KR100968848B1 - 삼일열 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소에 특이적인항체 및 이를 포함하는 열대열 말라리아와 삼일열말라리아의 중복 감염 진단 키트 - Google Patents

삼일열 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소에 특이적인항체 및 이를 포함하는 열대열 말라리아와 삼일열말라리아의 중복 감염 진단 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase)에 특이적인 단클론 항체, 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체, 그리고 삼일열 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소에 동시 특이적인 단클론 항체를 포함하는 말라리아 진단 키트 및 이를 이용한 중복 감염된 말라리아의 진단 방법에 관한 것으로, 본 발명의 진단 키트는 감염된 말라리아의 종류를 구분할 수 있을 뿐만 아니라, 삼일열 말라리아와 열대열 말라리아의 중복 감염을 높은 특이성과 민감도로서 진단할 수 있는 세계 최초로 개발된 신속하고 간편한 진단 키트이다. 또한, 본 발명은 상기의 키트에 사용되는 삼일열 및 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적으로 결합하는 단클론 항체들, 이들을 생산하는 융합세포들에 관한 것이다. 또한, 삼일열 말라리아에 특이적인 단클론 항체를 포함하는 말라리아 진단 키트에 관한 것이다.
젖산탈수소효소, 단클론 항체, 말라리아, 중복 감염, 진단키트

Description

삼일열 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소에 특이적인 항체 및 이를 포함하는 열대열 말라리아와 삼일열 말라리아의 중복 감염 진단 키트{The kit for diagnosing mixed malaria infection of Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum comprising specific antibodies against lactate dehydrogenase of Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum}
본 발명은 삼일열 및 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 각각 특이적인 단클론 항체 및 이를 동시에 포함하는 말라리아의 진단 키트 및 이를 이용한 말라리아의 진단 방법에 관한 것이며, 특히, 중복 감염된 말라리아를 감별할 수 있는 세계 최초의 진단 기술에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기의 진단 키트에 사용되는 단클론 항체 그리고 이들을 생산하는 융합세포 (hybridoma)에 관한 것이다.
말라리아는 모기에 의해서 전염되는 감염성 질환으로서, 전 세계적으로 연간 3~5억 명의 사람들이 말라리아에 감염되며, 그 가운데 약 270만 명 정도가 목숨을 잃고 있다. 인간에게 말라리아를 유발하는 종은 열대열 말라리아(Plasmodium falciparum), 삼일열 말라리아(P. vivax), 난형열 말라리아(P. ovale) 및 사일열 말라리아(P. malariae)의 4종이 존재하며, 그 가운데 열대열 말라리아(P. falciparum)는 가장 독성이 강하고 치사율이 높으며 삼일열 말라리아(P. vivax)는 전 세계적으로 가장 널리 분포하고 있는 종이다. 우리나라에서는 예로부터 말라리아를 학질이라고 불렀으며, 정부와 WHO의 노력에 의해 1980년대 초에 모두 박멸된 것으로 보고 됐었지만, 휴전선 이북지역으로부터 넘어온 모기에 의해서 1993년 다시 재발된 이후, 계속해서 환자 수가 증가하고 있다. 최근 들어서는 해외여행의 증가에 의해서 토착형 말라리아인 삼일열 말라리아 외에도 열대열 말라리아에 감염된 해외 여행자들이 국내에서 치료받은 사례가 보고되고 있다.
말라리아의 생활환은 크게 사람에게서 성장하는 무성 생식기와 모기 내에서 성장이 이루어지는 유성 생식기로 나누어진다. 모기가 사람을 물게 되면, 모기의 침샘 내에 존재하던 종충(sporozoite)이 혈액내로 들어와서 간세포로 침투한다. 간세포에 침투한 종충은 분열을 거듭하여 포자낭충(merozoite)를 형성하고, 간세포로부터 나온 포자낭충은 적혈구로 들어가게 된다. 적혈구에서 수백개로 분열한 포자낭충은 적혈구를 터트리면서 혈액내로 방출되며, 분열된 포자낭충 중에서 일부는 생식모세포(gametocyte)를 형성하게 된다. 모기가 사람을 물면서 모기 내부로 들어간 생식모세포는 모기의 중장(midgut)에서 분열한 후 모기의 침샘으로 이동하여 종충(sporozoite)를 형성하고 다시 모기가 사람을 물기까지 기다리게 된다.
이러한 말라리아의 감염을 진단하는 방법 중에서 가장 고전적이면서도 확실한 방법은 현미경을 통한 혈액 도말법이다. 혈액 도말법은 슬라이드 글라스에 혈액을 얇게 도말한 후 염색하고, 이를 현미경으로 관찰하여 말라리아에 감염된 적혈구를 찾아내는 방법이다. 이 방법은 테스트 당 소모비용이 매우 저렴하며, 혈액 ㎕당 5~10마리의 말라리아 원충만 존재하더라도 진단이 가능하고, 4종의 말라리아를 구분할 수 있다는 장점은 있지만, 현미경과 같은 고가의 장비가 필요하며 숙련된 전문가만이 말라리아 감염을 정확히 구분할 수 있으며, 대량 검사에는 적당하지 않다는 단점이 있다. 아크리딘 오렌지(Acridine orange)로 염색한 혈액을 형광 현미경을 통해 관찰함으로써 말라리아를 진단하는 방법 또한 존재한다. 하지만 이 방법은 테스트 당 소요비용이 고가이며, 원심분리기, 형광 현미경, 그리고 필터 유닛(filter unit)과 같은 장비들이 필요하다는 단점이 있다. PCR을 이용한 방법은 위에서 언급한 현미경을 이용한 방법에 비해 훨씬 더 민감하면서도 특이적인 진단법을 제공한다. 하지만 이 방법 역시 PCR 장비, 원심분리기와 같은 고가의 장비와 DNA를 추출할 수 있는 숙련된 전문가를 필요로 하며, 테스트 당 비용도 고가인 단점이 있다.
말라리아의 진단에 있어 말라리아의 젖산탈수소효소, 알돌라아제, 그리고 HRP-2가 주된 진단 표적물질로 이용이 되고 있다. 말라리아의 젖산탈수소효소는 D. L. Vander Jagt 등에 의해 말라리아에 감염된 혈액으로부터 1981년에 처음으로 분리되었으며, 1992년 Makler는 말라리아의 젖산탈수소효소를 이용하여 말라리아 감염을 진단할 수 있다고 보고하였다. 그 후 1999년 Piper 등은 열대열 말라리아(P. falciparum)의 젖산탈수소효소 유전자를 클로닝하여 단클론 항체를 제작하고, 이를 이용하여 열대열 말라리아와 삼일열 말라리아를 구분하여 측정할 수 있는 키트에 대해 보고하였다 (Piper, R. C., et al. 1999. Am. J. Trop. Med. Hyg. 60(1): 109-118.). 하지만, 아시아권에서 주로 창궐하는 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효 소에 대해서는 비교적 최근에 유전자 클로닝이 처음 이루어졌기 때문에 아직까지 이에 대한 단클론 항체는 개발된 적이 없었으며, 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체의 개발은 본 발명을 통하여 이룩되었다.
말라리아 알돌라아제는 H. Dobeli 등이 열대열 말라리아에 감염된 환자의 혈액으로부터 재조합 단백질을 제작하고 정제한 후 그에 대한 생화학적 특성을 처음으로 규명하였다. 1999년 Tjitra 등은 말라리아 알돌라아제와 HRP-2 단백질에 대한 단클론 항체로 구성된 신속 면역크로마토그라피법을 이용한 키트를 제작하고, 이를 이용하여 말라리아 감염 진단에 대한 내용을 발표하였다(Tjitra 등(1999) J. Clin . Microbiol. 37, 2412-2417). 이들은 열대열 말라리아 진단에는 HRP-2(histidine-rich protein)라는 단백질에 대한 단클론항체를, 삼일열 말라리아 진단에는 알돌라아제에 대한 단클론항체를 이용하였다. 이들이 제작한 키트의 특이도와 민감도는 각각 94%와 98% 였으나, 말라리아 원충수가 마이크로리터 당 500마리 이하로 떨어질 경우 양성률이 현저히 떨어졌다고 보고하였다. 또한, HRP-2 단백질은 열대열 말라리아의 감염에서만 검출되어 삼일열 말라리아 등과 같은 다른 말라리아의 감염을 판별할 수 없으며, HRP-2 단백질이 말라리아 치료가 끝난 환자의 혈액에서 수 주 동안 존재하므로 잘못된 양성 반응을 일으킬 수 있는 문제점이 있다(Hanscheid(1999) Clin . Lab . Haem . 21 235). 이러한 잘못된 양성 반응의 결과는 불필요한 말라리아 치료를 유발시켜 부작용이 많은 약물 치료에 노출되게 한다.
말라리아 환자의 25% 정도가 삼일열 말라리아와 열대열 말라리아에 의해 중복감염이 된다고 보고된 바 있다. 하지만, 열대열 말라리아와 삼일열 말라리아의 감염을 치료하기 위한 약재는 다르다. 또한, 열대열 말라리아의 경우 최근 들어 약재 내성 말라리아가 빈빈하게 발생하여 환자들의 치료에 어려움을 격고 있는 실정이다. 하지만, 삼일열 말라리아의 경우 열대열 말라리아와 비교하여 현재까지는 약재 내성이 심각하지 않다. 하지만, 무분별한 약재를 투여할 경우 삼일열 말라리아도 약재 내성이 생길 수 있어 범국가적으로 치료에 있어 주의를 해야 한다.
하지만, 현재까지 삼일열 말라리아와 열대열 말라리아의 유전자들이 이미 공지되었음에도 불구하고 불행하게도 현재까지 삼일열 말라리아만을 특이적으로 진단할 수 있거나 삼일열 말라리아와 열대열 말라리아가 중복 감염되어 있는 질환을 진단할 수 있는 방법은 유전자 검사법을 제외하고는 전세계적으로 없는 실정이다. 그 이유는 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소의 재조합 단백질을 대장균 등에서 수용성이며 효소 활성을 가진 상태로 만들기가 어려우며, 삼일열 말라리아와 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소의 유전자 상동성이 매우 높기 때문에 삼일열 말라리아에만 특이적인 항체를 생산하지 못했기 때문이다. 하지만, 유전자 검사법은 시간이 많이 걸리고, 검사 비용이 고가이며, 특수한 기기와 고도로 훈련된 사람을 필요로 하기 때문에 실제 말라리아가 많이 창궐하는 지역에서는 이 방법을 사용하는 데에 많은 어려움이 있다.
따라서, 특이도와 민감도가 뛰어나며, 삼일열 말라리아만의 감염 여부를 감별해낼 수 있거나, 말라리아 원충의 종류를 구분할 수 있으며, 특히, 말라리아의 중복 감염을 감별해 낼 수 있는 간편하고 경제적인 말라리아의 진단 키트의 개발이 요구되고 있다.
본 발명에서는 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 특이도와 민감도가 뛰어나며, 삼일열 말라리아 감염 여부를 감별해낼 수 있고, 말라리아 원충의 종류를 구분할 수 있으며, 최초로 말라리아의 중복 감염을 간편하고 경제적으로 진단할 수 있는 키트를 개발하였다. 또한, 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소에 대한 단클론 항체와 다클론 항체, 그리고 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 대한 단클론 항체들을 포함하는 진단 키트를 개발하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소 (LDH; lactate dehydrogenase)에 특이적인 단클론 항체를 제조하고 이와 함께 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체를 동시에 이용함으로써 말라리아 중복감염을 검출하는 방법 및 진단 키트를 완성하였다.
본 발명은 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체와 다클론 항체, 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체, 그리고, 삼일열 및 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 동시 특이적인 단클론 항체를 포함하는 말라리아 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 진단 키트를 이용하여 말라리아를 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 단클론 항체를 생산하는 융합세포를 제공한다.
본 발명은 상기 진단 키트에 사용되는 말라리아의 젖산탈수소효소들에 대해 특이적인 신규한 단클론 항체를 제공한다.
본 발명에서 이룩한 삼일열 및 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 대한 단클론 항체를 포함하는 진단 키트는 1) 열대열 말라리아와 삼일열 말라리아를 구분할 수 있으며, 기존의 진단키트들에서 문제점으로 대두된, 2) 삼일열 말라리아와 열대열 말라리아의 중복 감염을 감별해 낼 수 있으며, 3) 삼일열 말라리아에 대한 낮은 민감도를 극복한 간편하고 경제적인 진단 키트이다. 특히, 삼일열 말라리아의 약재 내성균 억제에 국제적으로 크게 기여할 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체와 다클론 항체, 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체, 그리고 삼일열 및 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 동시 특이적인 단클론 항체를 포함하는 말라리아 진단 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 진단 키트는 기존의 진단 키트에 비해 특이도와 민감도가 뛰어나며, 말라리아의 종류를 구분할 수 있으며, 특히, 말라리아의 중복 감염을 감별할 수 있는 장점이 있는 신속, 간편한 최초의 진단 키트이다.
본 발명의 말라리아의 진단 키트에 사용되는 단클론 항체는 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체, 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체, 그리고, 삼일열 및 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 동 시 특이적인 단클론 항체이다. 구체적으로 수탁번호 KCTC11239BP의 융합세포에 의해 생산되는, 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체 1H3C10, 수탁번호 KCTC11240BP의 융합세포에 의해 생산되는, 열대열 말라리아 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체 T12E, 그리고 수탁번호 KCTC11241BP의 융합세포에 의해 생산되는, 삼일열 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소에 동시 특이적인 단클론 항체 T28C이다.
본 발명자들은 삼일열 말라리아에 감염된 한국인 환자와 열대열 말라리아에 감염된 베트남인 환자의 혈액에 존재하는 말라리아 원충으로부터 각각 DNA를 추출하고, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)법을 이용하여 삼일열 및 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소 유전자를 각기 증폭하였으며, 이를 이용하여 2 종의 유전자 재조합 항원을 제작하였다 (도 4a 및 도 4b).
제작된 유전자 재조합 항원을 대장균에서 발현한 후, 순수하게 정제하고 (도 5a), 이를 면역원으로 사용하여 생쥐에 주사하여 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소에만 특이적으로 반응하는 단클론 항체를 분비하는 융합세포, 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에만 특이적으로 반응하는 단클론 항체를 분비하는 융합세포, 그리고, 열대열 및 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소에 동시 특이적으로 반응하는 단클론 항체를 분비하는 융합세포를 분리하여 단클론 항체를 제조하였다. 제조한 단클론 항체 중 가장 높은 반응성을 나타내는 항체들, 즉, 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소 특이 항체 1H3C10, 열대열 말라리아 젖산탈수소효소 특이 항체 T12E, 그리고 열대열 및 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소에 동시 특이 항체 T28C를 각기 선별 하여, 본 발명의 진단 키트에 사용하였다. 본 발명의 진단 키트에는 상기 항체 이외에도 통상적인 진단 키트에 포함될 수 있는 설명서, 진단 시약 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 키트에 사용하기 위한 검정 시스템은 이에 한정되는 것은 아니나, 엘리자 (ELISA) 법, 딥-스틱 디바이스 법, 면역 크로마토그래피법 및 방사 분할 면역검정 디바이스 및 플로우-쓰로우 (flow-through) 디바이스 등을 포함한다. 본 발명의 키트는 바람직하게는 면역 크로마토그래피법을 이용한 스트립 형태, 또는, 디바이스 형태의 진단 키트이다.
면역 크로마토그래피 측정법 (immunochromatographic assay: ICA)은 그 신속함과 간편함 때문에 래피드 테스트 (rapid test)라고도 불리는데, 그 원리는 검체의 혈청 중에 들어 있는 말라리아 항원이 콜로이드성 금 입자 (colloidal gold particle)에 결합된 표식자 항체 (tracer antibody)와 반응한 다음 모세관 현상에 의해 니트로셀룰로오스 (nitrocellulose) 막의 미세구멍을 통하여 이동하는 도중에 미세구멍의 내부 표면에 고정되어 있는 포획 항체 (capture antibody)와 결합하여 발색 띠 (colorized band)를 형성함으로써 양성 및 음성을 육안으로 판별하는 것이다. 면역크로마토그래피 진단 방법은 절차가 간단하고 결과가 신속하게 나오기 때문에 호르몬, 항원, 항체, 의약 성분 등의 검사에 현재 많이 이용되고 있다.
본 발명의 상기 진단 키트에서, 항원-항체 복합체는 색체입자결합법으로 검출하며, 색체입자로는 예를 들어 콜로이드성 금 입자 또는 칼라 유리 또는 플라스틱(예: 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드(bead)를 포함한다. 본 발명에 서는 바람직하게 금 콜로이드를 이용한다.
또한, 상기 진단 키트에서, 항원-항체 복합체와 결합하는 포획 항체(capture antibody)로는 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체와 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체를 사용하며, 특히, 수탁번호 KCTC11239BP의 융합세포에 의해 생산되는 단클론 항체 1H3C10과 수탁번호 KCTC11240BP의 융합세포에 의해 생산되는 단클론 항체 T12E가 바람직하다. 포획 항체에 대한 또 다른 형태로서는 삼일열 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소에 대해 각기 특이적인 토끼 다클론 항체를 사용한다. 콜로이드성 금 입자와 결합하는 표식자 항체 (tracer antibody)로는 삼일열 및 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 동시 특이적인 단클론 항체를 사용하며, 특히, 수탁번호 KCTC11241BP의 융합세포에 의해 생산되는 T28C를 사용한다.
본 발명의 면역크로마토그래피법을 이용한 말라리아 진단 키트에 있어 보다 상세하게는 표면에 세 개의 눈에 보이지 않는 선이 그어져 있는 니트로셀룰로오스 막과 항체-금 축합체가 건조 상태로 보관되어 있는 유리섬유 패드 (혹은 플라스틱 웰)의 두 가지 주요 부분으로 구성되어 있다. 상기 니트로셀룰로오스 막에 눈에 보이지 않는 선에는 서로 다른 세 가지 항체가 고정화 되어 있다. 구체적으로 제일 아래 쪽에 있는 1번 검사선 (test line 1, T1)은 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체인 T12E를, 2번 검사선 (test line 2, T2)에는 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체인 1H3C10를, 위쪽의 대조선 (control line, C)에는 산양 항-생쥐 면역글로불린 항체 (goat anti-mouse IgG antibody)가 고정되어 있다. 삼일열 및 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 동시 특이적인 단클론 항체 T28C와 콜로이드성 금 입자를 축합(conjugation)시킨 항체-금 축합체는 유리섬유 패드 (또는 플라스틱 웰)에 주입한 후 건조되어 있다. 이렇게 구성되어 있는 키트의 검체 적하부에 검체를 가하면 건조 상태로 보관되어 있는 항체-금 축합체가 수화되고 검체 중의 항원과 결합하면서 동시에 모세관 현상에 의하여 니트로셀룰로오스 막에 있는 미세구멍을 통하여 이동한다. 이어, 상기 보이지 않는 선에 고정되어 있는 항체가 항체-금 축합체에 결합된 항원과 반응하면서 항체-금 축합체가 띠고 있는 붉은 색 때문에 눈에 보이는 붉은 선으로 나타나게 된다. 또한, 위쪽 선에 고정되어 있는 산양 항-생쥐 면역를로불린 항체는 항원이 없더라도 항체-금 축합체와 반응할 수 있으므로 매 검사마다 반드시 나타나고, 이것으로 검사가 적절하게 수행되었는지를 확인할 수 있다. 즉, 항원이 있으면 그 키트의 검사선에 고정된 항체와 반응하여 검사선과 대조선이 동시에 나타나고, 항원이 없으면 검사선은 나타나지 않고 대조선만 나타난다.
또한, 본 발명의 진단 키트는 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체와 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체를 동시에 사용함으로써 말라리아 원충의 종류 및 말라리아의 중복 감염을 구분할 수 있다. 상기와 같은 구성을 가지는 본 발명의 진단 키트에 열대열 말라리아 양성 검체를 접촉시키면 검사선 T1에 색 띠가 나타나고, 삼일열 말라리아 양성 검체를 접촉시키면 T2에 색 띠가 나타난다. 만일, 말라리아가 중복 감염된 양성 검체를 접촉시키면 T1과 T2에 동시에 색 띠가 나타나게 된다. 이로써 본 발명의 진단 키트를 사 용함으로써 말라리아 중복 감염을 감별할 수 있을 뿐만 아니라, 원충의 종류까지도 간편하고 신속하게 구분하여 진단할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에서 이룩한 유전자 재조합된 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소와 유전자 재조합된 열대열 말라리아 젖산탈수소효소를 이용한 면역-친화 크로마토그래피 (immuno-affinity chromatography) 법을 통하여 제작된 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소와 열대열 말라리아 젖산탈수소효소에 특이적인 토끼 다클론 항체를 이용하여 말라리아의 중복 감염 및 원충의 종류를 구별하여 진단할 수 있다. 즉, 포획 항체로서 검사선 T1에는 열대열 말라리아 젖산탈수소효소 특이 토끼 다클론 항체를, 검사선 T2에는 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소 특이 토끼 다클론 항체를, 대조선 C에는 산양 항-생쥐 면역글로불린 항체를 고정화 시켜 둔다. 콜로이드성 금입자에는 삼일열 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소에 동시 특이적인 생쥐 단클론 항체 T28C를 축합시켜 축합 패드에 위치시켜서 말라리아를 감별 진단할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 진단 키트를 이용하여 항원-항체 반응을 수행하는 단계를 포함하는 말라리아를 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명의 말라리아 진단 방법은 채취된 전혈을 상기의 진단 키트의 샘플 적하부에 접촉하여 흡수되도록 하여 방치한 후, 반응이 종료된 진단 키트의 검사선이 나타나는 위치에 따라 열대열 또는 삼일열 말라리아의 양성 여부를 판단한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기한 진단 키트에 사용되는 삼일열 및 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 대해 특이적인 신규한 단클론 항체들 및 다클론 항체들을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 삼일열 말라리아 LDH에 특이적인 단클론 항체와 이를 포함하는 삼일열 말라리아를 진단할 수 있는 키트를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소 (LDH; lactate dehydrogenase)에 특이적 단클론 항체와 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체를 이용하여 말라리아 중복감염을 검출하는 방법 및 진단키트를 제공하고 상기 진단 키트는 삼일열 및 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 동시 특이적인 단클론 항체를 추가로 이용할 수 있다.
본 발명의 단클론 항체 및 다클론 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다, 구체적으로, 단클론 항체는 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소와 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소를 면역원으로 하여 생쥐를 면역화시킨 후, 이의 비장 세포 (splenocyte)를 골수종 세포 (myeloma)와 융합하여 융합세포 (hybridoma)를 생성하고, 각각의 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적으로 결합하는 융합세포를 선별하여 이로부터 제조한 항체이다. 구체적으로, 도 1의 흐름도에서 예시한 바와 같이 열대열 말라리아 및 삼일열 말라리아에 감염된 환자의 혈액에 존재하는 말라리아 원충으로부터 각각 DNA를 추출하고 도 3에 표기한 프라이머 BL-PvLDH-F와 BL-PvLDH-R을 이용한 PCR을 수행하여 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소 유전자 (도 4a)를, 프라이머 BL-PfLDH-F와 BL-PfLDH-R을 이용한 PCR을 수행하여 열대열 말라리아 젖산탈수소효소 유전자 (도 4b)를 증폭하여, 이를 이용하여 재조합 항원을 제작하였다. 제작된 항원을 정제하고, 이를 면역원으로 사용하여 생쥐에 주 사하여 삼일열 말라리아 및 열대열 말라리아에만 특이적으로 반응하는 항 말라리아 젖산탈수소효소 단클론 항체를 분비하는 융합세포와 열대열 및 삼일열 말라리아에 모두 반응하는 항 말라리아 젖산탈수소효소 단클론 항체를 분비하는 융합세포를 각기 선별적 분리(selective cloning)를 하였다. 좀 더 구체적으로, 삼일열 및 열대열 말라리아에 각기 특이적으로 반응하는 항 말라리아 젖산탈수소효소 단클론 항체를 분비하는 융합세포를 선별하기 위하여, 재조합 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소가 결합된 엘리자 플레이트 (ELISA plate)와 재조합 열대열 말라리아 젖산탈수소효소가 결합된 엘리자 플레이트 (ELISA plate)를 준비하여 반응성을 스크리닝 (screening)하였다. 재조합 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소가 결합된 플레이트에서는 반응을 하지만 재조합 열대열 말라리아 젖산탈수소효소가 결합되어 있는 플레이트에서는 반응하지 않는 단클론 항체를 분비하는 융합세포를 선별하였으며, 여기에서 분비되는 단클론 항체를 1H3C10으로, 재조합 열대열 말라리아 젖산탈수소효소가 결합된 플레이트에서는 반응을 하지만 재조합 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소가 결합되어 있는 플레이트에서는 반응하지 않는 단클론 항체를 분비하는 융합세포를 선별하였으며, 여기에서 분비되는 단클론 항체를 T12E로, 두 종류의 플레이트 모두에서 반응을 하는 단클론 항체를 분비하는 융합세포를 선별하였으며, 여기에서 분비되는 단클론 항체를 T28C라 명명하고 이를 본 발명에서 기술한 키트 제작에 사용하였다. 이렇게 선별된 융합세포주를 각각 생쥐 복강에 주입한 후, 일정 기간이 지난 다음 복수를 채취하고, 이로부터 단클론 항체를 분리하였다. 본 발명의 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소만을 선별적으로 인지하는 단클론 항체 1H3C10을 생 산하는 융합세포는 KCTC11239BP(기탁일자 2007.11.15)로, 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소만을 선별적으로 인지하는 단클론 항체 T12E를 생산하는 융합세포는 KCTC11240BP(기탁일자 2007.11.15)로, 열대열 및 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소를 선별적으로 인지하는 단클론 항체 T28C를 생산하는 융합세포들은 KCTC11241BP(기탁일자 2007.11.15)로 각각 기탁하였다.
따라서, 또 다른 양태로서 본 발명은 단클론 항체 1H3C10, 단클론 항체 T12E, 그리고 단클론 항체 T28C를 각각 생산하는 융합세포 KCTC11239BP, KCTC11240BP, 그리고 KCTC11241BP에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 삼일열 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소 유전자의 클로닝 , 대량 발현 및 정제
1) 말라리아 DNA의 정제 및 중합효소연쇄반응을 이용한 삼일열 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소의 유전자 증폭
성균관대학교 의과대학 (수원, 한국)으로부터 제공받은 삼일열 말라리아 환자의 혈액과 호치민시 의과대학 (호치민시, 베트남)으로부터 제공받은 열대열 말라 리아 환자의 혈액으로부터 닥터 젠틀 키트 (Dr. GenTLE Kit; TAKARA Bio사, 일본)의 용법 및 용량에 준하여 삼일열 말라리아 및 열대열 말라리아 DNA를 각각 추출하였다. 추출된 각각의 DNA를 주형으로 하여, 말라리아 젖산탈수소효소의 유전자에 해당하는 부분을 양쪽 말단 프라이머를 이용하여 증폭시킨 다음, 이를 대장균에서 단백질을 발현시킬 수 있는 발현 벡터 pET-28a (Novagen 사, 미국)로 클로닝하였다. 이에 사용된 프라이머의 염기서열은 도 3과 같다. 즉, BL-PvLDH-F 프라이머 (서열번호 1)와 BL-PvLDH-R 프라이머 (서열번호 2)을 이용하여 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소를, BL-PfLDH-F 프라이머 (서열번호 3)와 BL-PfLDH-R 프라이머 (서열번호 4)을 이용하여 열대열 말라리아 젖산탈수소효소를 증폭 및 클로닝 (cloning)하였다. 클로닝된 말라리아 젖산탈수소효소 유전자들에 대한 염기 서열을 에이비아이 377 (ABI 377, PerKin Elmer사, 미국) 염기서열 분석 장치를 이용하여 분석하였으며, 그 결과는 도 4a(삼일열 말라리아 젖산탈수소효소; 서열번호 5)와 도 4b (열대열 말라리아 젖산탈수소효소; 서열번호 6)와 같다.
2) 재조합 삼일열 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소의 정제
재조합 말라리아 젖산탈수소효소들은 히스티딘 친화성 컬럼 (histidine affinity column; Invitrogen 사, 미국)을 이용하여 정제하였으며, 이렇게 정제된 재조합 단백질은 트롬빈 (thrombin, Novagen 사, 미국) 처리를 통해 히스티딘 태그 (histidine tag)로부터 분리시켰다. 분리된 히스티딘 태그는 히스티딘 친화성 컬럼에 다시 통과시켜 제거하였으며, 트롬빈은 하이트랩 벤자미딘 컬럼 (Hitrap Benzamidine column, Amersham Bioscience 사, 스웨덴)에 통과시켜 제거하여, 순수한 재조합 말라리아 젖산탈수소효소들을 얻었다.
실시예 2 : 삼일열 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소에 대한 단클론 항체 제작
1) 재조합 말라리아 젖산탈수소효소를 이용한 면역화
산양, 토끼 또는 다클론 항체의 생산에 용이한 동물에 일정량의 재조합 말라리아 젖산탈수소효소가 들어 있는 인산염 완충액 (PBS)과 같은 부피의 컴플리트 프로인트 아주번트 (complete Freund's adjuvant)가 섞인 현탁액을 만들어 피하 주입하였다. 3주 후에 인컴플리트 프로인트 아주번트 (incomplete Freund's adjuvant)를 사용하여 같은 요령으로 한 번 더 주사하고, 다시 3주 후에 같은 요령으로 한 번 더 주사하였다. 마지막 면역처리 후 3~5일 뒤에 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 인산염 완충액에 희석하여 (1/1000) 엘리자(ELISA, Enzyme linked Immun osorbant assay) 방법으로 항체의 역가를 결정하였다. 만약 역가가 낮게 나오면 1주 후에 다시 면역화시킨다.
면역화가 충분하게 이루어진 개체로 부터 혈액을 채혈하여 원심분리를 통하여 혈청을 얻었다. 이 혈청을 재조합 젖산탈수소효소가 공유결합으로 결합된 세파로스 (Sepharose) 충진제가 들어있는 컬럼에 주입을 하였다. 컬럼에 들어있는 충진제 부피의 5배이상의 생리식염수를 이용하여 세정하여 결합하지 않은 단백질들을 세척하였다. 그 후, 컬럼에 결합된 항체는 100mM 글리신용액 (glycine solution, pH 2.8) 으로 용출 (elution) 시켰다. 이 때 1M Tris (pH 9.0) 용액을 용출액의 1/10 부피를 첨가해 주어 pH를 보정해 주었다. 용출된 항체액을 농축한 후 150mM 인산완충용액에서 투석하고, 투석이 끝나면 브래드포드법 (Bradford assay)을 이용하여 항체의 양을 확인하고 사용 전까지 냉동 보관하였다.
실시예 3 : 삼일열 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소에 대한 단클론 항체 제작
1) 항원의 면역화
각각 100㎍의 재조합 말라리아 젖산탈수소효소가 들어 있는 인산염 완충액 (PBS)과 같은 부피의 컴플리트 프로인트 아주번트 (complete Freund's adjuvant)가 섞인 현탁액을 만들어 생후 6-8주 가량 된 암컷 생쥐 (BALB/C, 대한바이오링크(주), 한국)의 복강 내에 주입하였다. 2주 후에 인컴플리트 프로인트 아주번트 (incomplete Freund's adjuvant)를 사용하여 같은 요령으로 한 번 더 주사하고, 다시 2주 후에 같은 요령으로 한 번 더 주사하였다. 마지막 면역처리 후 2일 뒤에 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 인산염 완충액에 희석하여 (1/1000) 엘리자(ELISA, Enzyme linked Immun osorbant assay) 방법으로 항체의 역가를 결정하였다. 만약 역가가 낮게 나오면 2주 후에 다시 면역화시킨다.
2) 비장세포 (Splenocyte)와 골수종 (Myeloma) 세포의 융합
면역화 된 쥐에서 비장을 꺼낸 후, 조직분쇄기로 비장을 으깬 후, 세포 혼탁액을 용기에 담고 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 골수종 세포는 세포배양용 플라스크에서 회수하여 RPMI1640에 현탁하고 세포수를 계산하였다. 비장세포 역시 세포수를 계산하였다. 1× 107의 골수종 세포와 1× 108의 비장세포를 50ml 용기로 옮겨 RPMI1640을 적당량 첨가 후 200× g로 5분간 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 현탁시켜 천천히 흔들어 주면서 1ml의 50% PEG (polyethylene glycol) 용액을 1분 동안 가하였다. 5분 후에 1ml의 RPMI1640을 30초에 걸쳐 넣고, 다시 3ml의 RPMI1640을 30초에 걸쳐 첨가하였다. 또 다시 17ml의 RPMI1640을 1분에 걸쳐 넣은 다음 20ml의 RPMI1640을 더 넣어주고, 5분 동안 반응시켰다. 200× g로 5분간 원심분리한 후 배지는 제거하였다. 50ml의 1% HAT (hypoxathine-aminopterin -thymidine)을 함유하는 RPMI1640에 주의하여 현탁한 후, 피더 세포 (feeder cell)가 들어있는 96웰 세포배양용 용기에 100㎕/웰 씩 융합된 세포를 넣어준 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 세포를 배양하였다.
3) 융합세포주의 클로닝 및 복수를 이용한 항체 생산
10일 정도 후에, 융합세포가 군락을 형성하여 자라는 것이 확인되면 96웰 세포배양용 용기에서 배지를 조금 취하여 엘리자 법으로 말라리아 젖산탈수소효소에 대한 항체를 생산하는 웰을 확인하고, 그 웰의 세포를 회수하여 24웰 세포배양용 용기로 옮긴 다음 배양한 후, 안정한 단클론 세포주가 얻어질 때까지 제한 희석(limited dilution) 법을 이용하여 클로닝을 계속하였다. 클로닝이 완료되면 티 플라스크 (T flask)로 옮겨 대량으로 배양하여 얼린 후 액체 질소에 보관하였다.
생후 6-8주 된 쥐 (BALB/C)의 복강에 인컴플리트 프레운즈 아주번트(incomplete Freund's adjuvant)를 0.5ml 주사하였다. 1주일째 되는 날 융합세포를 인산염 완충액에 현탁하고 계수하여, 쥐 한 마리당 1.5× 106세포를 0.5ml 인산염 완충액에 현탁 후 복강에 주사하였다. 1-2주가 지나면서 복수가 적당히 차오르면 주사기를 이용하여 복수 (ascitic fluid)를 채취한 후 냉동 보관하였다.
4) 단클론 항체의 정제
채취한 복수에 황산 암모늄 (ammonium sulfate)을 10%의 농도로 첨가한 후 30분간 혼합하였다. 그리고 15000rpm에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 취하였다. 다시 이 상층액에 황산 암모늄을 50%의 농도로 첨가한 후 4℃에서 30분간 방치하였다. 다시 15000rpm에서 30분간 원심 분리하여 상층액은 버리고 침전물을 20mM 인산완충용액 (phosphate buffer, pH 7.0)에 현탁시켰다. 이 현탁액을 20mM 인산완충용액에서 18시간 이상 투석 (dialysis)하였다. 투석 후, 20mM 인산완충용액 (pH 7.0)으로 평형화된 단백질 G-결합 컬럼 (Protein G-coupled column)에 투석액을 주입하고, 모두 주입되고 나면 인산완충용액을 이용하여 흡착하지 않은 물질들을 제거해주었다. 컬럼에 결합된 항체는 100mM 글리신용액 (glycine solution, pH 2.8) 으로 용출 (elution) 시켰다. 이 때 1M Tris (pH 9.0) 용액을 용출액의 1/10 부피를 첨가해 주어 pH를 보정해 주었다. 용출된 항체액을 농축한 후 150mM 인산완충용액에서 투석하고, 투석이 끝나면 브래드포드법 (Bradford assay)을 이용하여 항체의 양을 확인하고 사용 전까지 냉동 보관하였다.
5) 단클론 항체의 선정 및 해리상수 (Kd) 계산
정제된 말라리아 젖산탈수소효소-특이 단클론 항체들을 대상으로 말라리아 젖산탈수소효소와의 반응성을 확인하기 위해서 엘리자 방법을 이용하여 측정하였다. 이를 위해서 2종의 말라리아 젖산탈수소효소를 각각 96 웰 (well) 엘리자 플레이트 (ELISA plate)에 5㎍/㎖의 농도로 코팅하였다. 정제된 말라리아 젖산탈수소효소-특이 단클론 항체들을 각각 단계적으로 희석하여 재조합 삼일열 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소가 각각 코팅된 플레이트와 반응시키고, 반응 후 결합되지 않은 항체를 세척과정을 통해 제거하였다. 고추냉이 과산화효소 (HRP; Horseradish peroxydase)가 결합된 산양 항 생쥐 면역글로블린을 반응시키고, 세척과정을 통해 반응하지 않은 과산화효소-IgG를 제거한다. 과산화효소의 기질이 되는 TMB (tetramethyl benzidine)를 넣고 발색시켜 반응정도에 따른 흡광도 (A450)를 측정하였다. 도 6a에서와 같이 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소에 대해서는 1H3C10이, 열대열 말라리아 젖산탈수소효소에 대해서는 T12E가 반응성이 좋았으며, T28C는 삼일열과 열대열 말라리아 젖산탈수소효소 모두에서 좋은 반응성을 나타내었다.
또한, 본 발명에 이용한 키트의 제조에 사용하고자 하는 3종의 항체에 대한 해리상수 (dissociation constant, Kd)를 측정하기 위해서 간접적 경쟁 ELISA (indirect competitive ELISA)를 통하여 Klotz plot을 실시하고, 해리상수를 구한 결과, 본 발명을 통해 이룩한 단클론 항체들의 해리상수는 도 6b와 같았다. 즉, 단클론 항체 T12E는 해리상수가 25.24± 0.51 x 10-9이고, 단클론 항체 T28C는 해리상수가 24.21± 2.07 x 10-9이며, 단클론 항체 1H3C10은 해리상수가 36.52± 1.12 x 10-9이다.
실시예 4: 삼일열 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소 단클론 항체를 이용한 신속 면역크로마토그라피법 스트립 형태 진단 키트의 제조
1) 항체의 부동화
도 7a에서와 같이 플라스틱 카드에 부착된 니트로셀룰로오스 막의 특정 위치, 즉 1번 검사선 (test line 1, T1)에는 열대열 말라리아 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론항체 T12E을, 2번 검사선 (test line 2, T2)에는 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론항체 1H3C10를, 그리고 대조선 (control line, C) 위치에는 산양 항 생쥐 면역를로불린을 각각 분주하고 30℃ 인큐베이터에서 2일간 건조시켜 단클론 항체가 니트로셀룰로오스 막에 완전히 부동화되도록 하였다.
2) 금 축합체(gold conjugate)의 제조 및 금 축합 웰의 제조
삼일열 및 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 동시 특이적인 단클론 항체 T28C를 약 40nm 크기의 콜로이드성 금 입자 (colloidal gold particle)와 섞은 후 37℃ 항온 수조에서 1시간 동안 반응하여 단클론 항체와 콜로이드성 금 입자가 서로 결합되도록 하였다. 그 후, 소 혈청 알부민 (BSA; bovine serum albumin)와 수크로오스 (sucrose)를 각각 3% 및 1% 되게 첨가한 후, 다시 1시간 동안 반응시켜 항체가 결합하지 못한 콜로이드성 금 입자와 반응하도록 하였다. 그 후, 10,000rpm에서 원심 분리시켜 단클론 항체가 결합된 금 축합체를 회수하고, 540nm에서 흡광도를 측정한 후 냉장 보관하였다. 제조된 금 축합체를 플라스틱 재질의 마이크로웰 플레이트 (microwell plate)에 주입시킨 후, 건조시켜 금 축합웰 (gold conjugate well)을 제조하였다.
3) 스트립 키트의 조립
도 7a에서 예시되어 있는 바와 같이 말라리아의 젖산탈수소효소에 대한 단클론 항체가 결합된 니트로셀룰로오스 막이 붙어있는 플라스틱 카드의 상단부에는 검체 및 버퍼를 흡수할 수 있는 흡수 패드 (absorbance pad)를 부착하고, 위에는 스티커를 부착하여 스트립 형태 키트를 완성하였다.
실시예 5 : 삼일열 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소 단클론 항체를 이용 한 신속 면역크로마토그라피법 디바이스 형태 진단 키트의 제조
1) 항체의 부동화
도 8a에서와 같이 플라스틱 카드에 부착된 니트로셀룰로오스 막의 특정 위치, 즉 1번 검사선 (test line 1, T1)에는 열대열 말라리아 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론항체 T12E을, 2번 검사선 (test line 2, T2)에는 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론항체 1H3C10를, 그리고 대조선 (control line, C) 위치에는 산양 항 생쥐 면역글로불린을 각각 분주하고 30℃ 인큐베이터에서 2일간 건조시켜 단클론 항체가 니트로셀룰로오스 막에 완전히 부동화되도록 하였다.
2) 금 축합체(gold conjugate)의 제조 및 금 축합패드의 제조
삼일열 및 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 동시 특이적인 단클론 항체 T28C를 약 40nm 크기의 콜로이드성 금 입자 (colloidal gold particle)와 섞은 후 37℃ 항온 수조에서 1시간 동안 반응하여 단클론 항체와 콜로이드성 금 입자가 서로 결합되도록 하였다. 그 후, 소 혈청 알부민 (BSA; bovine serum albumin)와 수크로오스 (sucrose)를 각각 3% 및 1% 되게 첨가한 후, 다시 1시간 동안 반응시켜 항체가 결합하지 못한 콜로이드성 금 입자와 반응토록 하였다. 그 후, 10,000rpm에서 원심 분리시켜 단클론 항체가 결합된 금 축합체를 회수하고, 540nm에서 흡광도를 측정한 후 냉장 보관하였다. 제조된 금 축합체를 유리 섬유 (glass fiber) 재질의 패드에 흡수시키고 건조시켜 금 축합패드를 제조하였다.
3) 디바이스 형태 키트의 조립
도 8a에서 예시되어 있는 바와 같이 말라리아의 젖산탈수소효소에 대한 단클론 항체들이 결합된 니트로셀룰로오스 막이 붙어있는 플라스틱 카드의 상단부에는 검체 및 버퍼를 흡수할 수 있는 흡수패드 (Absorbance pad)를 부착하고, 하단부에는 검체를 적하하는 검체 패드 (Sample pad)와 축합 패드 (Conjugate pad)를 부착시켰다. 이렇게 조립된 반응 스트립 (strip)을 도 8a에 명시되어 있는 바와 같이 플라스틱 재질의 하우징 (housing)에 넣어 키트를 완성시켰다.
실시예 6 : 스트립 형태 키트의 검사 방법
금 축합웰과 세척웰을 꺼내어 준비를 한다. 금 축합웰에는 검체 전개액을 1방울, 그리고 키트와 함께 제공되는 세척웰에 검체 전개액을 4방울 떨어뜨린다. 환자의 검지 끝부분을 알콜솜을 이용하여 소독하고, 1회용 란셋 (lancet)을 이용하여 찌른 후, 모세관 튜브 (capillary tube)를 이용하여 혈액을 10마이크로리터 (microliter) 채취한다. 채취된 혈액을 금 축합웰에 넣고 모세관 튜브를 이용하여 검체전개액과 혼합한다. 그 후, 반응 스트립을 이 웰에 넣고 10분간 방치하여 검액이 흡수되도록 한 후, 세척액이 들어있는 세척웰로 반응 스트립을 옮긴 후, 다시 10분간 방치한다. 반응이 종료된 스트립은 도 7b에 명시되어 있는 바와 같이 검사선 상에 나타난 붉은 색의 띠의 위치에 따라 열대열 말라리아, 삼일열 말라리아, 또는 중복 감염 여부를 판독한다. 즉, 검사선 1 (T1)에서만 색 띠가 나타날 경우 열대열 말라리아 양성으로, 검사선 2 (T2)에서만 색 띠가 나타날 경우 삼일열 말라리아 양성으로, 그리고 검사선 1과 검사선 2에서 모두 색 띠가 나타날 경우 중복 감염으로 판독한다.
실시예 7 : 디바이스 형태 키트의 검사 방법
디바이스를 꺼내어 평편한 바닥에 놓는다. 환자의 검지 끝부분을 알콜솜을 이용하여 소독하고, 1회용 란셋 (lancet)을 이용하여 찌른 후, 모세관 튜브 (capillary tube)를 이용하여 혈액을 10마이크로리터 (microliter) 채취한다. 채취된 전혈을 도 8a에 명시되어 있는 바와 같이 검체 적하부에 넣고 혈액이 흡수되도록 한다. 세척액 투입구에 세척액을 3방울 떨어뜨린 후 15분간 방치한다. 반응이 종료된 키트는 도 8b에 명시되어 있는 바와 같이 검사선 상에 나타난 붉은 색의 띠의 위치에 따라 열대열 말라리아, 삼일열 말라리아, 또는 중복 감염 여부를 판독한다. 즉, 검사선 1 (T1)에서만 색 띠가 나타날 경우 열대열 말라리아 양성으로, 검사선 2 (T2)에서만 색 띠가 나타날 경우 삼일열 말라리아 양성으로, 그리고 검사선 1과 검사선 2에서 모두 색 띠가 나타날 경우 중복 감염으로 판독한다.
실시예 8 : 말라리아 젖산 탈수소효소를 이용한 신속 면역 크로마토그라피법 스트립 형태 및 디바이스 형태 키트의 효능 실험
상기 실시예 3 내지 5에 의해 제조된 진단 키트를 이용하여 삼일열 말라리아 양성 129 검체, 열대열 말라리아 양성 86 검체, 그리고, 중복 감염 양성 7 검체에 대한 키트의 성능을 테스트 하였다. 삼일열 말라리아 양성 검체들은 성균관대학교 의과대학 (수원, 한국)에서 30 건을, 호치민시 의과대학 (호치민, 베트남)에서 47 건을, 그리고, 인제대학교 의과대학 (부산, 한국)에서 52건을 기증받아 총 129 건의 검체에 대해서 시험을 하였다. 열대열 말라리아 양성 검체들은 호치민시 의과대학 (호치민, 베트남)에서 25 건을, 인제대학교에서 9 건을, 베트남 국립말라리아 연구소 (NIMPE; 하노이, 베트남)에서 52 건을 기증받아 총 86건의 검체에 대해서 시험을 하였다. PCR을 통한 유전자 검사법을 이용하여 확인된 삼일열 및 열대열 말라리아에 중복 감염된 검체는 7 건을 호치민시 의과대학으로부터 기증받아 본 키트의 효능시험에 이용하였으며, 그 결과는 표 1 (삼일열 말라리아 양성 검체 비교 테스트 결과) 및 표 2 (열대열 말라리아 양성 검체 비교 테스트 결과), 그리고 표 3 (열대열 및 삼일열 말라리아 중복감염 양성 검체 비교 테스트 결과)에 나타나 있는 바와 같다.
종합결과 (총 129 검체) 현미경 검경 및 PCR 결과
삼일열 양성 열대열 양성 중복 감염 음성
나노사인 말라리아 Pf/Pv/Mixed 삼일열 양성 123 0 0 0
열대열 양성 0 0 0 0
중복 감염 0 0 0 0
음성 6 0 0 0
계 129 0 0 0
민감도 (Sensitivity) 95.3%
상기 표 1에서와 같이 본 발명에 따른 나노사인 말라리아는 현미경 검경 및 PCR 결과 129개의 삼일열 말라리아 양성 검체에 대하여 123개가 양성으로 판명되었고 나머지 6개는 음성으로 판명되어 민감도가 95.3%를 나타내고 있다.
종합결과 (총 86 검체) 현미경 검경 및 PCR 결과
삼일열 양성 열대열 양성 중복 감염 음성
나노사인 말라리아 Pf/Pv/Mixed 삼일열 양성 0 0 0 0
열대열 양성 0 83 0 0
중복 감염 0 0 0 0
음성 0 3 0 0
계 0 86 0 0
민감도 (Sensitivity) 96.5%
상기 표 2에서와 같이 본 발명에 따른 나노사인 말라리아는 현미경 검경 및 PCR 결과 86개의 열대열 말라리아 양성 검체에 대하여 83개가 양성으로 판명되었고 나머지 3개는 음성으로 판명되어 민감도가 96.5%를 나타내고 있다.
종합결과 (총 7 검체) 현미경 검경 및 PCR 결과
삼일열 양성 열대열 양성 중복 감염 음성
나노사인 말라리아 Pf/Pv/Mixed 삼일열 양성 0 0 0 0
열대열 양성 0 0 1 0
중복 감염 0 0 6 0
음성 0 0 0 0
계 0 0 7 0
민감도 (Sensitivity) 85.7%
상기 표 3에서와 같이 본 발명에 따른 나노사인 말라리아는 현미경 검경 및 PCR 결과 7개의 삼일열 및 열대열 말라리아 중복감염 양성 검체에 대하여 6개가 양성으로 판명되었고 나머지 1개는 음성으로 판명되어 민감도가 85.7%를 나타내고 있다.
상기와 같이, 본 발명의 진단 키트는 기존의 진단 키트들이 열대열 말라리아의 검출에 대해서는 85 ~ 95% 범위의 민감도를, 그리고, 삼일열 말라리아의 검출에 대해서는 90%이하에서의 민감도를 갖고 있는 것을 고려하면 기존의 진단 키트들 보다 더욱더 우수한 민감도를 가지며, 그리고, 기존의 진단 키트들로는 검사할 수 없었던 말라리아의 중복 감염까지 검사를 할 수 있어 본 키트의 우수성을 확인하였다.
도 1은 본 발명에 따른 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소에 대한 생쥐 단클론 항체의 제작방법을 도시한 흐름도를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소에 대한 토끼 다클론 항체의 제작방법을 도시한 흐름도를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소의 유전자 증폭에 사용된 프라이머 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 유전자 재조합 단백질의 제작에 사용된 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 5a는 본 발명에 따른 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소의 유전자를 증폭한 결과를 나타낸 것이며, 도 5b는 이들 유전자들을 대장균에서 재조합 단백질로 발현한 것을 순수 정제한 결과를 나타내는 도면이다. 도 5b에서 M은 단백질 분자량 분석을 위한 표준 물질 (standard size markers)이며, 1번 레인 (lane)은 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소가 발현된 세포 용출액이며, 2번 레인은 순수 정제한 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소를 나타낸 것이며, 3번 레인은 열대열 말라리아 젖산탈수소효소가 발현된 세포 용출액이며, 4번 레인은 순수 정제한 열대열 말라리아 젖산탈수소효소를 나타낸 것이다.
도 6a는 본 발명에 따른 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소들에 대한 단클론 항체의 반응성 측정 그래프를 나타내는 도면이 다. 반응성의 측정은 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소 (도 6aa)와 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소 (도 6ab)가 각각 고정화되어 있는 플레이트에 본 발명에 따른 단클론 항체들을 농도별로 처리하여 반응성을 측정하였다. 도 6b는 본 발명에 따른 삼일열 말라리아 젖산탈수소효소 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소들에 대한 단클론 항체의 해리상수(Kd) 그래프를 나타내는 도면이다.
도 7a는 본 발명에 따른 열대열 말라리아 감염, 삼일열 말라리아 감염, 또는 이들의 중복 감염을 신속하게 진단할 수 있는 면역크로마토그라피법 스트립 형태의 구성 모식도를 나타내는 도면이며, 도 7b는 본 발명에 따른 말라리아 특이항원 진단 신속 면역크로마토그라피법 스트립 형태의 검사결과에 대한 사진을 나타내는 도면이다.
도 8a는 본 발명에 따른 열대열 말라리아 감염, 삼일열 말라리아 감염, 또는 이들의 중복 감염을 신속하게 진단할 수 있는 면역크로마토그라피법 디바이스 형태의 구성 모식도를 나타내는 도면이며, 도 8b는 본 발명에 따른 말라리아 특이항원 진단 신속 면역크로마토그라피법 디바이스 형태의 검사결과에 대한 사진을 나타내는 도면이다.
<110> BIOLAND LTD. <120> The kit for diagnosing mixed malaria infection of Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum comprising antibodies against lactate dehydrogenase of Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum <130> 0504 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-PvLDH-F primer <400> 1 cgcggatcca tgacgccgaa acccaaa 27 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-PvLDH-R primer <400> 2 ccgctcgagt taaatgagcg ccttcatcct 30 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-PfLDH-F primer <400> 3 cacggatcca tggcacaaaa gcaaaaa 27 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BL-PfLDH-R primer <400> 4 ccgctcgagt taagctaatg ccttcattc 29 <210> 5 <211> 951 <212> DNA <213> Plasmodium vivax <220> <221> gene <222> (1)..(951) <223> Pv-LDH gene <400> 5 atgacgccga aacccaaaat tgtgctcgtc gggtcgggca tgatcggagg cgtgatggcc 60 acgctgattg tgcagaagaa cctgggggac gtagtgatgt ttgacgtagt gaaaaacatg 120 ccccaaggaa aggcactaga tacgtctcac tcgaatgtga tggcttattc caattgcaag 180 gtgactggct cgaactcgta tgatgacttg aagggagccg acgtggtgat cgtcactgcg 240 ggatttacta aagcaccagg aaagagcgac aaggaatgga accgagatga tttactcccc 300 ttgaataaca aaattatgat tgagattggg ggacatatta agaacctttg ccccaatgcc 360 tttatcattg tggtgacgaa cccagtggac gtgatggtgc agttactctt cgagcattcc 420 ggagtcccaa aaaataaaat catcggatta ggtggtgtgc tagatacatc tagactgaaa 480 tattacatat cgcagaagtt gaacgtctgc ccgagagatg ttaatgcact cattgtcggt 540 gcacatggga acaagatggt tctcctgaaa aggtacatca cagttggagg tatcccattg 600 caagaattta ttaataacaa aaagattaca gatgaagaag tggaaggcat atttgatcgc 660 actgtgaaca ctgctttgga gattgtgaac ctccttgcct ctccttatgt tgccccagct 720 gctgccatca tcgaaatggc cgaatcttat ttgaaggata taaagaaagt gcttgtttgt 780 tccactctac tagagggaca atacggccac agcaacatct ttggtggtac tcctctcgtt 840 atcgggggca ccggagttga gcaagtcatc gagttgcagc tgaatgccga ggagaagacc 900 aagttcgacg aggcagttgc ggagactaaa aggatgaagg cgctcattta a 951 <210> 6 <211> 951 <212> DNA <213> Plasmodium falciparum <220> <221> gene <222> (1)..(951) <223> Pf-LDH gene <400> 6 atggcaccaa aagcaaaaat cgttttagtt ggctcaggta tgattggagg agtaatggct 60 accttaattg ttcagaaaaa tttaggagat gtagttttgt tcgatattgt aaagaacatg 120 ccacatggaa aagctttaga tacatctcat actaatgtta tggcatattc aaattgcaaa 180 gtaagtggtt caaacactta tgacgatttg gctggagcag atgtagtaat agtaacagct 240 ggatttacca aggccccagg aaagagtgac aaagaatgga atagagatga tttattacca 300 ttaaacaaca agattatgat tgaaattggt ggtcatatta agaagaattg tccaaatgct 360 tttattattg ttgtaacaaa cccagtagat gttatggtac aattattaca tcaacattca 420 ggtgttccta aaaacaagat tattggtttg ggtggtgtat tagatacatc aagattgaag 480 tattacatat ctcagaaatt aaatgtatgc ccaagagatg taaatgcaca cattgtaggt 540 gctcatggaa ataaaatggt tcttttaaaa agatacatta ctgtaggtgg tatcccttta 600 caagaattta ttaataacaa gttaatttct gatgctgaat tagaagctat atttgataga 660 actgttaata ctgcattaga aattgtaaac ttacatgcat caccatatgt tgcaccagct 720 gctgctatta tcgaaatggc tgaatcctac ttaaaagatt tgaaaaaagt attaatttgc 780 tcaaccttgt tagaaggaca atatggacac tccgatatat tcggtggtac acctgttgtt 840 ttaggtgcta atggtgttga acaagttatc gaattacaat taaatagtga ggaaaaagct 900 aaatttgatg aagccatagc tgaaactaag agaatgaagg cattagctta a 951

Claims (15)

  1. 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소(LDH; lactate dehydrogenase)에 특이적인 단클론 항체, 및
    삼일열 및 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 동시 특이적인 단클론 항체를 포함하는 말라리아 진단 키트에서,
    삼일열 말라리아 LDH에 특이적인 융합세포(기탁번호: KCTC11239BP)에 의해 생산된 단클론 항체 1H3C10을 추가로 포함함으로써 삼일열 및 열대열 말라리아의 중복감염을 진단하는 것을 특징으로 하는, 말라리아 진단 키트.
  2. 제1항에 있어서, 열대열 말라리아 LDH에 특이적인 단클론 항체는 융합세포(기탁번호: KCTC11240BP)에 의해 생산되는 T12E이며, 삼일열 및 열대열 말라리아 젖산탈수소효소에 동시 특이적인 단클론 항체는 융합세포(기탁번호: KCTC11241BP)에 의해 생산되는 T28C인, 말라리아 진단 키트.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 진단 키트는 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 형태의 말라리아 진단 키트.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 진단 키트는 항원-항체 복합체를 색체입자 결합법으로 검출하는 말라리아 진단 키트.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삼일열 말라리아 LDH에 특이적인 단클론 항체 1H3C10를 생산하는 융합세포 (기탁번호: KCTC11239BP).
  10. 삼일열 말라리아 LDH에 특이적인 융합세포 (기탁번호: KCTC11239BP)에 의해 생산되는 1H3C10인 단클론 항체.
  11. 삭제
  12. 제10항에 따른 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적 단클론 항체를 포함하는 삼일열 말라리아 진단 키트.
  13. 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소 (LDH; lactate dehydrogenase)에 특이적인 융합세포 (기탁번호: KCTC11239BP)에 의해 생산되는 1H3C10인 단클론 항체와 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체를 이용하여 말라리아 중복감염을 검출하는 방법.
  14. 삼일열 말라리아의 젖산탈수소효소 (LDH; lactate dehydrogenase)에 특이적인 융합세포 (기탁번호: KCTC11239BP)에 의해 생산되는 1H3C10인 단클론 항체와 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 단클론 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 말라리아 중복감염을 진단하는 키트.
  15. 제14항에 있어서, 상기 진단 키트는 삼일열 및 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 동시 특이적인 단클론 항체를 추가로 이용하는 키트.
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