KR101319202B1 - ｐＬＤＨ에 특이적으로 결합하는 ＤＮＡ 압타머 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 pLDH(Plasmodium Lactate Dehydrogenase)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 포함하는 말라리아 진단용 조성물, 및 말라리아 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명의 pLDH(Plasmodium Lactate Dehydrogenase)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머는 기존에 사용되는 항체보다 특이성 및 안정성이 뛰어나므로, 이를 이용하여 pLDH의 농도를 민감하고 정확하게 측정할 수 있는 바이오센서를 개발하면 말라리아 진단의 정확성을 증가시키는데 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.

Description

ｐＬＤＨ에 특이적으로 결합하는 ＤＮＡ 압타머{DNA aptamer specifically binding to pLDH(plasmodium lactate dehydrogenase)}
본 발명은 pLDH(Plasmodium Lactate Dehydrogenase)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 및 이를 포함하는 말라리아 진단용 조성물 등에 관한 것이다.
말라리아의 임상적 증상은 두통, 근육통, 발열, 구토 등으로 나타나는데 이와 같은 증상은 말라리아 고유의 증상이 아니므로 이를 근거로 진단하기는 어렵다. 일반적으로 현미경 검경법을 통해 확진이 가능하지만, 이는 고가의 장비와 숙련된 인원을 필요로 하기 때문에, 말라리아 유행 지역에서의 초기 진단용으로는 적절치 않다. 면역 크로마토그래피법을 이용한 휴대용 진단 키트는 항원-항체 반응을 이용하기 때문에 보관 환경에 따라 진단의 정확도에 큰 차이가 있다. 현장에서 실시하는 초기 진단에 의한 초기 대응은 치료 과정에 큰 영향을 미치므로 휴대용 진단 키트의 성능 개선이 필수적이다.
pLDH는 말라리아 기생충의 전 생활사에서 발견되는 효소로서 대사과정에 관여하는 필수 효소이다. 4가지 종류의 말라리아 기생충 모두 갖고 있으며, 이들의 서열 보존율은 매우 높다. 현재 시판되고 있는 휴대용 말라리아 진단 키트는 pLDH의 항체를 이용한 경우가 대부분이며 4가지 종류의 말라리아를 모두 진단할 수 있다.
압타머는 특정 물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA이다. 압타머는 특정물질에 대한 친화도가 매우 높고 안정하기 때문에 최근 많이 개발되고 있고 이를 이용한 치료제 및 진단용 센서로의 응용이 활발히 진행되고 있다. 압타머의 합성은 비교적 단순한 방법으로 가능하고 세포, 단백질 그리고 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에 이를 이용한 새로운 검출방법들의 개발이 가능하며 그 특이성 및 안정성이 이미 개발되어 있는 항체에 비해 매우 높기 때문에 치료제 개발 및 약물전달 시스템, 진단용 바이오센서로의 응용이 가능하다.
기존에 개발되어 있는 항체를 이용한 방법은 생체의 면역시스템을 이용하여 만들어지기 때문에 비교적 많은 시간이 들고 고비용이라는 단점이 있다. 또한 단백질이기 때문에 그 안정성이 압타머에 비해 떨어진다는 단점이 있으므로 고감도 센서의 개발에 제약이 있다. 말라리아 유행 지역이 대부분 온도가 높거나 습한 지역인 것을 생각해볼 때 항체를 이용한 진단 시스템은 정확성이 떨어지게 된다.
따라서, 상기와 같은 문제점들을 극복할 수 있는 말라리아 진단 방법에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.
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본 발명은 pLDH(Plasmodium Lactate Dehydrogenase)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머, 이를 포함하는 말라리아 진단용 조성물, 및 말라리아 진단키트를 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
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본 발명은 pLDH(plasmodium lactate dehydrogenase)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머로, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 DNA 압타머를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 pLDH(Plasmodium Lactate Dehydrogenase)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머를 포함하는 말라리아 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 pLDH(Plasmodium Lactate Dehydrogenase)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머를 이용하는 것을 특징으로 하는 말라리아 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 DNA　압타머는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열과 70% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함한다.
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본 발명의 pLDH(Plasmodium Lactate Dehydrogenase)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머는 기존에 사용되는 말라리아 진단용 항체보다 특이성 및 안정성이 뛰어난 장점을 가지고 있다. 또한 본 발명의 압타머를 이용하여 pLDH의 농도를 민감하고 정확하게 측정할 수 있는 바이오센서를 개발하면 말라리아 진단의 정확성을 증가시키는데 크게 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 pvLDH 단백질의 발현을 SDS PAGE로 확인한 결과이다.
도 2는 pvLDH 단백질을 분리한 후, 겔 여과(superdex200 column)에 의해 정제한 결과이다.
도 3은 pvLDH에 특이적인 압타머 선별 단계에 따라 UV 분광광도계를 이용하여 ssDNA와 pvLDH의 결합 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 서열번호 1로 기재되는 선별된 ssDNA(a) 및 서열번호 2로 기재되는 선별된 ssDNA(b)의 2차 구조를 Mfold 프로그램을 통해 예측한 결과이다.
도 5는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 압타머의 pvLDH (plasmodium vivax lactate dehydrogenase) 및 pfLDH (plasmodium falciparum lactate dehydrogenase)에 대한 결합 여부를 측정하기 위한 EMSA (Electrophoretic mobility shift assay) 결과를 나타낸 것이다 (SYBR® green으로 염색한 결과로, 각각의 lane이 의미하는 바는 다음과 같다. 1: PvLDH, 2: Aptamer #2, 3: Aptamer #2 + PvLDH, 4: Aptamer #1, 5: Aptamer #1 + PvLDH, 6: PfLDH, 7: Aptamer #2, 8: Aptamer #2 + PfLDH, 9: Aptamer #1, 10: Aptamer #1 + PfLDH).
도 6은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 압타머의 pvLDH (plasmodium vivax lactate dehydrogenase) 및 pfLDH (plasmodium falciparum lactate dehydrogenase)에 대한 결합 여부를 측정하기 위한 EMSA (Electrophoretic mobility shift assay) 결과를 나타낸 것이다 (쿠마시블루(coomassie blue)로 염색한 결과로, 각각의 lane이 의미하는 바는 다음과 같다. 1: PvLDH, 2: Aptamer #2, 3: Aptamer #2 + PvLDH, 4: Aptamer #1, 5: Aptamer #1 + PvLDH, 6: PfLDH, 7: Aptamer #2, 8: Aptamer #2 + PfLDH, 9: Aptamer #1, 10: Aptamer #1 + PfLDH).
도 7은 서열번호 1로 기재되는 압타머의 예측된 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예에서 돌연변이 분석 (mutation assay)에 사용된 압타머의 염기서열 및 변이 부분을 표시한 돌연변이의 염기서열이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 EMSA (Electrophoretic mobility shift assay) 방법에 따른 돌연변이 분석 (mutation assay) 결과이다. (각각의 lane이 의미하는 바는 다음과 같다. 1: pvLDH, 2: aptamer#1, 3: aptamer#1+pvLDH, 4: loop 1 돌연변이, 5: loop 1 돌연변이+pvLDH, 6: stem 돌연변이, 7: stem 돌연변이+pvLDH, 8: loop 2 돌연변이, 9: loop 2 돌연변이+pvLDH).
본 발명자는 pLDH에 대한 항체를 대신할 수 있는 압타머를 개발하기 위해 pLDH를 박테리아 발현시스템에서 발현 및 정제하고, 이를 이용하여 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 기법으로 DNA 압타머를 선별하였고, DNA 압타머들의 서열 및 구조를 확립함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
구체적으로, 본 발명은 pLDH(plasmodium lactate dehydrogenase)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머로, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 DNA 압타머를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 pLDH(Plasmodium Lactate Dehydrogenase)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머를 포함하는 말라리아 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 상기 DNA 압타머 이외에 약리학적으로나 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수있다. 상기 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 pLDH(Plasmodium Lactate Dehydrogenase)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머를 이용하는 것을 특징으로 하는 말라리아 진단 키트를 제공한다.
상기 본 발명의 DNA 압타머는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 DNA 압타머는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열과 70% 이상 동일한 서열을 갖는 것을 포함한다. 본 발명의 DNA 압타머는 (ⅰ) loop 1 부분(5'-TTCCNTNGN-3'), (ⅱ) G-C rich stem 부분, 및 (ⅲ) loop 2 부분(5'-AGT-3')을 공통적으로 포함하며, 상기 세 부분의 염기서열이 동일하다면, 그 밖의 염기는 어느 것으로 구성되어 있어도 본 발명의 범주에 속한다.
상기 pLDH는 pvLDH (plasmodium vivax lactate dehydrogenase), pfLDH (plasmodium falciparum lactate dehydrogenase), pmLDH (plasmodium malariae lactate dehydrogenase), 또는 poLDH (plasmodium ovale lactate dehydrogenase)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. pvLDH (psmodium vivax lactate dehydrogenase) 유전자 클로닝

pvLDH에 대한 유전자를 증폭하기 위해 BamH1 제한효소 인식 서열을 포함하는 5' 프라이머(CCCGGATCCATGACGCCGAAAATTGT)와 Xho1 제한효소 인식서열을 포함하는 3' 프라이머(CCCCTCGAGTTAAATGAGCGCCTTCATCCTTTTAGTCT)를 사용하였다. 유전자 증폭을 위한 주형(template)으로 Plasmodium vivax의 genomic DNA를 사용하였고 i-pfu 중합효소(polymerase)를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR, polymerase chain reaction) 과정을 통해 증폭하였다. 중합효소 연쇄 반응의 각 단계는 다음과 같다. 1) 주형(template)의 이중 가닥 DNA를 풀어주는 단계로 94℃에서 30초, 2) 주형과 프라이머가 결합하는 단계로 56℃ 에서 30초, 3) 새로운 가닥을 합성해 가는 단계로 72℃에서 1분 반응시켰고, 이와 같은 단계를 35번 반복하였다.
증폭된 pvLDH 유전자는 제한효소 절단 반응 및 DNA 라이게이션(ligation) 반응을 통해 (His)6-tag이 포함된 pET28a 벡터에 클로닝하였고, BL21(DE3) E. coli 세포에 형질전환하였다.

실시예 2. pvLDH 단백질의 발현

pvLDH 유전자가 형질전환 된 BL21(DE3) 세포는 LB(Luria Bertani) 배지에서 배양하되, UV 600 nm에서 광학밀도(OD, optical density) 값이 0.6에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 그 후, 단백질의 발현을 유도하기 위하여 최종 농도가 0.2 mM이 되도록 IPTG(isopropyl-thio-b-D-galactopyranoside)를 첨가한 후, 18℃에서 16시간 동안 배양하였다. 단백질의 발현은 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 확인하였고, 세포는 원심분리기로 배지와 분리시킨 후, PBS(10 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4) 버퍼로 한번 씻어 주었다. 발현시킨 단백질을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.

실시예 3. pvLDH 단백질의 정제

박테리아 세포 BL21(DE3)에서 발현된 pvLDH 단백질을 고순도로 정제하기 위하여 세포 용균 버퍼(lysis buffer)(20 mM Tris, 500 mM NaCl, 0.5 mM β-mercaptoethanol, 5% glycerol, 10 mM imidazole, pH 8.0)에 세포를 녹인 후, 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 15분 동안 초음파 분쇄(sonication)함으로써 세포를 파괴하였다. 수용액상의 단백질과 세포를 분리하기 위해 12,000 rpm 에서 40분 동안 원심분리하였다.
또한 고순도의 단백질을 얻기 위해 Ni-NTA와 (His)6-tag 아미노산이 결합하는 특성을 이용하였다. 구체적으로, FPLC (Fast protein liquid chromatography)에 Ni-NTA 컬럼을 연결하고 수용액상의 pvLDH를 컬럼에 흘려줌으로써 결합시켰다. Ni-NTA 컬럼에 결합된 단백질의 (His)6-tag은 이미다졸(immidazole)의 화합물과 경쟁적으로 결합하기 때문에 표적 단백질을 컬럼에서 분리시키기 위해 용출 버퍼(elution buffer)(20 mM Tris, 500 mM NaCl, 0.5 mM β-mercaptoethanol, 5% glycerol, 400 mM immidazole, pH 8.0)를 순차적으로 흘려줌으로써 pvLDH를 고순도로 분리할 수 있었다.
분리된 단백질에서 더욱 순도 높은 단백질을 얻기 위해 단백질의 pI 값에 따라 분리시키는 이온교환 (ion exchange) 컬럼인 MonoQ 컬럼을 FPLC에 연결한 후 단백질 수용액을 흘려주었다. pvLDH는 컬럼에 결합하지 않고 나머지 불순물만 결합하였으며, 결합하지 않은 분획 (non-binding fraction)을 취하여 크기에 따라 분리하는 겔 여과(gel filteration) 컬럼인 superdex200 컬럼을 이용해 한번 더 분리하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

실시예 4. SELEX을 이용한 pvLDH 단백질에 대한 압타머 탐색

<4-1> ssDNA(single strand DNA)라이브러리의 제조
양 말단에 PCR 증폭 및 클로닝을 위한 프라이머의 결합서열을 갖고, 가운데에 40개의 무작위 DNA염기서열을 포함하는 90개의 서열을 가지는 합성된 라이브러리(5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA-N40-CTGGCTCGAACAAGCTTGC-3')를 설계하였다.

*또한, PCR 증폭 및 ssDNA 생성을 위하여 5' 프라이머 (5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGA-3'), 3' 프라이머 (5'-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3') 및 비오틴이 결합된 3' 프라이머 (5'-Biotin-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3')를 사용하였다. 본 발명에서 사용된 모든 올리고뉴클레오티드는 바이오닉스 사(한국)에서 합성 및 PAGE 정제하였다.

<4-2> pvLDH의 Ni-NTA 자성 비드(magnetic bead)에 고정화
정제된 pvLDH는 표면에 코발트로 코팅되어 있어 단백질의 His-tag과 결합하는 자성 비드(magnetic bead)인 Dynalbead (invitrogen, 노르웨이)를 이용하여 비드에 고정하였다.
구체적으로, 단백질 결합 버퍼 (20 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, pH8.0) 100 ㎕에 녹아 있는 단백질 500 pmole과 20 ㎕의 비드를 외부 자석을 이용하여 결합버퍼로 세척한 후, 한 시간 동안 실온에서 반응하여 비드에 고정화하였다.

<4-3> pvLDH에 특이적인 압타머 선별
pvLDH에 특이적인 압타머를 선별하기 위해 자성을 이용한 특이적 분리 방법을 수행하였다.
먼저 ssDNA의 가장 안정한 구조형성을 위해, 100 ㎕의 결합 버퍼에 녹아 있는 ssDNA 라이브러리(1 nmole)를 90℃에서 3분 동안 배양한 후, 4℃에서 1 시간 동안 전배양하였다. 그 후, 앞서 자성 비드(magnetic bead)에 고정화된 pvLDH 단백질과 혼합하여 함께 약하게 흔들어 주면서 1시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 비드에 결합된 pvLDH 단백질과 결합하지 않는 ssDNA를 제거하기 위해 결합 버퍼로 비드를 두 번 세척하였다.
그 후, 자성 비드(magnetic bead)에 의해 단백질과 결합한 ssDNA를 분리하기 위해 용출 버퍼(20 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.01% tween20, 300 mM immidazole, pH8.0)를 이용해 단백질 및 단백질과 결합된 ssDNA를 용출시켰다. 용출된 ssDNA는 에탄올을 이용해 침전시킨 후, 60 ㎕의 증류수에 용해한 다음 5' 프라이머와 비오틴이 결합된 3' 프라이머, 및 i-pfu 중합효소(인트론 바이오테크놀로지, 한국)를 이용하여 PCR로 증폭시켰다. 다음 선별 과정을 위한 ssDNA를 생성하기 위해, 비오틴이 결합된 PCR 산물을 비오틴과 결합하는 스트렙타아비딘(streptavidin)이 코팅된 자성 비드와 함께 커플링 버퍼(5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.005% tween 20, pH 7.5) 조건에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 ssDNA만을 분리하기 위해 100 ㎕의 100 mM NaOH와 5분 동안 배양하였고, 외부 자석을 이용하여 선별된 ssDNA를 얻을 수 있었다.
첫 번째 선별된 ssDNA를 사용하여 반복적으로 선별하였다. 이때 엄격한 선별을 위해 ssDNA의 양 및 pvLDH의 농도는 점차 감소시키면서 진행하였으며, 반복되는 선별에서 용출된 ssDNA를 UV 분광광도계 (UV spectrometer, Biochrom Libra S22 spectromether)로 농도를 측정하여 남아 있는 ssDNA의 pvLDH와의 결합 정도를 확인하며 선별 과정을 진행하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

<4-4> 압타머 서열분석 및 구조분석
10 번째 반복 선별된 ssDNA는 변형되지 않은 5' 프라이머와 3' 프라이머를 이용하여 PCR 과정을 통해 증폭시켰고, pENTR/TOPO 벡터 (TOPO TA Cloning kit, Invitrogen, 미국)에 클로닝한 후, E.coli TOP10 세포 (Invitrogen, 미국)에 형질전환시켰다. ssDNA가 삽입된 클론을 miniprep 키트 (GeneAll, 한국)를 이용하여 정제한 후, 염기서열을 분석 (COSMO Genetech, 한국)을 하였다. 그 결과, 하기 표 1에서와 같이 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 ssDNA 서열을 분석할 수 있었다.
또한 선별된 ssDNA의 구조적 유사성을 분석하기 위하여, Mfold 프로그램 (http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi)을 이용하여 2차 구조를 분석할 수 있었고, 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이 공통의 서열 및 구조를 발견하였다.
[표 1]
Figure 112013047488368-pat00015


실시예 5. EMSA (Electrophoretic mobility shift assay)를 이용한 Plasmodium vivax 이외의 종(species)이 갖는 LDH에 대한 결합 유무 측정

서열번호 1 및 서열번호 2 압타머가 pvLDH 뿐만 아니라 다른 종의 말라리아 기생충의 LDH와도 결합할 수 있는지 알아보기 위하여 EMSA (Electrophoretic mobility shift assay) 방법을 통해 결합 유무를 확인하였다.
서열번호 1 및 서열번호 2 압타머 0.5 μM을 각각 0 μM 또는 2.5 μM의 pvLDH (plasmodium vivax lactate dehydrogenase) 또는 pfLDH (plasmodium falciparum lactate dehydrogenase)와 1시간 동안 상온에서 20 ㎕의 결합버퍼에서 배양한 후 6% 아크릴아마이드 겔(acrylamide gel)에 running하였다. 이 때, 전압은 120 볼트로 고정하였고, 전기영동 과정에서 발생하는 열에 의한 단백질-압타머 복합체의 변성을 방지하기 위해 0℃에서 40분 간 running하였다. SYBR® green과 쿠마시블루(coomassie blue)로 염색한 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5 및 도 6에서 각각의 레인(lane)이 나타내는 것은 아래 표 2에 기재하였다. 본 발명의 실시예에서 압타머의 발굴은 pvLDH 단백질을 통해서 진행되었지만, pvLDH와 pfLDH는 아미노산 서열 보존율(conservation rate)이 90% 이상인 것으로, 기능과 구조 등이 서로 매우 유사한바, 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 압타머는 pvLDH 뿐만 아니라, pfLDH와도 결합한다는 것을 확인하였다.
[표 2]
Figure 112013047488368-pat00016


실시예 6. 형광 측정을 통한 pLDH와 압타머 간의 결합력 측정

16 ㎍의 pvLDH를 10 ㎕ 자성 비드(megnetic bead)와 혼합한 후, 100 ㎕의 결합 버퍼 (20 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, pH8.0)에서 1시간 동안 배양하였다. 결합하지 않은 pvLDH를 분리하기 위해 상기 결합 버퍼로 2번 세척하였다. 다음으로, 다양한 농도의 FAM으로 표지된 압타머와 함께 1시간 동안 배양하고, pvLDH와 결합하지 않은 압타머는 세척하여 제거하였다.
자석을 이용하여 pvLDH에 결합된 FAM이 표지된 ssDNA만을 분리한 후, pvLDH가 고정된 자성 비드에 결합된 FAM이 표지된 ssDNA 압타머의 양을 형광측정(1420 Victor multilabel counter, PerkinElmer, USA) 방법으로 측정하였다. 그 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 DNA 압타머의 Kd 값을 측정 할 수 있었다. pfLDH에 대해서도 상기와 동일한 과정을 통해 Kd 값을 측정하였다.
[표 3]
Figure 112013047488368-pat00017


실시예 7. 압타머의 돌연변이 서열에 대한 결합 유무 측정

본 발명의 상기 실시예 4에서 발굴한 압타머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되며, 도 4에 나타난 바와 같이 2차 구조를 형성한다. 서열번호 1 및 서열번로 2로 기재되는 압타머의 2차 구조는 세 부분으로 나눌 수 있으며, 서열번호 1로 기재되는 압타머의 2차 구조를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 알 수 있는 바와 같이, pLDH에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머의 염기서열은 공통적으로 (ⅰ) Loop 1(빨간색), (ⅱ) G-C rich stem(파란색), 및 (ⅲ) Loop 2(녹색) 부분을 포함하며, 각각의 서열은 단백질과의 결합에 필수적인 서열이다.
본 발명자들은 EMSA (Electrophoretic mobility shift assay) 방법을 이용하여, 돌연변이 분석 (mutation assay)를 수행하였다. 서열번호 1로 기재되는 압타머의 일부 서열에 돌연변이를 만들고, 각각의 돌연변이 DNA와 pvLDH 단백질의 결합 여부를 EMSA (Electrophoretic mobility shift assay) 방법을 이용하여 확인하였다.
본 실시예에 사용된 서열번호 1로 기재되는 압타머의 돌연변이 서열은 각각 서열번호 3 내지 5로 기재되며, 도 8에 나타내었다. 또한, EMSA 결과를 도 9에 나타내었으며, 도 9에서 각각의 레인(lane)이 나타내는 것은 아래 표 4에 기재하였다.
[표 4]
Figure 112013047488368-pat00018

도 8 및 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, Loop 1과 Loop 2의 서열을 변형시켰을 때 pvLDH 단백질과 전혀 결합하지 않는 것을 확인할 수 있으며, 이는 Loop 1 및 Loop 2가 단백질과 직접적으로 결합하는 부분임을 뜻한다. G-C rich stem 부분의 경우 염기서열 전체를 변형시키면 DNA 2차 구조가 흐트러지기 때문에 일부만 변형시켰는데, 도 9에 나타난 바와 같이 결합력이 크게 감소하였음을 알 수 있다. 따라서 G-C rich stem 부분은 DNA의 안정된 2차 구조를 형성하도록 도울 뿐만 아니라 단백질과의 결합에도 크게 관여하는 것을 알 수 있다.
따라서, 상기 세 부분은 결합에 필수적인 부분이며, 그 외의 서열부분은 어떠한 서열로 변형되어도 무방하다는 것을 의미한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Claims (9)

  1. pLDH(plasmodium lactate dehydrogenase)에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머로, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 DNA 압타머.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 pLDH는 pvLDH (plasmodium vivax lactate dehydrogenase), pfLDH (plasmodium falciparum lactate dehydrogenase), pmLDH (plasmodium malariae lactate dehydrogenase) 및 poLDH (plasmodium ovale lactate dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, DNA 압타머.
  4. 제 1항의 DNA 압타머를 포함하는 말라리아 진단용 조성물.
  5. 삭제
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 pLDH는 pvLDH (plasmodium vivax lactate dehydrogenase), pfLDH (plasmodium falciparum lactate dehydrogenase), pmLDH (plasmodium malariae lactate dehydrogenase) 및 poLDH (plasmodium ovale lactate dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 말라리아 진단용 조성물.
  7. 제 1항의 DNA 압타머를 이용하는 것을 특징으로 하는 말라리아 진단 키트.
  8. 삭제
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 pLDH는 pvLDH (plasmodium vivax lactate dehydrogenase), pfLDH (plasmodium falciparum lactate dehydrogenase), pmLDH (plasmodium malariae lactate dehydrogenase) 및 poLDH (plasmodium ovale lactate dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 말라리아 진단 키트.
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