KR101351647B1

KR101351647B1 - 인간 심근 트로포닌 ⅰ에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 압타머

Info

Publication number: KR101351647B1
Application number: KR1020110145434A
Authority: KR
Inventors: 반창일; 송경미; 전위정
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2011-06-07
Filing date: 2011-12-29
Publication date: 2014-01-15
Also published as: KR20120135857A

Abstract

본 발명은 인간 심근 트로포닌 Ⅰ(human cardiac troponin I)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 포함하는 급성심혈관질환 진단용 조성물, 및 급성심혈관질환 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명의 인간 심근 트로포닌 Ⅰ(human cardiac troponin I)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머는 기존에 사용되는 항체보다 특이성 및 안정성이 뛰어나므로, 이를 이용하여 인간 심근 트로포닌 Ⅰ의 농도를 민감하고 정확하게 측정할 수 있는 바이오센서를 개발하면 급성심혈관질환 진단의 조기진단에 보다 효과적으로 응용할 수 있으며, 진단 정확성을 증가시키는데 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.

Description

인간 심근 트로포닌 Ⅰ에 특이적으로 결합하는 ＤＮＡ 압타머 {DNA aptamer specifically binding to human cardiac troponin Ⅰ}

본 발명은 인간 심근 트로포닌 Ⅰ(human cardiac troponin I)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 포함하는 급성심혈관질환 진단용 조성물, 및 진단 키트에 관한 것이다.

트로포닌(troponin)은 Troponin I, Troponin T, Troponin C의 세 가지 소단위로 구성되어 있으며 액틴 필라멘트상의 트로포미오신과의 결합을 통해 근세포의 수축과 이완을 조절하는 단백질 복합체이다. 이 복합체는 세포질내의 Ca² ⁺ 수준이 증가하면 Ca² ⁺와 Troponin C의 결합에 의해 구조적인 변화를 일으키고 이로 인해 액틴과 미오신과의 결합자리를 만들어 근육의 수축을 일으키는 역할을 하고 있다. 이 같은 현상은 골격근과 심근에 모두 작용되며 특히, 심근에 작용하는 Troponin I, Troponin T는 골격근에서 발현되는 것들과 아미노산의 길이가 달라 구분되어 진다.

또한 심근 트로포닌 Ⅰ(cadiac troponin I)의 경우 급성심혈관질환에서 그 발현양이 급격히 증가하는 것으로 알려져 있어서 이러한 단백질의 검출은 급성심혈관질환의 초기 진단에 매우 중요하다.

한편, 압타머(aptamer)는 특정 물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA이다. 압타머는 특정물질에 대한 친화도가 매우 높고 안정하기 때문에 최근 많이 개발되고 있으며, 이를 이용한 치료제 및 진단용 센서로의 응용이 활발히 진행되고 있다.

압타머의 합성은 비교적 단순한 방법으로 가능하고 세포, 단백질 그리고 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에 이를 이용한 새로운 검출방법들의 개발이 가능하며 이미 개발되어 있는 항체에 비해 그 특이성 및 안정성이 매우 높기 때문에 치료제 개발 및 약물전달 시스템, 진단용 바이오센서로의 응용이 가능하다.

기존에 개발되어 있는 분야 중 항체를 이용한 방법은 생체의 면역시스템을 이용하여 만들어지기 때문에 비교적 많은 시간이 들고 고비용이라는 단점이 있다. 또한 단백질이기 때문에 압타머에 비해 안정성이 떨어진다는 단점이 있으므로 고감도 센서의 개발에 제약이 있다.

트로포닌 Ⅰ(troponin I) 검출시스템에서도 항체를 이용한 방법들이 개발되어 있지만 앞서 설명한 이유들로 인해 많은 제약이 있는바, 급성심혈관질환의 초기 진단을 위해서는 보다 안정하고 저비용의 검출 시스템이 요구되고 있다.

본 발명은 인간 심근 트로포닌 Ⅰ(human cardiac troponin I)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 포함하는 급성심혈관질환 진단용 조성물, 및 진단 키트를 제공하고자 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 인간 심근 트로포닌 Ⅰ(human cardiac troponin I)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머로, 상기 DNA 압타머는 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 DNA 압타머를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 인간 심근 트로포닌 Ⅰ(human cardiac troponin I)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머를 포함하는 급성심혈관질환 진단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 인간 심근 트로포닌 Ⅰ(human cardiac troponin I)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머를 이용하는 것을 특징으로 하는 급성심혈관질환 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 인간 심근 트로포닌 Ⅰ(human cardiac troponin I)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머는 기존에 사용되는 급성심혈관질환 진단용 항체보다 특이성 및 안정성이 뛰어난 장점을 가지고 있다. 또한 본 발명의 압타머를 이용하여 인간 심근 트로포닌 Ⅰ의 농도를 민감하고 정확하게 측정할 수 있는 바이오센서를 개발하면 급성심혈관질환 진단의 조기진단에 보다 효과적으로 응용할 수 있으며, 진단 정확성을 증가시키는데 크게 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 Troponin I 단백질의 발현을 SDS PAGE로 확인한 결과이다.
도 2는 Troponin 복합체의 발현을 SDS PAGE로 확인한 결과이다.
도 3은 Troponin I단백질을 분리한 후, 겔 여과(superdex75 column)에 의해 정제한 결과이다.
도 4는 Troponin 복합체 단백질을 분리한 후, 겔 여과(superdex200 column)에 의해 정제한 결과이다.
도 5는 Troponin I에 특이적인 압타머 선별 단계에 따라 UV 분광광도계를 이용하여 ssDNA와 Troponin I의 결합 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 Human cardiac Troponin I에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 7은 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 Human cardiac Troponin I에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 8은 서열번호 5 및 서열번호 6로 기재되는 Human cardiac Troponin I에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 9는 트로포닌 Ⅰ(troponin Ⅰ) 단백질과 서열번호 1로 표시되는 압타머 간의 결합력 측정을 위한 SPR (surface Plasmon resonance) 결과를 나타내는 것이다.
도 10은 트로포닌 Ⅰ(troponin Ⅰ) 단백질과 서열번호 2로 표시되는 압타머 간의 결합력 측정을 위한 SPR (surface Plasmon resonance) 결과를 나타내는 것이다.
도 11는 트로포닌 Ⅰ(troponin Ⅰ) 단백질과 서열번호 3으로 표시되는 압타머 간의 결합력 측정을 위한 SPR (surface Plasmon resonance) 결과를 나타내는 것이다.
도 12는 트로포닌 Ⅰ(troponin Ⅰ) 단백질과 서열번호 4로 표시되는 압타머 간의 결합력 측정을 위한 SPR (surface Plasmon resonance) 결과를 나타내는 것이다.
도 13은 트로포닌 Ⅰ(troponin Ⅰ) 단백질과 서열번호 5로 표시되는 압타머 간의 결합력 측정을 위한 SPR (surface Plasmon resonance) 결과를 나타내는 것이다.
도 14는 트로포닌 Ⅰ(troponin Ⅰ) 단백질과 서열번호 6으로 표시되는 압타머 간의 결합력 측정을 위한 SPR (surface Plasmon resonance) 결과를 나타내는 것이다.
도 15는 트로포닌 Ⅰ(troponin Ⅰ) 단백질과 항체 간의 결합력 측정을 위한 SPR (surface Plasmon resonance) 결과를 나타내는 것이다.
도 16은 트로포닌 복합체(troponin complex) 단백질과 서열번호 1로 표시되는 압타머 간의 결합력 측정을 위한 SPR (surface Plasmon resonance) 결과를 나타내는 것이다.
도 17은 트로포닌 복합체(troponin complex) 단백질과 서열번호 2로 표시되는 압타머 간의 결합력 측정을 위한 SPR (surface Plasmon resonance) 결과를 나타내는 것이다.
도 18은 트로포닌 복합체(troponin complex) 단백질과 서열번호 3로 표시되는 압타머 간의 결합력 측정을 위한 SPR (surface Plasmon resonance) 결과를 나타내는 것이다.
도 19는 트로포닌 복합체(troponin complex) 단백질과 서열번호 4로 표시되는 압타머 간의 결합력 측정을 위한 SPR (surface Plasmon resonance) 결과를 나타내는 것이다.
도 20은 트로포닌 복합체(troponin complex) 단백질과 서열번호 5로 표시되는 압타머 간의 결합력 측정을 위한 SPR (surface Plasmon resonance) 결과를 나타내는 것이다.
도 21은 트로포닌 복합체(troponin complex) 단백질과 서열번호 6로 표시되는 압타머 간의 결합력 측정을 위한 SPR (surface Plasmon resonance) 결과를 나타내는 것이다.

본 발명자는 심근 트로포닌 Ⅰ(cardiac troponin I)에 대한 항체를 대신할 수 있는 압타머를 개발하기 위해 인간 심근 트로포닌 Ⅰ(human cardiac troponin I)을 박테리아 발현시스템에서 발현 및 정제하고, 이를 이용하여 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 기법을 이용하여 압타머를 선별하였고, DNA 압타머들의 서열 및 구조를 확립함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

구체적으로 본 발명은, 인간 심근 트로포닌 Ⅰ(human cardiac troponin I)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머로, 상기 DNA 압타머는 서열번호 1 내지 서열번호 6 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 DNA 압타머를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 압타머를 포함하는 급성심혈관질환 진단용 조성물 및 진단키트를 제공한다.

본 발명의 조성물은 상기 DNA 압타머 이외에 약리학적으로나 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수있다. 상기 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Troponin I, Troponin T, Troponin C 유전자 클로닝

인간 심근 트로포닌 I, 트로포닌 T, 트로포닌 C(human cardiac troponin I, troponin T, troponin C)에 대한 유전자를 증폭하기 위해 트로포닌 I의 경우, BamH1 제한효소 인식 서열을 포함하는 5′ 프라이머(GGATCC ATG GCG GAT GGG AGC AG)와 Hind3 제한효소 인식서열을 포함하는 3′ 프라이머(AAGCTT TCA AAA CTT TTT CTT GCG G)를 사용하였다. 또한 트로포닌 T의 경우, EcoRI 제한효소 인식 서열을 포함하는 5′ 프라이머(GAATTC ATG TCT GAC ATA GAA GAG GTG GTG)와 XhoI 제한효소 인식서열을 포함하는 3′ 프라이머(CTCGAG CTA TTT CCA GCG CCC GGT)을 사용하였고, 트로포닌 C는 트로포닌 T와 같은 제한 효소들을 이용하여 5′ 프라이머(GAATTC ATG GAT GAC ATC TAC AAG GCT GC)와 3′ 프라이머 (CTCGAG CTA CTC CAC ACC CTT CAT GAA CTC)을 이용하였다.

유전자 증폭을 위한 주형(template)으로 HEK293 세포에서 얻은 cDNA를 사용하였고 i-pfu 중합효소(polymerase)를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR, polymerase chain reaction) 과정을 통해 증폭하였다. 중합효소 연쇄 반응의 각 단계는 다음과 같다. 1) 주형(template)의 이중 가닥 DNA를 풀어주는 단계로 95℃에서 1분, 2) 주형과 프라이머가 결합하는 단계로 58℃ 에서 30초, 3) 새로운 가닥을 합성해 가는 단계로 72℃에서 1분 반응시켰고, 이와 같은 단계를 30번 반복하였다.

증폭된 인간 심근 트로포닌 I, 트로포닌 C(human cardiac troponin I, troponin C) 유전자는 제한효소 절단 반응 및 DNA 라이게이션(ligation) 반응을 통해 (His)6-tag이 포함된 벡터인 pET28a 벡터에 클로닝하였으며, 트로포닌 T의 경우 pET21a 벡터에 클로닝하였다. 또한 트로포닌 I와 트로포닌 C는 BL21(DE3) E. coli 세포에 형질전환하였고 트로포닌 T는 트로포닌 I와 공동발현을 위해 두 개의 클로닝된 유전자를 BL21-CodonPlus (DE3)-RIG E. coli세포에 함께 형질전환 하였다.

실시예 2. Troponin I 단백질의 발현

인간 심근 트로포닌 (human cardiac troponin I) 유전자가 형질전환 된 BL21(DE3) 세포는 LB(Luria Bertani) 배지에서 배양하되, UV 600 nm에서 광학밀도(OD, optical density) 값이 0.6에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 그 후, 단백질의 발현을 유도하기 위하여 최종 농도가 0.2 mM이 되도록 IPTG (isopropyl-thio-b-D-galactopyranoside)를 첨가한 후, 18℃에서 16시간 동안 배양하였다. 단백질의 발현은 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 확인하였고, 세포는 원심분리기로 배지와 분리시킨 후, PBS(10 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4) 버퍼로 한번 씻어 주었다. 발현시킨 Troponin I 단백질을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 SDS PAGE 젤에서 첫 번째 줄(M)은 마커(marker) 단백질의 크기를 나타내며, 두 번째 줄(bf)은 IPTG을 이용하여 발현을 유도하기 전의 상태를 나타낸다. 세 번째와 네 번째 줄(af)에 나타난 바와 같이 IPTG을 넣어준 후 약 28 KD의 크기에서 Troponin I 단백질이 발현된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. Troponin 복합체의 발현

인간 심근 트로포닌 T, 트로포닌(human cardiac troponin T, troponin I) 유전자가 함께 형질전환 된 BL21-CodonPlus (DE3)-RIG E. coli 세포와 트로포닌 C 유전자가 형질전환된 BL21(DE3)는 트로포닌 I의 발현과 마찬가지로 LB(Luria Bertani) 배지에서 배양하되, UV 600 nm에서 광학밀도(OD, optical density) 값이 0.6에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 그 후, 단백질의 발현을 유도하기 위해 IPTG (isopropyl-thio-b-D-galactopyranoside)를 최종 농도가 0.2 mM이 되도록 첨가한 후, 18℃에서 16시간 동안 배양하였다. 단백질의 발현은 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 확인하였고, 세포는 원심분리기로 배지와 분리시킨 후, PBS(10 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4) 버퍼로 한번 씻어 주었다. 발현시킨 트로포닌 T, 트로포닌 I, 트로포닌 C 단백질을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2 에 나타난 SDS PAGE 젤에서 첫 번째 줄(M)은 마커(marker) 단백질의 크기를 나타내며, 두 번째 줄(bf)은 IPTG을 이용하여 발현을 유도하기 전의 상태를 나타낸다. 두 번째 줄(af)에 나타난 바와 같이 IPTG을 넣어준 후 각각의 크기에서 트로포닌 I, 트로포닌 T, 트로포닌 C 단백질이 발현된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. Troponin I 단백질의 정제

박테리아 세포 BL21(DE3)에서 발현된 인간 심근 트로포닌 Ⅰ(human cardiac troponin I) 단백질을 고순도로 정제하기 위하여 세포 용균 버퍼(lysis buffer)(20 mM Tris, 500 mM NaCl, 0.5 mM β-mercaptoethanol, 3% glycerol, 0.01% tween 20, pH 8.0)에 세포를 녹인 후, 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 10분 동안 초음파 분쇄(sonication)함으로써 세포를 파괴하였다. 수용액상의 단백질과 세포를 분리하기 위해 15,000 rpm 에서 30분 동안 원심분리하였다.

또한 고순도의 단백질을 얻기 위해 Ni-NTA(Ni-Nitrilotriacetic acid)와 (His)6-tag 아미노산이 결합하는 특성을 이용하였다. 구체적으로, FPLC (Fast protein liquid chromatography)에 Ni-NTA 컬럼을 연결하고 수용액상의 cardiac troponin I을 컬럼에 흘려줌으로써 결합시켰다. Ni-NTA 컬럼에 결합된 단백질의 (His)6-tag은 이미다졸(immidazole)의 화합물과 경쟁적으로 결합하기 때문에 표적 단백질을 컬럼에서 분리시키기 위해 용출 버퍼(elution buffer)(20 mM Tris, 500 mM NaCl, 0.5 mM β-mercaptoethanol, 3% glycerol, 0.01% tween 20, 300 mM immidazole, pH 8.0)를 순차적으로 흘려줌으로써 cardiac troponin I을 고순도로 분리할 수 있었다.

분리된 단백질에서 더욱 순도 높은 단백질을 얻기 위해 단백질을 크기에 따라 분리하는 컬럼인 superdex75 컬럼을 FPLC에 연결한 후 크기에 따라 단백질을 한 번 더 분리 하였으며, 버퍼 속에 포함된 이미다졸(immidazole)을 제거하기 위하여 최종 버퍼(final buffer)(20 mM Tris, 300 mM NaCl, 0.5 mM β-mercaptoethanol, 3% glycerol, 0.01% tween 20, pH 8.0)를 이용하여 분리정제하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3의 SDS PAGE 젤에서 첫 번째 줄은 단백질의 크기를 나타내며, 두 번째 줄은 정제과정을 모두 마친 후 단백질의 상태를 나타낸다. 정제과정을 마친 후, 고순도의 Troponin I를 크기 25 KD에서 확인하였다.

실시예 5. Troponin complex ( Troponin T, C, I)의 정제

트로포닌 T. 트로포닌 I, Troponin C의 복합체 단백질을 고순도로 정제하기 위하여 트로포닌 T, 트로포닌 I가 발현된 세포를 용균 버퍼(lysis buffer)(20 mM Tris, 500 mM NaCl, 0.5 mM β-mercaptoethanol, 5% glycerol, pH 8.0)에 세포를 녹인 후, 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 파괴 하였고 원심분리를 통해 수용액상의 단백질을 분리하였다.

또한 트로포닌 I의 정제 과정과 마찬가지로 Ni-NTA(Ni-Nitrilotriacetic acid)와 (His)6-tag 아미노산이 결합하는 특성을 이용하였다. 구체적으로, FPLC (Fast protein liquid chromatography)에 Ni-NTA 컬럼을 연결하고 수용액상의 트로포닌 T, 트로포닌 I을 컬럼에 흘려줌으로써 결합시켰다. 표적 단백질을 컬럼에서 분리시키기 위해 용출 버퍼(elution buffer)(20 mM Tris, 500 mM NaCl, 0.5 mM β-mercaptoethanol, 5% glycerol, 300 mM immidazole, pH 8.0)를 순차적으로 농도를 높혀가며 컬럼에 흘려줌으로써 트로포닌 I, 트로포닌 T 분리할 수 있었다.

트로포닌 I, 트로포닌 T의 (His)6-tag을 TEV(Tobacco Etch Virus) protease을 처리하여 제거 하였다. 구체적으로 (His)6-tag 뒤에 있는 TEV protease 인식하고, 자르는 반응을 위해 TEV protease와 단백질을 20℃에서 6시간 동안 반응을 진행하였다.

TEV protease에 의해 (His)6-tag이 제거된 트로포닌 I, 트로포닌 T는 G-25 컬럼을 사용하여 용출버퍼에 있는 imidazole을 제거 후, 다시 Ni-NTA 컬럼에 흘려줌으로써 단백질로부터 떨어져 나간 (His)6-tag 가닥과 분리하여 순수한 트로포닌 I, 트로포닌 T만을 얻을 수 있었다.

또한 트로포닌 C의 경우는 위와 같이 Ni-NTA 컬럼을 통해 (His)6-tag이 포함된 상태로 정제하였고 G-25 컬럼을 통해 imidazole을 제거하였다.

트로포닌 복합체 상태의 단백질을 얻기 위해 위에서 정제된 (His)6-tag이 포함된 트로포닌 C를 Ni-NTA에 결합시킨 후, 컬럼에 트로포닌 I, 트로포닌 T 단백질을 흘려주어 컬럼상에서 복합체를 형성하도록 유도하였다. 결합하지 않는 잉여의 트로포닌 I, 트로포닌 T 단백질은 그대로 컬럼을 통과하였고 트로포닌 복합체가 형성된 상태의 단백질은 컬럼에서 용출버퍼를 이용해 얻을 수 있었다.

트로포닌 복합체에서 더욱 순도 높은 단백질을 얻기 위해 단백질을 크기에 따라 분리하는 컬럼인 Superdex 200 HL 컬럼을 FPLC에 연결한 후 크기에 따라 단백질을 한 번 더 분리 하였으며, 버퍼 속에 포함된 이미다졸(immidazole)을 제거하기 위하여 최종 버퍼(final buffer)(20 mM Tris, 300 mM NaCl, 0.5 mM β-mercaptoethanol, 5% glycerol, pH 8.0)를 이용하여 분리정제하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4의 SDS PAGE 젤에서 첫 번째 줄은 단백질의 크기를 나타내며, 두 번째 줄은 정제과정을 모두 마친 후 단백질의 상태를 나타낸다.

실시예 6. SELEX 을 이용한 Troponin I 단백질에 대한 압타머 탐색

<6-1> ssDNA ( single strand DNA )라이브러리의 제조

양 말단에 PCR 증폭 및 클로닝을 위한 프라이머의 결합서열을 갖고, 가운데에 40개의 무작위 DNA염기서열을 포함하는 90개의 서열을 가지는 합성된 라이브러리(5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-N40-CTGGCTCGAACAAGCTTGC-3')를 설계하였다.

또한, PCR 증폭 및 ssDNA 생성을 위하여 5' 프라이머 (5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGA-3'), 3' 프라이머 (5'-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3') 및 비오틴이 결합된 3' 프라이머 (5'-Biotin-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3')를 사용하였다. 본 발명에서 사용된 모든 올리고뉴클레오티드는 바이오닉스 사(한국)에서 합성 및 PAGE 정제하였다.

<6-2> human cardiac Troponin I의 Ni - NTA 자성 비드(magnetic bead)에 고정화

정제된 인간 심근 트로포닌 Ⅰ(human cardiac troponin I)은 표면에 코발트로 코팅되어 있어 단백질의 His-tag과 결합하는 자성 비드(magnetic bead)인 Dynalbead (invitrogen, 노르웨이)를 이용하여 비드에 고정하였다.

구체적으로, 단백질 결합 버퍼 (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 3% glycerol, 0.01% tween 20, 5 mM MgCl, pH 8.0) 150㎕ 에 녹아 있는 단백질 150 pmole과 20㎕ 의 비드를 외부 자석을 이용하여 결합버퍼로 세척한 후, 한 시간 동안 실온에서 반응하여 비드에 고정화하였다.

<6-3> human cardiac troponin I에 특이적인 압타머 선별

인간 심근 트로포닌 Ⅰ(human cardiac troponin I)에 특이적인 압타머를 선별하기 위해 자성을 이용한 특이적 분리 방법을 수행하였다.

먼저 ssDNA의 가장 안정한 구조형성을 위해, 100 ㎕의 결합 버퍼에 녹아 있는 ssDNA 라이브러리(1 nmole)를 90℃에서 3분 동안 배양한 후, 4℃에서 1 시간 동안 전배양하였다. 그 후, 앞서 자성 비드(magnetic bead)에 고정화된 Troponin I 단백질과 혼합하여 함께 약하게 흔들어 주면서 1시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 비드에 결합된 Troponin I 단백질과 결합하지 않는 ssDNA를 제거하기 위해 결합 버퍼로 비드를 두 번 세척하였다.

그 후, 자성 비드(magnetic bead)에 의해 단백질과 결합한 ssDNA를 분리하기 위해 용출 버퍼(20 mM Tris, 300 mM NaCl, 3% glycerol, 0.01% tween 20, 5 mM MgCl₂,300 mM immidazole, pH8.0)를 이용해 단백질 및 단백질과 결합된 ssDNA를 용출시켰다. 용출된 ssDNA는 에탄올을 이용해 침전시킨 후, 100㎕의 증류수에 용해한 다음 5' 프라이머와 비오틴이 결합된 3' 프라이머, 및 i-pfu 중합효소(인트론 바이오테크놀로지, 한국)를 이용하여 PCR로 증폭시켰다. 다음 선별 과정을 위한 ssDNA를 생성하기 위해, 비오틴이 결합된 PCR 산물을 비오틴과 결합하는 스트렙타아비딘(streptavidin)이 코팅된 자성 비드와 함께 커플링 버퍼(5 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.01%) 조건에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 ssDNA만을 분리하기 위해 100㎕의 100 mM NaOH와 5분 동안 배양하였고, 외부 자석을 이용하여 선별된 ssDNA를 얻을 수 있었다.

첫 번째 선별된 ssDNA를 사용하여 반복적으로 선별하였다. 이때 엄격한 선별을 위해 ssDNA의 양 및 Troponin I의 농도는 점차 감소시키면서 진행하였으며, 반복되는 선별에서 용출된 ssDNA를 UV 분광광도계 (UV spectrometer, Biochrom Libra S22 spectromether)로 농도를 측정하여 남아 있는 ssDNA의 Troponin I와의 결합 정도를 확인하며 선별 과정을 진행하였고, 그 결과(%)를 도 5에 나타내었다.

구체적으로, 도 5은 압타머의 선별과정에서 마그네틱비드에 고정화된 단백질과 결합하는 압타머의 결합정도를 나타낸다. 즉, 넣어준 압타머의 농도에 따른 결합한 압타머의 농도를 계산하여 이를 퍼센트(%)화 하였다. 도 5에서 알 수 있듯이, 각 선별과정에서 순차적으로 결합하는 압타머 DNA가 증가하는 것을 확인하였다.

<6-4> 압타머 서열 및 구조분석

12 번째 반복 선별된 ssDNA는 변형되지 않은 5' 프라이머와 3' 프라이머를 이용하여 PCR 과정을 통해 증폭시켰고, pENTR/TOPO 벡터 (TOPO TA Cloning kit, Invitrogen, 미국)에 클로닝한 후, E.coli TOP10 세포 (Invitrogen, 미국)에 형질전환시켰다. ssDNA가 삽입된 클론을 miniprep 키트 (GeneAll, 한국)를 이용하여 정제한 후, 염기서열을 분석 (COSMO Genetech, 한국)을 하였다. 그 결과, 하기 표 1에서와 같이 서열번호 1 내지 서열번호 6으로로 기재되는 ssNA 서열을 분석할 수 있었다.

또한 선별된 ssDNA의 구조적 유사성을 분석하기 위하여, Mfold 프로그램 (http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi)을 이용하여 2차 구조를 분석할 수 있었고, 도 6 내지 도 8 에 나타난 바와 같이 연속적인 T, C 서열의 반복에 따른 stem-loop 구조를 공통적으로 포함하고 있음을 알 수 있었다.

서열번호	염기서열
1	TCACACCCTCCCTCCCACATACCGCATACACTTTCTGATT
2	CCCGACCACGTCCCTGCCCTTTCCTAACCTGTTTGTTGAT
3	ATGCGTTGAACCCTCCTGACCGTTTATCACATACTCCAGA
4	CAACTGTAATGTACCCTCCTCGATCACGCACCACTTGCAT
5	CGTGCAGTACGCCAACCTTTCTCATGCGCTGCCCCTCTTA
6	CGCATGCCAAACGTTGCCTCATAGTTCCCTCCCCGTGTCC

실시예 7. SPR ( surface Plasmon resonance )을 이용한 단백질과 압타머 간의 결합력 측정

SPR (surface Plasmon resonance)은 금과 같은 금속에서 나타나는 광-전자 효과로서, 특정 파장의 광이 금속에 조사되면 대부분의 광에너지가 자유전자로 전이되는 공명현상이 일어나게 된다. 그 결과로 표면파가 생길 때 나타나는 현상을 SPR이라 부르며 금속과 접합된 시료표면에서의 물질 조성 변화에 따라 공명 파장 이동을 관찰함으로써 그 결합력을 측정 할 수 있다. Troponin I, Troponin 복합체와 결합하는 압타머와 결합력을 측정하기 위해 Ni-NTA (Ni-Nitrilotriacetic acid)가 코팅되어 있는 표면칩(Biacore AB, 스웨덴)을 이용하여 SPR을 측정함으로서 그 결합력을 확인하였다.

Ni-NTA칩에 Troponin I 단백질(200 nM)을 흘려주고 결합한 단백질에 각각의 압타머 DNA을 결합하였다. 여기서 압타머 DNA는 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM 농도로 실험하였으며, 압타머의 효율성을 입증하기 위해 시판되고 있는 항체(abcam, 영국)와 cardiac Troponin I의 결합력을 상기와 동일한 방법으로 측정한 결과, Kd 값이 20.1 nM로 본 발명의 압타머 Kd 값이 더 낮음을 확인하였다.

상기 SPR 결과 및 Kd 값을 하기 도 9 내지 도 15 및 표 2에 나타내었다.

압타머	Kd
서열번호 1	3.41 nM
서열번호 2	1.13 nM
서열번호 3	1.14 nM
서열번호 4	3.25 nM
서열번호 5	270 pM
서열번호 6	317 pM
항체(비교예)	20.1 nM

상기와 동일한 방법으로 트로포닌 복합체와 압타머가 결합 하는지에 대한 여부와 그 결합력을 측정하였다. 여기서 압타머 DNA는 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM 농도로 실험하였다. 그 결과 트로포닌 복합체의 경우도 트로포닌 I 압타머와 효과적으로 결합하는 것을 확인하였고, Kd 값이 트로포닌 I 만 결합하는 것과 비슷하거나 약간 높게 나타남을 확인하였다.

상기 SPR 결과 및 Kd 값을 하기 도 16 내지 도 21 및 표 3에 나타내었다.

압타머	Kd
서열번호 1	3.2 nM
서열번호 2	4.5 nM
서열번호 3	5.7 nM
서열번호 4	10.6 nM
서열번호 5	3.1 nM
서열번호 6	3.4 nM

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

인간 심근 트로포닌 Ⅰ(human cardiac troponin I)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머로서, 상기 DNA 압타머는 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, DNA 압타머.
제 1항의 DNA 압타머를 포함하는 급성심혈관질환 진단용 조성물.
제 1항의 DNA 압타머를 포함하는 급성심혈관질환 진단 키트.