CN102087294A - 一种疟疾免疫层析快速检测试纸条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种疟疾免疫层析快速检测试纸条及制备方法，所述试纸条由样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底衬上构成，标记垫上涂覆有彩色胶乳颗粒标记的恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，包被膜包括检测区和控制区，所述检测区包被与标记垫上的单克隆抗体处于不同表位的恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，所述控制区包被抗鼠IGg单克隆抗体。本发明的试纸条提高了在疟疾筛查的准确性和便捷性；操作简便，具有快速、简便、直观的优点。
Description
技术领域
本发明属于医学检验领域，具体地说，本发明涉及一种恶性疟(P.f)和非恶性疟(P.v、P.o、P.m)快速联测的免疫层析检测试纸条及其制备方法。
背景技术
疟疾(Malaria)是一种严重危害人类健康的虫媒传染病，寄生于人体的疟原虫有四种：恶性疟原虫(Plasmodiμm falciparμm)、间日疟原虫(Plasmodiμm vivax)、三日疟原虫(Plasmodiμm malariae)和卵形疟原虫(Plasmodiμm ovale)。我国以前二种为常见。血检疟原虫迄今仍是确诊疟疾最可靠的方法，此法能鉴别虫种和虫期，但耗时、费力，需要熟练的技术人员和一定的实验室条件。对于疟疾的实验室诊断主要是依靠病毒分离培养，虫体形态学观察、PCR和免疫学方法ELISA进行鉴定。虽然灵敏度高，但是需要时间长，往往不便于现场检测。因此，寻找快速、敏感、特异的疟原虫检测方法是当今疟疾防治工作中迫切需要解决的问题之一。
免疫层析技术在疟疾诊断中的运用主要是检测3种靶抗原：富组氨酸蛋白(HRP-II)、疟原虫乳酸脱氢酶(pLDH)和疟原虫谷氨酸脱氢酶(pGDH)。(1)HRP-II是恶性疟原虫消化血红蛋白后形成的代谢产物，由血液期无性体和早期配子体合成，含有大量组氨酸，具有种特异性，由于是水溶性抗原其可在疟疾患者的血浆、尿、全血中检测到，是诊断恶性疟的理想靶抗原。(2)pLDH是疟原虫体内代谢酶，红内期疟原虫无性期和配子体期均有表达，其物理生化、免疫学特性、酶催化作用等与人体红细胞和其他许多微生物的乳酸脱氢酶(LDH)差异性大，疟原虫LDH具有种属特异性，可以作为免疫诊断的靶抗原。研究表明，只有活虫体才可以产生LDH，血液pLDH水平与原虫血症平行，且LDH活性与活虫密度消长呈平行改变，因此通过检测pLDH可监测药物疗效以及复燃情况。疟原虫LDH，在疟原虫的整个红内期均表达，在疟原虫能量代谢中发挥重要作用。早期的研究揭示了在各种疟原虫LDH之间不但具有共同抗原表位，还具有特异性抗原表位，因而能同时鉴别诊断恶性疟和非恶性；另外LDH仅由活体虫产生，因此可用于鉴别疟原虫的死活，监测治疗效果和复燃的情况，是理想的疟疾免疫诊断试剂的靶抗原。
目前，国际、国内在本技术领域的现有技术有利用双抗体夹心法疟疾(Malaria)的胶体金快速诊断试剂，如艾康公司的恶性疟\间日疟免疫层析检测试纸条，该试纸条可以检测恶性疟及间日疟，通过排除法检测虫种，但是不能鉴别混合感染和鉴别虫期。MALAR-check公司的疟疾免疫试纸条基于免疫层析原理，利用双抗体夹心法检测血液标本中恶性疟原虫在血液无性期和配子体早起分泌的富组氨酸蛋白。其检测的敏感性和特异性与PARASHGHT-F法相近。此检测可提高常规镜检测诊断不能区别的混合感染的早起滋养体期。
另有现有技术中有产品采用检测恶性疟原虫HRP-II的双抗体夹心法，以重组的恶性疟原虫HRP-II诊断抗原为靶点，制备相应的单克隆抗体检测恶性疟。其缺陷均是无法进行恶性疟和非恶性疟的联检。目前以纳米胶体金为标记物的免疫层析技术发展很成熟，但其在灵敏度和稳定性方面比Elisa法或者PCR法有一定的差距，且胶体金标记制备工艺复杂，成本较高。且由于胶体金只能显示红色，不能多样式的显示检测结果，特别是对于多项目联检的试纸条来说，不易区分检测线和质控线，对于检测结果容易造成判断失误。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种疟疾免疫层析快速检测试纸条，该试纸条可以进行恶性疟和非恶性虐的联检，具有快速、简便、灵敏、操作方便的优点。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：
一种疟疾免疫层析快速检测试纸条，所述试纸条由样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底衬上构成，所述标记垫上涂覆有彩色胶乳颗粒标记的恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，包被膜包括检测区和控制区，所述检测区包被与标记垫上的单克隆抗体处于不同表位的恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，所述控制区包被抗鼠IGg单克隆抗体。
优选地，所述标记垫上恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体与彩色胶乳颗粒的比例为1∶5～1∶30，所述非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体与彩色胶乳颗粒的比例为1∶5～1∶30。
优选地，所述彩色胶乳颗粒标记的恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的浓度均为5～15μg/ml，涂敷在标记垫上的稀释参数为20cm2/ml～30cm2/ml。
优选地，所述包被膜上恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和所述非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体在所述检测区的包被浓度均为1.5mg/ml～2.0mg/ml；所述抗鼠IgG单克隆抗体在所述控制区的包被浓度为1.0mg/ml～2.0mg/ml。
优选地，所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体在所述检测区的包被浓度为1.7mg/ml；所述非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体在所述检测区的包被浓度为2.0mg/ml；所述抗鼠IgG单克隆抗体在所述控制区的包被浓度为2.0mg/ml。
优选地，所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体在检测区的包被用量均为0.10μl/mm～0.25μl/mm；所述抗鼠IgG单克隆抗体在控制区的包被用量为0.10μl/mm～0.30μl/mm。
本发明还提供了上述疟疾免疫层析快速检测试纸条的制备方法，采取了以下技术方案：
一种制备疟疾免疫层析快速检测试纸条的方法，包括以下步骤：
A.按常规方法纯化恶性疟原虫富组氨酸蛋白II和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的生产菌株；
B.筛选制备多株富组氨酸蛋白II和疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体；按常规方法，经过筛选配对筛选合适的两株恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和两株非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体；所述两株恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和两株非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体分别处于不同的表位；
C.彩色胶乳标记单克隆抗体
采用彩色胶乳标记一株恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体；所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的浓度均为5～15μg/ml，按稀释参数为20cm2/ml～30cm2/ml，将所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体喷点标记垫上，然后将标记垫烘干，密封；
D.将另一株恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体均稀释至1.5mg/ml～2.0mg/ml，按0.10μl/mm～0.25μl/mm的包被用量分别包被至包被膜的检测区的T1线和T2线；将抗鼠IgG单克隆抗体稀释至1.0mg/ml～2.0mg/ml，按0.10μl/mm～0.30μl/mm的包被用量包被至包被膜的控制区；
E.将样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸顺次粘贴在底衬上，即得。
优选地，所述包被膜上T1线和T2线之间的间距为3mm-5mm。
彩色胶乳标记层析检测技术是继胶体金标记技术以后，在胶乳凝集试验的基础上发展起来的，即用抗体致敏高分子胶乳，以直径1μm左右或更大一些的球形胶乳颗粒作为载体，将抗原或抗体结合在此载体上，即成为带有免疫配基的微球。作为一种免疫学方法，这种免疫微球兼有固相化试剂特有的优点和免疫反应的高度专一性，具有快速、操作简便、试剂稳定、可室温储运、不易污染的特点，在疾病诊断、免疫学测定、细胞的标记和识别以及细胞的分离等领域中应用日益广泛。相对于目前的胶体金产品，彩色胶乳的制备相对简单，胶乳载体与蛋白以共价形式结合，稳定性好，灵敏度高，同时彩色胶乳色彩丰富，有利于OTC产品多元分析、批间差小和标记方式多样化。
本发明采用了彩色胶乳免疫层析法和双抗体夹心的原理，制备一种可以同时检测恶性疟(P.f)和非恶性疟(P.v、P.o、P.m)的试纸条。本发明中使用彩色胶乳标记的恶性疟原虫富组氨酸蛋白II(HRP-II)单克隆抗体和非恶性疟乳酸脱氢酶(pLDH)单克隆抗体，使用双抗体夹心的方法来检测恶性疟或非恶性疟。彩色胶乳微球具有球径可控、反应过程可控以及灵敏性可控的优点，可以进一步提高试纸条的灵敏度和测试的准确度，且显示结果可以多样化显示，更加醒目。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的试纸条结合多种指标联合检测，提高了在疟疾筛查的准确性和便捷性，避免漏检，提高疟疾和登革热的预防能力，具有重大的经济和社会效益；
使用本发明试纸条操作简便，无需技术熟练专业人员，具有快速、简便、直观以及不需要特殊仪器的优点，灵敏性和特异性分别为92.56％和98.57％，与镜检符合率为96.38％。
附图说明
图1是本发明的结构示意图；
附图标记：1、底衬；2、样品垫；3、标记垫；4、包被膜；5、吸水纸；6、检测区；7、控制区。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1
请参阅图1，为本发明的疟疾免疫层析快速检测试纸条的结构示意图。本发明提供的一种恶性疟和非恶性疟快速检测试纸条，包括底衬1、样品垫2、标记垫3、包被膜4以及吸水纸5。标记垫3上涂覆有彩色胶乳标记的恶性疟原虫富组氨酸蛋白II(HRP-II)单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶(pLDH)单克隆抗体，包被膜4由检测区6和控制区7组成，检测区6包括有检测线T1和检测线T2，其中T1处包被与彩色胶乳标记的恶性疟原虫富组氨酸蛋白II(HRP-II)单克隆抗体处于不同表位的另一株恶性疟原虫富组氨酸蛋白II(HRP-II)单克隆抗体；T2处包被有与彩色胶乳标记的非恶性疟原虫乳酸脱氢酶(pLDH)单克隆抗体处于不同表位的另一株非恶性疟原虫乳酸脱氢酶(pLDH)单克隆抗体，控制区7C线包被抗鼠IGg单克隆抗体。
在该实施例中，所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体与彩色胶乳颗粒的比例为1∶10，所述非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体与彩色胶乳颗粒的比例为1∶10，彩色胶乳颗粒标记的恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的浓度均为5μg/ml，涂敷在标记垫上的稀释参数为20cm2/ml。所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体在所述检测区的包被浓度和所述非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体在所述检测区的包被浓度均为1.5mg/ml；所述抗鼠IgG单克隆抗体在所述控制区的包被浓度为1.0mg/ml。所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体在检测区的包被用量为0.10μl/mm；所述抗鼠IgG单克隆抗体在控制区的包被用量为0.10μl/mm。
该实施例的制备方法为：
A.按常规方法纯化恶性疟原虫富组氨酸蛋白II和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的生产菌株；
B.使用免疫原蛋白免疫小鼠，提取含单抗的小鼠腹水，采用饱和硫酸铵法纯化，获取多株恶性疟原虫富组氨酸蛋白II和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体；与相应的抗原反应，比对反应效果，筛选效果较好的两株，一株作为标记单抗，一株作为包被单抗；
C.彩色胶乳标记单克隆抗体
分别使用不同颜色的400nm直径的聚苯乙烯胶体大分子复合物作为彩色胶乳标记恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体；恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的浓度均为5μg/ml，按稀释参数为20cm2/ml，用点胶乳机将恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体喷点标记垫3上，然后将标记垫3置于37℃下烘干2-3小时，密封并置于室温；
D.采用浓度为0.05M碳酸盐缓冲液(CBS，pH9.6)作为包被稀释液，将恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体(4.0mg/ml)和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体(4.0mg/ml)均稀释至1.5mg/ml，按0.10μl/mm的包被用量分别包被至包被膜4的检测区的T1线和T2线；将抗鼠IgG单克隆抗体(5.62mg/ml)稀释至1.0mg/ml，按0.10μl/mm的包被用量包被至包被膜4的控制区；T1和T2线之间的间距为4.7mm。包被膜4喷膜后将其放置在干燥房(20℃～45℃，湿度10％-30％)，时间为12-24h。
E.将样品垫2、标记垫3、包被膜4和吸水纸5顺次粘贴在底衬1上，即得。
当用本发明的试纸条来检测样本时，(1)如果试纸条上的两条检测线T1和T2分别形成一条颜色反应线，表明样本为恶性疟原虫和非恶性疟原虫混合感染；(2)如果试纸条上的检测线T1形成一条颜色反应线，T2无颜色反应线出现时，表明样本为恶性疟原虫阳性；(3)当检测区T2形成一条颜色反应线，T1无颜色反应线出现时，此时为非恶性疟原感染(间日疟、卵形疟或三日疟)阳性，表明样本中含有非恶性疟间日疟、卵形疟或三日疟特异性抗原(非恶性疟原虫特异性抗原)；(4)如检测区内没有条带出现，则是阴性结果，表明样本中不含有疟原虫抗原。无论样本中是否存在于疟原虫抗原，一条颜色条带都会出现在质控区C。当C线不出现颜色条带时，检测结果无效。
使用实施例1的试纸条操作简便，具有快速、简便、直观以及不需要特殊仪器的优点，敏感性(阳性相符率)和特异性(阴性符合率)分别为92.56％和98.57％，与镜检符合率为96.38％。
实施例2
该实施例中的检测试纸条结构均与实施例1相同。
在该实施例中，在该实施例中，所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体与彩色胶乳颗粒的比例为1∶15，所述非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体与彩色胶乳颗粒的比例为1∶15，彩色胶乳颗粒标记的恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的浓度均为10μg/ml，涂敷在标记垫上的稀释参数为28cm2/ml。所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体在所述检测区的包被浓度为1.7mg/ml；所述非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体在所述检测区的包被浓度为2.0mg/ml；所述抗鼠IgG单克隆抗体在所述控制区的包被浓度为2.0mg/ml。所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体在检测区的包被用量为0.15μl/mm；所述抗鼠IgG单克隆抗体在控制区的包被用量为0.20μl/mm。
该实施例的制备方法与使用方法均与实施例1相同。
使用实施例1的试纸条操作简便，具有快速、简便、直观以及不需要特殊仪器的优点，敏感性(阳性相符率)和特异性(阴性相符率)分别为90.36％和98.27％，与镜检符合率为96.26％。
实施例3
该实施例中的检测试纸条结构均与实施例1相同。
在该实施例中，在该实施例中，所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体与彩色胶乳颗粒的比例为1∶20，所述非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体与彩色胶乳颗粒的比例为1∶20，彩色胶乳颗粒标记的恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的浓度均为15μg/ml，涂敷在标记垫上的稀释参数为25cm2/ml。所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体在所述检测区的包被浓度和所述非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体在所述检测区的包被浓度均为2.0mg/ml；所述抗鼠IgG单克隆抗体在所述控制区的包被浓度为1.5mg/ml。所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体在检测区的包被用量为0.25μl/mm；所述抗鼠IgG单克隆抗体在控制区的包被用量为0.28μl/mm。
该实施例的制备方法与使用方法均与实施例1相同。
使用实施例1的试纸条操作简便，具有快速、简便、直观以及不需要特殊仪器的优点，敏感性(阳性相符率)和特异性(阴性相符率)分别为91.38％和97.45％，与镜检符合率为96.11％。
Claims (8)
1.一种疟疾免疫层析快速检测试纸条，所述试纸条由样品垫(2)、标记垫(3)、包被膜(4)、吸水纸(5)顺次搭接粘贴在底衬(1)上构成，其特征在于，所述标记垫(3)上涂覆有彩色胶乳颗粒标记的恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，所述包被膜(4)包括检测区(6)和控制区(7)，所述检测区(6)包被与标记垫(3)上的单克隆抗体处于不同表位的恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体，所述控制区(7)包被抗鼠IGg单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的疟疾免疫层析快速检测试纸条，其特征在于，所述标记垫上恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体与彩色胶乳颗粒的比例为1∶5～1∶30，所述非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体与彩色胶乳颗粒的比例为1∶5～1∶30。
3.根据权利要求1所述的疟疾免疫层析快速检测试纸条，其特征在于，所述彩色胶乳颗粒标记的恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的浓度均为5～15μg/ml，涂敷在标记垫上的稀释参数为20cm2/ml～30cm2/ml。
4.根据权利要求1所述的疟疾免疫层析快速检测试纸条，其特征在于，所述包被膜上恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和所述非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体在所述检测区的包被浓度均为1.5mg/ml～2.0mg/ml；所述抗鼠IgG单克隆抗体在所述控制区的包被浓度为1.0mg/ml～2.0mg/ml。
5.根据权利要求4所述的疟疾免疫层析快速检测试纸条，其特征在于，所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体在所述检测区的包被浓度为1.7mg/ml；所述非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体在所述检测区的包被浓度为2.0mg/ml；所述抗鼠IgG单克隆抗体在所述控制区的包被浓度为2.0mg/ml。
6.根据权利要求1所述的疟疾免疫层析快速检测试纸条，其特征在于，所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体在检测区的包被用量均为0.10μl/mm～0.25μl/mm；所述抗鼠IgG单克隆抗体在控制区的包被用量为0.10μl/mm～0.30μl/mm。
7.一种制备权利要求1所述的疟疾免疫层析快速检测试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.按常规方法纯化恶性疟原虫富组氨酸蛋白II和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的生产菌株；
B.筛选制备多株富组氨酸蛋白II和疟原虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体；按常规方法，经过筛选配对筛选合适的两株恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和两株非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体；所述两株恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和两株非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体均分别是相同抗原处于不同的表位单抗；
C.彩色胶乳标记单克隆抗体
采用彩色胶乳标记一株恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体；所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的浓度均为5～15μg/ml，按稀释参数为20cm2/ml～30cm2/ml，将所述恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体喷点标记垫(3)上，然后将标记垫(3)烘干，密封；
D.将另一株恶性疟原虫富组氨酸蛋白II单克隆抗体和非恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体均稀释至1.5mg/ml～2.0mg/ml，按0.10μl/mm～0.25μl/mm的包被用量分别包被至包被膜(4)的检测区的T1线和T2线；将抗鼠IgG单克隆抗体稀释至1.0mg/ml～2.0mg/ml，按0.10μl/mm～0.30μl/mm的包被用量包被至包被膜(4)的控制区；
E.将样品垫(2)、标记垫(3)、包被膜(4)和吸水纸(5)顺次粘贴在底衬(1)上，即得。
8.根据权利要求7所述的疟疾免疫层析快速检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述包被膜上T1线和T2线之间的间距为3mm-5mm。
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102590522A (zh) * | 2012-03-07 | 2012-07-18 | 上海凯创生物技术有限公司 | 疟原虫抗体胶体金检测试剂盒及其制备 |
| CN102692504A (zh) * | 2012-06-26 | 2012-09-26 | 南京基蛋生物科技有限公司 | D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条及其制备方法 |
| CN104450625A (zh) * | 2014-11-17 | 2015-03-25 | 深圳市菲鹏生物股份有限公司 | 可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用 |
| CN106290839A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒 |
| CN106324252A (zh) * | 2016-08-09 | 2017-01-11 | 广东合鑫生物科技有限公司 | 非抗体结合蛋白在制备疟疾检测试剂中的应用 |
| CN110146697A (zh) * | 2019-06-03 | 2019-08-20 | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 | 一种快速检测恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的免疫试纸条 |
| WO2020049444A1 (en) * | 2018-09-03 | 2020-03-12 | Module Innovations Private Limited | A device and a lateral flow assay method for differential identification of plasmodium species |
| CN112979801A (zh) * | 2019-12-16 | 2021-06-18 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 一种可特异性结合hrp-ii的结合蛋白及其制备方法和应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004132892A (ja) * | 2002-10-11 | 2004-04-30 | Japan Clinical Laboratories Inc | 免疫クロマト測定法及びキット |
| CN1580778A (zh) * | 2004-05-21 | 2005-02-16 | 王继华 | 彩色胶乳层析法诊断试纸条及其制备方法 |
| EP1674868A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-06-28 | Chang Gung University (a university of Taiwan) | Method and device for detection of mycobacterium tuberculosis antigens in biological fluids |
| JP2008014751A (ja) * | 2006-07-05 | 2008-01-24 | Denka Seiken Co Ltd | 着色ラテックス粒子を用いるメンブレンアッセイ法およびキット |
| CN101241136A (zh) * | 2007-11-30 | 2008-08-13 | 广州万孚生物技术有限公司 | 检测唾液中滥用毒品的多联免疫层析试纸条、系统及其制备方法 |
| CN101852799A (zh) * | 2010-05-19 | 2010-10-06 | 南京黎明生物制品有限公司 | 免疫层析法检测试剂及其制作方法 |
-
2010
- 2010-12-31 CN CN201010620089.3A patent/CN102087294B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004132892A (ja) * | 2002-10-11 | 2004-04-30 | Japan Clinical Laboratories Inc | 免疫クロマト測定法及びキット |
| CN1580778A (zh) * | 2004-05-21 | 2005-02-16 | 王继华 | 彩色胶乳层析法诊断试纸条及其制备方法 |
| EP1674868A1 (en) * | 2004-12-21 | 2006-06-28 | Chang Gung University (a university of Taiwan) | Method and device for detection of mycobacterium tuberculosis antigens in biological fluids |
| JP2008014751A (ja) * | 2006-07-05 | 2008-01-24 | Denka Seiken Co Ltd | 着色ラテックス粒子を用いるメンブレンアッセイ法およびキット |
| CN101241136A (zh) * | 2007-11-30 | 2008-08-13 | 广州万孚生物技术有限公司 | 检测唾液中滥用毒品的多联免疫层析试纸条、系统及其制备方法 |
| CN101852799A (zh) * | 2010-05-19 | 2010-10-06 | 南京黎明生物制品有限公司 | 免疫层析法检测试剂及其制作方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 范培昌等: "快速诊断疟疾的免疫层析试条的研制", 《分析科学学报》, vol. 16, no. 5, 31 October 2000 (2000-10-31) * |
| 邱少富等: "胶体金免疫层析技术在疟疾诊断中的应用", 《微生物学免疫学进展》, vol. 34, no. 2, 20 June 2006 (2006-06-20) * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102590522A (zh) * | 2012-03-07 | 2012-07-18 | 上海凯创生物技术有限公司 | 疟原虫抗体胶体金检测试剂盒及其制备 |
| CN102590522B (zh) * | 2012-03-07 | 2014-07-16 | 上海凯创生物技术有限公司 | 疟原虫抗体胶体金检测试剂盒及其制备 |
| CN102692504A (zh) * | 2012-06-26 | 2012-09-26 | 南京基蛋生物科技有限公司 | D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条及其制备方法 |
| CN104450625A (zh) * | 2014-11-17 | 2015-03-25 | 深圳市菲鹏生物股份有限公司 | 可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用 |
| CN104450625B (zh) * | 2014-11-17 | 2017-06-27 | 广东菲鹏生物有限公司 | 可分泌抗疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用 |
| CN106290839A (zh) * | 2015-05-13 | 2017-01-04 | 上海凯创生物技术有限公司 | 恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒 |
| CN106324252A (zh) * | 2016-08-09 | 2017-01-11 | 广东合鑫生物科技有限公司 | 非抗体结合蛋白在制备疟疾检测试剂中的应用 |
| WO2020049444A1 (en) * | 2018-09-03 | 2020-03-12 | Module Innovations Private Limited | A device and a lateral flow assay method for differential identification of plasmodium species |
| CN110146697A (zh) * | 2019-06-03 | 2019-08-20 | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 | 一种快速检测恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的免疫试纸条 |
| CN110146697B (zh) * | 2019-06-03 | 2022-02-11 | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 | 一种快速检测恶性疟、间日疟、三日疟和卵形疟的免疫试纸条 |
| CN112979801A (zh) * | 2019-12-16 | 2021-06-18 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 一种可特异性结合hrp-ii的结合蛋白及其制备方法和应用 |
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| Publication number | Publication date |
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Date of cancellation: 20220922 Granted publication date: 20140820 Pledgee: Guangzhou Kaide Finance Leasing Co.,Ltd. Pledgor: GUANGZHOU WONDFO BIOTECH Co.,Ltd. Registration number: Y2019990000035 |