KR102002104B1 - 열대열 말라리아원충의 젖산탈수소효소에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 열대열 말라리아원충(Plasmodium falciparum)에 특이적으로 결합하는 펩티드, 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 열대열 말라리아원충 검출용 조성물 및 상기 열대열 말라리아원충 검출용 조성물을 유효성분으로 포함하는 열대열 말라리아원충 검출용 키트에 관한 것으로, 본 발명의 펩티드는 신속한 열대열 말라리아원충 특이적 감염 진단에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

열대열 말라리아원충의 젖산탈수소효소에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도{Peptide specifically binding to lactate dehydrogenase of Plasmodium falciparum and uses thereof}
본 발명은 열대열 말라리아원충의 젖산탈수소효소에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.
인체에 기생하는 말라리아는 다섯 종류로 우리나라에서 주로 유행하는 삼일열 말라리아원충(Plasmodium vivax, tertian malaria)은 지리적 분포가 가장 넓어서 온대, 아열대 및 열대지방에 분포한다. 열대열 말라리아원충(P. falciparum)은 아열대 및 열대에 주로 분포하며, 온대지방에서는 간혹 발생하는데 말라리아 중 나타나는 증상이 가장 심각하다. 사일열 말라리아원충(P. malariae)은 열대열 말라리아원충과 거의 같으나 그 발생 빈도가 훨씬 낮고, 난형열 말라리아원충(P. ovale)은 매우 국소적이고 열대 아프리카 지역에서만 발생한다. 원숭이열 말라리아원충(P. knowlesi)은 다른 말라리아와 현미경적 감별이 극히 어렵고, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)과 같은 분자진단법으로 감별이 가능하다. 동남아시아, 특히 말레이지아 보르네오에 분포하는데 주로 긴꼬리원숭이(macaques)에 나타나지만, 사람에서도 심한 감염증을 초래할 수 있어 주의를 요한다.
말라리아는 종 감별이 매우 중요한데 특히 열대열 말라리아원충 감염시 초기에 적절한 치료가 실행되지 않으면 의식장애, 신부전이 동반되기도 하고 높은 사망률을 보이므로 주의하여야 한다. 열대열 말라리아원충은 다른 말라리아 원충과 달라서 증상이 강하고 무서운 합병증을 야기하여, 악성말라리아라고 일컬어진다. 열대열 말라리아원충은 말초혈 중에 윤상체(ring form)와 생식모체(gametocyte)가 나타나는 것이 특징으로, 말라리아원충의 적혈구 내의 무성생식 즉, 분열생식(schizogony)이 내장 모세혈관에서 이뤄지는 것에 의해 나타나는 현상이다. 윤상체는 소형으로서, 종종 2개의 크로마틴과립(double chromatin ring)을 가지며, 하나의 적혈구 내에 2개 이상의 감염을 볼 수 있는 점 등이 다른 말라리아 원충과의 감별점이 된다. 생식모체는 매우 특징적으로서 이것이 발견되면 열대열 말라리라원충임이 확실해진다.
현재, 진단 시스템에 이용되는 대부분의 생물학적 검정(bioassay)은 항원에 특이적으로 결합하는 항체에 의존하고 있어, 항체의 개발이 진단기술의 향상에 중요하다. 그러나, 항체가 면역검정(immunoassay)의 요소로서 우수한 장점을 가지고 있음에도 불구하고, 생산을 위한 고인건비, 낮은 안정성, 비-최적화 환경에서 인식능 상실 및 다양한 수행 플랫폼에 대한 낮은 호환성 등의 한계점이 있다. 또한, 신규 항체의 개발 어려움으로 인해, 압타머와 같은 항체 대안물질들이 연구 및 개발되어야 할 필요성이 대두되고 있다.
핵산-기반 압타머는 용이한 화학적 합성, 가역적인 접힘(folding), 향상된 열안정도 및 저비용 등을 포함하는 항체와 대비된 많은 잠재적인 장점을 제공한다. 그러나, 핵산-기반 압타머의 선별은 많은 시간과 자원을 요구하며, 종종 분자적 진단 또는 치료학적으로 충분한 수준의 친화도를 가지는 압타머의 생산이 실패될뿐만 아니라, 핵산분해 효소에 취약하고, 핵산분해 효소에 대비한 안정도를 위해 추가적인 변형이 요구되는 단점이 있다. 또다른 항체 대안물질로 1996년 개발된 펩티드 압타머는 작은 조합의(combinatorial) 단백질로, 표적 분자의 특이적 자리에 나노몰 수준의 친화도를 가지고 결합하는 것을 특징으로 한다. 펩티드 압타머는 5 내지 20개의 아미노산 잔기로 구성되며, 전형적으로 안정된 단백질 스캐폴드 내에 루프형태로 박히는 특징이 있다.
한편, 한국등록특허 제1491624호에는 'ALLN(N-acetyl-L-Leucyl-Lleucyl-L-norleucinal) 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 말라리아 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 0982064호에는 '말라리아 원충에 대한 단일클론항체 및 이를 이용한 말라리아의 진단방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 열대열 말라리아원충의 젖산탈수소효소에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 삼일열 말라리아원충(Plasmodium vivax)의 젖산탈수소효소 단백질의 에피토프 서열(P1; 서열번호 1)의 아미노산 일부를 변형하여 열대열 말라리아원충(P. falciparum)의 젖산탈수소효소 단백질에 대한 결합에너지가 더욱 낮은 펩티드(Pf_P1; 서열번호 2)를 디자인하였고, 상기 Pf_P1 펩티드를 제조하여 열대열 말라리아원충의 젖산탈수소효소에 대한 결합력을 FLISA(fluorescence-linked immunosorbent assay) 방법으로 확인한 결과, Pf_P1 펩티드가 열대열 말라리아원충의 젖산탈수소효소에 특이적인 결합력을 보여주는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 열대열 말라리아원충(Plasmodium falciparum)에 특이적으로 결합하는 펩티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 열대열 말라리아원충 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 열대열 말라리아원충 검출용 조성물을 유효성분으로 포함하는 열대열 말라리아원충 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 말라리아원충의 감염이 의심되는 동물로부터 분리된 시료로부터 상기 열대열 말라리아원충 검출용 키트를 이용하여 열대열 말라리아원충을 검출하는 단계를 포함하는, 열대열 말라리아원충 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 열대열 말라리아원충에 특이적으로 결합하는 펩티드는 항체에 비해 크기가 작고, 단시간에 적은 비용으로 생산이 가능한 장점이 있다. 또한, 본 발명의 펩티드는 열대열 말라리아원충의 젖산탈수소효소에 특이적으로 결합하는 특성이 있어, 열대열 말라리아원충 특이적 감염 진단에 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 젖산탈수소효소 단백질과 펩티드간의 상호작용 도킹 모델을 보여주는 결과로, (a)는 P1 및 Pf_P1 펩티드의 활성 입체구조를 보여주는 이미지이며, (b)는 젖산탈수소효소 단백질에 각 펩티드의 최상의 도킹 배열(configuration)을 보여주는 이미지이다. P1; 삼일열 말라리아원충(Plasmodium vivax)의 젖산탈수소효소 단백질의 에피토프 서열, Pf_P1; P1 펩티드의 변형 펩티드, 열대열 말라리아원충(P. falciparum)의 젖산탈수소효소를 표적하는 펩티드.
도 2는 인간 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 또는 열대열 말라리아원충의 LDH에 대한 P1 및 Pf_P1 펩티드의 결합에너지(a) 및 RMSD(root-mean-square deviation)를 분석한 결과이다. *; P<0.05, **; P<0.01, ***; P<0.001.
도 3은 유로피움(Europium) 형광체에 결합된 Pf_P1 펩티드의 열대열 말라리아원충의 LDH 단백질에 대한 특이성을 검증한 FLISA 결과이다. RFU; relative fluorescence unit, BSA; bovine serum albumin, rPf LDH; 재조합 열대열 말라리아 원충 LDH.
도 4는 열대열 말라리아원충에 감염 또는 비감염된 적혈구 세포를 이용하여 유로피움 형광체에 결합된 Pf_P1 펩티드의 열대열 말라리아원충에 대한 특이성을 검증한 샌드위치 FLISA 결과이다. 1G10 및 1E6; 열대열 말라리아원충의 LDH 단백질에 특이적인 단클론항체, **; P<0.01, ***; P<0.001.
도 5는 포획 및 검출인자로 모두 Pf_P1 펩티드를 사용하고, 열대열 말라리아원충에 감염 또는 감염되지 않은 적혈구를 이용하여 Pf_P1 펩티드의 해리상수를 확인한 결과이다.
도 6은 유로피움 형광체에 결합된 Pf_P1 펩티드와 항체를 이용한 임상시료를 대상으로 수행한 샌드위치 FLISA 결과이다. a는 각각의 시료에 대한 FLISA 결과치이고, b는 a 결과를 그래프화한 것이다. Normal; 정상인 혈액, Pf-infected patient; 열대열 말라리아원충 감염 환자의 혈액, P.C.; 1,000 열대열 말라리아원충-감염 적혈구/㎕.
도 7은 Pf_P1 펩티드를 적용한 래피드 형광면역진단키트(FICT)의 모식도이다.
도 8은 FITC 분석에 사용된 임상 환자의 시료 정보와 검출 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 열대열 말라리아원충(Plasmodium falciparum)에 특이적으로 결합하는 펩티드를 제공한다.
용어 '펩티드(peptide)'는 펩티드 결합(peptide bond)에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
본 발명에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드는 열대열 말라리아원충의 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드(Pf_P1)는, 삼일열 말라리아원충의 LDH에 대한 에피토프 서열인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드(P1) 서열에서 3번째와 4번째 아미노산 잔기 사이에 T(threonine) 잔기가 2개 추가되고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 서열에서 마지막 잔기인 C(cystein)가 삭제된 것으로서, 본 발명의 Pf_P1 펩티드는 상기와 같은 아미노산 변형에 의해 표적하는 열대열 말라리아원충의 젖산탈수소효소에 대한 결합력이 P1 펩티드에 비해 유의성 있게 증가되었다. 또한, 상기와 같은 아미노산 변형에 의해 인간 LDH 단백질과 열대열 말라리아원충의 LDH 단백질에 대한 표적 특이성이 유의성있게 증가되었다(도 2).
본 발명은 또한, 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 열대열 말라리아원충(P. falciparum) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 열대열 말라리아원충 검출용 조성물의 유효성분인 펩티드는 전술한 바와 같으며, 본 발명에 따른 열대열 말라리아원충 검출용 조성물에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드의 아미노 말단에 형광물질이 결합된 펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 형광물질은 유로피움(Europium) 형광체 또는 양자점-라텍스 비드 복합체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 형광물질들과 펩티드간의 결합은 한국등록특허공보 제1782859호 및 한국공개특허공보 제2018-0003818호에 상세히 기술되어 있다.
본 발명은 또한, 상기 열대열 말라리아원충 검출용 조성물을 유효성분으로 포함하는 열대열 말라리아원충(P. falciparum) 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 열대열 말라리아원충 검출용 키트는 본 발명의 펩티드와 형광물질이 결합된 결합체를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 검출용 키트는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드가 기판에 흡착된 상태로 제공되거나, 열대열 말라리아원충에 결합할 수 있는 특이적 항체가 기판에 흡착된 상태로 제공되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 기판으로는 PVDF 막, 플레이트 및 슬라이드가 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 검출용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명의 열대열 말라리아원충 검출용 키트는 본 발명의 펩티드와 형광물질이 결합된 결합체를 포함하여 목적하는 항원을 면역검출할 수 있는 형광면역측정법을 사용하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 결합체를 포함하는 FLISA(fluorescence-linked immunosorbent assay) 키트 또는 FICT(fluorescent immunochromatographic test kit)일 수 있고, 보다 바람직하게는 샌드위치 FLISA 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 'FLISA(fluorescence-linked immunosorbant assay)'는, 플레이트를 이용한 면역측정방법으로, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay)와 동일한 원리를 가지며, 널리 이용되고 있는 방법 중 하나이다. FLISA의 경우, ELISA와 마찬가지로 형광 측정기를 이용하여 짧은 시간의 분석시간이면 진단하고자 하는 물질을 다량으로 측정할 수 있다. 또한, FLISA는 일반적으로 ELISA에 비하여 감도(sensitivity)와 특이도(specificity)가 모두 우수하다고 알려져 있다.
일반적으로 형광체의 경우 여기(excitation) 파장과 방출(emission) 파장대가 높을수록, 즉, 낮은 에너지로 여기가 가능할수록 보다 저렴한 형태의 광원을 선택할 수 있어 측정 장비들을 경제적으로 제작할 수 있게 된다. 또한, 면역 물질과 형광체와의 축합(conjugation) 반응 결합체는 형광면역측정법을 이용하기 위해 필수적인 요소이므로 사용 전(ready-to-use) 형태의 형광체의 개발은 매우 중요하다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 열대열 말라리아원충 검출용 키트는, 구체적으로는 나이트로셀룰로오스 멤브레인에 유리섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 패드를 결합시켜서 사람 또는 동물의 검체시료를 투입할 수 있는 시료주입부; 상기 시료 주입부로 부터 일정 간격 이격된 지점에 위치하는 시료 내의 열대열 말라리아원충 항원과 결합하는 열대열 말라리아원충 검출용 조성물을 포함하는 열대열 말라리아원충 항원의 결합부; 및 상기 결합부로부터 일정간격이 이격된 위치에 상기 열대열 말라리아원충의 특이적 항체가 고정된 검사선(test line)이 순차적으로 구비되는 것을 특징으로 하는 테스트 스트립 형태의 FICT(fluorescent immunochromatographic test kit) 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 키트는 추가적으로 상기 검사선으로부터 일정간격이 이격된 위치에 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 추가로 구비될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 열대열 말라리아원충 검출용 키트에, 목적하는 항원의 존재여부가 확인되지 않은 분리된 시료를 가하여 반응시키는 단계를 포함하는, 열대열 말라리아원충(P. falciparum)의 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 (a) 열대열 말라리아원충의 감염이 의심되는 동물로부터 분리된 시료를 수득하는 단계; 및 (b) 본 발명의 상기 키트를 이용하여 상기 수득한 시료로부터 열대열 말라리아원충을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 동물은 열대열 말라리아원충에 감염 가능성이 있는 인간, 원숭이, 가축, 쥐 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.
본 명세서에서 용어 '시료'는 검출 대상체로 샘플 또는 검체와 동일한 의미로 사용되었으며, 상기 시료는 예컨대, 혈액, 림프, 골수액, 타액, 유즙, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌추출 액, 척수액, 관절액, 복수, 양막액 또는 세포조직액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 시약
열대열 말라리아원충(Plasmodium falciparum) 3D7 균주(ATCC PRA-405D)는 American Type Culture Collection(미국)으로부터 구매하였으며, 본 발명에 사용된 펩티드는 펩트론(대전, 한국)에서 합성하여 사용하였다. P(S/V-COOH) 유로피움 나노파티클(Europium nanoparticle, Eu-NP) 비드(0.1㎛)는 Bangs Laboratories Inc.(미국)에서 구입하였으며, EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride), NHS(N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt) 및 Sulfo-NHS는 Thermo Scientific(미국)에서 구입하여 사용하였다. 본 발명에 사용된 열대열 말라리아원충의 젖산탈수소효소에 특이적으로 결합하는 단클론항체(1G10 및 1E6)는 아주대학교 신호준 교수로부터 제공받아 사용하였다.
2. 열대열 말라리아원충( P. falciparum )의 배양
열대열 말라리아원충 3D7은 O-형 인간 적혈구의 5% 적혈구용적률(hematocrit)을 가진 RPMI 1640 배지(24mM 탄산수소나트륨, 25㎍/㎖ 젠타마이신, 1% 알부맥스(albumax), 0.05% 히포잔틴(hypoxanthine) 및 1% 페니실린)에서 지속적으로 배양하였다. 혈액 내 기생충 함량의 정량은 김자 염색(giemsa staining; Polysciences, Inc., 미국)을 통해 매일 확인하였다. 배지는 매일 교체하였으며, 혈액 내 기생충 함량이 5~6%에 도달하면 1:5의 비율로 계대하였다. 배양 플레이트는 5% 이산화탄소, 5% 산소 및 90%의 질소 구성의 대기 상태 및 37℃의 온도 조건으로 배양하였다.
3. 펩티드 디자인
열대열 말라리아원충의 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase)에 결합하는 펩티드의 디자인은 삼일열 말라리아원충(P. vivax)의 젖산탈수소효소 단백질의 공지된 에피토프 서열(KITDEEVEGIFDC; 서열번호 1)의 아미노산 서열 일부를 변형하여 디자인하였다. 열대열 말라리아원충 젖산탈수소효소와 디자인한 펩티드의 3D 구조는 I-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)를 사용하여 확인하였으며, 젖산탈수소효소와 펩티드의 결합력은 PyRx-virtual Screening Tool(https://sourceforge.net/projects/pyrx/)에서 AutoDock Vina를 사용하여 분석하였다.
4. 재조합 항원의 발현
열대열 말라리아원충의 젖산탈수소효소(GenBank no. XM_001349953.1) 재조합 항원은 Linh 등(Korean J Parasitol (2017) 55(6):623-630)의 방법에 따라 대장균에서 발현시키고 정제하였다.
5. 유로피움(Europium)과 펩티드 또는 항체의 결합체 제조
유로피움 결합체는 여 등(Sci Rep. 2017, 7:7933)의 문헌을 참고하였다. 카복실레이트 아민(carboxylate amine) 응집법에 기반하여, 20㎕ 유로피움(Eu-NP, 0.1㎛, 1% w/t, Bangs lab.)을 5mM의 EDC 26㎕와 50mM의 NHS 200㎕를 포함하고 있는 745㎕의 0.05M MES 버퍼(pH 6.1)과 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후, 상기 혼합물을 27,237xg의 속도로 5분간 원심분리하여 반응하지 않은 성분들을 제거하였다. 활성화된 Eu-NP를 90㎕의 1E6 항체(0.52㎎/㎖) 또는 60㎕의 Pf_P1 펩티드(50μM)와 반응시켰다. 반응은 0.1M 인산나트륨(pH 8.0) 940㎕를 이용하여 수행하였으며, 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, 2mM 붕사(Borax, pH 9.0) 및 1% 소혈청알부민을 포함하고 있는 저장 버퍼로 세척한 후, 반응물을 400㎕의 저장 버퍼에 넣고 4℃에서 보관하였다.
6. FLISA 및 Kinetic dissociation 측정
Pf_P1 펩티드의 항원 결합능을 확인하기 위해, 96-블랙 웰 마이크로플레이트의 각 웰에 0.6, 1.3, 2.5, 5.0, 10, 20 및 40㎍의 재조합 말라리아원충의 젖산탈수소효소 항원(rPf_LDH) 및 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 각각 넣고 4℃에서 밤새 반응시켜 코팅시켰다. 그 후, 5% 탈지우유를 포함하고 있는 블록킹 버퍼로 2시간 동안 반응시키고, PBS-T를 이용하여 세척하였다. 그 후, Eu-NP-펩티드 결합체(150nM)를 처리하고, 37℃에서 1 시간 동안 반응시킨 후, PBS-T를 이용하여 5회 세척하고, PBS 100㎕를 각 웰에 넣어주었다. 형광분석은 Infinite F200 마이크로플레이트 리더기로 분석하였고, 여기파장(Ex), 방출파장(Em)은 각각 355, 612nm이다.
또한, Pf_P1 펩티드의 해리상수를 확인하기 위해, Pf_P1 펩티드 1㎍을 96-블랙 웰 마이크로플레이트의 각 웰에 넣고 4℃에서 밤새 반응시켜 코팅시켰다. 그 후, 10%가 열대열 말라리아원충에 감염된 적혈구와 정상적인 적혈구(대조구)를 플레이트에 처리하고 1시간 동안 반응시켰다. PBS-T를 이용하여 세척한 후, Eu-NP-펩티드 결합체(1,100nM)를 2배씩 계열희석하여 2-1 부터 2-8까지 처리하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 평형화된 해리상수(dissociation constants; Kd)는 비선형분석(nonlinear analysis)을 이용하여 산출하였다.
7. Sandwich FLISA
단클론항체 1G10 항체(0.1㎍/well)를 96-블랙 웰 마이크로플레이트에 넣고 4℃에서 밤새 반응시켜 코팅시켰다. PBS-T를 이용하여 세척하고, 5% 탈지우유를 포함하고 있는 블록킹 버퍼로 2시간 동안 반응시킨 후, PBS-T를 이용하여 3회 세척하였다. 그 후, 10, 100, 1,000 및 10,000 cell/㎕ 농도의 열대열 말라리아원충에 감염된 인간 적혈구 세포 또는 감염되지 않은 인간 적혈구 세포를 웰에 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS-T를 이용하여 3회 세척한 후, Eu-NP-펩티드 결합체(220nM) 또는 Eu-NP-항체 결합체(73.125nM)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS-T를 이용하여 5회 세척한 후, PBS 100㎕를 각 웰에 넣어주었다. 형광분석은 Infinite F200 마이크로플레이트 리더기로 분석하였고, 여기파장(Ex), 방출파장(Em)은 각각 355, 612nm이다.
8. 양자점(quantum dots : QDs)-라텍스 비드-펩티드 복합체의 제조
양자점-라텍스 비드-Pf_P1 펩티드 복합체를 제조하기 위해, 친수성 화합물이 코팅된 양자점과 라텍스 비드가 결합된 복합체를 먼저 제조하였다. 약 200nm 크기의 0.4pM 아미노 라텍스(amine latex, life technology사) 20㎕에 세척완충액(8.77g/ℓ NaCl이 포함된 O.1M Phosphate Buffered Saline, pH 8.0)을 가하여 1회 세척하고, 친수성 화합물로 코팅된 10μM의 양자점을 50㎕ 혼합하고, 0.2M EDC 100㎕ 및 0.2M Sulfo-NHS 150㎕를 넣고 실온에서 3시간 동안 반응시켰다. 상기 반응이 종료된 후, 반응물을 원심분리(17,000rpm, 5분)를 통해 결합하지 않은 양자점을 제거하고, 침전물을 상기 세척완충용액을 가하여 1회 세척한 후, 다시 원심분리하여 친수성 화합물이 코팅된 양자점과 라텍스 비드가 결합된 복합체를 제조하였다. 상기 복합체는 여기파장(Ex) 및 방출파장(Em)이 각각 360, 580nm이다.
상기 양자점-라텍스 비드 복합체에 60㎎/㎖의 숙신산 무수물(succinic anhydride) 500㎕를 처리하고 1시간 동안 반응시켜, 양자점-라텍스 비드 복합체에서 양자점이 결합되지 않은 라텍스 비드 표면의 아미노기를 카르복실기로 치환하였다. 그 후, 원심분리(17,000rpm, 5분)를 통해 복합체를 회수하고, 50μM의 Pf_P1 펩티드 50㎕ 및 0.1M 인산나트륨 용액(pH 8.0) 400㎕를 넣고 1시간 반응시켰다. 상기 반응물을 원심분리하여 양자점-라텍스 비드-Pf_P1 펩티드 복합체를 회수하고, 0.1M 인산나트륨 용액(pH 8.0) 200㎕에 넣어 보관하였다.
9. 열대열 말라리아원충 검출용 키트의 제작
상기에서 제조한 양자점-라텍스 비드-Pf_P1 펩티드 복합체를 이용하여 열대열 말라리아원충 검출용 FITC 키트를 제작하였다.
구체적으로는 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인의 일 말단에 유리섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 검체 패드를, 상기 검체 패드와 일정간격을 두고 제조한 양자점-라텍스 비드-Pf_P1 펩티드 복합체를 10배 희석하고 4㎕를 결합 패드에 가한 다음, 일정 간격을 두고 검사선(Test line; T)을 설정하고, 상기 검사선에 말라리아 원충의 LDH에 특이적인 항체(1G10)를 1㎎/㎖을 가하여 고정시켰다.
그 결과로서, 스트립 형태의 나이트로셀룰로오스 멤브레인 위에 검체 패드, 양자점-라텍스 비드-Pf_P1 펩티드 복합체를 함유하는 결합 패드 및 검사선이 순차적으로 정렬된 형태의 형광 검출 키트를 제작하였다(도 7).
실시예 1. 열대열 말라이아원충의 젖산탈수소효소에 대한 펩티드의 도킹 및 결합에너지 분석
본 발명자들은 이전의 연구(Bao DT et al., Theranostics, 2017, 7:1835-46)를 통해 에피토프-유래 펩티드가 인플루엔자 바이러스에 결합하는 항체를 대신하여 신속 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서는 삼일열 말라리아원충(Plasmodium vivax)의 젖산탈수소효소 단백질의 알려진 에피토프 서열(P1; 서열번호 1)의 아미노산 일부를 변형하여 열대열 말라리아원충(P. falciparum)의 젖산탈수소효소 단백질(이하 LDH)에 대한 결합력이 향상되도록 펩티드(Pf_P1, KITTTDEEVEGIFD; 서열번호 2)를 디자인하였고, 상기 Pf_P1 펩티드의 활성 배좌(conformation)를 PyMOL 분자 그래픽 시스템을 이용하여 시각화하였으며, P1 펩티드 또는 Pf_P1 펩티드와 LDH와의 결합 구조를 확인하였다(도 1).
또한, P1 또는 Pf_P1 펩티드와 인간 및 열대열 말라리아원충의 LDH(각각 GenBank no. AAS93432.1 및 XM_001349953.1)간의 결합에너지 및 RMSD(root-mean-square deviation)를 분석한 결과, P1 및 Pf_P1 펩티드 모두 인간 LDH에 비해 열대열 말라리아원충 LDH에 대해서 유의성 있는 수준으로 보다 낮은 결합에너지를 보여주었다(결합에너지가 낮을수록 결합 친화도가 높음을 의미). 특히, P1 펩티드는 열대열 말라리아원충 LDH에 대해 -6.43±0.08 kcal/mol의 결합에너지를 보인 반면, Pf_P1 펩티드는 열대열 말라리아원충 LDH에 대한 결합에너지가 -6.94±0.20 kcal/mol로 확인되어, 결합력이 더욱 증가된 것을 알 수 있었다(도 2a). RMSD 분석에서는, P1 펩티드는 인간 및 열대열 말라리아원충 LDH 사이에 유의성 있는 차이가 확인되지 않았으나, Pf_P1 펩티드는 인간 및 열대열 말라리아원충 LDH 간에 유의적인 차이가 관찰되었다(도 2b). 상기 결과를 통해, Pf_P1 펩티드가 열대열 말라리아원충의 LDH에 대해서 특이적으로 결합함을 유추할 수 있었다.
실시예 2. 펩티드와 재조합 항원간의 상호작용 분석
Pf_P1 펩티드의 재조합 열대열 말라리아원충 LDH(rPf LDH)에 대한 상호작용을 분석하기 위해서, Eu NP-펩티드 결합체의 rPf LDH에 대한 결합을 FLISA로 분석하였다. 그 결과, 1.3㎍/㎖의 농도부터 Eu NP-펩티드 결합체의 결합력이 BSA와 rPf LDH 간에 유의성 있는 수준으로 차이나는 것을 확인할 수 있었다(도 3). 이를 통해 본 발명의 Pf_P1 펩티드가 열대열 말라리아원충 LDH에 특이적으로 결합하는 것을 알 수 있었다.
상기의 펩티드 매개 FLISA로부터 얻은 결과를 항체 매개 FLISA를 통한 결과와 비교하기 위해, 열대열 말라리아원충에 감염 또는 감염되지 않은 적혈구 세포를 시료로 하고, 열대열 말라리아원충 LDH에 특이적인 항체인 1G10을 포획 항체로, Eu NP-펩티드(Pf_P1) 결합체 또는 Eu NP-항체(1E6) 결합체를 각각 검출인자로 사용하여 샌드위치 FLISA를 수행하였다. 항체는 펩티드에 대한 동일 분자비를 실험에 사용하였다.
샌드위치 FLISA 분석 결과, 펩티드 또는 항체를 검출인자로 사용한 두 경우 모두에서 열대열 말라리아원충에 감염된 적혈구 세포 농도 100 cell/㎕ 구간부터 양성 신호가 확인되었다(도 4). 상기 결과를 통해, 본 발명의 Pf_P1 펩티드가 열대열 말라리아원충 LDH에 특이적인 항체를 대체하여 신속 진단에 활용될 수 있음을 유추할 수 있었다.
또한, 포획 및 검출인자로 모두 Pf_P1 펩티드를 사용하여 해리상수를 확인한 결과, 본 발명의 Pf_P1 펩티드는 해리상수가 447.5±134.9nM로 확인되었다(도 5).
실시예 3. Pf_P1 펩티드를 이용한 임상 시료의 분석
Pf_P1 펩티드를 이용하여 임상 환자 혈청을 대상으로 열대열 말라리아원충 진단을 검정하였다. 모든 환자 시료는 2012년 6월 16까지 우간다에서 수집한 것으로, -20℃에서 보관된 것이다. 분석은 Eu NP-펩티드(Pf_P1) 결합체를 사용하여 상기 실시예 2에서와 같은 조건으로 샌드위치 FLISA를 진행하였으며, 정장인 환자 혈청 시료(5개)와 감염 환자 혈청 시료(10개)를 각각 50㎕씩 동량의 증류수와 혼합하여 사용하였다. 열대열 말라리아원충 감염 환자 내의 원충혈증(parasitemia)은 151에서 128,636까지 다양하게 확인되었다(도 6a).
샌드위치 FLISA 결과, 정상인의 혈청 시료에서보다 감염 환자 혈청 시료에서 현저하게 높은 형광값이 확인되었고(도 6b), 이를 통해 포획항체-검출 펩티드로 구성된 샌드위치 FLISA를 통해 원충혈증을 진단하는 것이 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 열대열 말라리아원충 검출용 키트를 이용한 임상 시료의 분석
양자점-라텍스 비드-Pf_P1 펩티드 복합체를 이용하여 상기에서 제작한 FITC 키트를 이용하여 임상 시료를 분석하였다.
간단하게, 열대열 말라리아원충 감염 환자의 혈액을 30㎕의 용해 버퍼(Tris-HCl (pH 8.0), 0.1% tween 20 및 0.05% NaN3)와 혼합한 후 샘플 패드에 점적하고, 150㎕의 용해 버퍼를 샘플 패드에 추가로 떨어뜨려 20분 동안 반응시킨 다음, medisensor 형광측정장비로 검사선의 형광값을 측정하였다. 분석에 사용된 감염 환자의 원충혈증(parasitemia)은 39부터 128,636까지 다양하게 확인되었다(도 8a).
FITC 키트를 이용한 분석 결과, 원충혈증 39의 환자 검체는 음성 검체(정상인; normal)와 큰 차이가 없었으나, 원충혈증 119 이상의 환자 검체는 음성 검체들에 비해 현저히 높은 형광값을 보여주었다(도 8). 이상의 결과를 통해, 본 발명의 Pf_P1 펩티드가 열대열 말라리아원충의 신속 진단법에 항체의 대안물질로 유용하게 활용될 수 있음을 유추할 수 있었다.
<110> Wonkwang University Center for Industry-Academy Cooperation <120> Peptide specifically binding to lactate dehydrogenase of Plasmodium falciparum and uses thereof <130> PN18141 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 1 Lys Ile Thr Asp Glu Glu Val Glu Gly Ile Phe Asp Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pf_P1 peptide <400> 2 Lys Ile Thr Thr Thr Asp Glu Glu Val Glu Gly Ile Phe Asp 1 5 10

Claims (7)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 열대열 말라리아원충(Plasmodium falciparum)에 특이적으로 결합하는 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 열대열 말라리아원충의 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 열대열 말라리아원충 검출용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 펩티드는 형광물질과 결합된 펩티드인 것을 특징으로 하는 열대열 말라리아원충 검출용 조성물.
  5. 제3항의 열대열 말라리아원충 검출용 조성물을 유효성분으로 포함하는 열대열 말라리아원충 검출용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 열대열 말라리아원충 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로 부터 일정 간격 이격된 지점에 위치하는 시료 내의 열대열 말라리아원충 항원과 결합하는 열대열 말라리아원충 검출용 조성물을 포함하는 열대열 말라리아원충 항원의 결합부; 및 상기 결합부로부터 일정간격이 이격된 위치에 상기 열대열 말라리아원충의 특이적 항체가 고정된 검사선(test line)이 순차적으로 구비되는 것을 특징으로 하는 테스트 스트립 형태의 열대열 말라리아원충 검출용 키트.
  7. 말라리아원충의 감염이 의심되는 동물로부터 분리된 시료로부터 제5항의 열대열 말라리아원충 검출용 키트를 이용하여 열대열 말라리아원충을 검출하는 단계를 포함하는, 열대열 말라리아원충 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
KR1020180055742A 2018-05-16 2018-05-16 열대열 말라리아원충의 젖산탈수소효소에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도 KR102002104B1 (ko)

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