KR101104817B1 - 융합 파트너로 이용해 리포터로 사용이 가능한 에스테라아제(ｅｓｔｌ120ｐ)와 이를 인디케이터로 이용한 클로닝 벡터의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 에스테라아제(ESTL120P) 유전자 내에 다중 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS)가 도입되어 있는 재조합 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 인디케이터(indicator)로서 사용하여 외래 유전자를 포함하는 클론을 선별하는 단계를 포함하는 재조합 유전자 클로닝 벡터의 제조방법은 기존의 인디케이터(indicator)들 보다 저가의 기질을 이용하며 짧은 배양시간을 통해 빠르고 정확하게 재조합 균체의 선별이 가능하며, PCR 증폭 산물을 직접 클로닝할 수 있는 TA 클로닝 벡터와의 접목을 통해 상업적으로 판매되는 기존의 클로닝 벡터내의 인디케이터(indicator)들을 대체 할 수 있을 것으로 기대된다.

인디케이터, 에스테라아제, 다중 클로닝, 폴리뉴클레오티드

Description

융합 파트너로 이용해 리포터로 사용이 가능한 에스테라아제(ＥＳＴＬ120Ｐ)와 이를 인디케이터로 이용한 클로닝 벡터의 제조방법{The use of esterase ESTL120P for reporter as a fusion partner, and its use for indicator in cloning vector system}

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 에스테라아제(ESTL120P) 유전자에 관한 것으로, 구체적으로 상기 에스테라아제 유전자 내에 다중 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS)가 도입되어 있는 재조합 폴리뉴클레오티드를 인디케이터(indicator)로서 사용해 외래 유전자를 포함하는 클론을 선별하는 단계를 포함하는 재조합 유전자의 제조방법에 관한 것이다.

생명과학과 공학 전 분야에서 분석, 정제 혹은 선별을 위해 다양한 융합 파트너(fusion partner) 즉, 리포터(reporter) 또는 친화성 택(affinity tag) 및 인디케이터(indicator)가 사용되고 있다. 이들 융합 파트너(fusion partner) 및 인디케이터(indicator)들은 잡종화 과정(hybridization)을 통해 단백질, DNA 및 RNA의 탐침, 발현양의 측정, 환경 혹은 시료 내의 특정물질의 정량분석은 물론 항체와 접합된 형태로 제작하여 신약타켓 발굴, 단백질간의 상호작용 여부 판별 및 발굴, 재 조합균체의 선별 등과 같은 목적에 사용된다. 뿐만 아니라 목적하는 단백질의 N-혹은 C-말단에 융합하여 정제를 용이하게 할 목적으로 이용되기도 한다.

분석용도로 사용하는 리포터(reporter)는 높은 선택성과 반응민감도를 지닌 동위원소 표지물이 광범위하게 이용되었고 현재에도 활용되어지고 있다. 그러나 이들의 지닌 잠재적인 독성과 고비용, 표지된 물질의 분리와 탐침에 비교적 긴 시간이 필요하다는 단점들로 인해 점차 사용범위가 줄어들고 있는 추세이다. 최근에는 기질의 특정 공유결합이 깨져 나타나는 산물의 발색(chromogenic) 혹은 형광(fluorogenic) 특성을 이용한 리포팅(reporting) 기술이 주로 이용되고 있다. 형광능은 특정파장의 빛 혹은 에너지를 흡수하여 불안정한 높은 에너지 상태로 전환된 후 다시 낮은 에너지 상태로 안정화될 때 빛이 발생하는 것을 말하며, 이렇게 흡수된 에너지가 화학반응을 동반한 후 빛을 내는 경우를 루미네선스(luminescence)라 한다. 위와 같은 성질을 갖는 반응물의 생성을 위한 기질의 분해에는 크게 산화 환원 등의 전형적인 화학반응과 생촉매인 효소를 이용하는 방법이 있으며, 생물공학 분야 전반에서는 주로 효소 반응이 이용되고 있다.

이렇게 빛 혹은 발색을 이용하는 루미네선스(luminescence) 성질을 이용하는 리포팅(reporting) 기술은 크게 생물로부터 유래한 효소의 고유 기질을 사용하는 생물발광(bioluminescence)와 인위적인 기질을 이용하는 화학발광(chemiluminescence)로 구분되며, 이외에 발색이 특정 기질의 분해, 즉 화학반응을 동반하지 않고 단백질 자체가 발광하는 형광단백질이 존재한다. 전자의 루미네선스(luminescence) 중 화학발광(chemiluminescence)로는 알칼리 포스파타아 제(alkaline phosphatase), 양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 크산틴옥시다아제(xanthine oxidase) 등의 효소와 기질로서 루미놀(luminol), 루시게닌(lucigenin), 아크리디늄 에스테르(acridinium ester), 비오틴(biotin), 플루오레세인(fluorescein), 디옥시제닌(dioxigenin) 등의 화합물이 이용되고 있다. 특히 효소기반의 화학발광(chemiluminescence) 기술의 발달로 과거 ¹²⁵I 또는 ³²P 등의 동위원소를 이용해 얻을 수 있는 감도에 접근하고 있다.

그러나 상기 반응을 액상에서 측정할 때 감도가 낮고 분석을 위해 고가의 장비가 필요한 단점 및 합성된 인위적인 기질을 사용하기 때문에 생물체 내에서 이용하는데 제약이 따른다.

생물발광(Bioluminescence)은 여러 생물체에 존재하는 화합물의 일종인 루시페린(luciferin)을 기질로 루시페라아제(luciferase)에 의해 유도된 산화반응으로부터 생성된 빛을 측정하는 방법을 이용하며, 주로 살아 있는 생명체 자체가 분석의 도구가 된다. 루시페라아제(Luciferase)는 자연계에 널리 분포하고 다양한 구조를 지니고 있으나 북미반딧불이(Photinus pyralis)와 해양미생물인 비브리오 하베이(Vibrio harveyi)로부터 유래된 효소가 주로 이용된다. 루시페라아제(Luciferase)의 반응은 매우 효율적이고 민감해 0.03 내지 0.10 pg 의 효소에 의해 생성된 빛까지 측정할 수 있다.

단백질 자체가 발광하는 형광단백질의 경우 해파리(jellyfish)인 Aequorea victoria 로부터 유래한 녹색형광단백질(GFP), Discocosoma genus로부터 유래한 DsRed(Discosoma red fluorescent protein)단백질, 이외에 이들을 방향적 분자 진화법(directed moleuclar evolution) 등의 단백질 공학 기술을 이용하여 변형한 형광단백질이 있다. 이들은 특별한 조효소나 기질 없이 빛을 내는 장점이 있어 다양한 분야에서 활용되어 지고 있다.

위에 언급된 베타-갈락토시다아제, 루시페라아제(Luciferase), 녹색형광단백질(GFP), DsRed(Discosoma red fluorescent protein)와 같은 단백질 기반의 리포터(reporter)는 생체 밖(in vitro) 조건에서 뿐만 아니라 생체 안(in vivo)에서도 널리 사용되고 있다. 이들은 단백질의 발현, 세포내 이동 및 존재위치를 확인하는데 주로 사용되고 있으며 재조합균체의 선별을 위한 클로닝벡터의 인디케이터(indicator)로 사용되기도 한다.

전술한 리포터(reporter)와는 달리 분리정제의 목적으로 사용하는 친화성 택(affinity tag)은 목적하는 단백질의 N- 혹은 C-말단에 융합하여, 단백질을 세포내 지정된 위치로 이동시키거나 용해도를 높여, 단백질 가수분해 효소들에 대한 친화도를 감소시킴으로써 세포내에서 목적 단백질의 안정성을 높이는 역할을 하기도 한다. 궁극적으로 특정 화합물에 결합하는 능력을 이용하여 목적하는 단백질의 정제를 용이하게 하며 6x His(hexahistidine), FLAG, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione-S-transferase, GST), 말토스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP), 단백질 A(Protein A), 어피바디(Affibody) 등이 사용된다.

언급된 다수의 리포터(reporter)와 융합단백질(fusion protein)이 공존하는이유는 실험환경 및 목적단백질과의 호환성, 리포터와 융합단백질이 갖는 고유의 특성들로 인해 한 종류만으로 분석, 정제 및 선별 등의 모든 목적에 적용할 수 없기 때문이다. 이러한 이유로 현재에도 새로운 융합 파트너(fusion partner) 혹은 리포터(reporter)의 개발 및 개량을 위한 연구가 계속 되고 있다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 에스테라아제(ESTL120P) 유전자 내에 다중 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS)가 도입되어 있는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명은 인디케이터(indicator)로서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 사용하여 외래 유전자를 포함하는 클론을 선별하는 단계를 포함하는 재조합 유전자의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 리포터(reporter) 또는 친화성 택(affinity tag)으로서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 사용하여 단백질 또는 유전자의 발현을 분석하거나 분리 정제하는 단계를 포함하는 단백질 또는 유전자의 발현 분석 또는 분리 정제 방법에 관한 것이다.

본 발명은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 에스테라아제(ESTL120P) 유전자 내에 다중 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS)가 도입되어 있는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 대상인 에스테라아제는 전형적인 카르복실에스테라아제(carboxylesterase)의 한 종류로서 선별된 에스테라아제(EST1767)는 33kDa 의 모노머(monomer)이며 대장균숙주에서 과발현되나 부분적으로 불용성 응집체를 형성하며 안정성이 낮다. 단백질공학 기술로 개량되어 특성이 향상된 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 에스테라아제(ESTL120P)는 염기서열 분석결과 120번의 루신(leucine)이 프롤린(proline)으로 치환되었으며 야생형과 같이 단량체로 높은 활성을 지니고 있으며 서열번호 1에 기재된 염기서열로 이루어지는 유전자이다.

상기 선별된 에스테라아제(ESTL120P) 유전자 내부에 다중 클로닝 위치(multi cloning site, MCS)를 삽입 후 클로닝 벡터의 인디케이터(indicator)로 사용하기 위해 에스테라아제 아미노산서열을 다양한 2차구조 예측프로그램을 접목한 조합접근(combinatorial approach)법으로 다중 클로닝 위치(multi cloning site,MCS)의 삽입 위치를 결정 분석한 후, 다양한 갭(gap)부위 중 상단과 하단 부위에 명확한 2차구조가 나타나지 않는 서열번호 2의 216번과 217번, 281과 282번, 및 306번과 307번 아미노산 사이를 다중 클로닝 위치의 삽입에 적당할 것이라 예측하였으며, 삽입 결과 이들 중 216번째 아미노산 위치에 삽입한 구조물이 가장 높고 일관된 활성을 보였다. 상기 부위에 다중 클로닝 위치(multi cloning site,MCS)를 삽입해도 활성이 유지되는 재조합 구조물(cp216M-MCS)을 얻은 후, 이를 pTrc99A 플라스미드에 삽입하여 E.coli XL1-Blue에 도입한 형질전환 세균 E.coli XL1-Blue[pTrc99A-cp216M-MCS]을 대전광역시 유성구 어은동 52번지 생명공학연구원 유전자자원센터에 소재하는 국제기탁기관인 유전자은행에 2008년 6월 20일자로 수탁하여 수탁번호 KCTC 11357BP를 부여받았다.

상기 제작된 벡터(pTrc99A-cp216M-MCS)와 기존의 인디케이터(indicator)로 GFP와 베타-갈락토시다아제를 사용하는 전형적인 클로닝시스템의 선별능을 비교하였다. 도 5를 참조한다.

또 다른 용도의 벡터 시스템으로 PCR을 통해 증폭된 유전자를 제한효소 처리나 정제과정 없이 직접 벡터에 도입할 수 있는 TA 벡터 시스템이 존재하며, 이 시스템을 본 발명에서 제작한 구조물로 구현하기 위해 cp216M-MCS 가 삽입된 다중 클로닝 위치(multi cloning site,MCS)를 TA 클로닝 과정에 이용할 수 있는 새로운 T-벡터용 서열번호 12의 염기서열로 이루어지는 다중 클로닝 위치(multi cloning site, MCS)로 치환하여 TA 클로닝 시스템을 완성하였으며, 앞서의 결과와 유사한 높은 선별도를 얻을 수 있었다.

본 발명자들은 재조합된 클로닝벡터의 인디케이터(indicator)로 에스테라아제(ESTL120P)가 적합함을 확인하였으며, 테트라머(tetramer)로 기능을 하는 DsRed와 융합시킨 경우에도 활성이 유지되는 특성 및 에스테라아제(ESTL120P)가 TFK-matrix(trifluoromethyl ketone Sepharose CL-6B)에 결합할 수 있는 능력과 높은 민감도를 고려할 때 개량된 에스테라아제(ESTL120P) 유전자를 인디케이터(indicator), 리포터(reporter) 또는 친화성 택(affinity tag)으로서 사용하여 외래 유전자를 포함하는 클론의 선별, 단백질 또는 유전자의 발현을 분석하거나 분리 정제하는 단계를 포함하는 단백질 또는 유전자의 발현 분석 또는 분리 정제 방법으로 이용 가능한 것을 확인하였다.

본 발명은 기존의 인디케이터(indicator)들 보다 저가의 기질을 이용하며 짧은 배양시간을 통해 빠르고 정확하게 재조합 균체의 선별을 가능하게 할 것이며, PCR 증폭 산물을 직접 클로닝할 수 있는 TA 클로닝 벡터와의 접목을 통해 상업적으로 판매되는 기존의 클로닝 벡터내의 인디케이터(indicator)들을 대체 할 수 있다.

또한 분석, 정제 등을 위한 융합 리포터(fusion reporter)로서의 활용은 본 발명의 구조물이 생물공학, 생명과학 분야에서 기존의 다양한 리포터들(reporter) 보다 폭 넓게 활용할 수 있다.

따라서 생명과학과 공학의 근간이 되는 재조합유전자 조작기술에 본 발명의 구조물을 적용함으로써 보다 높은 효율성을 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.

이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

[ 실시예 1] 안정성과 가용성이 증가된 돌연변이 에스테라아제의 제작

본 발명의 대상인 에스테라아제는 전형적인 카르복실에스테라아제(carboxylesterase)의 한 종류로서 다수의 미생물이 포함된 토양시료로부터 α-naphtylacetate와 Fast Blue RR을 이용한 활성측정법을 통해 발굴하였다. 선별된 에스테라아제(EST1767)는 33kDa의 모노머(monomer)이며 대장균숙주에서 과발현되나 부분적으로 불용성 응집체를 형성하며 안정성이 낮은 문제점이 발견되었다(Protein Eng. 16:357). 이를 기존에 알려진 PCR 을 이용한 전형적인 단백질공학 기법으로 에스테라아제 유전자에 무작위 돌연변이를 유발하였다. 돌연변이가 유도된 유전자를 pTrc99A 플라시미드에 삽입하고 대장균(XL1-Blue)에 형질전환한 후 항생제가 포함된 LB(Luria Broth) 고체배지(100ug/ml Ampicillin)에 도말하였다. 도말된 고체배지를 37℃에서 12 내지 14시간 동안 배양하여 돌연변이 라이브러리를 제작하였다. 뚜렷한 콜로니가 형성된 후 α-naphtylacetate와 Fast Blue RR을 이용하여 활성을 보이는 돌연변이를 선별하고, 안정성이 증가된 돌연변이의 선별확률을 높이기 위해 이들을 재조합하는 방법으로 두 번째 라이브러리를 제작하였다. 알려진 바와 같이 효소의 구조적 안정성은 열안정성 등의 물리적 안정성과 비례하여 증가한다는 점에 착안해 도말된 고체배지를 42 내지 60℃에서 2시간 동안 열처리 한 후 역가를 측정하였을 때 활성이 남아있는 돌연변이를 재선별하였다. 선별된 돌연변이 가운데 야생형과 같이 단량체로 높은 활성을 지니며 열안정성이 증가된 에스테라아제(ESTL120P)를 얻었으며, 염기서열 분석결과 120번의 루신(Leucine)이 프롤린(proline)으로 치환되었음을 확인하였다 (도1).

[ 실시예 2] 인디케이터 ( indicator ) 제작을 위한 에스테라아제 유전자 내부로의 다중 클로닝 위치( multi cloning site , MCS )삽입

먼저 선별된 에스테라아제 유전자가 인디케이터(indicator)로서 활용이 가능한지를 확인하기 위해 유전자 내부를 제한효소 KpnI으로 절단하고 메타게놈으로부터 얻은 유전자 단편을 삽입하여 삽입 불활성화(insertional inactivation) 여부를 확인하였다. 결과적으로 다양한 크기의 외래유전자의 삽입으로 에스테라아제가 불활성화되는 것이 확인되어 효과적으로 유전자의 도입여부를 확인할 수 있었다. 실험 결과를 근거로 에스테라아제 유전자 내부에 다중 클로닝 위치(multi cloning site, MCS)가 삽입된다면 클로닝벡터의 인디케이터로 사용할 수 있을 것이라 예상하였다

본 발명의 대상인 에스테라아제(ESTL120P)의 아미노산 서열을 NCBI의 BlastP에 적용하여 GenBank로부터 관련된 에스테라아제 서열정보들을 수집하였다. 수집된 아미노산서열 중 동종으로부터 유래한 파랄로그(paralogue)에 해당하는 서열을 제외한 후 웹 기반의 복합 정렬 프로그램(multiple alignment program)에 적용하였다. 이용된 프로그램은 MATFF, T-coffee, ClustalW, DCA, MUSCLE이다. 각각의 프로그램으로 정렬(alignment)한 후 나타난 결과를 JNet 이차구조예측 프로그램을 사용하여 구조적 특성을 분석하였다. 위의 과정에서 예측된 다양한 갭(gap) 부위 중 상단과 하단 부위에 명확한 2차구조가 나타나지 않는 3곳(216과 217, 281과 282, 306과 307번 아미노산 사이)을 다중 클로닝 위치(MCS) 장착에 적합한 위치로 선정하였 다.

선정된 갭(gap) 위치에 다중 클로닝 위치(multi cloning site)를 삽입하기 전에 인위적인 염기서열 혹은 아미노산 서열의 삽입에 상관없이 에스테라아제 본래의 활성이 유지되는지를 확인하고, 다중 클로닝 위치(multi cloning site)의 삽입을 용이하게 할 목적으로 Ala-Ser를 코딩하는 염기서열(GCTAGC)를 다음과 같은 합성 프라이머를 이용해 PCR로 삽입하였다: (1) 에스테라아제 증폭용 프라이머, 정방향(서열번호 3: ATAGAATTCGTGCAGATTCAGGGTCATTAC)와 역방향 프라이머(서열번호 4: ATAAAGCTTTTACAGACAACCGGCCAAT); (2) 216과 217 사이에 NheI 부위를 삽입하기 위한 프라이머, 정방향(서열번호 5: ATAGCTAGCGATGAAGCCGCACAACG-3)와 역방향 (서열번호 6: ATAGCTAGCGCCCATATTGCCTTTACTGC); (3) 281과 282 사이에 NheI 부위를 삽입하기 위한 프라이머, 정방향(서열번호 7: ATAGCTAGCAGTTTGCTGGAAAGCGACATG) 와 역방향 (서열번호 8: ATAGCTAGCACCGTCCAACAAACCGC); (4) 306과 307 사이에 NheI 부위를 삽입하기 위한 프라이머, 정방향(서열번호 9: ATAGCTAGCAGTCAATAAGGTTTTATCCGGC)와 역방향(서열번호 10: ATAGCTAGCCAGACCCGTTTTGGCC).

GCTAGC로 구성된 6염기서열은 제한효소 NheI이 인식하는 서열로, 코딩하는 아미노산의 곁사슬이 비교적 작으며, 전하를 띄지 않아 목적에 적합할 것으로 예상되었다. PCR 기법으로 예측된 위치에 두 개의 아미노산을 삽입하였을 때 도 2a의 결과를 얻었다. 그림에서와 같이 변이효소의 306번 아미노산 위치에 삽입한 경우를 제외한 나머지 위치에 2개의 아미노산이 삽입되더라도, 육안으로 쉽게 구별할 수 있는 활성이 유지되었다. 이러한 결과를 바탕으로 예측된 위치에 다중 클로닝 위 치(multi cloning site)를 삽입하여도 활성이 유지되는 구조물이 존재할 가능성을 확인하였다. 이를 근거로 다음과 같은 33개의 염기서열로 구성된 다중 클로닝 위치(multi cloning site, MCS)를 에스테라아제의 예측된 모든 위치에 삽입하였다.

합성된 다중 클로닝 위치(multi cloning site)는 내부를 절단하는 제한효소로 처리하는 경우, 생성된 말단의 형태가 점착성(sticky) 이거나 비점착성(blunt)인 NheI, PstI, BamHI 및 BalI 인식서열을 포함하고 있으며, 이차구조 예측에 의해 무작위 코일(random coil)형태로 존재할 수 있음이 확인되었다. 다중 클로닝 위치(multi cloning site)를 두 개의 아미노산이 삽입된 위치에 도입한 후 각각의 활성을 측정하였을 때 도 2b의 결과를 얻었다. 변이효소의 216번째 아미노산 위치에 삽입된 경우를 제외한 다른 재조합효소에서 두 개의 아미노산이 삽입된 경우와 비슷한 활성감소가 확인되었으며, 306과 307사이의 갭(gap)에 다중 클로닝 위치(multi cloning site)가 삽입된 경우엔 활성이 현저히 감소하였다. 다중 클로닝 위치(multi cloning site)가 장착된 에스테라아제 유전자 중 가장 높고 일관된 활성을 보여주는 216번째 아미노산 위치의 다중 클로닝 위치 삽입구조물(cp216M-MCS)을 인디케이터(indicator)로 사용할 후보로 선정하여 염기서열을 분석하였다. 분석결과 본래의 염기서열이 보존된 형태로 인위적으로 삽입한 다중 클로닝 위치(multi cloning site)가 정확한 위치에 존재하고 있음이 확인할 수 있었다(도 3).

[실시예 3] 다중 클로닝 위치(multi cloning site,MCS)가 장착된 에스테라아제의 인디케이터(indicator) 로서의 성능평가

염기서열 분석으로 다중 클로닝 위치(multi cloning site, MCS)의 정확한 삽입이 확인된 cp216M-MCS 를 EcoRI 과 HindⅢ 로 절단한 후 같은 제한효소로 절단한 pTrc99A에 도입하여 도 4의 클로닝 벡터(pTrc99A[cp216M-MCS])를 완성하였다. 현재 인디케이터(indicator)로 주로 사용되는 GFPuv를 pTrc99A로 서브클로닝한 pTGFPuv와 베타-갈락토시다아제를 인디케이터(indicator)로 지닌 pBluscriptII-SK 를 대조군으로 외래유전자의 도입에 의한 인디케이터(indicator)의 불활성화현상으로 선별능을 비교하였다. 선별능의 비교를 위해 메타게놈 유전체를 4bp cutter인 Sau3AI으로 부분 절단한 유전자 단편을 각각의 벡터에 도입한 후 37℃에서 12 내지 14시간 배양하였다. 인디케이터(Indicator)로서 녹색형광단백질(GFP)과 베타-갈락토시다아제의 선별능은 14시간 배양한 후 UV hand lamp 및 육안으로 콜로니를 관찰하였을 때 형광을 나타내지 않거나 무색을 띄는 클론을 선별한 후 18시간 후에 형광을 갖거나 파란색으로 변한 클론(false positive)의 비율을 고려하고 플라스미드를 분리해 검증하였다. 에스테라아제 cp216M-MCS 의 선별능은 12시간 배양 후 α-naphtylacetate 와 Fast Blue RR을 이용해 활성을 측정한 후, 갈색으로 변화하지 않는 콜로니를 선별하여 플라스미드를 분리하거나 콜로니 PCR을 통해 외래유전자가 삽입된 비율로 결정하였다.

각각의 클로닝벡터를 지닌 재조합균주를 12시간 배양한 시점에서 선별능을 비교하였을때 녹색형광단백질(GFP)과 베타-갈락토시다아제를 인디케이터(indicator)로 지닌 시스템에서는 외래유전자가 삽입된 클론과 그렇지 않은 클론이 명확히 구별되지 않아 신뢰도를 결정할 수 없었다. 그러나 cp216M-MCS를 인디케이터(indicator)로 사용한 것은 활성측정을 통해 명확하게 외래유전자를 지닌 클론들이 구분되었다. 14시간 이후에는 모든 클로닝 시스템에서 외래유전자의 도입여부를 식별할 수 있었으나, 18시간까지 추가 배양한 후 재확인 한 결과 도 5의 결과와 같이 cp216M-MCS 를 사용하였을 때 보다 높은 신뢰도를 보임을 확인할 수 있었다.

[실시예 4] 에스테라아제 유전자를 이용한 TA-클로닝벡터 시스템 제작

TA 클로닝 벡터의 제작을 위해 고안된 다중 클로닝 위치(multi cloning site, MCS)는 3’말단에 기존의 TA 시스템과 동일한 말단구조를 갖도록 XcmI 제한효소가 인식하는 특이서열 두 개를 삽입하였다. XcmI은 5’말단의 CCA와 3’말단의 TGG 사이에 9개의 무작위서열을 포함하여 총 15개의 염기 서열을 인식한 후 상위가닥의 8번째, 하위가닥의 7번째 인산에스테르결합을 절단한다. 절단부위 내부에 무작위 서열조합이 가능한 특성을 이용해 절단 부위에 티아민(thiamine) 및 아데닌(adenine)이 위치하도록 배열함으로써 기존의 TA 클로닝 벡터와 동일한 말단을 갖도록 할 수 있다. 따라서 절단위치에 EcoRV와 NsiI 인식서열을 삽입하여 말단이 티아민(thiamine)이 되도록 하였으며, 절단효율을 높이기 위해 두 개의 XcmI 인식서열 사이에 ApaI 인식서열을 삽입하였다.

제작된 T-벡터용 다중 클로닝 위치(MCS)를 먼저 NheI 부위가 삽입된 3개의 구조물에 삽입한 후 활성이 유지되는 것을 선별하였을 때, 전술한 실시예의 결과처럼 216번과 217번 아미노산 잔기 사이에 삽입된 구조물이 가장 높은 활성을 보였다. 이때 앞서 사용한 pTrc99A 플라스미드에 XcmI 인식서열이 존재해 T-벡터 시스템을 구축하는 목적에는 적합지 않아 XcmI 인식서열이 없는 pQE30 플라스미드를 기본벡터로 이용하였다. 제작된 구조물을 pQE30으로 옮기기 위해 BamHI과 HindIII 인식서열을 갖는 에스테라아제증폭용 프라이머, 정방향(5'-ATAGGATCCGTGCAGATTCAGG GTCATTAC-3') 와 역방향 프라이머(5'-ATAAAGCTTTTACAGACAACCGGCCAAT-3')로 PCR을 수행한 후 서브 클로닝해 pQE-cp216-TM을 얻었다. 제작된 플라스미드를 XcmI으로 절단하여 PCR로 증폭된 유전자를 클로닝하였을 때 외래 유전자의 삽입이 용이하며 활성이 사라짐을 확인 할 수 있었다(도 6).

[ 실시예 5] 리포터( reporter ) 및 친화성 태그( affinity tag )로서 에스터레이즈 유전자 활용

개량된 에스테라아제의 민감성과 높은 활성은 인디케이터(indicator) 기능뿐만 아니라 리포터(reporter) 및 친화성 태그(affinity tag)의 융합 파트너(fusion partner)로서 사용 가능할 것이라 예상하고, 이를 확인하기 위해 테트라 머(tetramer)로 활성을 갖는 DsRed를 링크(linker) 없이 직접 융합해 보았다. DsRed 와 에스테라아제 유전자는 양 말단에 BamHI 인식서열을 갖는 프라이머를 사용하여 증폭한 후 전형적인 유전자조작 과정을 통해 이종 단백질을 융합하였다. 융합을 위한 에스테라아제 프라이머, 정방향 (서열번호 13: TAGGATCCGTGCAGATTCAGGGTCATTA CG)과 역방향(서열번호 14: TAGGATCCCAGACAACCGGCCAATATTCC) 및 융합을 위한 DsRed 증폭용 프라이머, 정방향(서열 번호 15: TCGGATCCACAGCCTCCTCCGAGAACGTC)과 역방향(서열번호 16: TAGGATCCACACAGGAACAGGTGGTGGCG).

제작된 재조합유전자를 제한효소로 절단해 본 결과 DsRed C-말단부위에 에스테라아제가 융합되었음이 확인되었다. 도 7에서 볼 수 있듯이 두 개의 단백질이 융합되었음에도 비변성 PAGE에서 에스테라아제의 활성과 DsRed의 고유활성이 보존되어 있음을 확인할 수 있었다. 융합단백질 제작에 있어 일반적인 단위체(monomer)와 단위체(monomer)의 융합은 물론, 테트라메릭(tetrameric) 단백질과의 융합에도 에스테라아제의 활성이 유지되는 결과는 개량된 에스테라아제가 특정 단백질의 분석 및 정제를 위한 리포터(reporter) 및 친화성 태그(affinity tag)로서 사용 가능함을 보여주고 있다.

도 1은 단백질공학 기법으로 개량한 돌연변이 에스터레이즈 ESTL120P의 (a)염기(서열번호 1)와 (b)아미노산(서열번호 2) 서열을 나타낸 것이다.

도 2는 선별된 에스터레이즈에 두 개의 아미노산과 멀티클로닝 사이트를 삽입한 후 액체 및 고체 배지에서 활성을 측정한 그림이다.

도 3은 멀티클로닝 사이트가 삽입된 개량된 에스터레이즈 ESTL120P의 염기서열을 나타낸 것이다.

도 4는 멀티클로닝 사이트가 삽입된 에스터레이즈 cp216M-MCS를 인디케이터(indicator)로 사용한 클로닝 벡터의 모식도이다.

도 5는 GFP와 베타-갈락토시다아제를 인디케이터(indicator)로 사용하는 클로닝벡터와 본 발명의 구조물을 인디케이터(indicator)로 사용한 클로닝 시스템의 선별정확도를 비교한 그림이다.

도 6은 에스터레이즈를 인디케이터(indicator)로 사용하는 TA-클로닝벡터를 나타내는 그림이다.

(a: cloning vector, b: 외래 유전자의 삽입 유무에 따른 활성의 차이)

도 7은 에스터레이즈와 dsRed 융합단백질의 양쪽 활성을 확인한 그림이다.

(1: 대조군, 2: 에스터레이즈 ESTL120P, 3: DsRed와 에스터레이즈(ESTL120P) 융합 단백질, 4: DsRed 와 에스터레이즈(ESTL120P) 융합단백질)

<110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> The use of esterase ESTL120P for reporter as a fusion partner, and its use for indicator in cloning vector system <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1146 <212> DNA <213> Pseudomonas fluorescens <400> 1 gtgcagattc agggtcatta cgaacttcag ttcgaagcgg tacgtgaagc gttcgccgcc 60 ttgttcgatg acccgcagga gcgtggtgcc gggctttgca tccagatcgg cggggaaacg 120 gtagtcgacc tgtgggccgg taccgccgac aaggatggtg ccgaggcctg gcacagcgac 180 accctcgtca acctgttctc gtgcaccaag acgtttactg cggtcacggc cctgcaattg 240 gtcgccgaag gcaagctgaa gctggatgcg ccagtggccg attattggcc ggcgtttgcg 300 gcggcgggga aggaaaccat caccctgcgc cagttgctct gccaccaggc cggattgccg 360 gcgatccgcg aaatgctgcc cgccgaagcg ctatacgact ggcaacgcat ggtcgacacc 420 ctggcggccg aagcgccgtg gtggacaccg ggccaaggcc atggctacga ggcaattacc 480 tatggttggc tggtcggcga attgctgcgc cgtgccgacg ggcgcggccc gggtgaatcc 540 atcgtggcgc gggttgcgcg gccgttggga ctggacttcc atgtagggct ggcggatgaa 600 gagttttatc gcgtggctca tatagcgcgc agtaaaggca atatgggcga tgaagccgca 660 caacgtttac tgcaagtaat gatgcgtgaa ccgaacgcca tgacgacgcg ggcatttgcc 720 aacccacctt ctattctgac cagcaccaat aaacccgaat ggcgacgcat gcagcagccg 780 gcggcaaatg gtcacggtaa tgcgcgcagc ctggcgggtt tttatagcgg tttgttggac 840 ggtagtttgc tggaaagcga catgctcgaa caattgactc gtgaacacag tattgggccg 900 gataaaacct tattgactca gacccgtttt ggcctgggct gcatgttgga tcaaccgcag 960 ttgcccaatg caaccttcgg ccttggcccg cgtgcgtttg ggcaccctgg cgcgggtggt 1020 tcggtggggt ttgccgaccc tgaacatgat gttgcgttcg gttttgtgac taatacgttg 1080 gggccgtatg tacttatgga ccctcgtgcg cagaagttgg tcggaatatt ggccggttgt 1140 ctgtaa 1146 <210> 2 <211> 381 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <400> 2 Val Gln Ile Gln Gly His Tyr Glu Leu Gln Phe Glu Ala Val Arg Glu 1 5 10 15 Ala Phe Ala Ala Leu Phe Asp Asp Pro Gln Glu Arg Gly Ala Gly Leu 20 25 30 Cys Ile Gln Ile Gly Gly Glu Thr Val Val Asp Leu Trp Ala Gly Thr 35 40 45 Ala Asp Lys Asp Gly Ala Glu Ala Trp His Ser Asp Thr Leu Val Asn 50 55 60 Leu Phe Ser Cys Thr Lys Thr Phe Thr Ala Val Thr Ala Leu Gln Leu 65 70 75 80 Val Ala Glu Gly Lys Leu Lys Leu Asp Ala Pro Val Ala Asp Tyr Trp 85 90 95 Pro Ala Phe Ala Ala Ala Gly Lys Glu Thr Ile Thr Leu Arg Gln Leu 100 105 110 Leu Cys His Gln Ala Gly Leu Pro Ala Ile Arg Glu Met Leu Pro Ala 115 120 125 Glu Ala Leu Tyr Asp Trp Gln Arg Met Val Asp Thr Leu Ala Ala Glu 130 135 140 Ala Pro Trp Trp Thr Pro Gly Gln Gly His Gly Tyr Glu Ala Ile Thr 145 150 155 160 Tyr Gly Trp Leu Val Gly Glu Leu Leu Arg Arg Ala Asp Gly Arg Gly 165 170 175 Pro Gly Glu Ser Ile Val Ala Arg Val Ala Arg Pro Leu Gly Leu Asp 180 185 190 Phe His Val Gly Leu Ala Asp Glu Glu Phe Tyr Arg Val Ala His Ile 195 200 205 Ala Arg Ser Lys Gly Asn Met Gly Asp Glu Ala Ala Gln Arg Leu Leu 210 215 220 Gln Val Met Met Arg Glu Pro Asn Ala Met Thr Thr Arg Ala Phe Ala 225 230 235 240 Asn Pro Pro Ser Ile Leu Thr Ser Thr Asn Lys Pro Glu Trp Arg Arg 245 250 255 Met Gln Gln Pro Ala Ala Asn Gly His Gly Asn Ala Arg Ser Leu Ala 260 265 270 Gly Phe Tyr Ser Gly Leu Leu Asp Gly Ser Leu Leu Glu Ser Asp Met 275 280 285 Leu Glu Gln Leu Thr Arg Glu His Ser Ile Gly Pro Asp Lys Thr Leu 290 295 300 Leu Thr Gln Thr Arg Phe Gly Leu Gly Cys Met Leu Asp Gln Pro Gln 305 310 315 320 Leu Pro Asn Ala Thr Phe Gly Leu Gly Pro Arg Ala Phe Gly His Pro 325 330 335 Gly Ala Gly Gly Ser Val Gly Phe Ala Asp Pro Glu His Asp Val Ala 340 345 350 Phe Gly Phe Val Thr Asn Thr Leu Gly Pro Tyr Val Leu Met Asp Pro 355 360 365 Arg Ala Gln Lys Leu Val Gly Ile Leu Ala Gly Cys Leu 370 375 380 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 3 atagaattcg tgcagattca gggtcattac 30 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 4 ataaagcttt tacagacaac cggccaat 28 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artifical sequence <400> 5 atagctagcg atgaagccgc acaacg 26 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artifical sequence <400> 6 atagctagcg cccatattgc 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taggatccca gacaaccggc caatattcc 29 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artifical sequence <400> 15 tcggatccac agcctcctcc gagaacgtc 29 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 16 taggatccac acaggaacag gtggtggcg 29

Claims (15)

1. 삭제
2. 삭제
3. 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 에스테라아제 유전자 내에 다중 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS)가 도입되어 있는 재조합 폴리뉴클레오티드.
4. 삭제
5. 제3항에 있어서, 에스테라아제 유전자가 서열번호 1에 기재된 염기서열로 이루어지는 것인 재조합 폴리뉴클레오티드.
6. 제3항에 있어서, 다중 클로닝 위치가 서열번호 2의 216번과 217번, 281과 282번, 및 306번과 307번 아미노산 사이의 어느 하나 이상의 위치에 도입되어 있는 재조합 폴리뉴클레오티드.
7. 제3항에 있어서, 다중 클로닝 위치가 TA 클로닝(TA cloning)이 가능한 염기서열을 갖는 것인 재조합 폴리뉴클레오티드.
8. 제7항에 있어서, 다중 클로닝 위치가 서열번호 12의 염기서열로 이루어지는 것인 재조합 폴리뉴클레오티드.
9. 제3항, 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
10. 제9항에 있어서, 발현 벡터 또는 클로닝 벡터인 재조합 벡터.
11. 제10항에 있어서, TA 클로닝(TA cloning) 벡터인 재조합 벡터.
12. 제3항, 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환 미생물.
13. 제12항에 있어서, 수탁번호 KCTC 11357BP로 기탁된 형질전환 미생물.
14. 인디케이터(indicator)로서 제3항, 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드를 사용하여 외래 유전자를 포함하는 클론을 선별하는 단계를 포함하는, 재조합 유전자의 제조방법.
15. 리포터(reporter) 또는 친화성 태그(affinity tag)으로서 제3항, 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드를 사용하여 단백질 또는 유전자의 발현을 분석하거나 분리 정제하는 단계를 포함하는, 단백질 또는 유전자의 발현 분석 또는 분리 정제 방법.

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