CN102229913A

CN102229913A - 一种用于检测疟原虫的胶体金快速免疫层析检测试纸及抗体和细胞株

Info

Publication number: CN102229913A
Application number: CN2011101385243A
Authority: CN
Inventors: 郝文波; 李明; 吴英松; 徐伟文; 罗树红; 王萍; 廖小青
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2011-05-26
Filing date: 2011-05-26
Publication date: 2011-11-02

Abstract

本发明公开了一种用于检测疟原虫的胶体金快速免疫层析检测试纸及抗体和细胞株。本发明的检测试纸包括底板、样品垫、聚酯纤维素垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、聚酯纤维素垫、硝酸纤维素膜和吸水垫沿着底板的长度方向依次部分重叠并固定在底板上，聚酯纤维素垫上喷涂有一层胶体金-抗体1H12复合物；硝酸纤维素膜上分布有第一检测带、第二检测带和质控带，其中第一检测带是在硝酸纤维素膜上喷涂抗体2A5形成，第二检测带是在硝酸纤维素膜上喷涂抗体4F6形成，质控带是在硝酸纤维素膜上喷涂羊抗小鼠IgG1抗体形成。本发明所说的检测试纸操作简单，快速，敏感、特异，可用于疟疾早期、快速诊断。

Description

一种用于检测疟原虫的胶体金快速免疫层析检测试纸及抗体和细胞株

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体地说，涉及一种用于检测疟原虫的胶体金快速免疫层析检测试纸及抗体和细胞株。

背景技术

疟疾是广泛流行于热带、亚热带及温带边缘地区的一种重要虫媒传染病。在所有虫媒传染性疾病中，疟疾是发病率和死亡率最高的疾病之一。目前世界上仍有90多个国家、24亿人生活在疟疾流行区。每年有5亿人发病，250多万人死亡。发病和死亡的病例中，90%是在非洲和亚洲的贫穷国家。据不完全统计，目前中国全国估计每年有25－30万人发病。另外，疟疾还是造成进入疟区部队非战斗减员的主要疾病之一。面对疟疾对人类造成的严重威胁，世界卫生组织（WHO）提出进一步研究与开发更有效的疟疾防治药物和诊断技术，以达到2010年全球疟疾死亡人数减少50%，2015年再减少50%的目标。

由于受各种因素的影响，疟疾疫苗的研制进展缓慢，因此实现疟疾的快速有效的诊断和治疗就显得尤为重要。八十年代以来，随着分子生物学的发展和基因诊断技术的出现，疟疾诊断方法也在不断改进，显示了较高的敏感性和特异性，且实现了疟疾的早期快速诊断。然而，这些方法都需要使用复杂的仪器设备和技术条件，所以难以在基层推广应用。

以检测疟原虫特异性抗原为基础的免疫学方法具有快速、简便、可靠等优点，在疟疾诊断上日益受到重视。免疫学检测主要是利用单克隆抗体检测疟原虫的特异性抗原（即所谓抗原捕获法）。根据疟疾流行区偏僻、落后的特点，迄今已开发了多种适合疟疾流行区现场使用的免疫层析检测方法和相应的试剂条。其原理为利用硝酸纤维素膜制备免疫层析测试条，在硝酸纤维素膜上包被抗被检抗原的一株单克隆抗体作为捕获带，同时，将另一株单克隆抗体偶联在胶体金或乳胶上作为检测试剂。当样品溶液和检测试剂通过捕获带时，二者形成的复合物即被包被在膜上的抗体捕捉，如果样品中含有被检抗原，则捕获带可发生颜色反应，并且颜色反应的强弱与样本中的抗原浓度成正比。

目前报道的疟原虫诊断靶抗原主要有富组氨酸蛋白II （HRPⅡ）和乳酸脱氢酶（LDH）。HRP-II是恶性疟原虫感染、特别是急性感染病人血清中存在的一种特异性标志，几乎在整个红内期均有分泌，在感染机体的血清中含量很高，有种特异性，且为暴露的抗原成分，被认为是理想的恶性疟原虫诊断抗原。检测恶性疟原虫的商品检测条ParaSight-F(dipstick)和ICT Malaria P.f(ICT1)都是基于HRPⅡ建立的。但基于靶抗原HRPII的诊断方法存在某些缺点，包括：HRPII只存在于无性期和早期配子体中，故不能检测仅含有成熟配子体的血液样品；临床症状已消失、血液中虫体已被清除之后，HRPII仍会存在很长一段时间；由于抗HRPII单克隆抗体可能与类风湿因子产生交叉反应，因而可能导致假阳性。

乳酸脱氢酶（LDH）：LDH是另一种引人注意的疟原虫循环抗原，因其具有不同于人类红细胞LDH的独特理化和免疫化学性质，在疟疾诊断方面具有重要的应用价值。不同种属的疟原虫之间既具有各自的特异性，又具有交叉反应，但都与人红细胞和哺乳类LDH无交叉反应，这些特性为疟原虫抗原检测方法的建立提供了有利的理论依据。另外，LDH作为疟疾诊断抗原，还有以下两个优点：在各种疟原虫LDH之间不但有共同抗原表位，还具有种特异的抗原表位，因而能同时鉴别诊断恶性疟和间日疟；

Figure 2011101385243100002DEST_PATH_IMAGE002

LDH仅由活虫体产生，因此可用于鉴别虫的死活，监测治疗效果及复燃情况。国外已有疟原虫LDH制成OptiMAL和ICT Malaria P.f/P.v (ICT2)等免疫诊断试剂盒的报道，可同时诊断恶性疟和间日疟。但两种方法都是利用恶性疟原虫的LDH来制备属特异性抗体，通过排除法来诊断间日疟。在层析条上包被两株LDH单克隆抗体，一株为恶性疟种特异性单克隆抗体，另一株为能与恶性疟原虫和间日疟原虫都反应的属特异性单克隆抗体，如两条抗体带均出现红色反应带，即为恶性疟或恶性疟与间日疟混合感染；如只有属特异性单克隆抗体带出现反应，则为间日疟感染。此种方法的缺点是当两条抗体带均出现反应时，无法对恶性疟和混合感染进行鉴别诊断。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于检测疟原虫的胶体金快速免疫层析检测试纸。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种杂交瘤细胞系4F6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.3954。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏日期：2010年6月25日。分类命名：恶性疟原虫/间日疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体杂交瘤细胞株。

一种杂交瘤细胞系2A5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.3955。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏日期：2010年6月25日。分类命名：恶性疟原虫/间日疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体杂交瘤细胞株。

一种杂交瘤细胞系1H12，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.3956。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏日期：2010年6月25日。分类命名：恶性疟原虫/间日疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体杂交瘤细胞株。

一种用于检测间日疟原虫LDH的捕获抗体4F6，由杂交瘤细胞系CGMCC NO.3954分泌所得。

一种用于检测恶性疟原虫LDH的捕获抗体2A5，由杂交瘤细胞系CGMCC NO.3955分泌所得。

一种用于检测恶性疟原虫和间日疟原虫LDH的检测抗体1H12，由杂交瘤细胞系CGMCC NO.3956分泌所得。

本发明所述单抗2A5能特异性结合恶性疟原虫LDH，不与间日疟原虫LDH结合；单抗4F6能特异性结合间日疟原虫LDH，不与恶性疟原虫LDH结合；而单抗1H12与两种疟原虫LDH都能结合。三株单抗与其他哺乳动物及寄生虫的LDH反应均为阴性，如人、鼠、兔红细胞及弓形虫、血吸虫、华支睾吸虫等。

本发明所述的三个单抗配对用于恶性疟原虫和间日疟原虫抗原的鉴别检测，主要是结合双抗体夹心的胶体金免疫层析方法的检测，其中单抗2A5作为捕获恶性疟原虫LDH抗体，单抗4F6作为捕获间日疟原虫LDH抗体，单抗1H12结合胶体金颗粒作为检测抗体。基于上述原理，本发明所述的单抗用于制备成可产业化的检测恶性疟原虫和间日疟原虫抗原的试剂，该试剂可以是试纸的形式。所述的试纸可以是胶体金快速免疫层析检测试纸。

一种用于检测疟原虫的胶体金快速免疫层析检测试纸，包括底板、样品垫、聚酯纤维素垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、聚酯纤维素垫、硝酸纤维素膜和吸水垫沿着底板的长度方向依次部分重叠并固定在底板上，聚酯纤维素垫上喷涂有一层胶体金-抗体1H12复合物；硝酸纤维素膜上分布有第一检测带、第二检测带和质控带，其中第一检测带是在硝酸纤维素膜上喷涂抗体2A5形成，第二检测带是在硝酸纤维素膜上喷涂抗体4F6形成，质控带是在硝酸纤维素膜上喷涂羊抗小鼠IgG1抗体形成；其中所述的胶体金-抗体1H12复合物由抗体1H12包被在胶体金颗粒上制得。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明所说的检测恶性疟原虫和间日疟原虫抗原的试纸操作简单，快速，敏感、特异，可用于疟疾早期、快速诊断。本发明试纸与现有同类检测疟原虫的试纸相比，由于同时使用抗恶性疟原虫LDH种特异性抗体和抗间日疟原虫LDH种特异性抗体，所以本发明的方法既能鉴别诊断单纯的间日疟原虫和恶性疟原虫感染，又能鉴别诊断混合感染。因此，本发明为疟疾诊断领域提供了一种可供选择的新方法。

附图说明

图1 是本发明单抗2A5对恶性疟原虫感染全血、间日疟原虫感染全血及正常红细胞裂解抗原进行免疫印迹的结果，其结合条带的分子量为34kDa；其中条带1是 Marker，条带2是正常血红细胞裂解抗原，条带3是恶性疟原虫全血裂解抗原，条带4为间日疟原虫全血裂解抗原。

图2是本发明单抗4F6对恶性疟原虫感染全血、间日疟原虫感染全血及正常红细胞裂解抗原进行免疫印迹的结果，其结合条带的分子量为34kDa；其中条带1是 Marker，条带2是正常血红细胞裂解抗原，条带3是恶性疟原虫全血裂解抗原，条带4为间日疟原虫全血裂解抗原。

图3是本发明单抗1H12对恶性疟原虫感染全血、间日疟原虫感染全血及正常红细胞裂解抗原进行免疫印迹的结果，其结合条带的分子量为34Da；其中条带1是 Marker，条带2是恶性疟原虫全血裂解抗原，条带3是间日疟原虫全血裂解抗原，条带4为正常血红细胞裂解抗原。

图4是本发明胶体金快速免疫层析试纸的结构示意图，其中1是样品垫，2是聚酯纤维素垫、3是硝酸纤维素膜、4是吸水垫、5是第一检测带、6是第二检测带、7是质控带、8是底板。

图5是本发明检测疟疾的胶体金快速免疫层析试纸对恶性疟原虫感染血样、间日疟原虫感染血样、混合感染血样及正常人血样的检测结果，其中1是混合感染血样，2是恶性疟原虫感染血样，3是间日疟原虫感染血样，4正常人血样。

具体实施方式

实施例1 本发明单克隆抗体的制备和鉴定

本例举例描述本发明的恶性疟原虫和间日疟原虫免疫层析法中所使用的抗疟原虫抗体材料的制备。

1、疟原虫重组抗原的制备：

PCR扩增恶性疟原虫LDH（PfLDH）和间日疟原虫LDH（PvLDH）基因

Figure 2011101385243100002DEST_PATH_IMAGE003

PCR扩增PfLDH基因

以恶性疟原虫海南株基因组DNA为模板，PCR法扩增PfLDH基因片段，引物为：

PfLDH-P1：5’- CCTCGAATTCATGGCACCAAAAGCAAAAATCGT -3’（SEQ NO.1）

PfLDH-P2：5’- CCCTGTCGACTTAAGCTAATGC2CT TCAT TCTCT -3’ （SEQ NO.2）

反应在50 ml体系中进行。循环参数为93℃变性5分钟，93℃ 50秒℃ 45秒℃ 60秒，共30个循环后，72℃延伸5分钟。扩增产物用0.9%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳显示在约951bp处有一特异扩增条带，分子量大小与已报道的恶性疟原虫Honduras株的LDH一致。

Figure 2011101385243100002DEST_PATH_IMAGE004

PCR扩增PvLDH基因

以海南现场采集的间日疟原虫血样提取的间日疟原虫基因组DNA为模板，PCR法扩增PvLDH基因片段，引物为：

PvLDH-P1: 5’- ATATGAATTCATGACGCCGAAACCCAAA -3’ （SEQ NO.3）

PvLDH-P2：5’- GTACGGATCCTTAAATGAGCGCCTTCA -3’ （SEQ NO.4）

反应在50 ml体系中进行。循环参数为94℃变性5分钟，94℃ 45秒℃ 60秒℃ 45秒，共30个循环后，72℃延伸10分钟。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳显示在约951bp处有一特异扩增条带，分子量大小与已报道的间日疟原虫Belem株的LDH一致。

重组表达质粒的构建及鉴定

恶性疟原虫LDH重组表达质粒的构建与鉴定

PfLDH PCR 产物用EcoRⅠ+SalⅠ酶切后，用低融点琼脂糖电泳回收，与经相应内切酶酶解的pGEX-4T-1表达质粒连接，取约30μl连接液转化TG1感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB 平板上，37 ℃培养过夜。从转化平板上挑取单菌落,分别培养后，小量提取质粒分别进行PCR及EcoRⅠ+SalⅠ双酶切鉴定，阳性重组克隆能扩增出约951bp的目的片段，用EcoRⅠ+ SalⅠ双酶切后可产生约4900bp及951bp 两条带，而空载体酶切后只有4900bp 的一条带。测定的恶性疟原虫海南株(FCC1/HN) LDH 基因的全编码区长为951bp，无内含子，预测编码316个氨基酸，分子量为34kDa，结果表明PfLDH基因已被正确克隆到pGEX-4T-1载体中，从而得到定名为pGEX-PfLDH的重组质粒。

间日疟原虫LDH重组表达质粒的构建与鉴定

PvLDH PCR 产物用EcoRI＋BamHI酶切后，用低融点琼脂糖电泳回收，与经相应内切酶酶解的PET23a表达质粒连接，取约30μl连接液转化BL21感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB 平板上，37 ℃培养过夜。从转化平板上挑取单菌落，分别培养后，小量提取质粒分别进行PCR及EcoRI＋BamHIⅠ双酶切鉴定，阳性重组克隆能扩增出约951bp的目的片段，用EcoRI＋BamHI双酶切后可产生约3600bp及951bp 两条带，而空载体酶切后只有3600bp 的一条带。测定的间日疟原虫海南株LDH 基因的编码区全长也为951bp，无内含子，预测编码316 个氨基酸，分子量为34kDa，结果表明PvLDH基因已被正确克隆到PET23a载体中，从而得到定名为PET23a-PvLDH的重组质粒。

（3）重组蛋白表达及表达产物分析

PfLDH重组蛋白的表达及鉴定　

将pGEX-PfLDH重组表达质粒接种于Amp＋LB 中培养过夜，次日按1%（V/V）比例转入新鲜的、添加氨卞青霉素（Amp）的LB培养基中。37℃培养至OD590 值达0.7 时, 加IPTG至终浓度为1mmol/ L，37℃诱导培养4h 收菌。经SDS－PAGE 检测，可见重组子表达产物显示为一条分子量约为60kDa的新的蛋白条带，作为对照的空质粒载体的表达产物则只显示一条约26kDa的条带。ELISA分析显示，鼠抗恶性疟原虫血清能够与pGEX-PfLDH表达产物反应，而与BL21和pGEX-4T-1转化菌的表达产物无反应。将工程菌的表达产物电转移至硝酸纤维素膜上，以鼠抗恶性疟原虫血清为抗体进行Western印迹分析，结果显示在60kDa蛋白处出现一特异性反应条带，而pGEX-4T-1转化的细菌则未见相应的带。

用纯化后的重组蛋白免疫小鼠，40天后以琼脂扩散法检测效价达1:16。Western-blot分析结果显示该血清能识别恶性疟原虫和间日疟原虫分子量约为34kDa处的虫源蛋白，但与红细胞则几乎无反应。

PvLDH重组蛋白的表达及鉴定

PvLDH重组蛋白的表达与鉴定基本方法同PfLDH，PvLDH表达的诱导温度为37℃，最佳诱导时相OD590 为0.8时，IPTG诱导浓度为1mmol/L，诱导时间为4.5h。SDS-PAGE检测显示获得分子量约34kDa的新的蛋白区带。ELISA分析显示，鼠抗间日疟原虫血清能够与pET23a-PvLDH表达产物反应，而与BL21和pET23a转化菌的表达产物无反应。Western blot分析结果显示鼠抗间日疟原虫血清能特异识别工程菌表达产物在34kDa蛋白处条带，而pET23a转化的细菌则未见相应的带，而重组蛋白免疫小鼠获得血清能同时识别恶性疟原虫和间日疟原虫分子量约为34kDa处的虫源蛋白，但与红细胞则几乎无反应。

2、抗恶性疟原虫和间日疟原虫LDH抗体的制备

分别制备抗恶性疟原虫和抗间日疟原虫LDH抗体，方法如下。

使用6-8周龄的Balb/C小鼠作为免疫动物。首先用纯化的重组LDH （75μg）加等体积完全弗氏佐剂乳化后，皮下多点注射进行基础免疫。2周后，以在不完全弗氏佐剂中乳化的同样剂量蛋白进行追加免疫。追加免疫后2周，再次用不含弗氏佐剂的同样剂量蛋白腹腔注射，以进行加强免疫。末次免疫后，从动物的尾静脉采血并测试抗体效价。必要时，可于处死动物分离脾细胞前3天，再加强免疫一次。

血清抗体效价达到足够的水平后，处死动物并分离脾细胞，按适当比例将被免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合并在PEG-4000作用下融合之。

以纯化的重组蛋白包被微量滴定板，然后以间接ELISA法检测杂交瘤阳性克隆，并用有限稀释法对检出的阳性克隆进行亚克隆。

PfLDH组首先用重组融合蛋白进行筛选，有20孔为阳性，经pGEX-4T-1诱导菌、恶性疟原虫和红细胞蛋白复筛，得到2株仅与恶性疟原虫虫体蛋白发生反应，而与pGEX-4T-1诱导菌和红细胞不发生反应的细胞株，命名为1H10 和2A5。

2A5经2次亚克隆，1H10经3次亚克隆后，建立了稳定的抗PfLDH杂交瘤细胞株。两种单克隆抗体与间日疟原虫虫体抗原进行ELISA和Western blot反应，均为阴性，表明两单克隆抗体均为恶性疟原虫种特异性单克隆抗体，此组融合未筛选到能同时与恶性疟原虫和间日疟原虫反应的属特异性单克隆抗体。

PvLDH组亦首先用重组蛋白进行筛选，有29孔为阳性，经pET23a诱导菌、间日疟原虫和红细胞蛋白复筛，得到5株仅与间日疟原虫虫体蛋白发生反应，而与pET23a诱导菌和红细胞不发生反应的细胞株，命名为1D8、1H12、2E9、3F10 和4F6。5株单克隆抗体经2～3次亚克隆后，建立了稳定的抗PvLDH杂交瘤细胞株。五种单克隆抗体与恶性疟原虫虫体抗原进行ELISA和Western blot反应，1D8、4F6和3F10反应阴性，为间日疟原虫种特异性单克隆抗体， 2E9和1H12反应阳性，为能同时与恶性疟原虫和间日疟原虫反应的属特异性单克隆抗体。

对上述7种单克隆抗体进行配对，检测恶性疟原虫和间日疟原虫LDH抗原，结果显示，优选单抗为恶性疟原虫种特异性单克隆抗体2A5、间日疟原虫种特异性单克隆抗体4F6和交叉反应性单克隆抗体1H12，最终选择此三种单抗进行疟原虫快速检测试剂盒的研制。

ELISA试验表明，在体外培养条件下，得自杂交瘤培养物上清的抗体2A5、1H12和4F6的效价分别为1：512、1：256和1：256。在体内培养条件下，得自动物腹水液的抗体效价为分别1：51200、1：25600和1：25600。进一步的抗体分型实验结果显示，2A5和1H12杂交瘤细胞分泌的抗体类型为IgG1，4F6杂交瘤细胞分泌的抗体类型为IgG2a。对三株杂交瘤细胞的形态学观察可见，它们的染色体数目范围在92~110之间，并且大多数为端着丝点，少数为亚中部及中央着丝点。三株单抗2A5、4F6和1H12分别对恶性疟原虫感染全血、间日疟原虫感染全血及正常红细胞裂解抗原进行免疫印迹分析，结果显示：单抗2A5仅与恶性疟原虫全血裂解抗原中分子量约34kDa的条带结合（图1）；单抗4F6仅与间日疟原虫全血裂解抗原中分子量约34kDa的条带结合（图2）；单抗1H12可同时与恶性疟原虫全血裂解抗原和间日疟原虫全血裂解抗原中分子量约34kDa的条带结合（图3）；三株单抗均不与正常血红细胞裂解抗原发生反应。

实施例2 本发明检测疟原虫的胶体金快速免疫层析试纸

1、1H12单克隆抗体的纯化和胶体金标记

用Protein G Sepharose 4 Fast Flow柱（Amersham）纯化1H12单克隆抗体腹水。采用柠檬酸三钠还原法制备20-30nm胶体金溶液。以0.1M碳酸钾调胶体金pH值为7.2，加入适量单克隆抗体1H12，室温搅拌30min，然后加入BSA至终浓度为1％，继续室温搅拌30min；溶液高速离心后弃上清，沉淀用20mmol/L TBS(pH 8.2)溶解，4℃保存备用。

制作金标垫时，取胶体金-抗体结合物原液2ml，用稀释液稀释至14ml。将聚酯纤维素膜浸泡在胶体金-抗体溶液10分钟，37℃烤干后热合封口并置于4℃下保存备用。

2、抗体固相硝酸纤维素膜的制备

用固相溶液(0.02mol/L PB, pH8.0)将纯化的2A5和4F6单克隆抗体稀释至2.5mg/ml，同时取羊抗小鼠IgG用固相溶液稀释至2mg/ml。将三种抗体分别点样在硝酸纤维素膜上(2A5、4F6和羊抗小鼠IgG分别加样于第一检测线、第二检测线和质控线处)，然后将硝酸纤维素膜置于封闭液(1%脱脂奶粉)中37℃孵育1小时，在洗涤液(0.02mol/L PB, pH7.0)中将负载固相化抗体的硝酸纤维素膜浸洗二次，然后室温风干并置4℃下保存。

3、免疫层析检测试纸的制作

如图4所示，一种用于检测疟原虫的胶体金快速免疫层析检测试纸，包括PVC底板8、样品垫1、聚酯纤维素垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4，所述样品垫1、聚酯纤维素垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4沿着底板8的长度方向依次部分重叠并固定在底板8上，聚酯纤维素垫2上喷涂有一层胶体金-抗体1H12复合物；硝酸纤维素膜3上分布有第一检测带5、第二检测带6和质控带7，其中第一检测带5是在硝酸纤维素膜3上喷涂抗体2A5形成，第二检测带6是在硝酸纤维素膜3上喷涂抗体4F6形成，质控带7是在硝酸纤维素膜3上喷涂羊抗小鼠IgG1抗体形成；其中所述的胶体金-抗体1H12复合物由抗体1H12包被在胶体金颗粒上制得。首先将PVC底板8平铺于台面上，轻轻揭开板中端的保护膜，将硝酸纤维素膜粘附于其上；然后揭开硝酸纤维素膜下缘的保护膜，将聚酯纤维素垫粘附于其上，聚酯纤维素垫覆盖在硝酸纤维素膜上1mm；再揭开薄板最下端的保护膜，将样品垫1粘附于其上，样品垫覆盖在聚酯纤维素垫上3mm；再揭开板上端的保护膜，将吸水垫4粘附于其上，吸水垫4覆盖在硝酸纤维素膜上2mm；最后在自动切条机上将贴好的PVC底板8切成3mm宽的测试条，将每个测试条装入卡式塑料盒内，置于铝箔袋中，并加入干燥剂，热合封口，即完成免疫层析检测板的制作。

4、本发明试纸对疟疾血样进行检测。

从真空包装袋中取出检测试纸，置于干净平坦的台面上，用一次性毛细吸管垂直滴入10μl全血标本于加样孔中，再滴入3滴缓冲液，15分钟内读取测试结果。阳性反应为质控线出现阳性的前提下，两条检测线至少一条出现红色。仅第一检测线呈红色判断为恶性疟原虫感染，仅第二检测线呈红色判断为间日疟原虫感染，第一和第二检测线同时呈红色判断为恶性疟原虫和间日疟原虫混合感染。阴性反应则只有一条红色的质控线（图5）。

在实验室研究的基础上，我们使用本发明的方法共检测了门诊可疑疟疾患者血液样品258份。以镜检法检查的结果作为标准，并对自制检测条及国外OptiMAL试剂盒（荷兰DiaMed AG公司生产）检测疟原虫感染的结果进行比较，结果如下列表1所示。

表1. 自制检测条和OptiMAL试剂盒检测疟疾的比较

Figure 2011101385243100002DEST_PATH_IMAGE005

由表1所示的结果可以看出，镜检法检查258份样品中有185(71.71%)份检出疟原虫，其中42份为恶性疟原虫，109份为间日疟原虫，34份为两种疟原虫混存。OptiMAL法检出181(70.16%)份阳性血样，其中74份为恶性疟原虫/混合感染，105份为间日疟原虫，1份为假阳性。本发明的检测条检出184(71.32%)份阳性血样，其中40份为恶性疟原虫，107份为间日疟原虫，34份为混合感染，2份为假阳性。

以镜检法为参考标准，本发明的检测条和OptiMAL试剂盒检测疟疾的阳性检出符合率分别为97.84%和96.76%，特异度分别为97.26%(71/73)和98.63%(72/73)。由于OptiMAL法不能鉴别诊断恶性疟原虫和混合感染，因此镜检法检出的42份恶性疟原虫感染和34份混合感染的血样在OptiMAL检测法中都只能判定为恶性疟原虫感染/混合感染。

EQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 一种用于检测疟原虫的胶体金快速免疫层析检测试纸及抗体和细胞株

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cctcgaattc atggcaccaa aagcaaaaat cgt 33

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccctgtcgac ttaagctaat gccttcattc tct 33

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atatgaattc atgacgccga aacccaaa 28

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtacggatcc ttaaatgagc gccttca 27

Claims

1.一种杂交瘤细胞系4F6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.3954。

2.一种杂交瘤细胞系1H12，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.3956。

3.一种用于检测间日疟原虫LDH的捕获抗体4F6，其特征在于由杂交瘤细胞系CGMCC NO.3954分泌所得。

4.一种用于检测恶性疟原虫和间日疟原虫LDH的检测抗体1H12，其特征在于由杂交瘤细胞系CGMCC NO.3956分泌所得。

5.一种用于检测疟原虫的胶体金快速免疫层析检测试纸，其特征在于包括底板（8）、样品垫（1）、聚酯纤维素垫（2）、硝酸纤维素膜（3）和吸水垫（4），所述样品垫（1）、聚酯纤维素垫（2）、硝酸纤维素膜（3）和吸水垫（4）沿着底板（8）的长度方向依次部分重叠并固定在底板（8）上，聚酯纤维素垫（2）上喷涂有一层胶体金-抗体1H12复合物；硝酸纤维素膜（3）上分布有第一检测带（5）、第二检测带（6）和质控带（7），其中第一检测带（5）是在硝酸纤维素膜（3）上喷涂抗体2A5形成，第二检测带（6）是在硝酸纤维素膜（3）上喷涂抗体4F6形成，质控带（7）是在硝酸纤维素膜（3）上喷涂羊抗小鼠IgG1抗体形成；其中所述的胶体金-抗体1H12复合物由抗体1H12包被在胶体金颗粒上制得。