KR20070097648A

KR20070097648A - 말라리아 원충에 대한 단일클론 항체 및 이를 이용한말라리아의 진단방법

Info

Publication number: KR20070097648A
Application number: KR1020060027803A
Authority: KR
Inventors: 박현; 신호준
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2006-03-28
Filing date: 2006-03-28
Publication date: 2007-10-05
Anticipated expiration: 2026-03-28
Also published as: KR100982064B1

Abstract

본 발명은 말라리아의 젖산 탈수소효소 폴리펩티드(Lactate Dehydrogenase Polypeptide)를 이용한 단일클론 항체 제조방법 및 이를 이용한 말라리아의 진단 방법에 관한 것으로, 상세하게는 말라리아의 LDH 유전자를 인코딩(encoding)하는 폴리펩티드를 이용하여 열대열 말라리아의 특이항원(PfMSP, PfLDH, PfHRP), 삼일열 말라리아의 특이항원(PvMSP, PvLDH, PvHRP) 및 항원 결정기에 대한 특이 단일클론 항체를 제조하여 이의 민감도를 확인함으로써 말라리아 환자의 진단, 말라리아의 예방 또는 치료제 개발에 광범위하게 응용될 수 있다.

말라리아, 단클론 항체, 삼일열 말라이아, 열대열 말라리아, 진단 방법

Description

말라리아 원충에 대한 단일클론 항체 및 이를 이용한 말라리아의 진단방법{Monoclonal antibody and diagnostic method of malaria parasites}

도 1은 열대열 말라리아로부터 분리한 LDH의 아미노산 서열을 나타낸 도이고,

도 2는 열대열 말라리아 재조합 항원 단백질인 PfLDH #2로 면역시킨 마우스의 항체가를 측정한 도이며,

도 3는 열대열 말라리아 재조합 항원 단백질인 PfLDH #3로 면역시킨 마우스의 항체가를 측정한 도이고,

도 4는 PfLDH #2에 대한 단일클론 항체를 분비하는 잡종세포를 키운 배지의 상청액에 대한 흡광도를 측정한 도이며,

도 5는 PfLDH #3에 대한 단일클론 항체를 분비하는 잡종세포를 키운 배지의 상청액에 대한 흡광도를 측정한 도이고,

도 6은 마우스 복수 채취법으로 수득한 PfLDH #2에 대한 단일클론 항체의 흡광도를 측정한 도이며,

도 7은 마우스 복수 채취법으로 수득한 PfLDH #3에 대한 단일클론 항체의 흡광도를 측정한 도이고,

도 8은 열대열 말라리아 메로조이트의 용해물(merozoites lysate) 중에서 LDH부분의 사이즈를 M(사이즈 마커)과 함께 나타낸 도이며,

도 9는 PfLDH #2에 대한 단일클론 항체들(B4D, C2B, D2H, D7E)이 말라리아의 LDH 항원과 반응하는지 나타낸 도이고,

도 10은 PfLDH #3에 대한 단일클론 항체들(A4F, A7E, B9G, D5G)이 말라리아의 LDH 항원과 반응하는지 나타낸 도이며,

도 11은 PfLDH #2에 대한 단일클론 항체(D7E)의 민감도를 보기 위해 열대열 말라리아 메로조이트 용해물을 단계 희석한 뒤, 단일클론 항체(D7E)와 반응 여부를 나타낸 도이고,

도 12는 PfLDH #3에 대한 단일클론 항체(D5G)의 민감도를 보기 위해 열대열 말라리아 메로조이트 용해물을 단계 희석한 뒤, 단일클론 항체(D5G)와 반응 여부를 나타낸 도이다.

본 발명은 말라리아의 LDH(Lactate Dehydrogenase)과 반응하는 단일클론 항체의 생산 및 이를 이용한 민감도 높은 말라리아의 진단방법에 관한 것이다.

말라리아는 플라스모디움(Plasmodium)속의 원생동물 기생충에 의해 유발된다. 사람을 감염시키는 4가지 종으로는 플라스모디움 팔시파룸(P. falciparum ; 열 대열 말라리아), 플라스모디움 비박스(P. vivax ; 삼일열 말라리아), 플라스모디움 말라리아(P. malariae) 및 플라스모디움 오발레(P. ovale)가 있다. 이들 중에서, 플라스모디움 팔시파룸이 급성 말라리아 및 종종 치명적 말라리아를 주로 초래하지만, 각각의 말라리아 감염과 관련된 이병률은 유의 수준이며, 전 세계 인구의 대부분이 이 질병에 걸릴 위험이 있다. 말라리아는 전 세계 인구의 40%가 살고 있는 지역에서는 공중 보건 문제이고, 이 질병은 이들 지역사회에 대한 심각한 사회적 및 경제적 결과를 갖는다. 조절 대책의 포기 또는 붕괴 및 화학요법에 대한 살충제와 팔시파룸 말라리아에 대한 벡터의 내성 증가에 의해 질병이 최근에 부활 되고 있다. 따라서 말라리아에 대해 효과적인 백신을 개발하는 것이 시급하다.

백신을 개발하기 위한 대부분의 실험은 관련된 기생충의 종 및 스테이지에 대해 숙주에서의 보호 면역반응을 유도할 수 있는 하나의 단백질을 확인하고자 하는데 집중되었다. 이것은, 기생충의 생활 주기의 복잡성, 합성된 폴리펩티드의 범위 내에 있는 항원의 개수 및 다양성, 및 말라리아를 조절하는 면역계의 중요한 측면에 대한 피상적인 이해로 인해 그 자체로 방대한 작업이다. 그럼에도 불구하고, 몇몇 단백질은 단일 클론성 항체, 면역 개체로부터의 혈청 및 박테리아내의 라이브러리로부터 발현된 유전자의 단편에 대한 항체를 사용함으로써 확인되었다. 기생충의 성장 및 전개에 대한 시험관 내 또는 생체 내에서의 항체의 효과, 직접 면역 실험, 및 단백질의 서브셀룰라(subcellular) 위치 또는 가능한 기능을 포함하는 다수의 표준을 사용함으로써, 몇몇 백신 후보체가 제안되었다. 후보체 중의 하나는 적혈구를 침범하는 기생충 스테이지인 메로조이트 (merozoite)의 외부에 위치한 메로 조이트 표면 단백질-1 (MSP-1으로 약기되지만, MSAI, PMMSA, P. 190 또는 gP 195로도 공지되어 있음)이다. MSP1은 모든 말라리아 기생충종의 메로조이트 표면에서 발견되기 때문에, 후보체 말라리아 백신에 대한 이상적인 표적이다. 실제로, 전구체 단백질은 단백 가수분해 처리되어, 분자량이 상이한 몇몇 폴리펩티드의 복합체를 형성한다(Holder et al., Parasitology, 94, pp.199-208, 1987).

말라리아 (malaria)는 세계보건기구 (WHO)가 지정한 5대 주요 질병으로 한 해 동안 세계적으로 500,000명의 사망률을 갖는 치명적인 질병이다. 말라리아 진단은 말초 혈액 (peripheral blood)을 사용하는 박층 도말법(thin smear method)과 후층 도말법(thick smear method)이 많이 사용된다. 이 방법에서 흔히 사용하는 염색 방법은 라이트-김사(Wright-Giemsa) 염색법인데 많은 시간이 필요하고, 경험이 많은 숙련자들 조차 오진 가능성이 크다.

분자생물학적인 방법으로는 Rubio 등(Rubio JM, Garcia L. et al., Usefulness of seminested multiplex PCR in surveillance of imported malaria in Spain, J Clin Microbiol, 37(10), pp3260-3264, 1999)이 발표한 원충 DNA의 중합효소 반응을 이용한 말라리아 검출법이 주로 사용된다. 유전자 검사법(Nested-PCR)을 적용한 것이 주로 사용되며 표적 유전자는 원충의 포자소체(circumsporozoite) 단백 유전자, 메로조이트(merozoite) 표면 단백 유전자, 적혈구 결합 단백 유전자등을 증폭한다. PCR은 높은 민감도 때문에 말라리아의 치료 후 추적에도 응용되지만 정량화하여 말라리아의 혈중 농도를 계산하기가 힘들다는 단점이 있다(Pieroni P. et al., Comparison of the ParaSight-F test and the ICT Malaria Pf test with the polymerase chain reaction for the diagnosis of Plasmodium falciparum malaria in travellers, Trans R Soc Trop Med Hyg, 92(2), pp.166-169, 1998).

이처럼 기존의 진단법에는 단점과 한계가 있다. 또한 한국의 삼일열 말라리아(Plamodium vivax)는 1달 이내의 짧은 잠복기를 보이기도 하나 보통 6개월에서 1년, 길게는 3년 이상의 장기 잠복 기간을 갖는 경우가 많다. 이런 지연형 잠복기(prolonged incubation type)를 보이는 경우는 항체가 형성되지 않거나, 항원의 양이 매우 적어 무증상으로 나타날 수 있어 진단하기에 어려움이 많다. 따라서 이를 조기 진단해야만 한다. 또한 삼일열 말라리아는 한국, 중국, 동남아시아 및 남미의 해결되지 않은 감염성 질환일 뿐만 아니라 수혈 등을 통해서 전파될 수 있어서 혈액의 스크리닝이 필요한 질환이다.

현재 세계적으로 가장 많이 쓰이는 방법이 딥스틱 키트(Dipstick kit)법인데 말라리아의 특이항원 중 플라스모디움 젖산 탈수소효소(Plasmodium lactate dehydrogenase ; pLDH), 플리스모디움 히스티딘 고함유 단백질-2( Plasmodium histidine rich protein - 2 ; pHRP-2) 항원을 검출하는 방법이다. 이를 활용하여 제품화된 것으로 ICTTM Malaria Pf/Pv (Amrad ICT, Australia), OptiMAL (Flow Inc., U.S.A), 및 ParaSightTM F (Becton Dickinson, U.S.A)등 크게 3가지 제품이 사용되고 있는데 표적항원은 서로 다르다. 이러한 3개 회사의 제품을 찬수다(Chansuda W, Rapid diagnostic techniques for malaria control, Trends Parasitol, 17(7), pp307-309, 2001)가 조사한 결과, 열대열 말라리아(Plasmodium falciparum)에 대해서는 88-98% 정도의 높은 진단 민감율이 있는 반면, 삼일열 말 라리아(Plasmodium vivax)에 대한 민감도는 각각, 75%, 83% 및 87% 정도로 문제가 있었다. 제품 공급 회사의 주장과는 달리 예민도가 기존 방법보다 낮기 때문에 보완이 필요한데, 특히 삼일열 말라리아에 대한 진단율은 70-80% 정도 밖에 되지 않는다(Cooke AH. et al., Comparison of a parasite lactate dehydrogenase-based immunochromatographic antigen detection assay (OptiMAL) with microscopy for the detection of malaria parasites in human blood samples, Am J Trop Med Hyg, 60(2), pp173-176, 1999). 이런 이유 중에 하나는 선진국에서는 주로 열대열 말라리아에 대한 연구가 진행 되어져 왔고 상대적으로 삼일열 말라리아에 대한 연구가 덜 진행 되어져 왔기 때문이다. 순수 배양의 한계나 원충의 지역별 차이 등으로 인해 삼일열 말라리아에 대한 연구나 진단, 치료에 한계가 있어왔다(Moody A., Rapid diagnostic tests for malaria parasites, Clin Microbiol Rev, 15(1), pp66-78, 2002). 아직까지 우리나라를 포함한 동남아시아 및 중남미에 널리 분포하는 삼일열 말라리아 및 열대열 말라리아를 같이 진단할 수 있는 민감도가 높은 항체는 아직 개발되어 있지 않다.

일반적으로 원충류의 항원구조는 복잡하여 각각의 항원 및 항원 결정기(antigenic determinants)에 대한 분석이 쉽지 않다. 이에 아직까지 많이 이용되고 있는 세포융합기술 (cell fusion technique)을 이용하여 단일 클론 항체(monoclonal antibody)를 생산하여 항원구조 및 항원 결정기에 대한 연구를 진행 하고 있다(Kohler G. et al., Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256(5517), pp495-7496, 1975).

또한 말라리아 젖산 탈수소효소는 원충의 원형질내에서 발견되는 대사효소로서 원충의 에너지 대사에 영향을 미치며 말라리아의 모든 단계에서 존재하고, 열대열 말라리아의 젖산 탈수소효소는 다른 말라리아 종과 부분적인 상동성(homology)이 있어서 이에 대한 항체 제조시 열대열 말라리아의 젖산탈수소효소에 특이적인 항체 및 다른 말라리아 원충들의 젖산 탈수소효소에 공통적인 항체 생산이 가능하다.

이에 본 발명자들은, 열대열 말라리아의 특이항원(PfMSP, PfLDH, PfHRP), 삼일열 말라리아의 특이항원(PvMSP, PvLDH, PvHRP) 및 항원 결정기에 대한 특이 단일 클론 항체를 제조하고자, 일차적으로 열대열 말라리아의 LDH 유전자를 인코딩(encoding)하는 폴리펩티드(polypeptide)를 이용하여 단일 클론 항체를 생산하고 특성을 규명하였으며, 특이항원 및 항원 결정기에 대한 단일클론 항체의 생산으로 삼일열 및 열대열 말라리아 환자를 진단하는데 있어서 진단 민감도를 높일 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 말라리아의 LDH(Lactate Dehydrogenase)와 반응하는 단일클론 항체의 생산 및 이를 이용한 민감도 높은 말라리아의 진단방법을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 말라리아의 LDH(Lactate Dehydrogenase)와 반응하는 단일클론 항체 및 이를 이용한 민감도 높은 말라리아의 진단방법을 제공한다.

상세하게는 말라리아 원충으로부터 LDH(lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자중 말라리아 특이한 부위를 펩타이드(pepetide)로 제조하여 단일클론 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

말라리아 원충으로부터 LDH(lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자중에서 열대열과 삼일열 말라리아에서 항원성이 특이하게 나타날 것으로 판단되는 부위로부터 단일클론 항체를 제조하기 위해 1) LDH 유전자의 특이 부분에 대한 펩타이드(pepetide)를 제조하고 여기에 운반체(carrier)로서 MAPs을 붙여, 이 펩타이드 항원을 마우스에 면역시키는 단계; 2) 상기 면역된 마우스로부터 혈청을 분리하여 골수종 세포(myeloma)와 세포 융합을 실시하는 단계; 3) 상기 융합세포로부터 HAT(hypoxantine, aminopterin, thymidine)배지를 이용하여 잡종세포(hybridoma cell)를 선택, 분리 배양하여 항체 분비 여부를 확인하는 단계; 4) 상기 잡종세포로부터 한계 희석법을 이용하여 단일클론 항체를 생성하는 단일클론 세포주를 선택하는 단계; 5) 상기 단일클론 세포주를 대량으로 배양하여 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 단일세포군 항체만을 순수 분리하는 단계를 통하여 본 발명의 단일클론 항체를 수득할 수 있다.

또한, 본 발명의 단일클론 항체는 상기 5단계로 구성되는 단일클론 항체 수 득방법에서 3)단계까지 동일하게 수행하고, 4) 마우스에 프리스탄(pristane) 또는 IFA(incomplete freund's adjuvant)를 복강내로 주사하고 7 내지 10일 후 상기 융합세포를 복강내로 주사하는 단계; 5) 상기 융합세포 주사 후 1 내지 2주일 후 복강에 복수가 차면 복수를 바늘로 찔러 모아 원심 침전하고 상청액을 모으는 단계; 6) 상기 상청액을 단백질 A 컬럼을 이용하여 항체만을 순수 분리하는 단계를 추가적으로 수행하여 본 발명의 단일클론 항체를 수득할 수도 있다.

본 발명의 펩타이드로 제조된 항원은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로부터 선택됨을 특징으로 하고, 본 발명에서 수득되는 단일클론 항체는 서열번호 2의 항원으로부터 수득되는 B4D, C2B, D2H 및 D7E, 서열번호 3의 항원으로부터 수득되는 A4F, A7E, B9G 및 D5G 항체를 포함한다.

본 발명의 단일클론 항체의 이소타입(isotype)을 확인해본 결과, 서열번호 2의 항원에 대한 단일클론 항체는 IgM 클래스(class)이고, 서열번호 3의 항원에 대한 단일클론 항체는 IgG2b 클래스(class)임을 확인하였다.

또한, 본 발명의 말라리아 원충은 플라스모디움 팔시파룸(P. falciparum), 플라스모디움 비박스(P. vivax), 플라스모디움 말라리아(P. malariae) 및 플라스모디움 오발레(P. ovale), 바람직하게는 플라스모디움 팔시파룸(P. falciparum) 및 플라스모디움 비박스(P. vivax)를 포함한다.

본 발명은 상기 제조 방법으로 제조된 단일클론 항체를 이용하여 말라리아 질환을 진단하는 진단 방법을 제공한다.

상기 단일클론 항체는 열대열 말라리아와 삼일열 말라리아의 젖산 탈수소효 소(LDH)에 공통적인 단일클론 항체를 이용하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 단일클론 항체는 말라리아의 예방 또는 치료를 위한 치료제를 평가하기 위한 방법에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시 예 및 실험 예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시 예 및 실험 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예 및 실험 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 열대열 말라리아 항원 제조 및 마우스 내 면역

1-1. 열대열 말라리아 항원의 BALB /c 마우스 내 면역

생후 6주된 BALB/c 마우스(18g, 암컷)를 각 3마리씩 그룹을 만들어 도 1에 나타낸 열대열 말라리아(Plasmodium falciparum)의 젖산 탈수소효소 유전자 및 이를 이용하여 특이적 부분에 대한 항원을 제작하기 위해 반응성이 특이한 #1 #2 및 #3 부분(도 1 참조)에 대한 재조합 단백질을 합성하였다. 이 각각의 재조합 단백질의 사이즈가 작아 면역성을 보이지 않기 때문에 운반체(carrier)를 연결하여 면역성을 갖는 재조합 단백질 항원(Hapten-Carrier conjugate)을 하기 표 1 및 서열번호 1 내지 서열번호 3과 같이 제작하였다. 재조된 말라리아 항원 중 생물학적 반응성이 가장 높은 항원(각각 PfLDH #1, PfLDH #2 및 PfLDH #3라 명명함)으로 각각 면역시켰다. 이때 항원은 200 ㎕(단백질 함량 50 ㎍)을 동량의 어쥬반트(Freund's complete adjuvant)와 잘 섞어 혼합하여 마우스 복강 내로 주사하였다. 두 번째부 터는 2주일 간격으로 같은 양의 항원을 어쥬반트(Freund's incomplete adjuvant)와 잘 섞어 복강 내로 면역시켰다. 이와 같이 면역을 3번 시행한 후, 마지막으로 면역시키고 2주일 뒤 ELISA 방법으로 면역역가 (immune titer)를 측정하여 1:50,000 이상의 수치를 보이면, 항원 100 ㎕ (단백질 함량 25 ㎍)을 마우스 꼬리의 정맥으로 주사하였다. 4-6일 후 마우스의 비장 세포를 적출하여 SP2/0 골수종(Myeloma) 세포와 함께 세포융합 (cell fusion)에 사용하였다.

특이부분	아미노산 서열(재조합 단백질 항원)	항원이름	서열의 길이
#1	-SKAKIVLVGSGMIGGVMATLIVGKNL-	PfLDH #1	26 amino acids
#2	-FTKAPGKSDKEWNRDDLLPLNNKIMIEIGGH-	PfLDH #2	31 amino acids
#3	-DYG-HSDIFGGTPVVLGAN-	PfLDH #3	18 amino acids

1-2. 말라리아 항원으로 면역시킨 BALB /c 마우스의 항체가 측정

열대열 말라리아의 LDH 유전자에 대한 재조합 항원 펩타이드(PfLDH #1, PfLDH #2 및 PfLDH #3)로 마우스를 면역시킨 후, 간접 ELISA 방법을 통해 면역역가를 확인하였다. 2차 면역 후 얻은 마우스의 혈청을 가지고 분석한 결과 PfLDH #2로 면역시킨 마우스 혈청의 흡광도는 0.67로 확인되었다. 같은 방법으로, 4차 면역 후 얻은 마우스의 혈청에서는 1.34의 값이 나왔다. 최종적으로 정맥 내 주사를 한 뒤에 얻은 결과는 1.4였다. 아무것도 면역하지 않은 정상 마우스와 PBS를 가지고 실험을 한 음성 대조군에서는 각각 0.25와 0.18이 나왔다. 또한 PfLDH #3으로 면역시킨 마우스 혈청의 흡광도는 0.52로 확인되었다. 같은 방법으로, 4차 면역 후 얻은 마우스의 혈청에서는 0.95의 값이 나왔다. 최종적으로 정맥 내 주사를 한 뒤에 얻은 결과는 1.1이었다. 아무것도 면역하지 않은 정상 마우스와 PBS를 가지고 실험을 한 음성 대조군에서는 각각 0.15와 0.1이 나왔다(도 2, 도 3 참조).

도 2 및 도 3의 결과는 열대열 말라리아 #2 및 #3 부분에 대한 재조합 항원 단백질로 면역한 뒤 얻은 마우스의 혈청에 대한 분석 결과이다. 최종적으로 본 실험에서는, ELISA 측정 결과 흡광도가 0.8이 넘는 마우스를 가지고 세포 융합을 실시하였다.

실시예 2. 세포 융합 ( cell fusion )과 잡종 세포 ( hybridoma cell )의 생산

마우스에 항원을 계획에 따라 면역시키고 마우스의 꼬리에서 혈액을 채취하여 면역역가(immune titer)를 면역효소 흡착법 (ELISA)을 통해 확인하였다. 1:100,000 이상의 역가를 보이는 마우스의 비장을 적출하고 RPMI-1640 배지에서 비장세포를 분리한 후, RPMI-1640 배지(10% 우태아 혈청 포함)에서 자란 골수종 세포(SP2/0 세포주, ATCC)를 사용하여 세포융합을 실시하였다(Kohler G et al., Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256(5517), pp495-497, 1975).

CO₂ 항온기(37℃, 5% CO₂)에서 세포융합이 일어난 잡종 세포를 HAT(hypoxantine, aminopterine, thymidine)배지를 이용하여 선택, 분리 배양하고 항체 분비 여부를 ELISA방법으로 관찰하였다. 항체를 분비하는 웰(well)의 세포들을 HT(hypoxantine, thymidine)배지를 사용하여 선택, 분리 배양하였다. 잡종세포의 성장은 도치 현미경(inverted microscope)으로 관찰하였다.

여러 차례 세포 융합을 실시 한 결과 대략적인 세포 융합 비율은 PfLDH #2에서는 90% 정도였고, PfLDH #3에서는 60% 정도였다. 하지만 PfLDH #1에 대한 잡종 세포주는 얻지 못하였다. 최종적으로, PfLDH #2에 특이적인 16개의 잡종 세포주와 PfLDH #3에 특이적인 14개의 잡종 세포주를 얻었으며, 3차례에 걸친 한계 희석법을 통해서 PfLDH #2에 대한 단일클론 세포주 4개와 PfLDH #3에 대한 단일클론 세포주 4개를 최종 선택하였다. ELISA로 PfLDH #2에 대한 단일클론 항체 4개와 PfLDH #3에 대한 단일클론 항체 4개에 대한 흡광도를 측정한 결과, PfLDH #2에 대한 단일클론 항체에서는 1.75에서 2.53 사이의 높은 값을 나타냈으며, PfLDH #3에 대한 단일클론 항체에서는 1.05에서 1.7 사이의 값을 나타내었다(도 4 및 도 5 참조).

모든 실험에 있어서 ELISA는 각각 3차례씩 실시하였으며, 각각 3일 동안 배양한 단일클론 세포주의 상청액을 이용하여 측정하였다. PfLDH #2에 대한 단일클론 항체의 이름은 B4D, C2B, D2H 및 D7E라 명명하였고, PfLDH #3에 대한 단일클론 항체의 이름은 A4F, A7E, B9G 및 D5G 라 명명하였다. 또한 PfLDH #2에 대한 단일클론 항체 중에서는 D7E가, PfLDH #3에 대한 단일클론 항체 중에서는 D5G가 가장 높은 역가를 나타내었다.

대량의 항체를 얻기 위하여, 각각의 잡종세포를 마우스의 복강에 주사하여 생긴 복수를 채취하는 방법을 실시하였다. 이 방법을 통해 얻는 항체의 역가를 측정하기 위해서 마우스로부터 채취한 복수를 인산완충용액(PBS)에 1:50의 농도로 희석하여 ELISA 방법을 실시하였다. 각각 3차례 반복 실험 결과, PfLDH #2에 대한 단일클론 항체로부터 얻은 복수의 흡광도 값은 1.43에서 2.05의 범위로, 도 6에 나타내었고, PfLDH #3에 대한 단일클론 항체로부터 얻은 복수의 흡광도 값은 0.92에서 1.35의 범위로, 도 7에 나타내었다.

본 실험을 통해 마우스의 복수 내에 분비되는 항체의 농도가 단일클론 세포주의 배양을 통해 얻는 항체보다 50배 이상 된다는 것을 확인할 수 있었다. 단백질 A 컬럼 친화성 크로마토그래피를 이용하여 마우스 복수로부터 항체를 분리, 정제 하였으며, 얻어진 항체는 -20℃에 보관하였다.

실시예 3. 면역효소 흡착법 ( ELISA ) 시행

면역된 마우스의 역가와 세포융합 세포들의 항체 생산을 확인하기 위하여 면역효소 흡착법 (ELISA)을 시행하였다. 각각의 항원을 단백질의 농도가 1-5 ㎍/㎖가 되도록 0.05M 완충 용액(pH 9.6, carbonate-bicarbonate 완충 용액)에 희석하여 폴리스티렌(polystyrene) ELISA판 (Immunoplate, Nunc)에 100 ㎕/well씩 분주한 후, 4℃에서 12시간 이상 항원을 부착시켰다. 항원이 부착된 ELISA판을 PBST(0.05% Tween 20이 담긴 인산 완충 용액, pH7.4)로 5분씩 3회 세척한 후 3% BSA로 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 비 특이성 반응을 차단하였다. 시험할 혈청을 0.01M PBS (pH 7.4)에 1:100-1:500으로 희석하여 37℃에서 1시간 이상 반응시킨 후, PBST로 5분씩 3회 세척한 후 0.01M PBS (pH 7.4)에 1:3,000-1:5,000으로 희석한 이뮤노글로블린(peroxidase conjugated goat anti-mouse immunoglobulin, Cappel, U.S.A)을 100 ㎕/웰 씩 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

PBST로 5분간 3회 세척 후, 기질(substrate) 완충 용액 10㎖에 p-NPP tablet(p-nitrophenyl phosphate 20㎎, Sigma) 1개를 녹인 후, 이것을 100 ㎕/웰 씩 넣고 실온에서 빛을 차단 시키고 30분간 반응시킨 후, ELISA 리더로 405 nm의 파장에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다.

실시예 4. 단일클론 항체를 생산하는 세포군 선택

단일클론 항체를 생성하는 단일 클론의 선택은 한계 희석법 (limiting dilution)을 이용하여 선택하였다. 즉, 배양중인 잡종 세포 중에서 항체를 생산하는 세포를 선택하기 위해서 96-웰 플레이트를 ELISA로 검사하여 항체를 생산하는 웰만 24-웰 플레이트로 옮겨서 배양하였다. 세포가 자란 숫자를 계산하여 96-웰 플레이트에 0.25 세포/웰 이 되도록 희석하고 96-웰 플레이트에 넣고 배양하였다.

세포가 자란 웰을 선택하여 항체의 생산 여부를 상기 ELISA 방법으로 확인하고, 항체를 분비하는 웰을 선택하여 24-웰 플레이트에서 배양하였다. 이런 방법을 2-3회 반복하여 단일 클론 세포주를 선택하였다.

실시예 5. 단일 클론 항체의 이소타이핑( isotyping )

분비되는 항체의 이소타입(isotype)을 확인하고자 이소타이핑 키트(Sigma mouse monoclonal antibody isotyping kit, ISO-1, Sigma)를 사용하여 이소타입 확인을 실시하였다.

얻어진 단일클론 항체들의 이소타이핑을 키트(Sigma mouse monoclonal antibody isotyping kit)를 통해서 분석한 결과 PfLDH #2에 대한 단일클론 항체는 4가지 클론 모두 IgM 클래스(class)로, PfLDH #3에 대한 단일클론 항체는 4가지 클론 모두 IgG2b 클래스(class)로 확인되었다.

실시예 6. 단일 클론 항체의 대량 생산 및 정제

항체를 분비하는 단일 클론 세포주를 대량으로 배양하여 배양액으로부터 단백질 A 컬럼 친화성 크로마토그래피를 이용하여 단일 세포군 항체만을 순수 분리하였다. 다른 한편으로는 발현된 말라리아 항원에 대한 단세포군 항체의 대량 생산과 정제를 위하여 마우스 복수 채취법(ascites collection)을 시행하였다. 8주 정도의 암컷 BALB/c 마우스에 프리스탄(pristane, 또는 Freund's incomplate adjuvant)을 200 ㎕씩 복강 내로 주사하였다. 7-10일후 PBS(phosphate buffered saline)로 씻은 5x10⁵- 5x10⁶개의 융합 세포(hybridoma cells)를 마우스의 복강 내로 주사하였다. 1-2주일이 지나고 마우스의 복강에 복수가 차기 시작한 후 19G 바늘로 복강을 찔러 복수를 모았다. 모아진 복수를 4℃에서 1시간 이상 둔 뒤에 5,000xg에서 15분간 원심침전하고 난 후 상청액만을 조심스럽게 모았다.

단백질 A 컬럼을 이용하여 항체만 순수 분리하였고, 정제한 항체의 분자량을 조사하기 위해 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 시행하였다. 또한 항원에 대한 항체의 반응을 확인하기 위해 이뮤노 블럿(immunoblot)을 시행하여 반응대를 확인하였다.

실험 결과, 먼저 단일클론 항체들이 열대열 말라리아 메로조이트의 용해물(lysate), 특히 LDH에 대해서 반응하는지를 관찰하기 위해 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿을 실행한 결과 도 8에서 보여지는바와 같이 열대열 말라리아 메로조이트 용해물의 전체 밴드 패턴은 대략 9 내지 11개로 나타났고, 그 중에서 33kDa의 밴드가 열대열 말라리아의 LDH 부분임을 확인하였다.

또한, 각각의 단일클론 항체가 열대열 말라리아 LDH 항원과 반응하는지를 확인하기 위해서 웨스턴 블럿을 시행한 결과, 도 9와 도 10에서 보여지는바와 같이 PfLDH #2와 PfLDH #3에 대한 단일클론 항체 전부에서, LDH를 나타내는 33kDa에서 강한 반응을 보였다.

다음으로 단일클론 항체들의 민감도(sensitivity)를 조사하기 위해서 열대열 말라리아 메로조이트 용해물을 단계별로 희석하여 실험에 사용하였다. PfLDH #2에 대한 단일클론 항체는 4가지 모두 1.16ng/㎖의 농도로 열대열 말라리아 메로조이트 용해물을 희석시켰을 때까지 반응대가 확인되었고, PfLDH #3에 대한 단일클론 항체는 모두 1.22ng/㎖의 농도로 용해물을 희석시켰을 때까지 반응대가 확인되었다(도 11, 도 12 참조).

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 말라리아의 LDH(Lactate Dehydrogenase)과 반응하는 단일클론 항체의 생산 및 이를 이용한 민감도가 높은 본 발명의 말라리아 진단방법은 신속하면서도 대량으로 말라리아 감염 여부를 효율적으로 진단할 수 있는 진단 방법을 제공한다.

<110> Wonkwang University Center for Industry-Academy Cooperation <120> Monoclonal antibody and diagnostic method of malaria parasites <130> DIF/06-02-18/MR <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of PfLDH #1 <400> 1 Ser Lys Ala Lys Ile Val Leu Val Gly Ser Gly Met Ile Gly Gly Val 1 5 10 15 Met Ala Thr Leu Ile Val Gly Lys Asn Leu 20 25 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of PfLDH #2 <400> 2 Phe Thr Lys Ala Pro Gly Lys Ser Asp Lys Glu Trp Asn Arg Asp Asp 1 5 10 15 Leu Leu Pro Leu Asn Asn Lys Ile Met Ile Glu Ile Gly Gly His 20 25 30 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of PfLDH #3 <400> 3 Asp Tyr Gly His Ser Asp Ile Phe Gly Gly Thr Pro Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Ala Asn

Claims

1) LDH 유전자의 특이 부분에 대한 펩타이드(pepetide)를 제조하고 여기에 운반체(carrier)로서 MAPs을 붙여, 이 펩타이드 항원을 마우스에 면역시키는 단계;

2) 상기 면역된 마우스로부터 혈청을 분리하여 골수종 세포(myeloma)와 세포 융합을 실시하는 단계;

3) 상기 융합세포로부터 HAT(hypoxantine, aminopterin, thymidine)배지를 이용하여 잡종세포(hybridoma cell)를 선택, 분리 배양하여 항체 분비 여부를 확인하는 단계;

4) 상기 잡종세포로부터 한계 희석법을 이용하여 단일클론 항체를 생성하는 단일클론 세포주를 선택하는 단계;

5) 상기 단일클론 세포주를 대량으로 배양하여 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 단일세포군 항체만을 순수 분리하는 단계를 포함하는 말라리아 원충에 대한 단일클론 항체를 제조하기 위한 제조방법.

4) 마우스에 프리스탄(pristane) 또는 IFA(incomplete freund's adjuvant)를 복강내로 주사하고 7 내지 10일 후 상기 융합세포를 복강내로 주사하는 단계;

5) 상기 융합세포 주사 후 1 내지 2주일 후 복강에 복수가 차면 복수를 바늘로 찔러 모아 원심 침전하고 상청액을 모으는 단계;

6) 상기 상청액을 단백질 A 컬럼을 이용하여 항체만을 순수 분리하는 단계를 포함하는 말라리아 원충에 대한 단일클론 항체를 제조하기 위한 제조방법.

제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 재조합 항원은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.

제 1항 또는 제 2항에 있어서, 3)단계의 세포 융합 시 사용되는 마우스의 혈청은 ELISA 측정 결과 흡광도가 0.8 이상임을 특징으로 하는 방법.

제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 서열번호 2의 항원에 대한 B4D, C2B, D2H 또는 D7E, 서열번호 3의 항원에 대한 A4F, A7E, B9G 또는 D5G 임을 특징으로 하는 방법.

제 5항에 있어서, 상기 단일클론 항체의 이소타입(isotype)은 서열번호 2에 대한 단일클론 항체의 이소타입은 IgM 클래스(class), 서열번호 3에 대한 단일클론 항체의 이소타입은 IgG2b 클래스(class)임을 특징으로 하는 방법.

제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 말라리아 원충은 열대열 말라리아(Plasmodium falciparum) 또는 삼일열 말라리아(Plasmodium vivax)임을 특징으로 하는 방법.