KR20140055776A

KR20140055776A - 제초제 저항성 pat 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20140055776A
Application number: KR1020120123071A
Authority: KR
Inventors: 김양훈; 이문종; 이상희
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2012-11-01
Filing date: 2012-11-01
Publication date: 2014-05-09
Also published as: KR101432897B1

Abstract

본 발명은 제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하는 활성을 가짐으로써, 예를 들어 농산품, 가공식품 등의 시료에서 신속하게 제초제 저항성 PAT 단백질을 검출하고 진단하는 데 유용한 정보를 제공할 수 있다.

Description

제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도{DNA aptamer specifically binding to herbicide-resistance PAT protein and uses thereof}

본 발명은 제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(Aptamer) 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 자세하게는 SELEX 선별기법을 이용하여 선별과정을 거친 최적화된 DNA 앱타머를 이용한 환경의 제초제 저항성 작물을 신속, 정확하게 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.

1973년 코헨과 보이어에 의해 개발된 유전자 재조합 기술은 새로운 유전자를 재조합하여 새로운 기능을 부여하는 기술로, 기존에 연구가 많이 진행된 대장균을 통해 재조합된 단백질을 얻어내는 것이 가장 대표적인 예이다. 이는 체내에서 소량만 생산되거나, 획득하기 힘든 단백질 및 고가의 단백질 등을 확보하는 기술로 발전되어 왔으며, 특히 인슐린을 발현하는 유전자를 대장균 내에 삽입하여 인슐린 단백질을 얻어내는 기술이 알려져 있다. 현재는 연구 목적으로 특정 균에 항생제 저항성을 부여하여 특이적으로 균을 선별할 수 있는 기술로도 사용되고 있다.

한편, 18세기 이전만 해도 2~3억 명에 불과했던 세계의 인구는 18세기 후반 산업혁명과 더불어 의학 기술과 농업 기술의 발전에 따라 급격하게 증가하여 2012년 현재 인구가 70억 명이 넘지만 농업에 종사하는 인구의 비율은 오히려 줄어들어 농민 1인이 부양해야 하는 인구가 계속적으로 늘어나고 있는 추세이다. 따라서, 지금보다 혁신적인 농업기술이 절실히 요구되고 있으며 과학기술의 발전이 맞물려 유전자 재조합 기술을 이용한 작물을 생산하기에 이르렀다.

유전자 재조합 기술이 적용된 작물 중 가장 대표적인 사례는 bar 유전자에 의해 발현되는 형질인 제초제 저항성 형질을 이용하는 것이다. 제초제 저항성 형질은 제초제를 처리 시 제초제 저항성 형질을 획득한 목적 작물만을 선택적으로 재배하는 기술로 단기적으로 수확량을 늘리는 결실을 얻게 되었다. 그러나, 유전자 재조합 작물이 가지는 이러한 장점에도 불구하고, 제초제 저항성 유전자 재조합 작물은 치명적인 위험성도 가지고 있다. 1997년 Bt-toxin 제초제와 이에 대한 내성을 지닌 유전자 재조합 작물인 일명 ‘Bt-옥수수’가 개발되었는데 이를 먹은 조명나방 애벌레의 천적인 풀잠자리 애벌레의 높은 치사율을 나타냈으며, 1999년에는 Bt-옥수수의 화분을 먹은 monarch 나비애벌레의 치사율이 44%에 달했다는 연구결과가 발표된 바 있다. 이로 인해 유전자 재조합 작물과 치사율간의 상호관계를 보다 심층적으로 분석할 필요성이 제기되었으나, 유전자 재조합 작물에 대한 안전성을 확보할 수 없다는 사실과 유전자 재조합 작물의 위험성에 대한 인식이 확산되었다. 특히, 유전자 재조합 작물이 무분별하게 사용되는 것을 방지하기 위해 대부분의 국가에서는 정책의 일환으로 유전자 재조합 식품 등에 별도의 표시를 하도록 규정하고 있지만, 이 표시제에는 비의도적 혼입률이 존재하여 일정 기준치 이상으로 존재할 때만 유전자 재조합 재료 사용 제품임을 표시하는 등의 매우 제한적이다. 또한, 국내에서는 유전자 재조합 작물을 검출하기 위하여 PCR을 이용한 검출법과 유전자 재조합 단백질의 항체를 스트립(strip)에 결합시켜 항원-항체 반응을 이용하여 확인하는 검출법 및 ELISA법 등의 방법을 이용하고 있으나 이들 방법은 노동집약적일 뿐만 아니라 민감도가 떨어져 정확한 진단에 어려움이 있다.

따라서, 본 발명에서는 제초제 저항성 PAT 단백질을 이용하여 제초제 저항성 작물을 검출하기 위한 방법을 제시하고자 하며, 이를 위하여 특정 표적 물질에 특이적으로 결합하는 앱타머(Aptamer)를 개발하여 PAT 단백질과의 강한 결합을 형성하게 되고 이를 이용한 검출법을 이용하여 환경 시료 내 제초제 저항성 PAT 단백질을 검출함으로써 유전자 재조합 작물의 여부를 신속하게 검출할 수 있는 기술을 제안하고자 한다.

대한민국 공개특허 제10-2012-0081762호

본 발명자들은 잠재적 위험성을 가지고 있는 환경 내의 유전자 재조합 작물을 신속하게 검출하는 데 사용될 수 있도록 제초제 저항성 PAT 단백질에 높은 특이도로 결합하는 DNA 앱타머(Aptamer)를 개발하였으며, 특히 선별된 앱타머의 특이성 및 응용 가능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(Aptamer)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 제초제 저항성 PAT 단백질 검출방법 및 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 DNA 앱타머를 함유하는 식물, 식품 조성물에서의 제초제 저항성 유전자를 검출하는 센서를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 식품 속의 제초제 저항성 PAT 단백질의 검출 진단 키트를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하고, 서열번호 1 내지 29로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머(Aptamer)를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오타이드의 리보스 2′위치의 하이드록실기가 수소원자, 불소원자, -0- 알킬기, -0- 아실기 또는 아미노기로 치환되는 화학적 변형을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 제초제 저항성 PAT 단백질 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은,

(a) 표면상에 고정되어 있고 표적물질에 특이적으로 결합하는 제 1 앱타머에 표적 물질을 함유하는 시료와 상기 표적 물질에 특이적으로 결합하며 표지 물질이 부착되어 있는 제 2 앱타머를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (b) 상기 표지물질을 분석하여 표적물질을 검출하는 단계;를 포함하는, 본 발명의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 제초제 저항성 PAT 단백질의 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기표지물질은 형광물질일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표지물질의 분석은 형광물질의 발광 또는 발광세기 및 색변화를 측정하여 수행하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 제초제 저항성 PAT 단백질의 검출용 센서를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서. 상기 센서는 DNA 앱타머가 gold 표면, glass 표면, 96웰 플레이트(96-well plate) 기판 또는 마이크로어레이 칩에 고정된 형태를 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 제초제 저항성 PAT 단백질 검출용 키트를 제공한다.

나아가 본 발명은,

(a) 제초제 저항성 PAT 단백질을 함유하는 것으로 예상되는 시료와 본 발명의 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및 (b) 제초제 저항성 PAT 단백질과 결합된 상기 DNA 앱타머를 확인하는 단계를 포함하는, 제초제 저항성 PAT 단백질의 키트 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 앱타머와 제초제 저항성 PAT 단백질을 함유하는 시료를 혼합 시 색을 나타낼 수 있는 발색물질을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발색물질은 골드 나노물질일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, (b) 단계는 표지물질이 부착되어 있는 앱타머와 앱타머에 고정된 표지물질에 상보적으로 결합하는 물질이 결합되는 과정을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 표지물질은 바이오틴, 스트렙트아비딘, 아미노기 또는 카르복실기일 수 있다.

이와 같이, 본 발명은 제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하는 활성을 가짐으로써, 예를 들어 농산품, 가공식품 등의 시료에서 제초제 저항성 작물을 검출, 진단하는 데 유용한 정보를 제공할 수 있다.

도 1은 bar 유전자를 클로닝할 pGEX-4T-1 벡터와 제초제 저항성 PAT 단백질을 발현하는 bar유전자를 클로닝하기 위하여 BamH I과 Xho I을 처리한 후, 1% 아가로스 젤로 확인한 결과를 나타낸다. 레인 1: 1 kbp DNA size 마커; 레인 2: 제한효소 처리한 pGEX-4T-1 벡터의 결과; 레인 3: PCR 후에 제한효소 처리한 bar 유전자의 결과; 레인 4: 100 bp DNA size 마커의 결과이다.
도 2는 PAT 단백질의 최적의 발현조건을 확인하기 위하여 IPTG의 농도를 다르게 하여 발현한 후에 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과를 나타낸다. 레인 1: 단백질 size 마커 (mid-range, Elpis); 레인 2: non-IPTG 활성형 단백질의 결과; 레인 3: non-IPTG 비활성형 단백질의 결과; 레인 4: 0.1 mM IPTG 활성형 단백질의 결과; 레인 5: 0.1 mM IPTG 비활성형 단백질의 결과; 레인 6: 1 mM IPTG 활성형 단백질의 결과; 레인 7: 1 mM IPTG 비활성형 단백질의 결과이다.
도 3은 발현된 PAT 단백질을 GST system을 이용하여 정제한 후에 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과를 나타낸다. 레인 1: 단백질 size 마커 (mid-range, Elpis); 레인 2: GST system을 이용하여 정제한 단백질의 결과; 레인 3: 정제한 단백질을 1× PBS 완충용액으로 투석한 단백질의 결과이다.
도 4는 무작위 DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 후, 스트렙트아비딘 아가로스 레진을 이용하여 ssDNA만을 선택적으로 회수한 결과와 PCR로만 증폭한 결과를 나타낸다. 레인 1: 100 bp DNA size 마커; 레인 2: DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 결과; 레인 3: PCR 기법으로 증폭한 DNA 앱타머를 스트렙트아비딘 아가로스 레진을 이용하여 ssDNA만을 회수한 결과이다.
도 5는 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머 제작을 위한 SELEX 과정 후 선별된 round에서 확보한 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머 후보군들의 용리액을 round별로 나노드랍을 이용하여 정량적으로 측정한 결과이다.
도 6은 제초제 저항성 PAT 단백질을 고정시키기 위하여 센서칩(Sensor chip) CM5의 표면을 EDC / NHS 완충용액을 이용하여 활성화시키고 PAT 단백질을 고정시켜 제초제 저항성 PAT 단백질 앱타머를 PAT 단백질과 결합시키는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 7은 m-fold 프로그램을 이용하여 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머 HRPA-05, HRPA-07, HRPA-28의 예상 구조를 나타낸 것이다.
도 8은 확보한 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머를 이용하여 육안으로 신속하게 확인하는 산업적 응용을 하기 위하여 나타낸 모식도이다. 스트렙트아비딘이 고정된 기판(a)에 바이오티닐화된 앱타머를 고정시키고(b), 제초제 저항성 PAT 단백질을 DNA 앱타머에 결합시킨 후에(c) 형광물질을 붙인 DNA 앱타머를 결합시켜(d) 형광을 확인하는 방법을 나타낸 것이다.
도 9는 기판 위에 DNA 앱타머와 스트렙트아비딘을 고정시킨 후 시료주입구에 시료를 주입하여 capture line과 control line에 나타난 표지를 확인하여 제초제 저항성 PAT 단백질의 존재 여부를 확인하는 방법을 나타낸 것이다. (a)는 기판에 스트렙트아비딘과 앱타머를 고정시킨 모형을 모의적으로 나타낸 것이고, (b)는 모형의 모식도를 나타낸 것이다.

본 발명의 명세서에서 용어 “DNA 앱타머(Aptamer)”라 함은 특정 표적물질에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미한다. 본 명세서에서 “DNA 앱타머”는 “DNA 올리고뉴클레오타이드”와 혼용하여 사용한다.

본 명세서에서 용어 “올리고뉴클레오타이드”는 일반적으로 길이가 약 200개 미만을 갖는 뉴클레오타이드 중합체를 지칭하며, 이에는 DNA 및 RNA가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 DNA 핵산 분자이다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질이 해당된다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드 중합체의 합성 전·후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 합성 후에 (예를 들어 표지와의 결합) 추가로 변형시킬 수 있다.

본 발명의 DNA 앱타머는 전형적으로는 표적 물질의 결합에 대한 시험관 내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 표적 물질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 생균 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 표적 물질이 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체 내 또는 시험관 내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 본 명세서에서 “SELEX 방법”이란 임의적으로 합성된 DNA의 집합에서 특정 물질에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 물질의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법을 의미한다(Louis et al. 1992. Nature 355, 564-566).

하기 본 발명의 구체적인 일실시예에 의하면, 본 발명의 DNA 앱타머는 다음의 단계를 통해 선별된다:

(ⅰ) 제초제 저항성 PAT 단백질을 발현하기 위해 준비하는 단계; (ⅱ) PCR (Polymerase Chain Reaction) 기법을 이용하여 DNA 앱타머를 증폭하고, ssDNA 앱타머를 제조하는 단계; (ⅲ) 발현된 제초제 저항성 PAT 단백질을 이용한 SELEX 기법을 통해 제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계; (iv) 선별된 앱타머의 특성을 분석하는 단계

(ⅰ) 제초제 저항성 PAT 단백질을 준비하는 단계.

환경에 존재하는 제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하는 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머를 제작하기 위하여 먼저 PAT 단백질을 코딩하고 있는 bar 유전자를 증폭하여 확보한다. NCBI의 데이터베이스에 알려져 있는 bar 유전자 서열을 이용하여 프라이머를 제작하고 PCR 기법을 이용하여 증폭한다. 증폭된 유전자는 pGEX-4T-1 벡터와 동일한 제한효소를 처리하여 절단 후 결합(ligation)하여 E. coli DH5α에 형질전환한다. 재조합된 형질전환체에서 IPTG induction을 이용하여 PAT 단백질의 과발현을 유도한 후, GST system을 이용하여 PAT 단백질을 정제하여 확보한다.

(ⅱ) PCR 기법을 이용하여 DNA 앱타머를 증폭하고, ssDNA 앱타머를 제조하는 단계.

PCR을 이용하여 무작위 dsDNA 라이브러리를 증폭한다. 증폭된 무작위 dsDNA 라이브러리에서 ssDNA 만을 증폭하기 위해 비대칭 PCR을 수행한다. 비대칭 PCR은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 10 : 1 비율(예를 들면, 동일한 농도(25 μM)에서 정방향 프라이머를 10 ㎕, 역방향 프라이머 1 ㎕)을 사용하여 PCR을 수행함으로써 단일가닥 DNA를 수득하는 방법이다. ssDNA 앱타머를 선별하는 방법은 예를 들면, PCR 수행시 역방향 프라이머에 바이오틴(biotin)을 부착시켜 dsDNA를 증폭하고, 증폭 산물에 스트렙트아비딘을 처리하여 바이오틴-스트렙트아비딘 복합체를 형성하여 복합체를 선택적으로 제거함으로써 ssDNA 앱타머만을 선별할 수 있게 된다. 제조한 ssDNA 앱타머는 SELEX 방법에 사용하기 위해 ssDNA를 가열하여 변성시킨 후 상온에서 천천히 식혀 3차원 구조를 형성시킨다.

(ⅲ) 발현된 제초제 저항성 PAT 단백질을 이용한 SELEX 기법을 통해 제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계.

상기 준비한 제초제 저항성 PAT 단백질과 ssDNA 앱타머를 서로 접촉하여 반응시킨 후, 결합하지 않는 ssDNA 앱타머는 세척하여 제거하고 PAT 단백질에 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머만을 용출시킨다.

(iv) 선별된 앱타머의 특성을 분석하는 단계.

상기의 SELEX 과정을 수행하여 선별된 앱타머는 PAT 단백질과의 결합력을 확인하기 위한 나노드랍을 이용하여 용리된 앱타머의 농도 확인 및 SPR(Surface Plasmon Resonance) 분석을 통해 정량적으로 결합력을 확인한다. 또한 선별된 앱타머의 2차원 구조의 확인을 위한 구조 분석을 수행한다.

본 발명의 방법에서는 제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머가 최대로 용출되는 최적의 SELEX 라운드(Round)를 선택하기 위해 용출된 ssDNA를 나노드랍 방법으로 정량하는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에서 최적 SELEX 라운드 중 제초제 저항성 PAT 단백질과 최적 결합력을 보이는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 최적 SELEX 라운드 선별과 마찬가지로 최적 라운드에서 확보한 앱타머 서열 각각을 모두 확보하여 동일한 농도의 ssDNA로 제작 후 SELEX를 진행한 뒤 용리된 앱타머 농도를 나노드랍 방법을 통해 측정함으로서 최적 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머를 선별하였다.

본 발명의 DNA 앱타머는 바람직하게는 서열목록 제 1 서열 내지 제 29서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.

한편, 본 발명의 서열목록 제 1 서열 내지 제 29 서열의 앱타머 중 가장 특이성이 높았던 제 5 서열과 제 7 서열, 제 28 서열의 2차 구조는 도 9에 도시된 2차 구조를 형성할 것으로 추정된다.

본 발명의 DNA 앱타머는 제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하는 특성을 유지하면서, 상기 서열목록 제 1 서열 내지 제 29 서열 중 어느 하나의 염기서열과 실질적인 동일성을 나타내는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드도 포함하는 것으로 해석된다.

본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 제초제 저항성 PAT 단백질의 검출용 조성물에 관한 것이다. 하기 본 발명의 구체적인 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 DNA 앱타머는 제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하므로, 다양한 환경에 존재하는 제초제 저항성 작물의 존재 여부를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 제초제 저항성 PAT 단백질의 검출 방법에 관한 것이다: (a) 제초제 저항성 PAT 단백질을 함유하는 것으로 예상되는 시료와 상기 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; (b) 제초제 저항성 PAT 단백질과 결합된 상기 DNA 앱타머를 확인하는 단계.

본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 제초제 저항성 작물이 가지고 있는 제초제 저항성 PAT 단백질 검출 센서에 관한 것이다. 상기 검출 센서는 제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태로 제공될 수 있으며, 고정화된 칩은 glass, gold, plate, 마이크로어레이 등의 제조체 저항성 검출용 DNA 앱타머가 고정될 수 있는 형태로, 상기에 한정되지는 않는다. DNA 앱타머를 칩이나 기판 상에 고정화시키는 것은 당 업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 칩 또는 기판을 EDC / NHS로 개질하고, 획득한 PAT 단백질의 N-terminal의 NH₂ 잔기를 이용하여 기판에 고정화하여 사용될 수 있다.

본 발명은 식품 조성물 속의 제초제 저항성 PAT 단백질의 검출 할 수 있는 상기의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 검출용 진단 키트에 관한 것이다. 이때, 상기의 방법은 상기 DNA 앱타머와 식품, 음료 추출물, 조미료, 식품첨가제 등의 제초제 저항성 유전자로 형질전환 가능한 식물을 포함하는 중에서 선택되는 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 DNA 앱타머는 제초제 저항성 PAT 단백질에 결합하는 능력이 매우 뛰어나므로 DNA 앱타머와 제초제 저항성 PAT 단백질을 함유할 것으로 예상되는 시료를 접촉시켜 제초제 저항성 작물을 검출할 수 있다. 상기 DNA 앱타머에 결합된 제초제 저항성 PAT 단백질의 검출은 DNA 앱타머와 제초제 저항성 PAT 단백질 결합 복합체를 검출하는 방법에 기초할 수 있다. 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 DNA 앱타머가 형광물질, 예를 들어 플루오레세인(fulorescein), Cy3 또는 Cy5; 방사성물질, 또는 화학물질, 예를 들어 바이오틴(biotin)으로 표지되거나 1차 아민(primary amine)으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 제초제 저항성 PAT 단백질이 포함될 것으로 예상되는 시료는 예를 들어 농산품, 가공식품 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

제초제 저항성 PAT 단백질의 발현 시스템 구축

<1-1> PCR 을 이용하여 환경시료로부터 bar 유전자의 선택적 증폭

제초제 저항성 PAT 단백질 발현을 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. pGEX-4T-1 벡터에 클로닝할 목적으로 제한효소 BamH I과 Xho I의 서열을 정방향(Forward, sense)과 역방향(Reverse, antisense) 프라이머에 각각 삽입하였다(정방향 프라이머 : 5'- AATGGATCCATGAGCCCAGAACGACGCCC -3', 역방향 프라이머 : 5'- AGACTCGAGTCAGATCTCGGTGACGGGCA 3'). 다음으로 제초제 저항성 작물의 추출물과 기 확보한 프라이머를 이용하여 bar 유전자를 증폭하기 위한 PCR을 진행하였다. PCR 반응 조성으로는 10× PCR 완충용액 5 ㎕, 각 2.5 mM dNTP mixture 4 ㎕, 10 pM 정방향 프라이머 2 ㎕, 역방향 프라이머 2 ㎕, 제초제 저항성 작물 추출물 1~2 ㎕, Ex Taq 중합효소(TaKaRa, Japan) 0.3 ㎕(1 unit/㎕)와 증류수 34.7~35.7 ㎕로 구성하였다. PCR 반응 조건은 먼저 94℃에서 5분간 변성시킨 후에, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 3 ㎕를 취하여, 2% 아가로오스 겔을 이용하여 정확한 크기인 76 bp에서 밴드가 나타나는지 확인하고 확인된 DNA는 PCR 정제 키트(Qiagen, USA)를 이용하여 bar 유전자를 회수하였다.

<1-2> bar 유전자와 pGEX -4T-1 벡터의 클로닝 준비

기 확보한 bar 유전자를 이용하여 제초제 저항성 PAT 단백질을 발현시키기 위하여 pGEX-4T-1 벡터에 클로닝을 수행하기에 앞서, PCR로 증폭하여 확보한 bar 유전자와 pGEX-4T-1 벡터는 제한효소 BamH I과 Xho I을 이용하여 잘라내었다. 제한효소 반응 조성으로는 bar 유전자 PCR 산물 또는 pGEX-4T-1 벡터 172 ㎕, BamH I (Roche, USA) 4 ㎕(40 unit/㎕), Xho I(Roche, USA) 4 ㎕(40 unit/㎕), 10× 제한효소 완충용액 20 ㎕로 구성하였다. 제한효소 반응 조건은 37℃에서 2시간동안 반응시킨 후 65℃에서 15분간 불활성화하였고, 제한효소 반응 후 3 ㎕를 취하여, 1% 아가로오스 겔을 이용하여 확인하였다

그 결과, 도 1에서 나타낸 바와 같이, pGEX-4T-1 벡터의 크기인 약 5 kbp와 bar 유전자 크기인 약 80 bp에서 밴드가 정확한 위치에서 발현되는 것을 확인하였다(레인 1: 1 kbp DNA size 마커; 레인 2: 제한효소 처리한 pGEX-4T-1 벡터의 결과; 레인 3: PCR 후에 제한효소 처리한 bar gene의 결과; 레인 4: 100 bp DNA size 마커).

<1-3> bar 유전자를 발현벡터인 pGEX -4T-1 벡터에 클로닝

1% 아가로오스 겔에서 확인한 밴드의 선명도와 실제 DNA 사이즈를 비교하여 비율을 결정하였다. bar 유전자 PCR 산물과 pGEX-4T-1 벡터의 사이즈 비율이 1:10 임을 감안하여 클로닝의 반응 조성으로는 bar gene PCR 산물 0.5 ㎕, pGEX-4T-1 벡터 7.5 ㎕, 5X 클로닝 완충용액 2 ㎕로 구성하였고, 반응 조건으로는 16℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 65℃에서 15분간 불활성화하였으며, 클로닝 여부를 확인하기 위하여 클로닝 벡터를 bar 유전자 증폭용 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 이용하여 증폭하여 bar 유전자가 제대로 삽입되었는지 확인하였다.

<1-4> 클로닝 벡터로부터 PAT 단백질을 발현하기 위한 형질전환

클로닝이 확인된 단일 클론으로부터 PAT 단백질을 발현시키기 위하여 클로닝 벡터를 E. coli BL21(DE3) 수용성 세포(competent cell)에 형질전환을 수행하였다. 형질전환의 반응 조성으로는 E. coli BL21 수용성 세포 100 ㎕, 클로닝 벡터 10 ㎕, LB(Luria Bertani) 배지(Broth) 900 ㎕로 구성하였고, 반응 조건으로는 E. coli BL21 수용성 세포를 얼음 상에 보관한 상태로 클로닝 벡터 10 ㎕를 첨가하여 30분간 반응시키고 전기천공법(electroporation)용 큐벳에 옮겨 전기충격을 수행하여 형질전환을 하였다. 이후에 LB 배지 900 ㎕를 넣고 37℃ 교반배양기에서 1시간동안 반응한 후, 형질전환 여부를 확인하기 위하여 X-gal과 IPTG가 함유된 LB 배지에 배양하여 최종 확인하였다.

제초제 저항성 PAT 단백질의 발현 조건 확립

<2-1> IPTG ( isopropylthio -β-D- galactoside ) induction 을 이용한 제초제 저항성 PAT 단백질 발현 조건 확립

제초제 저항성 PAT 단백질 발현 조건을 확립하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 클로닝된 단일 클론의 Lac 오페론(operon)을 이용하여 IPTG를 첨가하여 클로닝된 PAT 단백질의 과발현을 유도하였다. 반응 조성으로는 LB 배지 10 ㎖, 1M IPTG를 각각 0 M, 0.1 mM, 1 mM이 되도록 0 ㎕, 1 ㎕ 및 10 ㎕로 구성하였다. 반응 조건으로는 LB 배지 10 ㎖에 형질전환된 E. coli BL21(DE3)을 100 ㎕씩 접종하고 18℃에서 10시간동안 배양하여 흡광도 600 ㎚(OD₆₀₀)에서 흡광도 값이 0.4에 이르렀을 때에 IPTG가 각 0 M, 0.1 mM 및 1 mM이 되도록 IPTG induction하여 20시간동안 18℃에서 배양한 후 배양액은 4℃에서 8,000rpm으로 10분간 원심분리하여 균체만을 따로 분리한 후, 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)에 재현탁하여 원심분리를 하였다. 균체를 세척하여 초음파분쇄기로 균체를 파괴한 후, 4℃에서 8,000rpm으로 10분간 원심분리하여 활성형 단백질과 비활성형 단백질로 분리하였다.

<2-2> PAT 단백질의 과발현 확인

IPTG의 양에 따른 발현양의 차이를 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 12% SDS-PAGE 겔에 각 단백질을 전기 영동하였고, 분리겔(separating gel)의 조성으로는 용액 A 2.4 ㎖, 용액 B 1.5 ㎖, 증류수 2.1 ㎖, 10% APS 25 ㎕. TEMED 2.5 ㎕로, 축적겔(stacking gel)의 조성으로는 용액 A 0.33 ㎖, 용액 B 0.5 ㎖, 증류수 1.1 ㎖, 10% APS 15 ㎕, TEMED 2.5 ㎕로 구성하였다. 단백질 샘플의 조성으로는 발현 단백질 10 ㎕와 2× 단백질 완충용액 10 ㎕를 혼합하여 5분간 끓여 준비하여 120V의 전하에서 60분간 전기영동하였다. 겔은 쿠마시 블루(coomassie-blue) 염색약에 5분간 염색한 후, 20분간 탈색 용액(Destaining solution)을 이용하여 밴드를 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, PAT 단백질의 최적의 발현조건을 확인하기 위하여 IPTG의 농도를 다르게 하여 발현한 후에 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과로 원하는 단백질 크기인 약 38 kDa에서 PAT 단백질의 밴드를 확인하였고, 본 발명자는 제초제 저항성 PAT 단백질 발현 조건 확립하였음을 알 수 있었다(레인 1: 단백질 size 마커 (mid-range, Elpis); 레인 2: non-IPTG 활성형 단백질의 결과; 레인 3: non-IPTG 비활성형 단백질의 결과; 레인 4: 0.1 mM IPTG 활성형 단백질의 결과; 레인 5: 0.1 mM IPTG 비활성형 단백질의 결과; 레인 6: 1 mM IPTG 활성형 단백질의 결과; 레인 7: 1 mM IPTG 비활성형 단백질)

제초제 저항성 PAT 단백질의 대량 확보를 위한 실험

<3-1> 제초제 저항성 PAT 단백질의 과발현을 위한 scale - up 조건 확립

상기의 실시예 2에서 확립한 제초제 저항성 PAT 단백질의 발현 조건을 이용하여 제초제 저항성 PAT 단백질의 과발현을 위한 scale-up 실험을 다음과 같이 수행하였다. scale-up 실험의 반응 조성으로는 LB 배지 200 ㎖과 1M IPTG 200 ㎕로 구성하였다. 반응 조건으로는 먼저 제초제 저항성 PAT 단백질의 유전자가 형질전환된 균주를 LB 배지 200 ㎖에 2 ㎖ 접종하여 10시간 동안 배양하여 흡광도 600 ㎚(OD₆₀₀)에서 값이 0.4에 이르렀을 때에 IPTG가 1 mM이 되도록 200㎕의 1 M IPTG를 첨가하여 IPTG induction을 수행하여 20시간동안 반응하였다.

<3-2> GST system 을 이용한 제초제 저항성 PAT 단백질의 정제

다양하게 발현된 단백질 중에서 클로닝 벡터의 특성에 따른 GST 융합 PAT 단백질을 순수분리하기 위하여 GST 정제를 수행하였다. 정제는 GST와 공유결합을 이루는 특성을 지닌 글루타티온 세파로오스 4B(glutathione sepharose 4B)을 이용하였다. 글루타티온 세파로오스 4B를 1× PBS 500 ㎕로 세척하고 원심분리 (4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 상층을 제거하였다. 세척된 글루타티온 세파로오스 4B를 GST 융합 PAT 단백질과 결합시키고 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 상층의 비결합 단백질들을 제거하였다. 순수 분리된 GST 융합 PAT 단백질은 환원된 글루타티온 용액(Reduced glutathione) 100 ㎕를 이용하여 글루타티온 세파로오스 4B와 GST 융합 PAT 단백질을 분리하였다.

<3-3> 제초제 저항성 PAT 단백질의 완충용액 교환을 위한 투석 수행

제초제 저항성 PAT 단백질의 완충용액인 환원된 글루타티온 용액을 1× PBS로 교환하기 위하여 투석을 진행하였다. 투석의 반응 조성으로는 Slide-A-Lyzer dialysis cassette(Thermo scientific, USA)에 주사기(Doowon, Korea)를 사용하여 확보한 PAT 단백질 용액을 주입하였고, 1 ℓ의 1× PBS 완충용액 2회 분을 가지고 진행하였다. 반응 조건으로는 stirrer(Cole-parmer instrument, USA)를 이용하여 1× PBS 완충용액 1 ℓ, 4℃에서 Slide-A-Lyzer dialysis cassette를 1시간동안 교반하는 반응을 총 2회 진행하였다. 이후, 주사기를 사용하여 Slide-A-Lyzer dialysis cassette의 PAT 단백질을 추출하여 확보하였고, 제초제 저항성 PAT 단백질은 bradford assay를 이용하여 단백질의 농도를 측정하였다. 측정된 제초제 저항성 PAT 단백질을 12% SDS-PAGE 겔을 이용하여 확인하였다.

그 결과, 도 3에서 나타낸 바와 같이, 발현된 PAT 단백질을 GST system을 이용하여 정제한 후에 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과로 정제가 잘 되었음을 확인할 수 있었다(레인 1: 단백질 size 마커 (mid-range, Elpis); 레인 2: GST system을 이용하여 정제한 단백질의 결과; 레인 3: 정제한 단백질을 1X PBS 완충용액으로 투석한 단백질)

제초제 저항성 PAT 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 ( Aptamer ) 확보를 위한 DNA 앱타머 풀의 준비

<4-1> 프라이머 및 DNA 앱타머 풀의 합성

제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하는 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머를 제작하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 양 말단에 앱타머 풀을 쉽게 증폭하기 위한 부위로서 5`-ATACCAGCTTATTCAATT의 부위와 3`-AGATTGCACTTACTATCT를 구성하고 중심에는 40개의 연속 무작위 뉴클레오타이드의 비율(dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1)로 가지는 서열의 합성과 이 DNA 라이브러리를 증폭할 수 있는 정방향 프라이머와 단일 가닥 DNA를 회수하기 위한 목적으로 사용할 바이오티닐화된 역방향 프라이머를 제작하였다(정방향 프라이머 : 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3', 바이오티닐화된(biotinylated) 역방향 프라이머 : 5'-바이오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3').

<4-2> PCR 기법을 활용한 DNA 앱타머 풀의 증폭

합성한 프라이머 및 40개의 연속 무작위 서열을 가지는 임의의 DNA 라이브러리를 PCR (Bioneer, Korea)을 이용하여 증폭하였다. 76bp의 DNA 라이브러리의 증폭을 위한 PCR 반응 조성으로는 10× PCR 완충용액 5 ㎕, 각 2.5 mM dNTP mixture 4 ㎕, 10 pM 정방향 프라이머 2 ㎕, 바이오티닐화된 역방향 프라이머 2 ㎕, 주형 DNA 라이브러리 1~2 ㎕, Ex Taq 중합효소(TaKaRa, Japan) 0.3 ㎕(1 unit/㎕)와 증류수 34.7~35.7 ㎕로 구성하였다. PCR 반응 조건은 먼저 94℃에서 5분간 변성시킨 후에, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 3 ㎕를 취하여, 2% 아가로오스 겔을 이용하여 정확한 크기인 76 bp에서 밴드가 나타나는지 확인하였다. 확인된 DNA는 PCR 정제 키트(Qiagen, USA)를 이용하여 DNA 앱타머 풀을 회수하였다.

<4-3> DNA 앱타머 풀의 ssDNA 제작 및 정제

상기한 바와 같이 5' 말단에 바이오티닐화된 dsDNA 앱타머 풀을 ssDNA 앱타머 풀로 제작하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 5' 말단이 바이오티닐화된 dsDNA 앱타머 풀 200 ㎕를 85℃에서 5분간 끓인 후에 얼음에 신속히 냉각시킨 후, 스트렙트아비딘 아가로오스 레진(Streptavidin agarose resin)을 dsDNA 앱타머 풀의 1/2배인 100 ㎕를 넣고 상온에서 스트렙트아비딘과 1시간 이상 반응을 유도하고, 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 스트렙트아비딘 아가로스 레진을 침전시킴으로써 스트렙트아비딘과 바이오틴 결합을 통해 바이오티닐화된 dsDNA 앱타머 풀 중 한쪽 서열을 제거하여 ssDNA 앱타머 풀을 제작하였다. 이후 순수한 ssDNA 앱타머 풀을 확보하기 위하여 상층 200 ㎕를 새 튜브에 옮기고 통상적으로 본 업계에서 사용하는 PCI 처리 및 에탄올 침전법을 활용하였다. 본 방법은 옮긴 ssDNA 앱타머 풀에 동량의 PCI 200 ㎕를 처리하고 교반하여 ssDNA에 잔류하는 지질과 단백질을 제거한 후 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 15분간 수행하여 상층 200 ㎕를 새 튜브에 옮겨 페놀을 제거하였다. 다음으로 에탄올을 DNA양의 3배인 600 ㎕를 넣고 3M Sodium Acetate를 1/10배인 20 ㎕ 그리고 1~2 ㎕의 tRNA를 첨가한 후에 -70℃의 초저온 냉동고(Deep freezer)에 1시간 이상 반응하였다. 그 후에 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 20분간 수행하여 DNA를 침전시키고 상층을 제거한 후에 85℃ Heating block에서 건조시키고 증류수 100 ㎕를 첨가하여 ssDNA 앱타머 풀을 확보하였다.

<4-4> ssDNA 앱타머 풀 확인을 위한 PAGE

스트렙트아비딘과 바이오틴 결합을 통해 회수된 ssDNA 앱타머 풀을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 회수된 ssDNA 앱타머 풀을 0.5× TBE 아크릴아마이드 겔(Acrylamide gel) 상에서 전기영동을 하여 확인하였고, 0.5× TBE (Tris-borate-EDTA) 아크릴아마이드 겔의 조성으로는 40% 아크릴아마이드 3.75 ㎖, 10× TBE buffer 0.75 ㎖을 넣고 증류수로 15 ㎖을 채운 후에 10% APS(Ammonium per sulfate) 용액 135 ㎕, TEMED(Tetramethylethylenediamine) 10.5 ㎕로 구성하였다. 아크릴아마이드 겔에 ssDNA 앱타머 풀 10 ㎕와 DNA loading dye 2 ㎕를 혼합하였고 래더마커(Ladder marker)로는 100 bp DNA 마커를 사용하였다. 제작한 PAGE (Poly-acrylamide Gel Electrophoresis)용 ssDNA 앱타머 풀 확인용 아크릴아마이드 겔을 150 V에 45분간 전기영동하였다. 겔은 ETBR 용액에 5분간 염색한 후에 Gel-doc(Bio-rad, USA)으로 자외선을 조사하여 관찰하였다

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 무작위 DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 후, 스트렙트아비딘 아가로오스 레진을 이용하여 ssDNA만을 선택적으로 회수한 결과와 PCR로만 증폭한 결과를 확인하였다(레인 1: 100 bp DNA size 마커; 레인 2: DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 결과; 레인 3: PCR 기법으로 증폭한 DNA 앱타머를 스트렙트아비딘 아가로스 레진을 이용하여 ssDNA만을 회수한 결과).

<4-5> DNA 앱타머 풀의 구조 제작

PAGE로 확인한 ssDNA 앱타머 풀은 자체 3차원의 구조를 형성하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 기 제작 확보한 ssDNA 앱타머 풀 100 ㎕와 동량의 3% NaCl이 함유된 2× 영양배지(2× Nutrient broth with 3% NaCl) 100 ㎕를 첨가한 후 85℃로 예열된 Heating block에서 5분간 가열하여 ssDNA 앱타머 풀의 변성을 유도하였다. 변성된 ssDNA는 상온에서 2시간 이상 반응하여, 3차원 구조 형성을 유도하였다.

제초제 저항성 PAT 단백질과 특이적으로 결합하는 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머 풀의 선별

<5-1> 구조 형성한 DNA 앱타머 풀과 제초제 저항성 PAT 단백질과의 결합 준비

상기의 실시예 3에서 확보한 제초제 저항성 PAT 단백질과 상기의 실시예 4에서 구조를 형성한 DNA 앱타머 풀을 물리적으로 결합을 유도하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. DNA 앱타머 풀과 제초제 저항성 PAT 단백질의 결합 조성은 10:1의 비율로 결정하고, 확보한 PAT 단백질 10 ㎕(53.04 pmole)과 DNA 앱타머 풀을 13.08 ㎍(530.4 pmole)을 넣어 반응시켰으며, 결합 반응 조건은 총 100 ㎕ 중 제초제 저항성 PAT 단백질 10 ㎕과 1× PBS 완충용액 90 ㎕으로 구성하였다. 또한 구조 형성한 ssDNA의 농도를 13.08 ㎍으로 총 부피가 50 ㎕가 되도록 증류수를 이용하여 조절하였으며, 다음으로 2× PBS 완충용액에 넣어 부피가 총 100 ㎕가 되도록 하였다.

<5-2> 구조 형성한 DNA 앱타머 풀과 제초제 저항성 PAT 단백질과의 결합

결합 준비된 제초제 저항성 PAT 단백질과 구조 형성 ssDNA를 섞어 결합을 유도하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 결합 조건으로는 thermomixer (Eppendorf, Germany)를 이용하여 4℃, 500 rpm에서 1시간동안 반응시킨 후, 결합을 형성한 DNA 앱타머만을 분리하기 위하여 글루타티온 세파로오스 4B를 이용하여 제초제 저항성 PAT 단백질을 회수하였다. 글루타티온 세파로오스 4B 100㎕를 1× PBS 500 ㎕를 이용하여 세척하고 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행한 후, 상층액을 제거하여 글루타티온 세파로오스 4B를 세척하였다.

<5-3> GST system 을 활용한 제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합한 DNA 앱타머 풀의 정제

기 확보한 글루타티온 세파로오스 4B를 제초제 저항성 PAT 단백질과 DNA 앱타머 혼합 용액을 섞어 글루타티온 세파로오스 4B와 GST의 결합을 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 결합 반응의 조성으로는 세척한 글루타티온 세파로오스 4B 100 ㎕를 PAT 단백질과 DNA 앱타머 혼합 용액 200 ㎕에 넣고 thermomixer에서 4℃, 500rpm으로 1시간동안 반응한 후, 10분간 원심분리(4℃, 13,000rpm)하여 상층액을 제거하여 글루타티온 세파로오스 4B와 결합한 DNA 앱타머 결합 제초제 저항성 PAT 단백질을 회수하였다.

<5-4> 글루타티온 세파로오스 4B의 세척 및 DNA 앱타머 결합 제초제 저항성 PAT 단백질의 용출

1× PBS 500 ㎕을 사용하여 글루타티온 세파로오스 4B에 비특이적으로 결합한 물질을 제거하고 세척한 후, 10분간 원심분리(4℃, 13,000rpm)하여 상층액을 제거하는 방법으로 세척을 진행하였다. 그 후에 글루타티온 세파로오스 4B로부터 DNA 앱타머 결합 제초제 저항성 PAT 단백질을 용출시키기 위하여 환원된 글루타티온을 사용하였으며, 환원된 글루타티온 100 ㎕를 글루타티온 세파로오스 4B 100 ㎕에 첨가하여 글루타티온 세파로오스 4B와 결합된 DNA 앱타머 결합 제초제 저항성 PAT 단백질을 용출하였다. 그 후에 10분간 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 수행하여 용출된 DNA 앱타머 결합 제초제 저항성 PAT 단백질 100 ㎕을 회수하였다.

<5-5> DNA 앱타머 결합 제초제 저항성 PAT 단백질로부터 DNA 앱타머 용출하 기 위한 PCI 및 에탄올 침전법 수행

용출된 PAT 단백질에 결합된 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머를 용출하기 위하여 당 업계에서 통상적으로 사용하는 PCI와 에탄올 침전법을 사용하였다. 용출된 100 ㎕의 DNA 앱타머에 동량의 PCI 용액 100 ㎕를 넣고 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 15분간 수행하여 상층액 100 ㎕를 확보한 후, 100% 에탄올 300 ㎕와 3M NaOAC 10 ㎕, tRNA 1 ㎕를 넣고 4℃에서 1시간동안 반응시켰다. 이 후, 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 15분간 수행하여 DNA 앱타머를 침전시키고 상층액을 제거한 후, 튜브를 잘 건조시켜 증류수 50 ㎕를 침전시킨 DNA 앱타머에 넣고 녹여 확보하였다.

제초제 저항성 PAT 단백질과 최적 결합력을 보이는 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머 후보군의 선별

<6-1> 라운드( Round ) DNA 앱타머 풀의 선별 및 확보

상기 기술한 방법을 이용하여 각 라운드의 용리 DNA 앱타머 풀을 이용하여 ssDNA를 제작한 후에 확보한 각 라운드의 ssDNA 앱타머 풀 50 ㎕를 제초제 저항성 PAT 단백질에 넣고 thermomixer에서 4℃, 500rpm의 조건으로 1시간 동안 반응시켰다. 이 후, 튜브를 꺼내 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 구조 형성 ssDNA 앱타머 풀이 결합되어 있는 제초제 저항성 PAT 단백질을 침전시키고 상층액을 제거하였다. 그리고 세척용액 200 ㎕를 넣어 세척한 후에 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 상층액을 제거하는 과정을 3회 수행하고 용출용액 100 ㎕를 넣어 85℃에서 5분간 가열한 후에 원심분리(4℃, 13,000rpm)를 10분간 수행하여 각 라운드의 용출된 DNA 앱타머를 확보하였다.

<6-2> 나노드랍(Nano-drop)을 이용한 각 라운드( round ) 용리 DNA 앱타머 풀의 분석

각 라운드의 DNA 앱타머 풀에 잔류하는 단백질과 지질을 제거하고 DNA만을 회수하기 위하여 당 업계에서 통상적으로 사용하는 PCI 및 에탄올 침전법을 사용하여 정제하였다. 확보한 각 라운드의 DNA 앱타머 풀 1 ㎕를 나노드랍으로 용리 농도를 측정하여 DNA 농도를 확인하였다. 각 라운드에서 확보한 DNA 앱타머 풀의 용리 농도를 비교하여 최적 라운드인 11 라운드를 최종 선별하였다.

그 결과, 도 5에서 나타낸 바와 같이, 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머 제작을 위한 SELEX 과정 후 선별된 라운드에서 확보한 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머 후보군들의 용리액을 라운드별로 나노드랍을 이용하여 정량적으로 측정한 결과이다.

선별된 라운드(round)에서 제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하는 제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군 분석

<7-1> DNA 앱타머 후보군 확보를 위한 T-벡터 클로닝 ( cloning ) 수행 및 선별

선별된 11 라운드에 대한 DNA 앱타머 후보군 확보를 위하여 11 라운드 DNA 앱타머 풀의 증폭을 위한 반응 조성으로는 10× PCR 완충용액 5 ㎕, 각 2.5 mM dNTP mixture 4 ㎕, 10 pM 정방향 프라이머 2 ㎕, 역방향 프라이머 2 ㎕, 주형 DNA 라이브러리 1~2 ㎕, Ex Taq 중합효소(TaKaRa, Japan) 0.3 ㎕(1 unit/㎕)와 증류수 34.7~35.7 ㎕로 구성하였다. PCR 반응 조건은 먼저 94℃에서 5분간 변성시킨 후에, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복하여, 마지막으로 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. 증폭시킨 DNA 앱타머를 T-벡터 클로닝 키트(Solgent, Korea)를 이용하여 T-blunt 벡터 1 ㎕, 6× 클로닝 버퍼(Cloning buffer) 1 ㎕, PCR 산물 4 ㎕의 조성으로 25℃에서 10분간 결합(Ligation)을 실시한 후에 수용성 세포(E. coli DH5α) 100 ㎕에 6 ㎕를 넣고 20분간 얼음 안에서 반응시켰다. 그 후에 열충격법을 이용하여 42℃에서 30초간 반응시켜 형질전환하였고 앰피실린(Ampicillin, 50 ㎍/㎖), 카나마이신(Kanamycin, 50 ㎍/㎖), X-gal(50 ㎍/㎖), IPTG (5 ㎍/㎖)이 포함되어 있는 LB 배양 플레이트(LB plate)에 스프레딩하여 배양하였다. 배지에 배양되어 자란 콜로니 중 흰색 콜로니 30개를 선별하여 각각 앰피실린과 카나마이신이 첨가된 LB 배지 5 ㎖에 접종한 후 플라스미드 DNA prep kit(Intron, USA)을 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 확보한 각 콜로니에 대한 플라스미드 DNA는 Solgent(Korea)에 의뢰하여 서열분석을 의뢰하였다.

<7-2> Clustal -X를 통한 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머 후보군 서열의 분석

각 콜로니들에 대한 서열 중에서 클로닝을 통해 삽입된 DNA 앱타머 서열을 확인하고 나열하여 Clustal-X 프로그램을 이용해 분석하였다. 각 서열에 대한 그룹을 형성하여 각 서열간의 서열 유사도를 분석하였다. 분석 결과 총 45개의 클론을 선별하여 30개의 정상서열을 확보하였으며, 동일서열을 가지는 서열이 1개를 제외하고 전체 29개의 서열이 최종 분석되었다(도 7 참조).

DNA 앱타머와 제초제 저항성 PAT 단백질간의 결합력을 확인하기 위한 SPR ( Surface Plasmon Resornance) 측정 및 분석

<8-1> PCR 을 이용한 DNA 앱타머 후보군의 준비

실시예 4에 제시된 방법을 이용하여 PCR 시료 중 10 pM 바이오티닐화된 역방향 프라이머와 10 pM 정방향 프라이머 대신 10 pM 정방향 프라이머와 10 pM 역방향 프라이머를 첨가한 시료를 이용하여 상기 실시예 4에서 제시된 방법과 동일한 방법으로 PCR을 진행하였다. 기 확보한 PCR 시료는 ssDNA를 제작하기 위하여 비대칭 PCR을 사용하였고, 반응 조성으로는 10× PCR 완충용액 10 ㎕, 각 2.5 mM dNTP mixture 8 ㎕, 10 pM 정방향 프라이머 10 ㎕, 10 pM 역방향 프라이머 1 ㎕, 각 앱타머 후보군 10 ㎕, Ex Taq 중합효소(TaKaRa, Japan) 0.5 ㎕(1 unit/㎕)와 증류수 60.5 ㎕로 구성하였다. PCR 반응 조건은 먼저 94℃에서 5분간 변성시킨 후에, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복하여, 마지막으로 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. 이 후, 통상적으로 당업계에서 사용하는 PCI 및 에탄올 침전법을 이용하여 순수 DNA 앱타머를 확보하였다.

<8-2> ssDNA 앱타머의 구조 제작

비대칭 PCR을 통해 확보한 ssDNA는 나노드랍에 1 ㎕를 넣고 ssDNA 농도를 측정한 후에 나머지 99 ㎕의 ssDNA 앱타머에 99 ㎕의 2× PBS를 첨가하여 85℃에서 5분간 가열하고 상온에서 1시간 이상 천천히 냉각하였다. 이 후, DNA의 농도가 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 3000 nM이 되도록 Coupling 완충용액인 10 mM NaOAC pH 4.5에 희석하여 준비하였다.

<8-3> Sensor chip CM5 에 제초제 저항성 PAT 단백질 고정

Sensor chip CM5에 제초제 저항성 PAT 단백질을 고정시키기 위하여 먼저 SPR의 start sensogram을 수행하였다. 센서칩 CM5의 4개 채널 중에서 1번 채널은 검사용으로 제초제 저항성 PAT 단백질을 붙이지 않았고 2번 채널에만 PAT 단백질을 고정시켰다. 고정 방법은 GE healthcare에서 제공한 실험방법에 의하여 금(Gold) 판막 위에 고정된 덱스트란(Dextran)의 수산기 (-OH)에 EDC / NHS 완충용액을 유속 10 ㎕/min으로 흘려주어 덱스트란의 표면을 활성화한 후, 제초제 저항성 PAT 단백질을 결합시켰다. 결합 조건으로는 유속 10 ㎕/min으로 5분간 접종하는 일련의 과정을 각각 2회 반복 수행하였다. 그 후에 10분간 유속을 10 ㎕/min으로 HBS-EP 버퍼를 흘려주어 고정된 제초제 저항성 PAT 단백질이 안정화되도록 하였다(도 4 참조).

<8-4> DNA 앱타머 후보군과 제초제 저항성 PAT 단백질 간의 결합력 측정 및 분석

준비된 각 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 3000 nM 농도의 DNA 앱타머 후보군을 튜브에 옮긴 후 Sensor chip CM5 위에 유속 5 ㎕/min으로 20분간 흘려주는 일련의 과정을 수행하였다. 이 과정동안 1번 채널과 2번 채널의 Sensogram을 비교, 분석하여 결합력을 확인하였다. 이 후, 50 mM NaOH를 유속 10 ㎕/min으로 5분간 흘려주며 고정화된 제초제 저항성 PAT 단백질로부터 DNA 앱타머 후보군을 제거한 후에 상기의 과정과 동일하게 제초제 저항성 PAT 단백질을 2회 결합시켰다. 이 과정에서 특이성이 있는 것으로 보이는 HRPA-5, HRPA-7, HRPA-28을 최적의 제초제 저항성 PAT 단백질 결합 DNA 앱타머로 선별하였다(도 8 참고).

선별된 DNA 앱타머의 예상 구조 모식도 제작

<9-1> 선별된 각 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머의 예상 구조 제작

선별한 HRPA-5, HRPA-7, HRPA-28의 DNA 앱타머의 예상 구조를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 웹사이트(http://mfold.rna.albany.edu/)에서 제공하는 m-fold 프로그램을 이용하여 예상 구조를 제작하였다. 구조 제작 조건으로는 DNA 앱타머의 서열을 선형가닥으로 지정하였으며 구조 제작 온도는 상온인 25℃로 지정하였다. 구조에 영향을 줄 수 있는 나트륨의 농도는 Coupling 완충용액으로 사용한 10 mM NaOAC의 나트륨 농도인 10 mM로 지정하여 예상 구조를 제작하였다(도 9 참조).

<9-2> 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머 구조 간의 비교 분석

HRPA-5, HRPA-7, HRPA-28의 전체 DNA 앱타머 서열에 대한 예상 구조를 통하여 각 예상 구조 간의 고리 모양(loop structure)과 DNA 앱타머 내부의 상호작용으로 인한 혼성화(Hybridization)의 정도를 비교하였다. 분석한 결과, HRPA-5와 HRPA-28의 예상 구조를 비교해봤을 때 고리 모양이 비슷한 경향을 보였으나 고리의 개수가 다른 것을 보아 서로 다른 에피토프(Epitope)를 가진 것으로 분석되었다. 따라서, 3개의 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머는 3개의 에피토프를 가질 것으로 예상된다.

최종 선별된 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머의 산업적 활용을 위한 각종 시료에서의 검출 방법 연구

상기의 실시예를 통해 제작 및 확보한 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머의 산업적 활용을 위하여 제초제 저항성 작물의 사용이 의심되는 환경에서의 제초제 저항성 PAT 단백질 특이 결합 DNA 앱타머를 이용한 검출 방법 및 제초제 저항성 작물의 원재료나 가공식품에서의 사용 여부를 진단하기 위한 응용 가능성을 확인하고자 하였다.

그 결과, 도 10과 11에 나타낸 바와 같이, 이를 통해 다양한 시료에서의 활용력을 이용하여 다양한 환경에서의 제초제 저항성 PAT 단백질의 검출이 가능할 것으로 기대된다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에 대한 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Chungbuk National University <120> DNA aptamer specifically binding to herbicide-resistance PAT protein and uses thereof <130> pn1210-491 <160> 29 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-01 Aptamer Sequence <400> 1 cacccgcaag aaagtcggag ttaaaggtcg ttctttgact 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-02 Aptamer Sequence <400> 2 ccacagtagg tgaggttcac tgagttatcc attgttggca 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-03 Aptamer Sequence <400> 3 cacacgtgtg gcccgcccaa tcaaagttcg tcgtgatctc 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-04 Aptamer Sequence <400> 4 cccaccaagc gttccggtct aagaacattt tcgcagtcca 40 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-05 Aptamer Sequence <400> 5 cgagcaagag agttcggctc gggacgtgta tccgtctcc 39 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-06 Aptamer Sequence <400> 6 cggcaagagg aactactcat tttcgggtag gatcctaagg 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-07 Aptamer Sequence <400> 7 cacaaaggag caagaactca attgcgctcg tatcttgtgg 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-08 Aptamer Sequence <400> 8 ccgttagaca agtatcgcta aatcgctaac gtcactctgg 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-09 Aptamer Sequence <400> 9 cggcgatgag gggcaactgc agtgtgagtt ctcgtcaaca 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-10 Aptamer Sequence <400> 10 cccgatcgaa aatataacct gagggtatgg ttttgttgtg 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-11 Aptamer Sequence <400> 11 cgacaataca cccaagcgct ctatcttgca ttgaatagtg 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-12 Aptamer Sequence <400> 12 ccgcgaaagg gtacttgtgc tgatcatatg gatcttcgga 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-13 Aptamer Sequence <400> 13 gggcgaacag agcggtatcc tcagggtggg atagcagccg 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-14 Aptamer Sequence <400> 14 cggaagagtt tggctcctta atgctgaacg tgcttcggca 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-15 Aptamer Sequence <400> 15 ctcaataggt cgcggtttaa cgtgttagag gaccgtcatt 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-16 Aptamer Sequence <400> 16 gccacaacag cttgcccaca cccatgctca aacgagtgca 40 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-17 Aptamer Sequence <400> 17 ccaggtgaag aggaacgcaa gatcctggcg tacgtattac 40 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-18 Aptamer Sequence <400> 18 accgagcagt acgtgcttaa caagtatcta cactcctacg 40 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-19 Aptamer Sequence <400> 19 gcggagaatg gctacctgaa acccgtgggg ctaatccgtc 40 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-20 Aptamer Sequence <400> 20 cgagcaagac tgtttagttt cgagactagg ggattcgtta 40 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-21 Aptamer Sequence <400> 21 catgcggagg cagattccat tcgggcagtg tgcgactagg 40 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-22 Aptamer Sequence <400> 22 agccaacgga acgccattgc ctgccacgtc cctttcaatg 40 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-23 Aptamer Sequence <400> 23 gtaagagtcc gcgatgatgt ttaaatctgt caagctcctg 40 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-24 Aptamer Sequence <400> 24 ctcgagggtg ctctggcttc gagttttttg gattttttcg 40 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-25 Aptamer Sequence <400> 25 gggagggagc ggtccttcaa cagtttagtc agcaaccttg 40 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-26 Aptamer Sequence <400> 26 ccagcgtggc aaactgaggg ttgtttgtgg acatgtgtgg 40 <210> 27 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-27 Aptamer Sequence <400> 27 gccctaacta cgcaagctag gtgtggctgt cgccgtgatg 40 <210> 28 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-28 Aptamer Sequence <400> 28 cacggaaagc agaacagcca ttactgcgga cttgacgttc 40 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRPA-29 Aptamer Sequence <400> 29 ggagaacacg ggaggtccaa gggatgcttt agttgtgagg 40

Claims

제초제 저항성 PAT 단백질에 특이적으로 결합하고, 서열번호 1 내지 29로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머(Aptamer).
제1항에 있어서,
상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오타이드의 리보스 2′위치의 하이드록실기가 수소원자, 불소원자, -0- 알킬기, -0- 아실기 또는 아미노기로 치환되는 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머(Aptamer).
제1항 또는 제2항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 제초제 저항성 PAT 단백질 검출용 조성물.
(a) 표면상에 고정되어 있고 표적물질에 특이적으로 결합하는 제 1 앱타머에 표적 물질을 함유하는 시료와 상기 표적 물질에 특이적으로 결합하며 표지 물질이 부착되어 있는 제 2 앱타머를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(b) 상기 표지물질을 분석하여 표적물질을 검출하는 단계;를 포함하는,
제1항 또는 제2항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 제초제 저항성 PAT 단백질의 검출 방법.
제4항에 있어서,
상기표지물질은 형광물질임을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서,
상기 표지물질의 분석은 형광물질의 발광 또는 발광세기 및 색변화를 측정하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 제초제 저항성 PAT 단백질의 검출용 센서.
제7항에 있어서,
상기 센서는 DNA 앱타머가 gold 표면, glass 표면, 96웰 플레이트(96-well plate) 기판 또는 마이크로어레이 칩에 고정된 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 센서.
제1항 또는 제2항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 제초제 저항성 PAT 단백질 검출용 키트.
(a) 제초제 저항성 PAT 단백질을 함유하는 것으로 예상되는 시료와 제1항 또는 제2항의 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및
(b) 제초제 저항성 PAT 단백질과 결합된 상기 DNA 앱타머를 확인하는 단계를 포함하는, 제초제 저항성 PAT 단백질의 키트 검출 방법.
제10항에 있어서,
(a) 단계에서 앱타머와 제초제 저항성 PAT 단백질을 함유하는 시료를 혼합 시 색을 나타낼 수 있는 발색물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서,
상기 발색물질은 골드 나노물질인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서,
(b) 단계는 표지물질이 부착되어 있는 앱타머와 앱타머에 고정된 표지물질에 상보적으로 결합하는 물질이 결합되는 과정인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 (b) 단계의 표지물질은 바이오틴, 스트렙트아비딘, 아미노기 또는 카르복실기인 것을 특징으로 하는 방법.