KR20110090840A - 서열 특이적 결합 단백질을 포함하는 키트 및 그를 이용한 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 및 장치 - Google Patents

서열 특이적 결합 단백질을 포함하는 키트 및 그를 이용한 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

서열 특이적 결합 단백질을 포함하는 키트 및 그를 이용한 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 및 장치를 제공한다. 일 구체예에 따른 서열 특이적 결합 단백질을 포함하는 키트 및 그를 이용한 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 및 장치에 의하면, 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 보다 효율적으로 결정할 수 있다.

Description

서열 특이적 결합 단백질을 포함하는 키트 및 그를 이용한 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 및 장치{Kit including sequence specific binding protein and method and device for determining nucleotide sequence of target nucleic acid}
서열 특이적 결합 단백질을 포함하는 키트 및 그를 이용한 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 및 장치에 관한 것이다.
뉴클레오티드 서열 분석은 의학 및 생물학 분야 연구의 기초적인 도구로서, 신약 개발을 위한 약물 타겟 또는 진단 마커의 발굴, 개인 유전체의 변이 관찰, 유용한 생물 자원의 확보의 수단이 될 수 있으며, 유전병, 암과 같은 질환 등 유전자의 변이에 의해 발생하는 질병에 대한 진단 분야에도 이용이 가능하다.
뉴클레오티드 서열 분석 방법의 예로는, 연쇄 종결 방법(chain termination method) 및 화학적 분해 방법(chemical degradation method)의 2가지 기본적인 접근 방법이 있다. 두 가지 방법 모두, 큰 DNA 조각으로부터 단일 뉴클레오티드의 차이를 구별할 수 있는 DNA 조각을 고해상도의 젤 전기영동을 통해 분리해야 한다. 이러한 과정들은 한번에 결정할 수 있는 DNA의 크기를 제한하게 되므로, 비용 및 시간이 많이 소모되고, 한번에 많은 표적 서열을 분석하는 데는 어려움이 있었다.
이후, 상기 방법을 대체한 차세대 유전자 서열 분석 기법의 등장으로 유전자 분석의 효율성이 증가되었고, 분석 비용도 급격히 감소되었다. 차세대 유전자 서열 분석 기법은 동시에 많은 시료를 분석할 수 있으나, 시간이 많이 소요되고, 읽을 수 있는 서열의 길이(read-length)가 매우 짧아 (25 내지 500 bp) 많은 배수의 서열을 분석해야 하며, DNA의 구조적인 변이를 탐지해내거나, 유전자의 배수(copy number)등을 분석하기가 어렵다.
관련 기술로, 생체에서 추출된 100 kb 정도의 하나의 DNA 분자를 나노 채널에 고정하고, 제한 효소(endonuclease)를 이용한 닉킹(nicking) 및 부위 특이적 프로빙(site specific probing) 기법을 통해 DNA의 서열을 분석하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 이는 표적 뉴클레오티드의 서열을 높은 해상도로 구별하기 어려워 DNA 분자를 확인하는 수준에 그치고 있다.
따라서, 종래 기술에 의하더라도, 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 보다 효율적으로 결정하는 방법 및 장치가 여전히 요구되고 있다.
하나 이상의 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지를 포함하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
표적 핵산 중의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 및 장치를 제공하는 것이다.
일 양상은 하나 이상의 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지를 포함하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위한 키트를 제공한다.
용어, "핵산(nucleic acid)"은 뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 상기 핵산은 DNA (gDNA 및 cDNA) 및/또는 RNA, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 분자를 포함한다. 뉴클레오티드는 핵산 분자의 기본 구성 단위로서, 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함하며, 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함할 수 있다.
용어, "표적 핵산(target nucleic acid)"은 뉴클레오티드 서열을 결정하고자 하는 대상이 되는 핵산을 의미한다. 상기 표적 핵산은 예를 들어, 게놈 DNA, mRNA, cDNA, 또는 증폭 반응에 의하여 증폭된 DNA일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
용어, "서열 특이적 결합 단백질(sequence specific binding protein)"은 상기 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하여 결합할 수 있는 단백질의 종류를 의미한다. 용어, "모티프(motif)"는 표적 핵산의 특정 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하는 특정한 아미노산 서열을 의미한다. 상기 모티프는 3차 구조 및/또는 2차 구조는 물론, 1차 구조의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 모티프는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산을 특이적으로 인식할 수 있다. 상기 서열 특이적 결합 단백질은 하나 이상의 모티프를 포함할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 모티프는 징크 핑거(zinc finger) 모티프, 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix) 모티프, 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix) 모티프, 류신 지퍼(leucine zipper) 모티프, 제한 효소(restriction endonuclease)의 핵산 결합 모티프 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 모티프를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 서열 특이적 결합 단백질은 1 내지 5개, 또는 1 내지 3개, 또는 2개의 징크 핑거 모티프를 포함할 수 있다.
상기 징크 핑거 모티프는 다양한 골격 구조를 가질 수 있으며, 예를 들어, Cys2His2, Cys4, His4, His3Cys, Cys3X, His3X, Cys2X2, His2X2(상기 X는 아연 결합(zinc ligating) 아미노산) 및 이들의 조합일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 징크 핑거 모티프는 예를 들어, CXX(XX)CXXXXXXXXXXXXHXXXH와 같이 보존된 시스테인 및 히스티딘 잔기를 포함하는 특정 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 징크 핑거 모티프는 DNA-결합 단백질의 다양한 패밀리에서 널리 발견된다. 상기 모티프 내의 보존된 시스테인 및 히스티딘 잔기는 징크 이온과 리간드를 형성하며, 이는 3차 구조를 안정화하는데 필수적이다. 상기 보존은 때때로 특이적인 잔기가 아닌 일종의 잔기일 수 있으며, 예를 들어, 징크 리간드 사이의 12-잔기의 루프 내에서, 한 지역이 우선적으로 소수성, 특히 류신 또는 페닐알라닌일 수 있다.
상기 징크 핑거 모티프는 표적 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하여 결합할 수 있다. 상기 표적 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 3 내지 15개 또는 6 내지 12개 길이의 뉴클레오티드를 갖는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 Cys2His2 징크 핑거 모티프는 α-나선 상의 7개의 아미노산이 3개의 뉴클레오티드의 서열을 특이적으로 인식할 수 있다. 즉, 서로 다른 징크 핑거 모티프는 서로 다른 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식할 수 있으며, 이러한 징크 핑거 모티프의 특정 아미노산 서열이 인식하는 특이적인 뉴클레오티드 서열에 대한 내용은 http://www.scripps.edu/mb/barbas/zfdesign/zfdesignhome.php에서 찾아볼 수 있다.
상기 징크 핑거 모티프는 야생형, 돌연변이형 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 돌연변이형 징크 핑거 모티프는 예를 들어, 상기 야생형 징크 핑거 모티프에서 1 내지 5개 또는 2 내지 4개의 아미노산 잔기가 치환된 것일 수 있으며, 상기 치환된 아미노산 잔기는 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산일 수 있다.
특정 뉴클레오티드 서열을 인식하고 결합할 수 있는 상기 징크 핑거 모티프의 라이브러리는 유전자 수준의 무작위 돌연변이를 통해 제작될 수 있다. 예를 들어, 파지의 표면에 징크 핑거 모티프 라이브러리를 표시시켜 선별하는 기법, 효모 혼성화(yeast one hybrid) 기법, 박테리아 혼성화(bacterial two hybrid) 기법, 셀-프리(cell-free) 번역을 통한 선별 기법을 사용할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 서열 특이적 결합 단백질은 검출 가능한 표지에 연결될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 키트는 2 이상의 서열 특이적 단백질을 포함하는 것으로, 상기 2 이상의 서열 특이적 단백질은 서로 다른 검출 가능한 표지를 갖는 것일 수 있다. 상기 키트는 2 이상의 서로 다른 서열 특이적 단백질 및 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트 내의 첫번째 서열 특이적 단백질이 GFP로 표지되어 있으면, 키트 내의 두번째 서열 특이적 단백질은 YFP로 표지되고, 키트 내의 세번째 서열 특이적 단백질은 RFP로 표지될 수 있으며, 상기 표지는 그 이상이 될 수 있다. 각각의 서로 다른 서열 특이적 단백질은 표적 핵산 내의 서로 다른 특이적 서열과 결합할 수 있으며, 상기 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 키트 내에 2 이상의 서로 다른 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지를 포함함으로써, 상기 키트는 오직 한 종류의 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지를 포함하는 키트와 비교하여 표적 핵산 내의 뉴클레오티드 서열을 결정하는데 있어서 정확성이 향상될 수 있다.
용어 "검출 가능한 표지(detectable label)"는 표지가 없는 동일한 종류의 분자들 중에서 표지를 포함하는 분자의 특이적으로 검출하도록 하는 원자 또는 분자를 의미한다. 상기 검출 가능한 표지는 빛 신호를 발산하는 표지, 전기 신호를 발산하는 표지, 방사능을 발산하는 표지 및 그의 조합으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 빛 신호를 발산하는 표지는 형광물질 및 인광물질은 물론 빛의 흡수 및/또는 발산의 특이적인 패턴을 갖는 물질을 포함할 수 있다. 상기 형광물질은 YFP(yellow fluorescent protein), GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein) 및 그의 조합으로부터 선택되는 형광 단백질을 포함할 수 있다. GFP는 푸른 빌에 노출되었을 때 밝은 녹색의 형광을 나타내는 23개의 아미노산으로 이루어진 단백질(26.9 kDa)이다. 많은 다른 해양 생물들이 유사한 녹색 형광 단백질을 가지고 있지만, GFP는 해파리류인 Aequorea Victoria로부터 처음으로 분리된 단백질을 일반적으로 의미한다. Aequorea Victoria의 GFP는 395 nm의 파장에서 주 여기(excitation) 피크를 가지며, 475 nm에서 보조 여기 피크를 갖는다. 방출(emission) 피크는 509 nm로서, 가시 스펙트럼의 낮은 녹색 부분이다. Renilla reniformis라는 바다 팬지(sea pansy)의 GFP는 498 nm에서 단일 주 여기 피크를 갖는다. 여기서 사용된 GFP는 야생형 GFP 및 GFP의 유도체를 포함한다. 다양한 사용에 대한 잠재성 및 연구자의 필요성으로 인해, GFP의 다양한 서로 다른 돌연변이가 개발되었다. 상기 GFP 유도체는 GFP 유도체는 1995년에 Roger Tsien에 의해 Nature에서 보고된, 단일 점 돌연변이 (S65T)를 갖는 GFP를 포함할 수 있다. 이 돌연변이는 GFP의 스펙트럼 특성을 극적으로 개선시켰으며, 형광의 증가, 광안정성을 야기하고, 509 nm에서 방출 피크를 유지하면서 주 여기 피크를 488 nm로 이동시켰다. 향상된 GFP(enhanced GFP, EGFP)를 생산하는 이러한 S65T에서의 37℃ 접힘(folding) 효율 점 돌연변이는 1995년 Ole Thastrup 연구실에 의해 발견되었다. EGFP는 포유동물에서 GFP의 실질적인 사용을 가능하게 하였다. 색 돌연변이체; 특히 청색 형광 단백질 (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), 청록색 형광 단백질(ECFP, Cerulean, CyPet) 및 황색 형광 단백질 유도체(YFP, Citrine, Venus, YPet)를 포함한 다수의 기타 돌연변이가 제작되었다. BFP 유도체 (mKalama1 제외)들은 Y66H 치환을 포함한다. 청록색 유도체의 중요한 돌연변이는 Y66W 치환으로, 이는 발색단이 페놀 성분보다는 인돌로 형성되도록 한다. 인돌 기의 증가된 부피(bulk)에 기인한 이러한 변형된 발색단에 명도(brightness)를 회복시키기 위해서는 몇 가지의 추가적인 보상적 돌연변이가 요구된다. YFP 유도체들의 적색편이된 파장은 T203Y 돌연변이에 의해 이루어지며, 치환된 티로신 잔기와 발색단 간의 파이-전자 적층(stacking) 상호작용에 기인한다. 이와 같은 두 종류의 스펙트럼 변이체들은 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 실험에 흔히 사용된다. 칼슘 또는 글루타메이트와 같은 세포 신호 분자, 단백질 인산화 상태, 단백질 보완(complementation), 수용체 이합체화(dimerization) 및 기타 과정들을 감지할 수 있는, 유전적으로 코딩된 FRET 리포터는 세포 활성의 고도로 특이적인 광학 판독(readout)을 실시간으로 제공한다. YFP는 에쿼리아 빅토리아에서 유래한, GFP의 유전적 돌연변이체이다. 여기 피크는 514 nm이고, 방출 피크는 527 nm이다. 녹색 형광 단백질(GFP)과 마찬가지로, 이는 일반적으로 형광 현미경 관찰에 의해 연구되는 세포 및 분자 생물학에 있어서 유용한 도구이다. YFP의 3가지 개선된 변이체는 Citrine, Venus, 및 Ypet이다. 이들은 감소된 염화물(chloride) 감수성, 보다 빠른 성숙 및 증가된 명도 (소광 계수 및 양자 수율의 결과)를 갖는다. 통상적으로, 황색 FP는 유전적으로 코딩된 FRET 감지자(sensor)에 대한 수용자(acceptor)로 기능하며, 그의 가장 가능성 있는 공여자 FP는 mCFP (단합체 청록색 FP)이다. GFP에 대한 적색 편이는 T203Y 돌연변이의 결과로서 Pi-Pi 적층 상호작용에 의해 야기되며, 이는 국소적 발색단 환경의 분극률(polarizability)을 본질적으로 증가시키고, 발색단 내에 추가적인 전자 밀도를 제공한다.
RFP는 적색 방출 형광 단백질이다. 광범위하게 사용된 최초의 산호 유래 형광 단백질은 디스코소마 스트리아타(Discosoma striata)로부터 유래되었으며, 일반적으로 DsRed로 지칭된다. 일단 완전히 성숙된 DsRed의 형광 방출 스펙트럼은 583 nm에서 피크를 나타내는 반면, 여기 스펙트럼은 558 nm에서 주 피크를 나타내고 약 500 nm에서 약한 피크를 나타낸다. DsRed는 절대적인 사합체이며, 큰 단백질 응집체를 형성할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 RFP는 야생형 DsRed의 유도체를 포함한다. DsRed 형광 단백질에 대한 문제점 중 소수는 돌연변이생성에 의해 극복되었다. DsRed2로 알려진, 2세대 DsRed는 펩티드 아미노 말단에 단백질 응집체의 생성을 방지하고 독성을 감소시키는 몇가지 돌연변이들을 포함한다. 또한, 형광표지(flurophore) 성숙 시간은 이러한 변형에 의해 감소된다. DsRed2는 또한 사합체를 형성하지만, 보다 신속한 성숙으로 인해 다중 표지 실험에서 녹색 형광 단백질과 더욱 상용성이 있다. 성숙 시간의 추가적인 감소는 3세대 DsRed 돌연변이체에 의해 실현되었으며, 이들은 또한 피크 세포성 형광의 측면에서 증가된 명도 수준을 나타낸다. DsRed-Express로부터의 적색 형광 방출은 DsRed2의 경우 6시간, DsRed의 경우 11시간인 것과 비교하여, 발현 후 1시간 내에 관찰될 수 있다. RedStar로 지칭된, 효모-최적화 변이체가 개발되었으며, 이는 또한 개선된 성숙율 및 증가된 명도를 갖는다. DsRed-Express 및 RedStar에서의 녹색 상태의 존재여부는 명백하지 않으며, 이는 이 형광 단백질을 다중 표지 실험에 있어서 주황색-적색 스펙트럼 영역에서 최적의 선택으로 만든다. 이 프로브들은 절대적 사합체로 존재하므로, 이들은 표지 단백질로서 최적의 선택이 아니다. 상당한 가능성을 보이는 수개의 추가적인 적색 형광 단백질들이 초산호 생물체들로부터 분리되었다. 포유동물에 최초로 적용된 것 중 하나는 HcRed1로서, 헤테락티스 크리스파(Heteractis crispa)로부터 분리되었으며 현재 시판중이다. HcRed1은 원래 적색광을 흡수하는 비-형광 색소단백질로부터 유래하였으며, 돌연변이 생성을 통해 588 nm에서 최대 흡수를 갖고, 618 nm에서 최대 방출을 갖는 약한 형광성 절대적 이합체를 생성한다. 이 단백질의 형광 방출 스펙트럼이 DsRed로부터의 분리에 충분하다고 하더라도, 이는 DsRed과 공응집(co-aggregate)하는 경향이 있으며, 훨씬 덜 밝다.
상기 검출 가능한 표지는, 예를 들어, 색깔 비드(colored bead), 항원 결정체, 효소, 혼성화 가능한 핵산, 발색물질, 형광물질, 인광물질, 전기적으로 검출 가능한 분자, 변경된 형광-분극 또는 변경된 빛-확산을 제공하는 분자 또는 양자점 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 표지는 P32 및 S35와 같은 방사선동위원소, 화학발광 (chemiluminescent) 화합물, 표지된 결합 단백질, 중금속 원자 및 다이와 같은 분광학적 마커, 및 자기 표지물을 포함할 수 있다. 상기 다이는 예를 들어, 퀴놀린 다이, 트리아릴메탄 다이, 프탈레인, 아조 다이 및 시아닌 다이를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 형광물질은 예를 들어, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Cy2, Cy3.18, Cy3.5, Cy3, Cy5.18, Cy5.5, Cy5, Cy7, Oregon Green, Oregon Green 488-X, Oregon Green, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 15, SYTO 16, SYTO 17, SYTO 18, SYTO 20, SYTO 21, SYTO 22, SYTO 23, SYTO 24, SYTO 25, SYTO 40, SYTO 41, SYTO 42, SYTO 43, SYTO 44, SYTO 45, SYTO 59, SYTO 60, SYTO 61, SYTO 62, SYTO 63, SYTO 64, SYTO 80, SYTO 81, SYTO 82, SYTO 83, SYTO 84, SYTO 85, SYTOX Blue, SYTOX Green, SYTOX Orange, SYBR Green YO-PRO-1, YO-PRO-3, YOYO-1, YOYO-3 또는 티아졸 오렌지(thiazole orange)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한편, 상기 검출 가능한 표지는 상기 서열 특이적 결합 단백질에 포함되어, 상기 단백질이 특이적으로 결합되는 뉴클레오티드 서열 및 표적 핵산에서 상기 뉴클레오티드 서열의 위치를 선택적으로 검출할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지는 상기 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지를 연결하는 링커를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 링커는 예를 들어, 상기 서열 특이적 결합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 부착될 수 있다. 이러한 링커는 비-펩티드 링커 또는 펩티드 링커일 수 있다.
상기 비-펩티드 링커는 당업계에서 링커로 이용되는 어떠한 화합물도 가능하며, 단백질 또는 펩티드에 있는 작용기 종류에 따라 적합한 링커를 선택할 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는 알킬 링커 또는 아미노 링커일 수 있다. 알킬 링커는 분지형 또는 비분지형, 시클릭 또는 아시클릭, 치환된 또는 비치환된, 포화된 또는 불포화된, 키랄, 아키랄 또는 라세미체 혼합물일 수 있다. 예를 들면, 알킬 링커는 2 내지 18개 탄소 원자를 가질 수 있다. 일부 알킬 링커는 히드록시, 아미노, 티올, 티오에테르, 에테르, 아미드, 티오아미드, 에스테르, 우레아 및 티오에테르를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 작용기를 포함한다. 이러한 알킬 링커는 1 프로판올, 1,2 프로판디올, 1,2,3 프로판트리올, 1,3 프로판디올, 트리에틸렌 글리콜 헥사에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 링커 (예를 들어, [-O-CH2-CH2-]n (n = 1-9)), 메틸 링커, 에틸 링커, 프로필 링커, 부틸 링커 또는 헥실 링커를 포함한다.
상기 펩티드 링커는 당업계에 공지된 다양한 링커를 이용할 수 있으며, 예를 들어, 복수의 아미노산 잔기로 이루어진 링커일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 상기 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광 단백질)를 충분한 거리로 이격시켜 각각의 폴리펩티드가 적합한 이차 및 삼차 구조로 폴딩되도록 할 수 있다. 예를 들어, 상기 펩티드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩티드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, (Gly4-Ser)3, (Gly2-Ser)2 또는 Gly4-Ser-Gly5-Ser일 수 있다. 상기 링커는 상기 단백질 및 표지의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 불필요하거나, 또는 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 키트는 표적 핵산을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 표적 핵산은 이중 가닥일 수 있으며, 상기 표적 핵산은 1 kb 내지 10 Mb의 길이를 갖는 것일 수 있다.
상기 키트는 상기 서열 특이적 결합 단백질을 안정화시키는데 필요한 시약, 예를 들어, 당업계에 공지된 완충액을 포함할 수 있으며, 상기 키트는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
다른 양상은 형광 단백질 및 징크 핑거 단백질이 융합된 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이와 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 유전자 구조(gene construct)를 제공한다.
용어, "유전자 구조(gene construct)"는 원하는 유전자의 발현에 필요한 기능적인 단위를 의미한다. 상기 유전자 구조는 벡터를 포함할 수 있다. 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등과 같은 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등과 같은 파지 또는 SV40 등과 같은 바이러스를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 형광 단백질 및 징크 핑거 단백질은 상기 설명한 바와 같다. 상기 형광 단백질은 YFP(yellow fluorescent protein), GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 형광 단백질 및 징크 핑거 단백질은 N말단에서 C말단의 순서로 융합되거나, C말단에서 N말단의 순서로 융합된 것일 수 있다. 상기 형광 단백질 및 징크 핑거 단백질은 링커, 예를 들어, 펩티드 또는 비펩티드 링커에 의해 융합된 것일 수 있다.
상기 유전자 구조에서 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 프로모터 서열 및/또는 종결 서열과 같은 뉴클레오티드 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
상기 유전자 구조는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 융합 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터, 즉 재조합 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 예를 들어, pL λ프로모터 trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등과 같은 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터, 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 메탈로티오닌 프로모터와 같은 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 또는 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터와 같은 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 가질 수 있다. 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
다른 양상은 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지 및 표적 핵산을 주입하기 위한 시료 주입부; 상기 시료 주입부와 유체소통 가능하게 연결된 채널을 포함하는 시료 이동부; 상기 시료 이동부에서 이동되는 표적 핵산을 포함하는 액체 매질의 흐름을 조절하는 유체 흐름 조절부; 및 검출 가능한 표지로부터 신호를 검출하기 위한 검출부를 포함하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 장치를 제공한다.
상기 시료 이동부 내의 상기 채널은 표적 핵산만이 통과되거나, 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지가 결합된 상기 표적 핵산이 통과할 수 있으며, 상기 채널의 너비 및 깊이는 각각 30 내지 200 nm일 수 있다.
상기 장치는 상기 시료 이동부와 유체소통 가능하게 연결되고, 상기 시료 주입부가 연결된 채널의 반대편 말단에 위치하는 시료 폐기부를 더 포함할 수 있다. 상기 채널은 상기 시료 이동부 내의 채널과 동일한 너비 및 깊이를 가질 수 있다.
또한, 상기 시료 이동부는 2 이상의 채널에서 각 채널의 한 쪽 말단과 다른 쪽 말단이 순차적으로 유체 소통 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 장치는 상기 채널의 한 쪽 말단에 유체소통 가능하게 연결된 시료 재생부를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료 재생부는 단백질 분해 효소를 더 포함할 수 있다. 상기 장치는 상기 시료 재생부와 유체소통 가능하게 연결되고, 상기 시료 재생부가 연결된 채널의 다른 쪽 말단에 위치하는 시료 표지부를 더 포함할 수 있으며, 상기 시료 표지부는 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지를 더 포함할 수 있다. 용어, "단백질 분해 효소(proteolytic enzyme):는 단백질을 분해할 수 있는 임의의 효소를 의미하는 것으로, 단백질을 형성하는 폴리펩티트 사슬 내에 연결된 아미노산 사이의 펩티드 결합을 가수분해할 수 있는 효소를 의미한다. 상기 단백질 분해 효소는 예를 들어, 펩티다아제, 프로테나아제 K, 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파테이트 프로테아제, 메탈로프로테아제 또는 글루탐산 프로테아제일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
한편, 상기 장치는 상기 검출 가능한 표지로부터 검출된 신호를 상기 신호에 상응하는 뉴클레오티드 서열로 변환시키기 위한 연산부를 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 핵산 및 하나 이상의 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지를 접촉시키는 단계; 상기 검출 가능한 표지로부터 신호를 검출하는 단계; 및 상기 신호로부터 상기 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
상기 접촉은 액체 매질 중에서 상기 서열 특이적 결합 단백질과 상기 표적 핵산을 혼합함으로써 이루어질 수 있다. 사용되는 액체 매질은 상기 서열 특이적 결합 단백질 및 상기 표적 핵산 자체의 안정성을 유지시킬 수 있고, 상기 단백질 및 핵산의 결합을 가능하게 하는 당업계에 공지된 완충액을 사용할 수 있다. 상기 접촉 과정은 상기 서열 특이적 결합 단백질에 포함된 핵산 결합 모티프가 표적 핵산에 근접하도록 하여 상기 단백질을 표적 핵산의 분석하고자 하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합시키도록 한다. 상기 접촉 단계 후에는 결합하지 않은 상기 단백질들을 제거하기 위한 세척 단계를 수행할 수 있다.
한편, 상기 표적 핵산은 이중가닥일 수 있다. 또한, 상기 표적 핵산은 이를 준비하는 과정에서 당업자에게 알려진 방법에 따라 다양한 길이를 갖도록 할 수 있으며, 예를 들어 1 kb 내지 10 Mb 또는 10 kb 내지 10 Mb의 길이를 갖도록 할 수 있다.
상기 방법은 상기 접촉된 시료를 상기 채널 내로 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 채널은 표적 핵산만이 통과되거나, 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지가 결합된 상기 표적 핵산이 통과할 수 있으며, 상기 채널의 너비 및 깊이는 각각 30 내지 200 nm일 수 있다. 상기 시료는 당업계에 알려진 방법에 따라 상기 채널 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 상기 시료는 기게적 펌핑, 전기적인 힘 또는 감압에 의해 도입될 수 있다. 상기 시료는 채널 내에서 정적 또는 유동 상태로 표적 핵산에 결합된 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지의 위치를 검출하는데 사용될 수 있다.
상기 방법은 상기 검출 가능한 표지로부터 발생하는 신호를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 검출 가능한 표지의 예는 상기 키트에서 설명한 바와 같으며, 상기 검출 신호의 검출은 당업계에 널리 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 표지가 예를 들어, 형광물질 또는 형광 단백질인 경우, 형광 측정 장치 또는 형광 현미경과 같은 장치를 사용하여 상기 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지가 결합된 표적 핵산 상의 위치를 검출할 수 있다. 상기 위치는 표적 핵산 내의 어떠한 지점으로부터 상대적인 위치일 수 있다. 예를 들어, 상기 지점은 표적 핵산의 양끝 지점일 수 있다. 상기 위치는 상기 시료가 채널에 도입된 이후에 측정될 수 있다. 이러한 경우, 상기 위치는 상기 채널 내에서 미리 정해진 위치와 연결시켜 측정할 수 있다.
서열을 결정하는 단계에 있어서, 검출된 신호의 확인은 상기 검출 가능한 표지로부터 발생하는 신호를 검출기로 측정하는 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 검출 가능한 표지로부터 발생하는 자기적 신호, 전기적 신호, 형광, 라만 등의 발광 신호, 산란광 신호, 및 방사능 신호로 이루어진 군으로부터 선택되는 신호를 측정할 수 있다. 검출 신호에 대한 구체예는 상기 검출 가능한 표지에서 설명한 바와 같다.
일 구체예에 따르면, 상기 서열의 결정은 검출된 신호로부터 특이적 서열을 결정하고, 채널 내에서 신호가 검출된 위치를 확인함으로서 수행될 수 있다. 예를 들어, GFP 및 YFP가 검출 가능한 표지로 사용되었다면, GFP가 결합되어 있는 특정 뉴클레오티드 서열은 GFP 신호에 해당하는 녹색의 형광을 나타낼 것이며, YFP가 결합되어 있는 특정 뉴클레오티드 서열은 YFP 신호에 해당하는 노란색의 형광을 나타낼 것이다. 이러한 방법으로, 표적 핵산의 뉴클레오티드의 염기 서열이 결정될 수 있다. 2 이상의 서로 다른 검출 가능한 표지, 예를 들어, 형광 단백질들이 표적 핵산의 뉴클레오티드 염기 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 또한, 하나의 검출 가능한 표지로부터 얻어진 표적 핵산의 한 부분의 뉴클레오티드 서열 조성은 또 다른 검출 가능한 표지로부터 얻어진 표적 핵산의 한 부분의 뉴클레오티드 서열 조성과 조합될 수 있으며, 이는 표적 핵산의 염기 서열의 정확성을 향상시킬 수 있다.
서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지가 결합된 위치는 채널 내에서 정적 또는 유동적 상태에서 확인될 수 있다. 예를 들어, 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지가 결합된 위치를 정적 상태로 확인하는 경우, 표적 핵산의 위치는 상기 채널 내에서 변하지 않는 상태로 존재할 수 있다. 상기 표적 핵산은 상기 채널에서 한쪽 끝이 고정된 지점으로부터 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지가 결합된 지점을 확인하여 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인할 수 있다. 또한, 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지가 결합된 위치는 유동적 상태에서 확인할 수 있다. 즉, 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지가 결합된 표적 핵산이 채널의 한쪽 말단으로부터 다른쪽 말단으로 이동하면서, 시간의 경과에 따라 상기 검출 가능한 표지로부터 발생하는 신호를 측정할 수 있다. 이러한 경우, 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지가 결합된 위치는 시간 경과에 따라 한쪽 말단으로부터 다른쪽 말단으로 확인할 수 있다. 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열은 모티프가 결합된 서열 및 위치에 관한 정보를 조합하여 얻을 수 있다.
또한, 상기 방법은 상기 표적 핵산의 부분 또는 전체의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 것일 수 있다.
상기 방법을 통해, 상기 신호를 검출하여 해당하는 서열 특이적 결합 단백질이 결합된 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인할 수 있으며, 상기 서열 특이적 결합 단백질의 종류를 다르게 하여 하나의 표적 핵산에 대한 상기 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법을 계속 반복하고 그로부터 얻어진 뉴클레오티드 서열을 조합하면, 표적 핵산 전체의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있게 된다. 또한, 상기 반복은 예를 들어, 프로테아제와 같은 단백질 분해 효소를 사용하여 상기 단백질을 제거함으로써, 표적 핵산을 재활용하는 단계를 거쳐 수행될 수 있다.
일 구체예에 따른 서열 특이적 결합 단백질을 포함하는 키트 및 그를 이용한 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 및 장치에 의하면, 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 보다 효율적으로 결정할 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 시료 이동부에 하나의 채널을 포함하는 뉴클레오티드 서열 결정 장치의 모식도이다.
도 2는 일 구체예에 따른 시료 이동부에 2 이상의 채널을 포함하는 뉴클레오티드 서열 결정 장치의 모식도이다.
도 3은 일 구체예에 따른 형광 단백질(YFP)이 연결된 서열 특이적 결합 단백질을 발현시키기 위한 벡터 pEP21b-YFP-ZF의 지도이다.
도 4는 pEP21b-YFP-ZF(1)로부터 과발현된 일 구체예에 따른 단백질의 SDS가 포함되지 않은 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(non-denaturing PAGE) 결과이다. A 및 B는 단백질이 용해되어 있는 보관액을 의미한다.
도 5은 pEP21b-YFP-ZF(2)로부터 과발현된 일 구체예에 따른 단백질의 SDS가 포함되지 않은 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 결과이다. A 및 B는 단백질이 용해되어 있는 보관액을 의미한다.
도 6은 AATTAG를 포함하는 DNA 절편과 ZF01의 EMSA 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 AACTGA를 포함하는 DNA 절편과 ZF01의 EMSA 결과를 나타낸 것이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
도 1 및 도 2는 일 구체예에 따른 뉴클레오티드 서열 결정 장치의 모식도이다. 도 1 및 도 2를 참조하여 일 구체예에 따른 뉴클레오티드 서열 결정 장치를 사용한 뉴클레오티드 서열 결정 방법의 일 구체예를 설명하면 다음과 같다.
먼저, 시료 주입부(100)에 뉴클레오티드 서열을 분석하고자 하는 표적 핵산이 포함된 시료를 주입한다. 시료는 예를 들어, 완충액에 포함된 표적 핵산일 수 있다. 상기 시료 주입부(100)에는 한 종류의 표적 핵산, 즉, 뉴클레오티드 서열이 동일한 표적 핵산을 주입할 수 있다. 또한, 상기 시료 주입부(100)에서 검출 가능한 표지로 표지된 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 아미노산 서열을 포함하는 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지와 뉴클레오티드 서열을 분석하고자 하는 표적 핵산을 접촉시켜 상기 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지를 상기 표적 핵산에 결합시키는 단계를 미리 수행할 수 있다.
상기 시료 주입부(100)에 주입된 표적 핵산은 시료 이동부(110)로 이동된다. 상기 시료 이동부(110)는 하나 또는 2 이상의 채널로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 채널은 상기 표적 핵산 한 분자가 상기 채널 내에서 2차 구조를 이루지 않도록, 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지가 결합된 표적 핵산이 통과할 수 있을 정도의 너비 및 깊이(약 30 내지 200 nm)을 갖도록 할 수 있다.
상기 시료 이동부(110)를 통해 이동되는 표적 핵산은 유체 흐름 조절부(120)에 의해 이동 속도의 조절을 받을 수 있다. 또한, 상기 유체 흐름 조절부(120)에 의해 상기 채널 내에 상기 표적 핵산이 2차 구조를 이루지 않은 상태로 위치시킬 수 있다. 이와 같이, 상기 표적 핵산이 이동되거나, 2차 구조를 이루지 않도록 위치한 정지 상태에서 검출부(130)는 상기 표적 핵산에 결합되어 있는 서열 특이적 결합 단백질 상의 다양한 검출 표지를 검출할 수 있다. 예를 들어, 상기 검출부(130)는 파장을 조절하여 다양한 파장의 형광을 검출할 수 있는 검출 장치일 수 있다.
상기 검출부(130)로부터 검출된 신호는 연산부(140)에서 상기 표적 핵산에서 발생하는 신호의 위치 및 상기 신호에 해당하는 뉴클레오티드 서열로 변환하는 과정을 거치게 된다. 이어서, 상기 변환된 뉴클레오티드 서열은 출력부(150)에서 사용자가 확인할 수 있다. 한편, 뉴클레오티드 서열 결정을 마친 표적 핵산 시료는 최종적으로 시료 폐기부(160)로 이동하여 폐기될 수 있다.
일 구체예에 따른 뉴클레오티드 서열 결정 장치는 도 2에 나타낸 바와 같이, 시료 이동부(110)에 2 이상의 채널을 포함할 수 있다. 상기 시료 이동부(110)에 2 이상의 채널을 포함하는 경우에는, 각각의 채널에 시료 재생부(170) 및 시료 표지부(180)을 더 포함할 수 있다. 상기와 같이 시료 주입부(100)를 통해 주입된 표적 핵산은 상기 시료 이동부(100)의 최초의 채널을 거쳐 시료 재생부(170)에 도달하게 된다. 상기 시료 재생부(170)에는 단백질을 분해할 수 있는 효소, 예를 들어 프로테나아제 K가 포함되어 있어, 상기 표적 핵산에 결합되어 있는 서열 특이적 결합 단백질을 분해시킬 수 있다. 이때, 유체 흐름 조절부(120)는 상기 표적 핵산이 시료 재생부(170)에 머물러 있을 수 있도록 표적 핵산이 포함된 완충액의 흐름을 조절할 수 있다. 상기 시료 재생부(170)에서 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지가 완전히 제거된 표적 핵산은 완충액의 흐름에 의해 시료 표지부(180)으로 이동하게 된다. 상기 시료 표지부(180)에는 이전 단계에서 결합된 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지와 다른 서열을 인식할 수 있는 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지가 포함되어 있다. 따라서, 상기 시료 표지부(180)에서 표적 핵산에 이전 단계와 다른 종류의 서열 특이적 결합 단백질이 결합함으로서 다음 단계에서는 이전 단계와 다른 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 도 2에서 화살표 방향은 유체의 흐름 방향을 나타낸다.
한편, 상기 시료 재생부(170) 및 시료 표지부(180) 사이에는 표적 핵산만 이동할 수 있도록 시료 재생부(170) 및 시료 표지부(180)에 포함된 단백질(예를 들어, 프로테나아제 K 또는 서열 특이적 결합 단백질)의 크기보다 작고, 표적 핵산의 크기보다 큰 포어를 포함하는 막을 포함하도록 할 수 있다.
일 구체예에 따른 2 이상의 채널을 포함하는 뉴클레오티드 서열 결정 장치에서 상기 단계를 여러 번 거치게 되면, 긴 길이의 표적 핵산(예를 들어, 10 kb 내지 10 Mb)의 뉴클레오티드 서열을 한번에 결정할 수 있다. 또한, 일 구체예에 따른 시료 이동부(110)를 2 이상 장착하면, 여러 종류의 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 한꺼번에 결정할 수 있다.
실시예 1: 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위한 표적 핵산의 준비
뉴클레오티드 서열을 결정하기 위한 표적 핵산으로, 인간의 게놈 DNA를 선택하였다. 인간의 게놈 DNA의 추출은 인간의 혈액으로부터 분리한 세포, 인간의 점막 상피 세포 또는 배양된 세포를 대상으로 하였다. 상기 수득한 세포로부터 상업적으로 이용가능한 키트(Bio-rad)를 사용하여, 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 인간 게놈 DNA을 추출하였다. 상기 키트를 사용하여 평균적으로 250 kb 이상의 인간 게놈의 DNA을 추출할 수 있었다.
실시예 2: 검출 가능한 표지가 연결된 서열 특이적 결합 단백질의 제조
본 실시예는 검출 가능한 표지(YFP)가 연결된 서열 특이적 결합 단백질을 발현시키기 위한 벡터를 제조하고, 상기 벡터를 이용하여 상기 단백질을 정제하는 과정이다.
상기 단백질을 생산하기 위하여 먼저, (Gly2Ser)2 링커 및 형광 단백질(YFP)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 얻었다. 상기 폴리뉴클레오티드 단편은 pEYFP(Invitrogen, USA)를 주형으로 하고, (Gly2Ser)2 링커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 BamHI으로 절단될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 YFP-BamHI-F 프라이머(서열 번호 1) 및 XhoI으로 절단될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 YFP-XhoI-R 프라이머(서열 번호 2)를 이용하여 증폭하였다. 상기 증폭은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystem)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같다: 95 ℃에서 5분; 95℃에서 20초, 68℃에서 2분 동안 30회 반복; 68℃에서 5분; 4℃로 냉각. 상기 반응으로부터 얻어진 PCR 산물을 제조사의 프로토콜에 따라 QIAquick Multiwell PCR Purification kit(Qiagen)로 세정하여 다음 과정에 사용하였다. 상기 증폭된 PCR 산물을 BamHI 및 XhoI 제한 효소로 절단한 다음, 동일한 제한 효소로 절단한 pET21b(Novagen) 벡터에 삽입하여 pET21b-YFP 벡터를 제조하였다.
서열 특이적 결합 단백질은 징크 핑거 모티프를 2개 포함하도록 제작하며, http://www.scripps.edu/mb/barbas/zfdesign/zfdesignhome.php를 통해 2 종의 징크 핑거 모티프를 포함하는 서열 특이적 결합 단백질을 디자인하였다. 상기 2 종의 서열 특이적 결합 단백질은 각각 AATTAG, AACTGA를 표적으로 하는 단백질이다. 표적 서열 AATTAG에서 AAT를 특이적으로 인식하는 징크 핑거 내의 아미노산 서열은 TTGNLTV (서열 번호 3)이고, TAG를 특이적으로 인식하는 아미노산 서열은 REDNLHT (서열 번호 4)이다. 또한, 표적 서열 AACTGA에서 AAC를 특이적으로 인식하는 징크 핑거 내의 아미노산 서열은 DSGNLRV (서열 번호 5)이고, TGA를 특이적으로 인식하는 아미노산 서열은 QAGHLAS (서열 번호 6)이다. 한편, 상기 2종의 서열 특이적 결합 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 7 및 서열 번호 8이다. 상기 서열 특이적 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 절편은 당업계에 공지된 방법에 따라 상기 폴리뉴클레오티드 절편에 해당하는 센스 및 안티센스 가닥의 올리고 뉴클레오티드를 합성하여, 어닐링(annealing)하는 방법으로 제작하였으며, 각각의 폴리뉴클레오티드 절편은 5' 및 3' 말단의 BamHI 제한 효소로 절단될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 추가하여, 상기 제작한 벡터 pET21b-YFP에 삽입하였다. 상기 합성한 폴리뉴클레오티드 절편의 센스 및 안티센스 가닥의 올리고뉴클레오티드는 각각 서열 번호 9 내지 서열 번호 12이다.
상기 합성된 폴리뉴클레오티드 절편은 BamHI 제한 효소로 절단한 다음, 동일한 제한 효소로 절단한 상기 제작된 벡터 pET21b-YFP에 삽입하여 pET21b-YFP-ZF(1) 및 pET21b-YFP-ZF(2)를 제조하였다(도 3).
상기 제조한 벡터를 이용하여 단백질을 과발현시키기 위해, 상기 벡터를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환시켰다. 이때, 배양액으로 암피실린(50 ug/ml)을 첨가한 LB 배지를 사용하며, 흡광도 600 nm에서 O.D.값이 0.5일 때 0.5 mM의 IPTG를 넣고 25 ℃에서 16시간 동안 더 배양하였다. 상기 배양하여 얻은 세포를, 25 mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0) 하에서 초음파로 분쇄한 후, 원심분리기(10,000 x g)를 이용하여 상층액을 얻었다. 상기 상층액을 상기 완충액으로 평형화된 Ni2 +-NTA superflow 칼럼(Qiagen)에 적용하고, 컬럼 부피의 5배에 해당하는 세척 완충액으로 세척한 다음, 용출 완충액(25 mM Tris-HCl, pH 8.0; 2.5 mM β-머캅토에탄올; 125 mM 이미다졸; 및 150 mM NaCl)으로 상기 단백질을 용출하였다. 상기 단백질이 포함된 분획들을 모아 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter(Milipore)를 이용하여 분획 중에 포함된 염을 제거하고 농축하였다. 농축된 단백질(YFP-링커-ZFP 융합단백질)을 보관액 A(25 mM Tris-HCl, pH 8.0; 2.5 mM β-머캅토에탄올; 125 mM 이미다졸; 150 mM NaCl; 및 50% 글리세롤) 또는 보관액 B(20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM DTT; 100 mM NaCl; 및 50% 글리세롤)에 녹여 보관하였다. 정제된 단백질 농도는 BSA를 표준 물질로 사용하여 측정하였다. 도 4 및 도 5에서 나타낸 바와 같이, 융합단백질은 30 kDa의 분자량을 가지며, 높은 순도로 정제됨을 확인할 수 있다. 한편, 이하 pET21b-YFP-ZF(1)로부터 발현된 단백질을 ZF01, pET21b-YFP-ZF(2)로부터 발현된 단백질을 ZF02로 명명하였다.
실시예 3: 표적 핵산과 서열 특이적 결합 단백질의 결합 능력 확인
상기 실시예 2에서 제조한 서열 특이적 결합 단백질이 표적 핵산에 특이적으로 결합하는지 여부를 확인하기 위해, 겔 지연 분석법(gel mobility shift assay)을 수행하였다.
먼저, 상기 서열 특이적 결합 단백질이 특이적으로 인식할 수 있는 뉴클레오티드 서열인 AATTAG 또는 AACTGA를 포함하는 올리고뉴클레오티드 20 mer를 합성한다(서열 번호 13 내지 서열 번호 16). 이후, 서열번호 13 및 14, 서열 번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드를 각각 어닐링시켜 표적 핵산을 제작하였다.
상기 제작한 표적 핵산 및 실시예 2에서 제조한 단백질을 완충액(10 ㎖ 중 20 mM 비스-Tris 프로판, pH 7.0; 100 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 20 mM ZnSO4; 10% 글리세롤; 0.1% Nonidet P-40; 5 mM DTT; 0.10 ㎎/㎖ BSA)에 첨가하고, 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 상기 반응물을 SDS가 포함되지 않은 PAGE를 수행한 결과, 표적 핵산 1(AATTAG를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편) 또는 2(AACTGA를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편)와 상기 표적 핵산 1 및 2를 각각 인지하는 단백질 ZF01 또는 ZF02의 결합물은 음성 대조군(표적 핵산(도면에서 DNA로 표시됨))과 비교하여 겔 상에서 이동거리가 짧은 것을 확인할 수 있었다(도 6 및 도 7).
실시예 4: 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 과정
실시예 1에서 얻은 250 kb의 표적 핵산 0.4 pM 및 실시예 2에서 제조한 단백질 (ZF01 또는 ZF02) 10 pM을 완충액(10 ㎖ 중 20 mM 비스-Tris 프로판, pH 7.0; 100 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 20 mM ZnSO4; 10% 글리세롤; 0.1% Nonidet P-40; 5 mM DTT; 0.10 ㎎/㎖ BSA)에 첨가하고, 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기 반응물에 YOYO-1을 첨가하고, 10분 동안 방치하여 상기 표적 핵산의 백본(backbone)을 염색한 다음, 나노 채널(SiO2 표면 처리된 실리콘에 넓이 100 nm, 깊이 80 nm, 길이 1 mm의 사각 형상의 채널을 제작함)에 주입하고, 491 nm 및 509 nm에서 분광 광도계를 이용하여 상기 서열 특이적 결합 단백질의 YFP로부터 형광 신호를 검출하였다.
실시예 5: 뉴클레오티드 서열의 재분석 시험
상기 실시예 4에서 분석이 완료된 표적 핵산을 나노 채널로부터 제거하여 상기 표적 핵산에 DNase-free 프로테나아제 K를 처리하고, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 표적 핵산과 서열 특이적 결합 단백질 ZF01을 반응시키고, 서열 특이적 결합 단백질의 YFP로부터 형광 신호를 측정하였다. 그 결과, 표적 핵산에 결합되어 있던 상기 서열 특이적 결합 단백질 ZF01이 제거되었음을 확인할 수 있었으며, 이후, 서열 특이적 결합 단백질 ZF02을 상기와 동일한 방법으로 다시 반응시키고, 그로부터 형광 신호를 재검출한 결과, 상기 표적 핵산으로부터 ZF01은 제거되고, 서열 특이적 결합 단백질 ZF02가 결합된 것을 확인할 수 있었다. 이는 일 구체예에 따른 뉴클레오티드 서열 결정 방법에서 표적 핵산의 재활용이 가능함을 의미하는 것으로, 적은 양의 표적 핵산으로 뉴클레오티드 서열 정보를 효율적으로 획득할 수 있음을 나타낸다.
100: 시료 주입부
110: 시료 이동부
120: 유체 흐름 조절부
130: 검출부
140: 연산부
150: 출력부
160: 시료 폐기부
170: 시료 재생부
180: 시료 표지부
<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Kit including sequence specific binding protein and method and device for determining nucleotide sequence of target nucleic acid <150> KR2010-0010500 <151> 2010-02-04 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP-BamHI-F primer <400> 1 ggatccatgg tgagcaaggg cgaggag 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YFP-XhoI-R primer <400> 2 ctcgagttac ttgtacagct cgtccat 27 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence which specifically recognize "AAT" <400> 3 Thr Thr Gly Asn Leu Thr Val 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence which specifically recognize "TAG" <400> 4 Arg Glu Asp Asn Leu His Thr 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence which specifically recognize "AAC" <400> 5 Asp Ser Gly Asn Leu Arg Val 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence which specifically recognize "TGA" <400> 6 Gln Ala Gly His Leu Ala Ser 1 5 <210> 7 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of zinc finger motif which specifically recognize "AATTAG" <400> 7 Leu Glu Pro Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser 1 5 10 15 Phe Ser Arg Glu Asp Asn Leu His Thr His Gln Arg Thr His Thr Gly 20 25 30 Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Thr Thr 35 40 45 Gly Asn Leu Thr Val His Gln Arg Thr His Thr Gly Lys Lys Thr Ser 50 55 60 <210> 8 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of zinc finger motif which specifically recognize "AACTGA" <400> 8 Leu Glu Pro Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser 1 5 10 15 Phe Ser Gln Ala Gly His Leu Ala Ser His Gln Arg Thr His Thr Gly 20 25 30 Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Asp Ser 35 40 45 Gly Asn Leu Arg Val His Gln Arg Thr His Thr Gly Lys Lys Thr Ser 50 55 60 <210> 9 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence(sense) of zinc finger motif which specifically recognize "AATTAG" <400> 9 ctggaaccgg gtgaaaaacc gtacaaatgc ccggaatgcg gtaaatcttt ctctcgtgaa 60 gacaacctgc acacccacca gcgtacccac accggtgaaa aaccgtacaa atgcccggaa 120 tgcggtaaat ctttctctac caccggtaac ctgaccgttc accagcgtac ccacaccggt 180 aaaaaaacct ct 192 <210> 10 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence(antisense) of zinc finger motif which specifically recognize "AATTAG" <400> 10 agaggttttt ttaccggtgt gggtacgctg gtgaacggtc aggttaccgg tggtagagaa 60 agatttaccg cattccgggc atttgtacgg tttttcaccg gtgtgggtac gctggtgggt 120 gtgcaggttg tcttcacgag agaaagattt accgcattcc gggcatttgt acggtttttc 180 acccggttcc ag 192 <210> 11 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence(sense) of zinc finger motif which specifically recognize "AACTGA" <400> 11 ctggaaccgg gtgaaaaacc gtacaaatgc ccggaatgcg gtaaatcttt ctctcaggcg 60 ggtcacctgg cgtctcacca gcgtacccac accggtgaaa aaccgtacaa atgcccggaa 120 tgcggtaaat ctttctctga ctctggtaac ctgcgtgttc accagcgtac ccacaccggt 180 aaaaaaacct ct 192 <210> 12 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence(antisense) of zinc finger motif which specifically recognize "AACTGA" <400> 12 agaggttttt ttaccggtgt gggtacgctg gtgaacacgc aggttaccag agtcagagaa 60 agatttaccg cattccgggc atttgtacgg tttttcaccg gtgtgggtac gctggtgaga 120 cgccaggtga cccgcctgag agaaagattt accgcattcc gggcatttgt acggtttttc 180 acccggttcc ag 192 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for EMSA including "AATTAG"(sense strand) <400> 13 tttttttaat tagttttttt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for EMSA including "AATTAG"(antisense strand) <400> 14 aaaaaaatta atcaaaaaaa 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for EMSA including "AACTGA"(sense strand) <400> 15 tttttttaac tgattttttt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide for EMSA including "AACTGA"(antisense strand) <400> 16 aaaaaaattg actaaaaaaa 20

Claims (33)

  1. 하나 이상의 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지를 포함하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위한 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표적 핵산은 1kb 내지 10Mb의 길이를 갖는 것인 키트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 표적 핵산은 이중 가닥인 것인 키트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 서열 특이적 결합 단백질은 징크 핑거(zinc finger) 모티프, 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix) 모티프, 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix) 모티프, 류신 지퍼(leucine zipper) 모티프, 제한 효소(restriction endonuclease)의 핵산 결합 모티프 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 모티프를 포함하는 것인 키트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 색깔 비드(colored bead), 발색물질, 형광물질, 형광 단백질, 인광물질, 전기적으로 검출 가능한 분자, 변경된 형광-분극 또는 변경된 빛-확산을 제공하는 분자, 양자점 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 형광 단백질은 YFP(yellow fluorescent protein), GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  7. 제1항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 상기 링커에 의해 상기 서열 특이적 결합 단백질과 연결되는 것인 키트.
  8. 형광 단백질 및 징크 핑거 단백질이 융합된 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이와 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 유전자 구조(gene construct).
  9. 제8항에 있어서, 상기 형광 단백질은 YFP(yellow fluorescent protein), GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein) 및 그의 조합인 것인 유전자 구조.
  10. 제8항에 있어서, 상기 형광 단백질 및 징크 핑거 단백질은 N말단에서 C말단의 순서로 융합된 것인 유전자 구조.
  11. 제8항에 있어서, 상기 형광 단백질 및 징크 핑거 단백질은 링커에 의해 융합된 것인 유전자 구조.
  12. 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지 및 표적 핵산을 주입하기 위한 시료 주입부; 상기 시료 주입부와 유체소통 가능하게 연결된 채널을 포함하는 시료 이동부; 상기 시료 이동부에서 이동되는 표적 핵산을 포함하는 액체 매질의 흐름을 조절하는 유체 흐름 조절부; 및 검출 가능한 표지로부터 신호를 검출하기 위한 검출부를 포함하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 결정 장치.
  13. 제12항에 있어서, 상기 장치는 상기 시료 이동부와 유체소통 가능하게 연결되고, 상기 시료 주입부가 연결된 채널의 반대편 말단에 위치하는 시료 폐기부를 더 포함하는 것인 장치.
  14. 제12항에 있어서, 상기 시료 이동부는 2 이상의 채널에서 각 채널의 한 쪽 말단과 다른 쪽 말단이 순차적으로 유체 소통 가능하게 연결된 것인 장치.
  15. 제12항에 있어서, 상기 장치는 상기 채널의 한 쪽 말단에 유체소통 가능하게 연결된 시료 재생부를 더 포함하는 것인 장치.
  16. 제15항에 있어서, 상기 시료 재생부는 단백질 분해 효소를 더 포함하는 것인 장치.
  17. 제12항에 있어서, 상기 장치는 상기 시료 재생부와 유체소통 가능하게 연결되고, 상기 시료 재생부가 연결된 채널의 다른 쪽 말단에 위치하는 시료 표지부를 더 포함하는 것인 장치.
  18. 제17항에 있어서, 상기 시료 표지부는 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지를 더 포함하는 것인 장치.
  19. 제12항에 있어서, 상기 채널은 너비 및 깊이가 30 내지 200 nm인 것인 장치.
  20. 제12항에 있어서, 상기 장치는 상기 검출 가능한 표지로부터 검출된 신호를 상기 신호에 상응하는 뉴클레오티드 서열로 변환시키기 위한 연산부를 더 포함하는 것인 장치.
  21. 제12항에 있어서, 상기 서열 특이적 결합 단백질은 징크 핑거(zinc finger) 모티프, 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix) 모티프, 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix) 모티프, 류신 지퍼(leucine zipper) 모티프, 제한 효소(restriction endonuclease)의 핵산 결합 모티프 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 모티프를 포함하는 것인 장치.
  22. 제12항에 있어서, 상기 서열 특이적 결합 단백질은 2개의 징크 핑거 모티프를 포함하는 것인 장치.
  23. 제12항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 색깔 비드(colored bead), 발색물질, 형광물질, 형광 단백질, 인광물질, 전기적으로 검출 가능한 분자, 변경된 형광-분극 또는 변경된 빛-확산을 제공하는 분자, 양자점 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 장치.
  24. 제23항에 있어서, 상기 형광 단백질은 YFP(yellow fluorescent protein), GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 장치.
  25. 핵산 및 하나 이상의 서열 특이적 결합 단백질 및 검출 가능한 표지를 접촉시키는 단계;
    상기 검출 가능한 표지로부터 신호를 검출하는 단계; 및
    상기 신호로부터 상기 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 서열 특이적 결합 단백질은 징크 핑거(zinc finger) 모티프, 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix) 모티프, 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix) 모티프, 류신 지퍼(leucine zipper) 모티프, 제한 효소(restriction endonuclease)의 핵산 결합 모티프 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 모티프를 포함하는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 핵산은 이중 가닥인 것인 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 핵산은 1 kb 내지 10 Mb의 길이를 갖는 것인 방법.
  29. 제25항에 있어서, 상기 서열 특이적 결합 단백질은 2개의 징크 핑거 모티프를 포함하는 것인 방법.
  30. 제25항에 있어서, 상기 검출하는 단계는 상기 결합 모티프가 상기 핵산에 결합하는 위치를 검출하는 것인 방법.
  31. 제25항에 있어서, 상기 결정하는 단계는 상기 결합 모티프가 상기 핵산에 결합하고, 상기 결합 모티프가 결합하는 염기 서열의 위치에 관한 정보를 조합하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  32. 제25항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 색깔 비드(colored bead), 발색물질, 형광물질, 형광 단백질, 인광물질, 전기적으로 검출 가능한 분자, 변경된 형광-분극 또는 변경된 빛-확산을 제공하는 분자, 양자점 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 형광 단백질은 YFP(yellow fluorescent protein), GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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