CN104450625A - 可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用。该杂交瘤细胞为三株，保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏号是CCTCC No：C2014185、CCTCC No：C2014184和CCTCC No：C2014181。此外，本发明还涉及一种灵敏度较高且特异性较强的疟疾检测试纸，以及包括该疟疾检测试纸的疟疾检测试剂盒。该疟疾检测试剂盒可以实现准确、快速地检测出恶性疟原虫，在特异性、灵敏度等方面较之传统的检测方法具有显著的优势，同时可以应用于间日疟和混合感染的检测。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，尤其是涉及一种可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用。
背景技术
疟疾是危害人体健康的严重的寄生虫病，是一种由媒介按蚊传播的传染病，它是由于疟原虫，通过蚊虫叮咬人体后，寄生在人体组织器官和红细胞内的一种寄生虫病。疟疾广泛流行于热带、亚热带及温带边缘地区，在所有虫媒传染病中，疟疾是发病率和死亡率最高的疾病之一。世界范围内，仅是呈现临床症状的患者病例每年就在3亿到5亿之间，而每年因患疟疾而死亡的人数则在一到三百万之间，发病和死亡的病例中，90％是非洲和亚洲的贫穷国家。据不完全统计，目前中国估计每年有25-30万人发病。寄生于人体的疟原虫有四种：恶性疟原虫、间日疟原虫，三日疟原虫，卵形疟原虫。主要以恶性疟和间日疟最为常见。
疟疾诊断是疟疾防治工作中的重点。血检疟原虫迄今仍是确诊疟疾最可靠的方法，此法能鉴别虫种各虫期，但耗时，费力，需要熟练的技术人员和一定的实验条件。对于疟疾的实验室诊断主要是依靠病毒分离培养，虫体形态学观察，PCR和免疫学方法ELISA进行鉴定。虽然灵敏度高，但是需要时间长，不便于现场检测，因此，寻找快速，敏感，特异的疟原虫检测方法对疟疾诊断及防治工作有着积极的推动作用。利用免疫层析技术发展起来的免疫层析试纸条，其优点是操作简单，判断标准明确，且不需要专门的仪器设备；检测快捷，只要10-15分钟就得到检测结果；试剂稳定性好，保存条件要求低，操作人员不需要特殊的专业知识和技术培训，适合在设备及条件不好的偏远落后地区进行筛查及诊断工作。
检测疟原虫特异性抗原为基础的免疫层析技术在疟疾诊断上日益受重视。 检测疟疾的靶抗原主要有富组氨酸蛋白II(HRP-II)和乳酸脱氢酶蛋白(LDH)
富组氨酸蛋白II(HRP-II)是恶性疟原虫消化血红蛋白后形成的代谢产物，由血液期无性体和早期配子体合成，含有大量组氨酸，具有种特异性，由于是水溶性抗原其可在疟疾患者的血浆，尿，全血中检测到，是诊断恶性疟疾的理想靶抗原。以富组氨酸蛋白II(HRP-II)为靶抗原诊断试剂有几点不足：1，只能用于恶性疟检测，对流行较广的间日疟无法检出；2，当患者血液中的活虫体消失后，HRP-II仍较长的时间存在体内，无法准确地确认感染期；3抗HRP-II单克隆抗体与类风湿因子起交叉反应会引起假阳反应。
疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)在疟原虫整个红内期均有表达，研究表明各种疟原虫LDH之间不但有共同抗原的表位，还具有种特异表位；且仅由活虫体产生，血液中LDH水平与原血虫症平行相关，检测LDH可鉴别虫体的存活状态，用于监测和判定药物的疗效。
市场上大多疟疾快速免疫诊断产品主要是以疟原虫富组氨酸蛋白II(HRP-II)靶抗原恶性单检产品和以恶性疟富组氨酸蛋白II(HRP-II)和非恶性疟乳酸脱氢酶(LDH)靶抗原的联检产品。以疟原虫富组氨酸蛋白II(HRP-II)为靶抗原的恶性疟检测试剂盒只能用于恶性疟检测，对间日疟不能检出，且易与类风湿因子起交叉反应会引起假阳反应。以恶性疟富组氨酸蛋白II(HRP-II)和非恶性疟乳酸脱氢酶(LDH)靶抗原的联检产品，只能诊断恶性疟和非恶性疟感染，对间日疟和混合感染无法鉴别诊断。
发明内容
基于此，有必要提供一种以能够对间日疟和混合感染进行鉴别诊断的疟疾检测试剂盒，以及可应用在该疟疾检测试剂盒中的可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用。
一种可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No：C2014185。
一种上述的杂交瘤细胞分泌的抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，所述抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体记为4G8，所述4G8能与间日疟原虫乳酸脱氢酶结 合，并且所述4G8能与恶性疟原虫乳酸脱氢酶结合。
一种可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No：C2014184。
一种上述的杂交瘤细胞分泌的抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，所述抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体记为1G2，所述1G2能与恶性疟原虫乳酸脱氢酶结合，并且所述1G2不与间日疟原虫乳酸脱氢酶结合。
一种可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CCTCC No：C2014181。
一种由上述的杂交瘤细胞分泌的抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，所述抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体记为3G6，所述3G6能与间日疟原虫乳酸脱氢酶结合，并且所述3G6不与恶性疟原虫乳酸脱氢酶结合。
如上述的抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体在制备疟疾检测试剂领域或制备疟疾检测设备领域的应用。
一种疟疾检测试纸，包括上述的4G8、上述的1G2以及上述的3G6。
在一个实施例中，包括支撑薄片、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、第一检测线、第二检测线及质控线，所述样品垫、所述金标垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸收垫从所述支撑薄片的一端向另一端依次设置在所述支撑薄片上，所述样品垫与所述金标垫部分重叠，所述金标垫与所述硝酸纤维素膜部分重叠，所述硝酸纤维素膜与所述吸收垫部分重叠，所述第一检测线、所述第二检测线和所述质控线依次间隔设在所述硝酸纤维素膜上，且所述第一检测线设在靠近所述金标垫的一端，所述质控线设在靠近所述吸收垫的一端，所述金标垫上涂覆有4G8包附胶体金颗粒形成的胶体金标记的单克隆抗体，所述第一检测线为1G2，所述第二检测线为3G6，所述质控线为羊抗鼠IgG抗体。
一种疟疾检测试剂盒，包括上述的疟疾检测试纸。
上述杂交瘤细胞的分泌产量高，分泌得到的抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体具有高亲和力、高特异性等优点，可广泛应用在制备疟疾分型诊断的检测领域，如检测试剂或检测设备的制备领域等。
上述疟疾检测试剂盒以疟原虫乳酸脱氢酶为检测抗原，3G6只与间日疟原 虫乳酸脱氢酶结合，不与恶性疟原虫乳酸脱氢酶结合；1G2只与恶性疟原虫乳酸脱氢酶结合，不与间日疟原虫乳酸脱氢酶结合；4G8能与间日疟原虫乳酸脱氢酶和恶性疟原虫乳酸脱氢酶结合。
上述疟疾检测试剂盒可以实现准确、快速地检测出恶性疟原虫，在特异性、灵敏度等方面较之传统的检测方法具有显著的优势，能够对间日疟和混合感染进行鉴别诊断。
附图说明
图1为一实施方式的检测试纸的正面示意图；
图2为图1中检测试纸的纵截面示意图；
图3为检测试剂盒示意图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用作进一步详细的说明。
一实施方式的可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞于2014年09月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No：C2014185，分类命名：杂交瘤细胞株MA-4G8。该杂交瘤细胞可分泌出抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的单克隆抗体，记为4G8。4G8可以应用于疟疾检测试剂或疟疾检测设备的制备领域中。4G8为抗间日疟原虫和恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，4G8能与间日疟原虫乳酸脱氢酶和恶性疟原虫乳酸脱氢酶结合。
另一实施方式的可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞于2014年09月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No：C2014184，分类命名：杂交瘤细胞株MA-1G2。该杂交瘤细胞也可分泌出抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的单克隆抗体，记为1G2。1G2可以应用于疟疾检测试剂或疟疾检测设备的制备领域中。1G2为抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体，1G2只与恶性疟原虫乳酸脱氢 酶结合，不与间日疟原虫乳酸脱氢酶结合。
另一实施方式的可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞于2014年09月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No：C2014181，分类命名：杂交瘤细胞株MA-3G6。该杂交瘤细胞也可分泌出抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的单克隆抗体，记为3G6。3G6可以应用于疟疾检测试剂或疟疾检测设备的制备领域中。3G6为是抗间日疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，3G6只与间日疟原虫乳酸脱氢酶结合，不与恶性疟原虫乳酸脱氢酶结合。
一实施方式的疟疾检测试剂盒包括壳体、疟疾检测试纸和其他检测试剂。
如图1和图2所示，本实施方式的疟疾检测试纸100包括支撑薄片110、样品垫120、金标垫130、硝酸纤维素膜140、吸收垫150、第一检测线160、第二检测线170及质控线180。样品垫120、金标垫130、硝酸纤维素膜140及吸收垫150从支撑薄片110的一端向另一端依次设置在支撑薄片110上。样品垫120与金标垫130部分重叠，金标垫130与硝酸纤维素膜140部分重叠，硝酸纤维素膜140与吸收垫150部分重叠。第一检测线160、第二检测线170及质控线180依次间隔设在硝酸纤维素膜140上，且第一检测线160设在靠近金标垫130的一端，质控线180设在靠近吸收垫150的一端。支撑薄片110采用不吸水的材料制作。样品垫120用于样品点样。金标垫130上涂覆有4G8包附胶体金颗粒形成的胶体金标记的4G8。第一检测线160为1G2。第二检测线170为3G6。质控线180为羊抗鼠IgG抗体。
如图3所示，检测试纸100可置于检测试剂盒的壳体200内。壳体200上开设有加样孔210及观察窗220。加样孔210对应样品垫120的位置。检测线160及质控线180裸露于观察窗220中，方便观察。
其他检测试剂可以根据需要直接在实验室制备。
上述试剂盒利用双抗体夹心法来检测被检材料中是否含有恶性疟原虫和间日疟原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)。检测时，样品中的疟原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)先和金标垫130上的抗体4G8结合，由于毛细管作用，反应复合物沿包被膜向前泳动，到达第一检测线160，若样品含中有恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)，会被设在硝酸纤维素膜140上的第一检测线160上的抗体1G2捕获，就会形成单抗-原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)-金标记单克隆抗体复合物，富集在第一检测线160上，形成红色沉淀线；若样品中含有间日疟原虫乳酸脱氢 酶蛋白(LDH)，会被设在硝酸纤维素膜140上的第二检测线170抗体3G6捕获，就会形成单抗-原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)-金标记单克隆抗体复合物，从而富集在第二检测线170上，形成红色沉淀线；未结合的金标记单克隆抗体则通过检测线，被羊抗鼠IgG抗体捕获，富集在质控线180上，形成红色沉淀线。当第一检测线160与质控线180上同时有红色沉淀线时判为恶性疟感染，当第二检测线170与质控线180上同时有红色沉淀线时判为间日疟感染。当第一检测线160、第二检测线170与质控线180上同时有红色沉淀线时判恶性疟和间日疟混合感染。若样品中不含有疟原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)，样品到达检测线160和170时，遇到捕获单抗就不会形成双单抗夹抗原反应复合物，仅富集在质控线180上形成红色沉淀线，此时判为阴性结果。
此外，在其他实施方式中，该检测试剂盒的结构不限于上文描述。上述单克隆抗体除应用在上述胶体金标记的单抗检测试剂盒外，还可以用于其他疟疾检测试剂盒或设备中。本领域技术人员可以理解，将本实施方式的单克隆抗体直接或间接结合其他信号基团(如磁性微球、辣根过氧化酶等)，或将本实施方式的单克隆抗体作为包被抗体(例如ELISA)，则可用于其他形式的疟原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)检测试剂或设备。故本实施方式所制备得到的杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体可广泛适用于制备疟原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)检测试剂或设备。
通过使用上述杂交瘤细胞分泌的抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，在提高灵敏度的同时改善特异性。通过使用上述抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，制备得到的试剂盒与现有疟疾检测试剂盒相比，在特异性、灵敏度及检出率方面都具有显著的优势。
下面主要结合附图及具体实施例对可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)单克隆抗体的杂交瘤细胞及相关应用作进一步详细的说明。
实施例1
杂交瘤细胞株的建立与抗疟原虫乳酸脱氢酶蛋白单克隆抗体的制备。
1、抗原免疫。
将重组疟原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)抗原(1.2mg/mL，深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，产品名称：28D-MA1)与弗氏完全佐剂(SIGMA，F5881)等体积混合，得到油状乳液。将该乳液以每只0.2毫升的剂量皮下施给BALB/c小鼠(广州省实验动物中心，6周龄雌性，5只)背部位点，第一次免疫14天后腹腔增强免疫(抗原与弗氏不完全佐剂(SIGMA，F5506)等体积混合)，增强免疫到四针后，采尾血进行效价检测，效价达到融合要求。
融合前3天，用相同剂量抗原与等体积0.9％氯化钠注射液混合腹腔注射追加免疫。
2、杂交瘤细胞系的制备。
(1)饲养细胞的制备。
以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75％酒精全身浸泡5分钟，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI 1640筛选培养液(含HAT的RPMI1640完全培养液中)重悬，调整细胞浓度1×105个/mL，加入96孔板，180μL/孔，37℃，5％CO2培养过夜。
(2)免疫脾细胞的制备。
小鼠末次免疫后第三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI 1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清RPMI 1640基础培养液重悬，如此重复三次，计数。
(3)小鼠瘤细胞的制备。
小鼠瘤细胞经筛选后，培养至对数生长期，取两大瓶制成细胞悬液，离心，弃上清，用RPMI 1640基础培养液重悬，如些重复三次，计数。
(4)细胞融合及HAT选择杂交瘤。
将小鼠瘤细胞与免疫脾细胞按1:10细胞数量比例混合，在50mL塑胶离心管内用RPMI 1640基础培养液洗1次，1,200rpm，离心8分钟。弃上清，将细胞混匀，缓慢加入1mL 50％的PEG1500融合，融合1分钟后加入15mL的RPMI1640基础培养液终止细胞融合。1,000rpm，离心5分钟。弃上清，用50mL的 RPMI 1640筛选培养液轻轻混悬，平分于10块96孔板，50μL/孔，37℃，5％CO2培养。培养至第六天，换HT培养液(含HT的RPMI 1640完全培养液)两次。
(5)抗体的检测。
用0.05M pH9.5碳酸缓冲溶液稀释重组疟原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)抗原(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，产品名称：28D-MA1)，使其终浓度为2μg/mL。每孔0.1mL加入96孔聚苯乙烯板，37℃孵育2小时或4℃过夜，接着用含10％小牛血清或1％脱脂奶粉的0.01M pH7.4PBS，0.12mL/孔，37℃孵育2小时，用于检测。重组融合后第七天，取细胞上清0.1mL于上述96孔检测板中，37℃孵育30分钟，水洗六次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，产品名称：羊抗鼠IgG)，37℃孵育30分钟同上洗后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50μL，测450nm吸收值。RPMI 1640完全培养液作为阴性对照，以测定值与对照值得比≧2.0为阳性细胞孔。
分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆四次，扩大培养后，用含10％DMSO的完全培养液冻存，细胞密度为106个/mL。细胞融合一次共获得3株能稳定分泌抗体的细胞株，于2014年09月25日保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心(即中国典型培养物保藏中心)，保藏号是分别为CCTCC No：C2014185、CCTCC No：C2014184和CCTCC No：C2014181。保藏号为CCTCC No：C2014185的细胞系分泌的抗体即为4G8，保藏号为CCTCC No：C2014184的细胞系分泌的抗体即为1G2，保藏号为CCTCC No：C2014181的细胞系分泌的抗体即为3G6。
3、单克隆抗体的制备。
选6-8周健壮的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL的弗氏不完全佐剂；10天后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞。接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠濒死之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～15mL腹水。收集腹水，离心取上清，放于-20℃冰箱保存。
取腹水上清，用2倍体积的0.06M pH4.0的醋酸缓冲液稀释。向混合液中加 原腹水体积3％正辛酸沉淀杂质。12000rpm离心20min沉淀杂质，取上清过滤。用1M的NaOH调滤液pH至7.4。向所得的滤液中加等体积的饱和硫酸铵，沉淀IgG。12000rpm离心20min后，弃上清，沉淀用0.01M pH7.4的PBS复溶。
4、效价测定。
用0.05M pH9.5碳酸缓冲溶液稀释重组疟原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)抗原，使其终浓度为2μg/mL。每孔0.1mL加入96孔聚苯乙烯板，37℃孵育2小时或4℃过夜。后用含10％小牛血清或1％脱脂奶粉的0.01M pH7.4PBS，0.12mL/孔，37℃孵育2小时，用于检测。
(1)细胞上清效价的检测：用含10％小牛血清或1％脱脂奶粉的0.01M pH7.4PBS稀释1G2、3G6和4G8细胞培养上清依次至10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍和640倍。向已包被抗原的96孔板中每孔依次加入0.1mL的不同稀释倍数的细胞培养上清，37℃孵育30分钟，水洗六次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，产品名称：羊抗鼠IgG)，37℃孵育30分钟同上洗后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50μL，测450nm吸收值。3株细胞在640倍稀释细胞培养上清时，吸收值大于0.5。1G2,3G6,4G8细胞培养上清效价可达到1:640。
(2)小鼠腹水效价的检测：用上述方法检测1G2、3G6和4G8单克隆抗体的杂交瘤细胞所制备的腹水抗体效价。1G2、3G6和4G8腹水效价为1：320000，1：320000，1：640000。
实施例2
疟疾胶体金快速检测试纸的制备。
1、硝酸纤维素膜的制备。
包被缓冲液的配制：含6％甲醇的0.01M PH7.2的PBS缓冲液为包被缓冲液，0.22μ膜滤过，置4℃备用，有效期一周。1000mL 6％甲醇的0.01M PH 7.2PBS缓冲液配方：NaCL 8g，KCL 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO40.2g，甲醇60mL，双蒸去离子水定容至1000mL。
硝酸纤维素膜的制备：用包被缓冲液将抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)单克隆抗体1G2稀释到1～5mg/mL，调整机器，划线为T1线，T1线即为第一检测线，T1线靠近金标垫端，距金标垫端约5mm。用包被缓冲液将抗间日疟原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)单克隆抗体3G6稀释到1～5mg/mL，调整机器，距T1线约3-5mm划T2线，T2线即为第二检测线。用包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产，产品名称：羊抗鼠IgG)稀释到1～5mg/mL，调整机器，划线为C线，C线即为质控线，C线靠近吸收垫，距吸收垫约3mm。距T2线5～8mm，。37℃烘干，封装备用。
2、胶体金、金标记单克隆抗体的制备。
(1)溶液的配制。
①氯金酸的配制：用双蒸去离子水溶解氯金酸，配成1％溶液，置4℃备用，有效期四个月。1000mL 1％氯金酸溶液配方：10g氯金酸：双蒸去离子水定容至1000mL。
②柠檬酸三钠的配制：用双蒸去离子水溶解柠檬酸钠，配成1％溶液，，0.22μ膜滤过，置4度备用，有效期容至1000mL。
③0.1M碳酸钾的配制：用双蒸去离子水配制，0.22μ膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL0.1M碳酸钾溶液配方：13.8g碳酸钾；双蒸去离子水定容至1000mL。
④2％PEG-20000的配制：用双蒸去离子水配制，0.22μ膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL 2％PEG-20000溶液配方：20g PEG-20000；双蒸去离子水定容至1000mL。
⑤标记洗涤保存液的配制：2％牛血清白蛋白(BSA)，0.05％叠氮钠(NaN3)，0.01M pH7.2PBS溶液，0.22μ膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL标记洗涤保存液配方：20g BSA，0.5g NaN3、0.01M pH7.2PBS溶液定容至1000mL。
(2)胶体金的制备：
用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％，置电炉煮沸，按每100mL 0.01％氯金酸加入2mL 1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物， 有效期一周。
(3)胶体金标记单克隆抗体的制备：
用0.1M碳酸钾调胶体金的PH值至8.2，按8～10μg抗体/mL胶体金加入实施例1中制备得到的抗恶性疟原虫和间日疟原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)单抗，磁力搅拌器混匀30min，搅拌下加入BSA至终浓度为1％静置1小时。13000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的标记洗涤保存液将沉淀重悬，置4℃备用，有效期一周。
3、金标垫的制备。
(1)封闭液的配制：
2％BSA，0.1％TritonX-100、0.05％NaN3，0.01M pH7.2PBS溶液，0.22μ膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL封闭液配方：20g BSA，0.5g NaN3、1mL TritonX-100、0.01M PH7.2PBS溶液定容至1000mL。
(2)金标垫的制备：
将金标垫浸泡于封闭液中30min后好的金标记抗体均匀的铺在金标垫上，每毫升溶液铺20平方厘米，冷冻干燥，封装，置4℃备用。
4、试纸条样品垫的制备。
(1)封闭液的配制：
2％BSA，0.1％TrtionX-100、0.05％NaN3，0.01M pH7.2PBS溶液，0.22μ膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL封闭液配方：20g BSA，0.5g NaN3、1mL TrtionX-100、0.01M PH7.2PBS溶液定容至1000mL。
(2)样品垫的制备：
将样品垫浸泡于封闭液中30min后，于37℃烘干，封装，置4℃备用。
5、试纸条的组装。
将吸收垫(购自Millipore公司)、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫依次层叠设置在不吸水的支撑薄片上，切成3mm宽的小条。每十小条一包，加入干燥剂，真空封装，得到所述检测试纸。
实施例3
疟疾胶体金快速检测试纸试剂盒。
1、疟疾胶体金快速检测试纸试剂盒包括：
①试纸条 一包(10条/包)
②样品稀释液 一瓶(10mL/瓶)
相关溶液的配制。
样品稀释液：样品稀释液为8％NaCL溶液。配制方法：80gNaCL，加蒸馏水定容至1000mL。
2、胶体金法疟原虫乳酸脱氢酶蛋白(LDH)的检测。
(1)直接将采集好的静脉全血20μL置于含有180μL稀释液的塑料试管中，充分混匀，取120μL溶解好的样品加入到试纸卡加样孔，等待15min后即可观察结果。
(2)结果判定：当试纸条出现肉眼可见的紫红色质控线，没有出现肉眼可见的紫红色检测线，结果判为阴性；当试纸条出现肉眼可见的紫红色质控线，第一检测线同时也出现肉眼可见的紫红色检测线，结果判恶性疟原虫感染；当试纸条质控线和第二检测线同时出现肉眼可见的紫红色检测线，结果判间日疟原虫感染；当试纸条质控线、第一检测线和第二检测线三者同时出现肉眼可见的紫红色检测线，结果判间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染；检测线颜色越深说明被检测样品的抗原水平越高；当试纸条没有出现肉眼可见的紫红色质控线，不管有没有出现肉眼可见的紫红色检测线。结果都判为检测试纸条失效，应废弃。
实施例4
疟疾胶体金快速检测试纸试剂盒的应用。
以镜检出的阳性样本和阴性样本作为实施例3制作的检测试剂盒的检测样本，其中152例恶性疟阳性样本，181例间日疟阳性样本，300例检出阴性样本，检测结果见表1。
表1：实施例3制作的检测试剂盒的检测结果。
由表1可以看出，实施例3制作的检测试剂盒检出恶性疟阳性样本147，相对灵敏度为96.7％；实施例3制作的检测试剂盒检出间日疟疟阳性样本177，相对灵敏度为97.7％，300份阴性样本检出296份，其中4份为假阳，相对特异性为98.7％。实施例3制作的检测试剂盒完全可以用于常规的疟疾快速诊断。
实施例5
疟疾胶体金快速检测试纸试剂盒稳定性实验。
1、疟疾胶体金快速检测试纸试剂盒批内及批间稳定性实验。
将实施例3制得同批次及不同批次生产的疟疾胶体金快速检测试纸试剂盒检测镜检出的疟疾阳性标本及阴性标本。
实验结果：经验证试剂盒批内和批间结果一致。
2：疟疾胶体金快速检测试纸试剂盒存放稳定性实验。
将实施例3制得的疟疾胶体金快速检测试纸试剂盒放在室温下(25℃),每周抽检样品。
实验结果：经验证试剂盒在室温下保存18个月，检测结果仍符合要求。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，保藏号为CCTCC No：C2014185。
2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，所述抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体记为4G8，所述4G8能与间日疟原虫乳酸脱氢酶结合，并且所述4G8能与恶性疟原虫乳酸脱氢酶结合。
3.一种可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，保藏号为CCTCC No：C2014184。
4.一种由权利要求3所述的杂交瘤细胞分泌的抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，所述抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体记为1G2，所述1G2能与恶性疟原虫乳酸脱氢酶结合，并且所述1G2不与间日疟原虫乳酸脱氢酶结合。
5.一种可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，保藏号为CCTCC No：C2014181。
6.一种由权利要求5所述的杂交瘤细胞分泌的抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，所述抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体记为3G6，所述3G6能与间日疟原虫乳酸脱氢酶结合，并且所述3G6不与恶性疟原虫乳酸脱氢酶结合。
7.如权利要求2、4或6所述的抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体在制备疟疾检测试剂领域或制备疟疾检测设备领域的应用。
8.一种疟疾检测试纸，其特征在于，包括如权利要求2所述的4G8、如权利要求4所述的1G2和如权利要求6所述的3G6。
9.如权利要求8所述的疟疾检测试纸，其特征在于，包括支撑薄片、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、第一检测线、第二检测线及质控线，所述样品垫、所述金标垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸收垫从所述支撑薄片的一端向另一端依次设置在所述支撑薄片上，所述样品垫与所述金标垫部分重叠，所述金标垫与所述硝酸纤维素膜部分重叠，所述硝酸纤维素膜与所述吸收垫部分重叠，所述第一检测线、所述第二检测线和所述质控线依次间隔设在所述硝酸纤维素膜上，且所述第一检测线设在靠近所述金标垫的一端，所述质控线设在靠近所述吸收垫的一端，所述金标垫上涂覆有4G8包附胶体金颗粒形成的胶体金标记的单克隆抗体，所述第一检测线为1G2，所述第二检测线为3G6，所述质控线为羊抗鼠IgG抗体。
10.一种疟疾检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求8或9所述的疟疾检测试纸。
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