18. 제10항, 제11항 또는 제13항에 있어서, 발광 측정값은 반응 속도에 의해(kinetically) 평가되는 것인 방법.
  19. 제10항, 제11항, 제13항 또는 제18항에 있어서, 복수 개의 표적 단백질이 측정되는 것인 방법.
  20. 발광 반응의 변화된 반응속도(kinetic) 특성을 갖는, 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아(Gaussia) 루시페라아제로 구성된 군으로부터 선택된 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체.
  21. 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제로 구성된 군으로부터 선택된 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체로서, 상기 돌연변이체 또는 유도체는 23번 내지 78번 아미노산의 영역에서 변형 또는 결실을 가지며 발광 반응의 변화된 반응속도 특성을 갖는 것인 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체.
  22. 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제로 구성된 군으로부터 선택된 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체로서, 상기 돌연변이체 또는 유도체는 23번 내지 78번 아미노산의 영역에서 변형 또 는 결실을 가지며 발광 반응의 변화된 생화학적 또는 물리화학적 특성을 갖는 것인 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체.
  23. 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제로 구성된 군으로부터 선택된 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체로서, 상기 돌연변이체 또는 유도체는 13번 내지 88번 아미노산의 영역에서 변형 또는 결실을 가지며 발광 반응의 변화된 반응속도 특성을 갖는 것인 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체.
  24. 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제로 구성된 군으로부터 선택된 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체로서, 상기 돌연변이체 또는 유도체는 13번 내지 88번 아미노산의 영역에서 변형 또는 결실을 가지며 발광 반응의 변화된 생화학적 또는 물리화학적 특성을 갖는 것인 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체.
  25. 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제로 구성된 군으로부터 선택된 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체로서, 상기 돌연변이체 또는 유도체는 13번 내지 68번 아미노산의 영역에서 변형 또는 결실을 가지며 발광 반응의 변화된 반응속도 특성을 갖는 것인 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체.
  26. 루시페라아제 Lu164, Lu22, LuAL, Lu39, Lu45, Lu16, Lu52 및 가우시아 루시페라아제로 구성된 군으로부터 선택된 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체로서, 상기 돌연변이체 또는 유도체는 13번 내지 68번 아미노산의 영역에서 변형 또는 결실을 가지며 발광 반응의 변화된 생화학적 또는 물리화학적 특성을 갖는 것인 루시페라아제의 돌연변이체 또는 유도체.
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