KR20120071191A

KR20120071191A - 표적 핵산의 염기 서열을 결정하기 위한 키트 및 이를 이용한 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법

Info

Publication number: KR20120071191A
Application number: KR1020100132821A
Authority: KR
Inventors: 이주원
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2010-12-22
Publication date: 2012-07-02
Also published as: US20120164754A1

Abstract

표적 핵산의 염기 서열을 결정하기 위한 키트 및 이를 이용한 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 표적 핵산의 염기 서열을 결정하기 위한 키트 및 이를 이용한 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법에 의하면, 시료 중에 포함된 표적 핵산의 염기 서열을 보다 효율적으로 결정할 수 있다.

Description

표적 핵산의 염기 서열을 결정하기 위한 키트 및 이를 이용한 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법{Kit and method for determining nucleotide sequence of target nucleic acid}

표적 핵산의 염기 서열을 결정하기 위한 키트 및 이를 이용한 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법에 관한 것이다.

DNA 결합 단백질 중 하나인 징크 핑거(zinc finger) 단백질은 다양한 서열의 표적 DNA에 결합될 수 있어 결합을 원하는 염기 서열의 재조합 가능하다. 또한, 매우 강한 DNA 결합력을 가지며, 형광 단백질과의 결합을 통해 다양한 파장대의 리포터를 쉽게 결합할 수 있다는 장점이 있다. 따라서, 이를 이용하여 핵산을 특이적으로 검출하려는 시도가 이루어지고 있다.

핵산의 진단 분야는 SNP의 구별, 병원성 세균의 감염, 바이러스의 감염, 유전병 진단 등에 활용되고 있다. 기존의 핵산 진단 방식은 대부분 증폭을 통해 이루어져 왔다. 증폭 방식의 핵산 진단 방법의 가장 큰 단점은 증폭 과정 시 기존의 오염 물질이 존재하여 위양성이 나타날 수 있고, 핵산의 진단 결과를 증폭 후에 도출하므로 증폭 전의 원래의 표적 핵산의 농도를 예측하는데 있어서 많은 오차를 포함할 수 있다.

따라서, 특정 핵산 서열을 증폭없이 진단, 탐지하기 위해서는 매우 높은 민감도와 특이성를 갖는 특정 서열의 핵산에만 결합하는 프로브가 요구된다.

표적 핵산의 염기 서열을 결정하기 위한 키트 및 이를 이용한 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 표적 핵산 내에서 n개의 염기로 이루어진 임의의 염기 서열에 특이적으로 결합하는 제1 단백질; 상기 제1 단백질의 말단에 연결되며, 상기 표적 핵산의 상기 임의의 염기 서열과 인접한 마이너 그루브(minor groove)에 비특이적으로 결합하는 제2 단백질; 및 상기 제2 단백질의 말단에 연결된 검출 가능한 표지로 이루어진 핵산 결합 프로브를 2 이상 포함하는 것으로, 상기 핵산 결합 프로브는 4ⁿ 종류이고, 상기 n은 3 내지 12의 정수인 것인, 표적 핵산의 염기 서열을 결정하기 위한 키트를 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 핵산 결합 프로브는 표적 핵산 내에서 n개의 염기로 이루어진 임의의 염기 서열에 특이적으로 결합하는 제1 단백질을 포함할 수 있으며, 상기 n은 3 내지 12의 정수일 수 있다.

용어, "핵산(nucleic acid)"은 뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 상기 핵산은 DNA (gDNA 및 cDNA) 및/또는 RNA, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 분자를 포함한다. 뉴클레오티드는 핵산 분자의 기본 구성 단위로서, 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함하며, 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함할 수 있다.

용어, "표적 핵산(target nucleic acid)"은 염기 서열을 결정하고자 하는 대상이 되는 핵산을 의미한다. 상기 표적 핵산은 예를 들어, 게놈 DNA, mRNA, cDNA, 또는 증폭 반응에 의하여 증폭된 DNA일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 제1 단백질은 n개의 염기로 이루어진 임의의 염기 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 n개의 염기로 이루어진 임의의 염기 서열은, 예를 들어, 표적 핵산이 DNA인 경우에는 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민, 표적 핵산이 RNA인 경우에는 상기 티민 대신의 우라실로 이루어지는 4개의 염기가 n개 만큼 임의로 배열된 서열을 의미한다. 일 구체예에 따르면, 상기 n은 6일 수 있다. 따라서, 상기 n이 6인 경우라면, 상기 임의의 염기 서열은 4⁶가지의 염기 서열일 수 있다.

상기 임의의 염기 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 제1 단백질은 핵산 결합 모티프(nucleic acid binding motif)를 포함할 수 있으며, 상기 단백질은 하나 이상의 핵산 결합 모티프를 포함할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 표적 염기 서열에 특이적으로 결합하는 아미노산 서열은 징크 핑거(zinc finger) 모티프, 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix) 모티프, 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix) 모티프, 류신 지퍼(leucine zipper) 모티프, 제한 효소(restriction endonuclease)의 핵산 결합 모티프, TBP 도메인 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산 결합 모티프를 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 아미노산 서열은 징크 핑거 모티프를 포함할 수 있으며, 상기 표적 서열 결합 단백질은 1 내지 5개, 또는 1 내지 3개, 또는 2개의 징크 핑거 모티프를 포함할 수 있다.

상기 징크 핑거 모티프는 다양한 골격 구조를 가질 수 있으며, 예를 들어, Cys₂His₂, Cys₄, His₄, His₃Cys, Cys₃X, His₃X, Cys₂X₂, His₂X₂(상기 X는 아연 결합(zinc ligating) 아미노산) 및 이들의 조합일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 징크 핑거 모티프는 표적 핵산 내에서 n개의 염기로 이루어진 임의의 염기 서열을 특이적으로 인식하여 결합할 수 있다. 상기 n은 예를 들어, 3 내지 21, 또는 6 내지 18, 또는 6 내지 9의 정수일 수 있으며, 또는 상기 n은 6일 수 있다. 예를 들어, 상기 Cys₂His₂ 징크 핑거 모티프는 α-나선 상의 7개의 아미노산이 3개의 뉴클레오티드의 서열을 특이적으로 인식할 수 있다. 즉, 서로 다른 징크 핑거 모티프는 서로 다른 염기 서열을 특이적으로 인식할 수 있으며, 이러한 징크 핑거 모티프의 특정 아미노산 서열이 인식하는 특이적인 염기 서열에 대한 내용은 http://www.scripps.edu/mb/barbas/zfdesign/zfdesignhome.php에서 찾아볼 수 있다. 따라서, 예를 들어, n이 6인 경우라면, 상기 제1 단백질은 징크 핑거 모티프 2개를 포함할 수 있으며, 상기 징크 핑커 모티프의 조합에 따라, 6개의 임의의 염기로 이루어진 4⁶가지의 염기 서열을 특이적으로 인식할 수 있는 제1 단백질을 제작될 수 있다.

상기 징크 핑거 모티프는 야생형, 돌연변이형 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 돌연변이형 징크 핑거 모티프는 예를 들어, 상기 야생형 징크 핑거 모티프에서 1 내지 5개 또는 2 내지 4개의 아미노산 잔기가 치환된 것일 수 있으며, 상기 치환된 아미노산 잔기는 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산일 수 있다.

특정 염기 서열을 인식하고 결합할 수 있는 상기 징크 핑거 모티프의 라이브러리는 유전자 수준의 무작위 돌연변이를 통해 제작될 수 있다. 예를 들어, 파지의 표면에 징크 핑거 모티프 라이브러리를 표시시켜 선별하는 기법, 효모 혼성화(yeast one hybrid) 기법, 박테리아 혼성화(bacterial two hybrid) 기법, 셀-프리(cell-free) 번역을 통한 선별 기법을 사용할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 핵산 결합 프로브는 상기 제1 단백질의 말단에 연결되며, 상기 표적 핵산의 상기 임의의 염기 서열과 인접한 마이너 그루브에 비특이적으로 결합하는 제2 단백질을 포함할 수 있다.

상기 제2 단백질은 상기 표적 핵산 내에서 n개의 염기로 이루어진 임의의 염기 서열 내 또는 상기 염기 서열의 양 말단으로부터 20 bp 이내에 존재하는 마이너 그르부와 결합할 수 있으며, 상기 비특이적인 결합은 특정한 제2 단백질이 특정한 염기 서열에 특이적으로 결합하지 않는 것을 의미한다. 상기 제2 단백질이 될 수 있는 단백질은, 예를 들어, 호메오 박스(homeobox) 단백질, HMG(high mobility group) 단백질, HU 단백질, 히스톤 폴드(histone fold) 단백질 및 폴리머라아제 크레프트(polymerase cleft) 단백질, 시퀀스 비특이적 징크핑거 xfin31(sequence non specific zincfinger xfin31), β-배럴(β-barrel) CspA, 아르기닌 리치 지역(arginine rich region) 및 RGG 모티프를 포함하는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

한편, 상기 제2 단백질은, 예를 들어, 상기 제1 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있으며, 링커에 의해, 또는 링커 없이 연결될 수 있다. 상기 링커는 비-펩티드 링커 또는 펩티드 링커일 수 있으며, 상기 링커에 대해서는 후술하도록 한다.

일 구체예에 따르면, 상기 핵산 결합 프로브는 상기 제2 단백질의 말단에 연결된 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다.

용어 "검출 가능한 표지(detectable label)"는 표지가 없는 동일한 종류의 분자들 중에서 표지를 포함하는 분자의 특이적으로 검출하도록 하는 원자 또는 분자로, 상기 검출 가능한 표지는 예를 들어, 색깔 비드(colored bead), 항원 결정체, 효소, 혼성화 가능한 핵산, 발색물질, 형광물질, 인광물질, 전기적으로 검출 가능한 분자, 변경된 형광-분극 또는 변경된 빛-확산을 제공하는 분자 또는 양자점 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 표지는 P³² 및 S³⁵와 같은 방사선동위원소, 화학발광 (chemiluminescent) 화합물, 표지된 결합 단백질, 중금속 원자 및 다이와 같은 분광학적 마커, 및 자기 표지물을 포함할 수 있다. 상기 다이는 예를 들어, 퀴놀린 다이, 트리아릴메탄 다이, 프탈레인, 아조 다이 및 시아닌 다이를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 형광물질은 예를 들어, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Cy2, Cy3.18, Cy3.5, Cy3, Cy5.18, Cy5.5, Cy5, Cy7, mcheery, Oregon Green, Oregon Green 488-X, Oregon Green, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 15, SYTO 16, SYTO 17, SYTO 18, SYTO 20, SYTO 21, SYTO 22, SYTO 23, SYTO 24, SYTO 25, SYTO 40, SYTO 41, SYTO 42, SYTO 43, SYTO 44, SYTO 45, SYTO 59, SYTO 60, SYTO 61, SYTO 62, SYTO 63, SYTO 64, SYTO 80, SYTO 81, SYTO 82, SYTO 83, SYTO 84, SYTO 85, SYTOX Blue, SYTOX Green, SYTOX Orange, SYBR Green YO-PRO-1, YO-PRO-3, YOYO-1, YOYO-3 또는 티아졸 오렌지(thiazole orange)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한편, 상기 검출 가능한 표지는 핵산 결합 프로브에 포함되어, 상기 제1 단백질이 특이적으로 결합되는 염기 서열을 특이적으로 검출할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 검출 가능한 표지는 제2 단백질의 말단과 링커를 통해 연결된 것일 수 있다. 상기 링커는 예를 들어, 상기 표적 서열 결합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 부착될 수 있다. 상기 링커는 비-펩티드 링커 또는 펩티드 링커일 수 있다.

상기 비-펩티드 링커는 당업계에서 링커로 이용되는 어떠한 화합물도 가능하며, 단백질 또는 펩티드에 있는 작용기 종류에 따라 적합한 링커를 선택할 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는 알킬 링커 또는 아미노 링커일 수 있다. 알킬 링커는 분지형 또는 비분지형, 시클릭 또는 아시클릭, 치환된 또는 비치환된, 포화된 또는 불포화된, 키랄, 아키랄 또는 라세미체 혼합물일 수 있다. 예를 들면, 알킬 링커는 2 내지 18개 탄소 원자를 가질 수 있다. 일부 알킬 링커는 히드록시, 아미노, 티올, 티오에테르, 에테르, 아미드, 티오아미드, 에스테르, 우레아 및 티오에테르를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 작용기를 포함한다. 이러한 알킬 링커는 1 프로판올, 1,2 프로판디올, 1,2,3 프로판트리올, 1,3 프로판디올, 트리에틸렌 글리콜 헥사에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 링커 (예를 들어, [-O-CH₂-CH₂-]_n (n = 1-9)), 메틸 링커, 에틸 링커, 프로필 링커, 부틸 링커 또는 헥실 링커를 포함한다.

상기 펩티드 링커는 당업계에 공지된 다양한 링커를 이용할 수 있으며, 예를 들어, 복수의 아미노산 잔기로 이루어진 링커일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 상기 제1 단백질 및 제2 단백질 똔느 제2 단백질 및 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광 단백질)를 충분한 거리로 이격시켜 각각의 폴리펩티드가 적합한 이차 및 삼차 구조로 폴딩되도록 할 수 있다. 예를 들어, 상기 펩티드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩티드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, (Gly₄-Ser)₃, (Gly₂-Ser)₂,Gly₅ 또는 Gly₄-Ser-Gly₅-Ser일 수 있다. 상기 링커는 상기 단백질 및 표지의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 불필요하거나, 또는 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 키트는 핵산 결합 프로브를 2 이상 포함하는 것으로, 상기 핵산 결합 프로브는 4ⁿ 종류일 수 있으며, 상기 n은 3 내지 12의 정수일 수 있다.

상기 키트는 표적 핵산의 염기 서열을 결정하기 위한 것으로, 염기 서열을 결정하고자 하는 상기 표적 핵산의 길이는 100 bp 내지 10 Mb, 또는 1 kb 내지 1 Mb일 수 있으며, 상기 길이를 갖는 표적 핵산 내에서 n개의 염기로 이루어진 임의의 염기 서열의 수는 2 이상 일 수 있다. 따라서, 상기 키트는 이러한 2 이상의 염기 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 결합 프로브를 2 이상 포함할 수 있다. 또한, n개의 염기로 이루어진 임의의 염기 서열은 총 4ⁿ 가지일 수 있으므로, 상기 길이를 갖는 표적 핵산의 염기 서열을 모두 커버하기 위해서, 상기 키트는 총 4ⁿ 종류의 상기 핵산 결합 프로브를 포함할 수 있다.

한편, 상기 키트는 상기 표적 서열 결합 단백질을 안정화시키는데 필요한 시약, 예를 들어, 당업계에 공지된 완충액을 포함할 수 있으며, 상기 키트는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

다른 양상은 염기 서열을 결정하고자 하는 표적 핵산과 상기 키트에 포함되어 있는 핵산 결합 프로브를 접촉시키는 단계; 상기 핵산 결합 프로브에 결합된 검출 가능한 표지로부터 신호를 검출하는 단계; 및 상기 검출된 신호를 염기 서열로 변환하는 단계를 포함하는, 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법을 제공한다.

상기 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 상기 방법은 염기 서열을 결정하고자 하는 표적 핵산과 상기 키트에 포함되어 있는 핵산 결합 프로브를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 접촉시키는 단계는 대상으로부터 시료를 얻는 단계 이후에 이루어질 수 있으며, 상기 시료는 생물학적 시료 또는 비생물학적 시료일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 핵산을 포함하는 시료라면 어떠한 것이든 가능하며, 예를 들어, 환자의 혈액, 누액, 타액, 바이러스 및 미생물일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 비생물학적 시료는, 예를 들어, 핵산 증폭 과정을 통해 증폭된 DNA 단편일 수 있다.

상기 접촉은 액체 매질 중에서 상기 핵산 결합 프로브와 상기 시료 자체 또는 상기 시료로부터 추출된 핵산을 혼합함으로써 이루어질 수 있다. 사용되는 액체 매질은 상기 핵산 결합 프로브 및 상기 표적 핵산 자체의 안정성을 유지시킬 수 있고, 상기 단백질 및 핵산의 결합을 가능하게 하는 당업계에 공지된 완충액을 사용할 수 있다. 상기 접촉 과정은 상기 핵산 결합 프로브를 이루고 있는 제1 단백질의 핵산 결합 모티프가 표적 핵산에 근접하도록 하여 상기 프로브를 표적 핵산의 결정하고자 하는 염기 서열에 특이적으로 결합하도록 할 수 있다. 상기 접촉 단계 후에는 결합하지 않은 상기 핵산 결합 프로브들을 제거하기 위한 세척 단계를 수행할 수 있다. 상기 단계를 통해 상기 표적 핵산에는 염기 서열에 따라 서로 다른 종류의 핵산 결합 프로브가 결합될 수 있다.

한편, 상기 표적 핵산은 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 표적 핵산은 이를 준비하는 과정에서 당업자에게 알려진 방법에 따라 다양한 길이를 갖도록 할 수 있으며, 예를 들어 100 bp 내지 10 Mb 또는 1 kb 내지 1 Mb의 길이를 갖도록 할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 표적 핵산은 검출 가능한 표지를 더 포함할 수 있다. 이는 상기 표적 핵산을 인위적으로 준비하는 과정에서 이루어질 수 있으며, 상기 검출 가능한 표지의 종류는 상기한 바와 같다.

이후, 상기 방법은 상기 핵산 결합 프로브에 결합된 검출 가능한 표지로부터 신호를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 검출된 신호의 확인은 상기 검출 가능한 표지로부터 발생하는 신호를 검출기로 측정하는 것을 의미한다. 즉, 상기 표적 핵산에는 염기 서열에 따라 서로 다른 종류의 핵산 결합 프로브가 결합되어 있고, 또한, 서로 다른 종류의 핵산 결합 프로브는 서로 다른 종류의 검출 가능한 표지를 포함할 수 있으므로, 상기 서로 다른 종류의 검출 가능한 표지로부터 발생하는 신호를 구별하여 표적 핵산 내의 서로 다른 위치의 염기 서열을 파악할 수 있다.

상기 신호는, 예를 들어, 상기 검출 가능한 표지로부터 발생하는 자기적 신호, 전기적 신호, 형광, 라만 등의 발광 신호, 산란광 신호, 및 방사능 신호로 이루어진 군으로부터 선택되는 신호일 수 있으며, 검출 신호에 대한 구체예는 상기 검출 가능한 표지에서 설명한 바와 같다.

일 구체예에 따르면, 상기 신호를 검출하는 단계는 상기 표적 서열 결합 단백질에 표지된 검출 가능한 표지로부터 발생하는 신호를 검출하는 것일 수 있다. 이는 상기 표적 서열 결합 단백질을 상기 생물학적 시료, 즉 인위적으로 합성한 폴리뉴클레오티드가 아닌 생시료 상에 존재하는 표적 핵산과 접촉시키는 경우에 수행하는 검출 방법일 수 있다. 합성된 폴리뉴클레오티드를 표적 핵산으로 사용하는 경우라면, 상기 폴리뉴클레오티드에 검출 가능한 표지를 결합시켜, 상기 표적 서열 결합 단백질에 표지된 검출 가능한 표지와 상기 표적 핵산에 표지된 검출 가능한 표지 사이의 형광 공명 에너지 전이(FRET)에 의해 발생하는 신호를 검출하여 표적 핵산의 존재 여부를 검출할 수 있다.

마지막으로, 상기 방법은 상기 검출된 신호를 염기 서열로 변환하는 단계를 포함할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 변환하는 단계 이후, 상기 변환된 염기 서열을 사용자에게 출력하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 표적 핵산에 결합된 서로 다른 종류의 핵산 결합 프로브의 검출 가능한 표지로부터 발생하는 신호로부터 상기 핵산 결합 프로브가 결합된 표적 핵산의 염기 서열을 유추할 수 있다. 예를 들어, AAAAAA에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 결합 프로브는 붉은색 형광 물질이 발광되도록 하고, AAAAAT에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 결합 프로브는 푸른색 형광 물질이 발광되도록 한다면, 표적 핵산 상에서 붉은색 및 푸른색의 위치를 파악하여 해당 부위의 염기 서열로 변환할 수 있다. 상기 변환 이후, 상기 신호를 조합하면, 표적 핵산의 전체 염기 서열을 결정할 수 있으며, 당업계에 널리 알려진 검출기 및 출력기를 통해 사용자에게 결정된 염기 서열의 결과를 출력할 수 있다.

일 구체예에 따른 표적 핵산의 염기 서열을 결정하기 위한 키트 및 이를 이용한 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법에 의하면, 시료 중에 포함된 표적 핵산의 염기 서열을 보다 효율적으로 결정할 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 핵산 결합 프로브의 개략도를 나타낸다.
도 2는 일 구체예에 따른 핵산 결합 프로브를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현 벡터 pET12b-Zif268-HMGa1-cherry의 개략도를 나타낸다. 상기 발현 벡터 내에 삽입된 핵산 결합 프로브를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 서열 번호 10에 나타내었다.
도 3은 일 구체예에 따른 발현 벡터 pET12b-Zif268-HMGa1-cherry 및 pET12b-Zif268-eHU-cherry로부터 발현된 융합 단백질의 SDS-PAGE 사진을 나타낸다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 표적 염기 서열 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질의 제조

본 실시예는 표적 염기 서열 결합 단백질(징크-핑거 단백질), 마이너 그루브에 비특이적으로 결합하는 단백질(HMGa1 도메인 또는 eHU 단백질) 및 검출 가능한 표지(mcheery)로 구성되는 융합 단백질을 발현시키기 위한 벡터를 제조하고, 상기 벡터를 이용하여 상기 융합 단백질을 정제하는 과정에 관한 것이다.

상기 단백질을 생산하기 위하여 먼저, (Gly₂Ser)₅ 링커의 일부 및 형광 단백질(mcheery)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 얻었다. 상기 폴리뉴클레오티드 단편은 pmcherry(Clontech, cat. no. 632522)를 주형으로 하고, (Gly₂Ser)₅ 링커의 일부를 코딩하며 내부에 BamHI으로 절단될 수 있는 염기 서열을 포함하는 mcheery F 프라이머(서열 번호 1) 및 XhoI으로 절단될 수 있는 염기 서열을 포함하는 mcheery R 프라이머(서열 번호 2)를 이용하여 증폭하였다. 상기 증폭은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystem)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같다: 95 ℃에서 5분; 95℃에서 20초, 68℃에서 2분 동안 30회 반복; 68℃에서 5분; 4℃로 냉각. 상기 반응으로부터 얻어진 PCR 산물을 제조사의 프로토콜에 따라 QIAquick Multiwell PCR Purification kit(Qiagen)로 세정하여 다음 과정에 사용하였다. 상기 증폭된 PCR 산물을 BamHI 및 XhoI 제한 효소로 절단한 다음, 동일한 제한 효소로 절단한 pET12b(Novagen) 벡터에 삽입하여 pET12b-cherry 벡터를 제조하였다.

표적 염기 서열 결합 단백질은 Kim 과 Pabo, 1998, PNAS, 95:2812-2817에 개시된 플라스미드(pCSZif268)를 주형으로 하고, NdeI으로 절단될 수 있는 염기 서열을 포함하는 ZIF268F 프라이머(서열 번호 3) 및 (Gly₂Ser)₅ 링커의 일부를 코딩하며 내부에 BamHI으로 절단될 수 있는 염기 서열을 포함하는 ZIF268R 프라이머(서열 번호 4)를 이용하여 증폭하였다. 상기 증폭은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystem)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같다: 95 ℃에서 5분; 95℃에서 20초, 68℃에서 2분 동안 30회 반복; 68℃에서 5분; 4℃로 냉각. 상기 반응으로부터 얻어진 PCR 산물을 제조사의 프로토콜에 따라 QIAquick Multiwell PCR Purification kit(Qiagen)로 세정하여 다음 과정에 사용하였다. 상기 증폭된 PCR 산물을 BamHI 및 NdeI 제한 효소로 절단한 다음, 동일한 제한 효소로 절단한 상기 pET12b-cherry 벡터에 삽입하여 pET12b-Zif268-cherry 벡터를 제조하였다.

HMGa1 도메인은 혈액에서 추출한 총 RNA로부터 역전사 효소(Invirtogen)을 이용하여 제작한 cDNA를 주형으로 하고, Gly₅ 링커를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 HMGF 프라이머(서열 번호 5) 및 HMGR 프라이머(서열 번호 6)를 이용하여 증폭하였다. 상기 증폭은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystem)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같다: 95 ℃에서 15분; 95℃에서 20초, 58℃에서 30초 72℃ 30초 동안 35회 반복; 72℃에서 3분; 4℃로 냉각. 상기 반응으로부터 얻어진 PCR 산물을 제조사의 프로토콜에 따라 QIAquick Multiwell PCR Purification kit(Qiagen)로 세정하여 다음 과정에 사용하였다. 상기 증폭된 PCR 산물을 SmaI 제한 효소로 절단한 다음, 동일한 제한 효소로 절단한 상기 pET12b-Zif268-cherry 벡터에 삽입하여 pET12b-Zif268-HMGa1-cherry 벡터를 제조하였다.

한편, HMGa1 도메인 대신에 eHU 단백질을 융합시킨 융합 단백질 발현 벡터의 제작은 상기 HMGa1 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편 대신, eHU 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 pET12b-Zif268-cherry 벡터에 삽입시킨 것을 제외하고는 상기 방법과 동일하게 제작하였으며(제작한 벡터는 pET12b-Zif268-eHU-cherry로 명명함), eHU 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 서열 번호 7 및 서열 번호 8에 기재하였다.

상기 제조한 pET12b-Zif268-HMGa1-cherry 또는 pET12b-Zif268-eHU-cherry 벡터를 이용하여 단백질을 과발현시키기 위해, 상기 벡터를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환시켰다. 이때, 배양액으로 암피실린(50 ㎍/㎖)을 첨가한 LB 배지를 사용하며, 흡광도 600 nm에서 O.D.값이 0.5일 때 0.5 mM의 IPTG를 넣고 25 ℃에서 16시간 동안 더 배양하였다. 상기 배양하여 얻은 세포를, 25 mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0) 하에서 초음파로 분쇄한 후, 원심분리기(10,000 x g)를 이용하여 상층액을 얻었다. 상기 상층액을 상기 완충액으로 평형화된 Ni²⁺-NTA superflow 칼럼(Qiagen)에 적용하고, 컬럼 부피의 5배에 해당하는 세척 완충액으로 세척한 다음, 용출 완충액(25 mM Tris-HCl, pH 8.0; 2.5 mM β-머캅토에탄올; 125 mM 이미다졸; 및 150 mM NaCl)으로 상기 단백질을 용출하였다. 상기 단백질이 포함된 분획들을 모아 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter(Milipore)를 이용하여 분획 중에 포함된 염을 제거하고 농축하였다. 농축된 융합 단백질을 보관액 A(25 mM Tris-HCl, pH 8.0; 2.5 mM β-머캅토에탄올; 125 mM 이미다졸; 150 mM NaCl; 및 50% 글리세롤) 또는 보관액 B(20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM DTT; 100 mM NaCl; 및 50% 글리세롤)에 녹여 보관하였다. 정제된 단백질 농도는 BSA를 표준 물질로 사용하여 측정하였다. 도 3에서 나타낸 바와 같이, 상기 2종의 융합 단백질은 약 35 kDa의 분자량을 가지며, 높은 순도로 정제되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 융합 단백질의 표적 핵산에 대한 결합력 측정

실시예 1에서 제조된 융합 단백질의 표적 핵산 염기 서열에 대한 친화력(affinity)을 측정하기 위하여 표면 플라스몬 공명 장치(Surface Plasmon Resonance, SPR, Biacore)를 사용하였다. CM5 칩 상에 표적 핵산(서열 번호 9)을 고정시킨 후, 실시예 1에서 제조한 융합 단백질을 마이크로유동 챔버 내로 통과시켰다. 상기 실험을 통해 제조사의 프로토콜에 따라 K_d 값을 계산하였으며, 실시예 1에서 제조된 융합 단백질(HMGa1 도메인이 융합된 단백질, eHU 단백질이 융합된 단백질)의 K_d값은 각각 140 nM, 860 nM로 판명되었다. 이는 제한 효소가 인식 서열에 결합하는 정도의 결합으로서, 이러한 결과로 볼 때, 실시예 1에서 제조한 융합 단백질은 상기 표적 핵산과 친화력이 충분히 높음을 알 수 있었다.

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Kit and method for determining nucleotide sequence of target nucleic acid <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcheery F primer <400> 1 gggcggatcc ggtggcagcg gcggttcgat ggtgagcaag ggcgag 46 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcheery R primer <400> 2 ggtgctcgag cttgtacagc tcgtccatg 29 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZIF268F primer <400> 3 tatacatatg gaacgcccgt atgcttgccc t 31 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZIF268R primer <400> 4 accggatccg cccgagccac cgctaccgcc gtccttctgt cttaaatgga 50 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGF primer <400> 5 aactacaaat accgaaaagg ggagacaaaa aagaagt 37 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMGR primer <400> 6 tttagctcga tatgcagcaa ta 22 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying polynucleotide encoding eHU protein <400> 7 gggggcggtg gcggtaacaa gactcaactg attgatg 37 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying polynucleotide encoding eHU protein <400> 8 cttaactgcg tctttcagtg c 21 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target polynucleotide immobilized on CM5 chip <220> <221> protein_bind <222> (19)..(24) <223> binding site of ZFP motif <400> 9 gtgtgtgtgt gatctgcgtg ggcggtaag 29 <210> 10 <211> 1056 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding probe binding specifically to the target sequence, "TGGGCG" <220> <221> gene <222> (1)..(196) <223> Zif268-2 <220> <221> misc_feature <222> (197)..(211) <223> 5x Gly tag <220> <221> gene <222> (212)..(286) <223> HMGa1 domain <220> <221> misc_feature <222> (287)..(331) <223> linker <220> <221> gene <222> (332)..(1035) <223> DsRed(mcherry) <220> <221> misc_feature <222> (1036)..(1053) <223> His tag <400> 10 atggaacgcc cgtatgcttg ccctgtcgag tcctgcgatc gccgcttttc tcgctcggat 60 gagcttaccc gccatatccg catccacaca ggccagaagc ccttccagtg tcgaatctgc 120 atgcgtaact tcagtcgtag tgaccacctt accacccaca tccgcaccca cacaggcgag 180 aagcccgggg gcggtggcgg tgtgccaaca cctaagagac ctcggggccg accaaaggga 240 agcaaaaaca agggtgctgc caagacccgg aaaaccgggg gtagcggtgg ctcgggcgga 300 tccggtggca gcggcggttc gatggtgagc aagggcgagg aggataacat ggccatcatc 360 aaggagttca tgcgcttcaa ggtgcacatg gagggctccg tgaacggcca cgagttcgag 420 atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac gagggcaccc agaccgccaa gctgaaggtg 480 accaagggtg gccccctgcc cttcgcctgg gacatcctgt cccctcagtt catgtacggc 540 tccaaggcct acgtgaagca ccccgccgac atccccgact acttgaagct gtccttcccc 600 gagggcttca agtgggagcg cgtgatgaac ttcgaggacg gcggcgtggt gaccgtgacc 660 caggactcct ccctgcagga cggcgagttc atctacaagg tgaagctgcg cggcaccaac 720 ttcccctccg acggccccgt aatgcagaag aagaccatgg gctgggaggc ctcctccgag 780 cggatgtacc ccgaggacgg cgccctgaag ggcgagatca agcagaggct gaagctgaag 840 gacggcggcc actacgacgc tgaggtcaag accacctaca aggccaagaa gcccgtgcag 900 ctgcccggcg cctacaacgt caacatcaag ttggacatca cctcccacaa cgaggactac 960 accatcgtgg aacagtacga acgcgccgag ggccgccact ccaccggcgg catggacgag 1020 ctgtacaagc tcgagcacca ccaccaccac cactga 1056

Claims

표적 핵산 내에서 n개의 염기로 이루어진 임의의 염기 서열에 특이적으로 결합하는 제1 단백질; 상기 제1 단백질의 말단에 연결되며, 상기 표적 핵산의 상기 임의의 염기 서열과 인접한 마이너 그루브(minor groove)에 비특이적으로 결합하는 제2 단백질; 및 상기 제2 단백질의 말단에 연결된 검출 가능한 표지로 이루어진 핵산 결합 프로브를 2 이상 포함하는 것으로, 상기 핵산 결합 프로브는 4ⁿ 종류이고, 상기 n은 3 내지 12의 정수인 것인, 표적 핵산의 염기 서열을 결정하기 위한 키트.
제1항에 있어서, 상기 n은 6인 것인 키트.
제1항에 있어서, 상기 제1 단백질은 징크 핑거(zinc finger) 모티프, 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix) 모티프, 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix) 모티프, 류신 지퍼(leucine zipper) 모티프, 제한 효소(restriction endonuclease)의 핵산 결합 모티프, TBP 도메인 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산 결합 모티프를 포함하는 것인 키트.
제1항에 있어서, 상기 제1 단백질은 2개의 징크 핑거 모티프를 포함하는 것인 키트.
제1항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 색깔 비드(colored bead), 발색물질, 형광물질, 인광물질, 전기적으로 검출 가능한 분자, 변경된 형광-분극 또는 변경된 빛-확산을 제공하는 분자 및 양자점으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
제1항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Cy2, Cy3.18, Cy3.5, Cy3, Cy5.18, Cy5.5, Cy5, Cy7, mcheery, Oregon Green, Oregon Green 488-X, Oregon Green, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 15, SYTO 16, SYTO 17, SYTO 18, SYTO 20, SYTO 21, SYTO 22, SYTO 23, SYTO 24, SYTO 25, SYTO 40, SYTO 41, SYTO 42, SYTO 43, SYTO 44, SYTO 45, SYTO 59, SYTO 60, SYTO 61, SYTO 62, SYTO 63, SYTO 64, SYTO 80, SYTO 81, SYTO 82, SYTO 83, SYTO 84, SYTO 85, SYTOX Blue, SYTOX Green, SYTOX Orange, SYBR Green YO-PRO-1, YO-PRO-3, YOYO-1, YOYO-3 및 티아졸 오렌지(thiazole orange)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
제1항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 제2 단백질의 말단과 링커를 통해 연결된 것인 키트.
제1항에 있어서, 제2 단백질은 호메오 박스(homeobox) 단백질, HMG(high mobility group) 단백질, HU 단백질, 히스톤 폴드(histone fold) 단백질 및 폴리머라아제 크레프트(polymerase cleft) 단백질, 시퀀스 비특이적 징크핑거 xfin31(sequence non specific zincfinger xfin31), β-배럴(β-barrel) CspA, 아르기닌 리치 지역(arginine rich region) 및 RGG 모티프를 포함하는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
염기 서열을 결정하고자 하는 표적 핵산과 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 키트에 포함되어 있는 핵산 결합 프로브를 접촉시키는 단계;
상기 핵산 결합 프로브에 결합된 검출 가능한 표지로부터 신호를 검출하는 단계; 및
상기 검출된 신호를 염기 서열로 변환하는 단계를 포함하는, 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 표적 핵산은 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드인 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 표적 핵산은 100 bp 내지 10 Mb의 길이를 갖는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 표적 핵산은 검출 가능한 표지를 더 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 색깔 비드(colored bead), 발색물질, 형광물질, 인광물질, 전기적으로 검출 가능한 분자, 변경된 형광-분극 또는 변경된 빛-확산을 제공하는 분자 및 양자점으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Cy2, Cy3.18, Cy3.5, Cy3, Cy5.18, Cy5.5, Cy5, Cy7, mcheery, Oregon Green, Oregon Green 488-X, Oregon Green, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, SYTO 11, SYTO 12, SYTO 13, SYTO 14, SYTO 15, SYTO 16, SYTO 17, SYTO 18, SYTO 20, SYTO 21, SYTO 22, SYTO 23, SYTO 24, SYTO 25, SYTO 40, SYTO 41, SYTO 42, SYTO 43, SYTO 44, SYTO 45, SYTO 59, SYTO 60, SYTO 61, SYTO 62, SYTO 63, SYTO 64, SYTO 80, SYTO 81, SYTO 82, SYTO 83, SYTO 84, SYTO 85, SYTOX Blue, SYTOX Green, SYTOX Orange, SYBR Green YO-PRO-1, YO-PRO-3, YOYO-1, YOYO-3 및 티아졸 오렌지(thiazole orange)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 신호를 검출하는 단계는 상기 핵산 결합 프로브에 결합된 검출 가능한 표지와 상기 표적 핵산에 표지된 검출 가능한 표지 사이의 형광 공명 에너지 전이(FRET)에 의해 발생하는 신호를 검출하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 변환하는 단계 이후, 상기 변환된 염기 서열을 사용자에게 출력하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.