WO2015188633A1 - 一种免疫层析检测方法及试纸 - Google Patents

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WO2015188633A1
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immunochromatographic
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陈岩松
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陈岩松
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow

Definitions

  • the present invention belongs to the field of in vitro diagnostic reagents, and particularly relates to an immunochromatographic detection method and a test strip and a test strip used.
  • Immunochromatography is a rapid diagnostic technique based on immunocolloidal gold technology that was developed in the 1990s.
  • the principle is to immobilize specific antibodies on the reaction membrane 2 first, and the sample pad 4 of the test paper is immersed for inspection. After the sample, due to capillary action, the sample to be tested will move forward along the membrane. When moving to the region where the antibody is immobilized, the corresponding antigen in the sample to be tested will specifically bind to the antibody, if immunogold is used. This area can be displayed in a certain color to achieve a specific immunodiagnosis.
  • Immunochromatography detection technology mainly represented by colloidal gold test paper has been widely used in various aspects of immunoassay, and the technique mainly fixes specific antibodies or antigens on the reaction membrane 2 in a strip shape.
  • the color development result of a test strip is analyzed, or multiple test strips are placed in different card slots for analysis. It has not been found that two or more single immunochromatographic test strips are fixed together without a gap.
  • the immunochromatographic detection method and test strip of the detection block 6 of the adjacent single immunochromatographic test strip are not at the same horizontal position of the reaction membrane 2.
  • the application No. CN200720005145 discloses a four-in-one combined detection plate for endocrine hormones, wherein the detection plate has four grooves corresponding to the test strips, and four test strips are fixed inside the plate body. . The method separates the test strips by the grooves to avoid color interference between the test strips.
  • the test paper is fixed by two or more single immunochromatographic test strips without gaps, which is equivalent to fixing a specific antibody or antigen to the reaction membrane 2 in a combination of two or more quadrilateral shapes;
  • the detection zone T adopts a quadrilateral shape pattern as the detection block 6, and the detection block 6 may be set to the same concentration or different concentration of the same antibody or antigen, or may be a plurality of antibodies or antigens of the same concentration or different concentrations.
  • Immunochromatographic techniques include, but are not limited to, double antibody sandwich methods, indirect methods, competitive inhibition methods.
  • the double antibody sandwich method which is a non-competitive binding assay, is suitable for detecting multivalent antigens having at least two antigenic determinants in a molecule.
  • the basic working principle is as follows: The antibody and the labeled antibody attached to the reaction membrane 2 are respectively combined with two antigenic determinants on the detected antigen molecule in the sample to be tested to form a labeled antibody-antigen-solid phase antibody immune complex.
  • the indirect method is a non-competitive binding assay.
  • the principle is that the antigen is solidified in the reaction membrane 2, and the antibody to be tested is first bound to the labeling molecule to form a complex, and then combined with the antigen on the reaction membrane 2 to form a labeling molecule - the antibody-antigen complex to be detected.
  • the basic principle is that the test antigen in the sample to be tested and the coated antigen of the solid phase compete for binding with the labeled antibody.
  • the labeled antibody is It does not bind to the solid phase coating antigen; if there is no antigen in the sample to be tested, the labeled antibody binds directly to the solid phase coating antigen.
  • the method for determining an immunochromatographic detection method includes a qualitative method of visually observing the color of the detection line 8 of the detection zone T, and a semi-quantitative method of visually observing the coloration of the plurality of detection lines 8 of the detection zone T with the naked eye.
  • the signal detection function of the instrument collects the characteristic signal of the detection line 8 on the test paper to perform a quantitative method.
  • Reactive film 2 coating determining the type of coated antibody or antigen based on the target to be detected in the sample to be examined
  • the test strip consists of a bottom plate 1, and a sample pad 4, a conjugate release pad 5, a reaction film 2, and an absorbent pad 3, which are sequentially disposed on the bottom plate 1;
  • (6) detecting the sample to be inspected adding a sample to be inspected in the test paper sample pad 4, and performing qualitative or semi-quantitative detection on the sample to be inspected by visually observing the color development of the plurality of detection blocks 6 and the control block 7 Or use the instrument with signal detection function to collect the characteristic signals of the detection block 6 and the quality control block 7 on the test paper for quantitative detection.
  • the object to be inspected in the sample to be inspected is determined according to the color development condition of the plurality of detection blocks 6, and then the coloration of the plurality of detection blocks 6 and the quality control block 7 is observed by the naked eye, and different objects to be inspected in the sample to be inspected are to be inspected.
  • Qualitative or semi-quantitative detection of the object, or the signal of the signal detection function is used to collect the characteristic signals of the detection block 6 and the quality control block 7 on the test paper for quantitative detection.
  • An immunochromatographic detection method for qualitative, semi-quantitative or quantitative detection of a sample to be inspected a test strip consisting of a bottom plate 1, and a sample pad 4, a conjugate release pad 5, which are sequentially disposed on the bottom plate 1
  • the reaction film 2 and the absorbent pad 3 are composed; the test paper is fixed by two or more single immunochromatographic test strips without gaps, which is equivalent to fixing the specific antibody or antigen in two or more quadrilateral shapes.
  • the reaction film 2 is divided into two regions, one is a detection zone T adjacent to the bond release pad 5, and the other is a quality control zone adjacent to the absorption pad 3 (:.
  • the detection zone is provided with 2 to 15 quadrilateral shape detecting blocks 6.
  • the detection block 6 can be set to the same concentration or different concentration of the same antibody or antigen, and the plurality of detection blocks 6 and the mass are observed by the naked eye.
  • the color of the control block 7 is qualitatively or semi-quantitatively detected, or the signal of the detection function is used to collect the characteristic signals of the detection block 6 and the quality control block 7 on the test strip for quantitative detection.
  • the detection block 6 is coated with different antibodies or antigens of the same concentration or different concentrations. First, the object to be inspected in the sample to be inspected is determined according to the color development of the plurality of detection blocks 6, and then the plurality of detection blocks are observed by the naked eye.
  • the quality control zone C is provided with 1 to 15 quadrilateral shape control blocks 7, and the control block 7 is coated with an antibody or antigen which can bind to the label on the conjugate release pad 5.
  • the conjugate release pad 5 is labeled with a specific antibody or antigen associated with a single target to be detected, or a plurality of specific antibodies or antigens associated with each target to be detected.
  • the immunochromatographic detection method includes but is not limited to quantum dot labeling method, colloidal gold label Notation, colloidal selenium labeling, colored or fluorescent latex labeling, magnetic particle labeling.
  • the sample to be tested is from clinical or non-clinical blood, body fluid, urine, saliva, genital tract secretion or other liquid sample or viscous sample.
  • the material of the bottom plate 1 includes, but is not limited to, a PVC (polyvinyl chloride) plate
  • the material of the reaction film 2 includes, but is not limited to, a nitrocellulose film and a cellulose acetate film
  • materials of the absorbent pad 3 include, but are not limited to, filter paper, samples.
  • Pad 4 materials include, but are not limited to, glass fibers and nonwovens
  • conjugate release pads 5 include, but are not limited to, glass fibers or nonwovens.
  • An immunochromatographic assay method and test strip comprising the immunochromatographic method and test strip according to any one of claims 1 to 10.
  • the present invention is an immunochromatographic detection method and a test paper.
  • the test paper is fixed by two or more single immunochromatographic test strips without gaps, which is equivalent to two or more specific antibodies or antigens.
  • a plurality of quadrilateral shapes are fixed on the reaction film 2; the detection zone T is equivalent to 2 to 15 quadrilateral shape detecting blocks 6, and the coloration of the plurality of detection blocks 6 and the quality control block 7 is observed by the naked eye or the signal is used.
  • the detection function of the instrument collects the characteristic signals of the detection block 6 and the quality control block 7 on the test paper, and can realize qualitative, semi-quantitative or quantitative detection of the sample to be inspected.
  • the operation is simple and rapid, and is widely used in the field of in vitro diagnostic reagents.
  • An immunochromatographic detection method of the present invention differs from the existing methods in that:
  • the existing immunochromatographic detection method can only be analyzed by the color development result of one test strip, or multiple test strips are placed in different card slots for analysis, and no two or more individual ones have been found.
  • the immunochromatographic test strips are fixed together without an interval, and the detection block 6 of the adjacent single immunochromatographic test strip is not in the same horizontal position of the reaction membrane 2 as the immunochromatographic detection method and the test paper.
  • An immunochromatographic detection method and test paper of the present invention the test paper is fixed by two or more single immunochromatographic test strips without gaps, and the detection of adjacent single immunochromatographic test strips Block 6 is not in the same horizontal position of the reaction film 2.
  • the detection zone T is provided with 2 to 15 quadrilateral shape detecting blocks 6, and the detection block 6 can be set to the same concentration or different concentrations of the same antibody or antigen.
  • the detection block 6 can also be set to a plurality of antibodies or antigens.
  • An immunochromatographic detection method of the present invention visually observing the color development of a plurality of detection blocks 6 and control blocks 7 by naked eyes
  • Qualitative or semi-quantitative detection of the sample to be inspected, or the characteristic signal of the detection block 6 and the quality control block 7 on the test paper is collected by an instrument having a signal detection function for quantitative detection.
  • the object to be inspected in the sample to be inspected is determined according to the color development condition of the plurality of detection blocks 6, and then the coloration of the plurality of detection blocks 6 and the quality control block 7 is observed by the naked eye, and different objects to be inspected in the sample to be inspected are to be inspected.
  • Qualitative or semi-quantitative detection is performed, or the characteristic signals of the detection block 6 and the quality control block 7 on the test paper are collected by an instrument having a signal detection function for quantitative detection.
  • the present invention provides a detection block 6 which is fixed by two or more single immunochromatographic test strips without gaps and adjacent single immunochromatographic test strips.
  • the immunochromatographic detection method and test paper which are not at the same horizontal position of the reaction membrane 2, the present invention provides more different detection blocks 6 and better recognized graphic information.
  • FIG. 1 is a schematic view of an immunochromatographic detection method and a test paper of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic view of a conventional immunochromatographic detection method and test paper.
  • Figure 3 is a schematic diagram of a human chorionic gonadotropin test strip (colloidal gold immunochromatography).
  • FIG. 4 is a schematic diagram of a combined test strip of urine microalbumin, urine 2 microglobulin, and cystatin C (colloidal gold immunochromatography).
  • Reactive film 2 coating determining the type of coated antibody or antigen based on the target to be detected in the sample to be examined
  • the test strip is composed of a bottom plate 1, and a sample pad 4, a conjugate release pad 5, a reaction film 2, and an absorbent pad 3 which are sequentially disposed on the bottom plate 1;
  • test strips are fixed together by two or more single immunochromatographic test strips without spacing, which is equivalent to two or more quadrilateral specific antibodies or antigens. Group And fixed to the reaction film 2;
  • (6) detecting the sample to be inspected adding a sample to be inspected in the test paper sample pad 4, and performing qualitative or semi-quantitative detection on the sample to be inspected by visually observing the color development of the plurality of detection blocks 6 and the control block 7 Or use the instrument with signal detection function to collect the characteristic signals of the detection block 6 and the quality control block 7 on the test paper for quantitative detection.
  • the object to be inspected in the sample to be inspected is determined according to the color development condition of the plurality of detection blocks 6, and then the coloration of the plurality of detection blocks 6 and the quality control block 7 is observed by the naked eye, and different objects to be inspected in the sample to be inspected are to be inspected.
  • Qualitative or semi-quantitative detection of the object, or the signal of the signal detection function is used to collect the characteristic signals of the detection block 6 and the quality control block 7 on the test paper for quantitative detection.
  • the reaction film 2 is divided into two regions, one is a detection zone T adjacent to the bond release pad 5, and the other is a quality control zone adjacent to the absorption pad 3
  • test strip is fixed together by two or more single immunochromatographic test strips without gaps, and the detection block 6 of the adjacent single immunochromatographic test strip is not at the same horizontal position of the reaction membrane 2.
  • the detection zone is provided with 2 to 15 quadrilateral shape detecting blocks 6.
  • the detection block 6 can be set to the same concentration or different concentration of the same antibody or antigen, and the plurality of detection blocks 6 and the mass are observed by the naked eye.
  • the color of the control block 7 is qualitatively or semi-quantitatively detected, or the signal of the detection function is used to collect the characteristic signals of the detection block 6 and the quality control block 7 on the test strip for quantitative detection.
  • the detection block 6 is coated with different antibodies or antigens of the same concentration or different concentrations. First, the object to be inspected in the sample to be inspected is determined according to the color development of the plurality of detection blocks 6, and then the plurality of detection blocks are observed by the naked eye.
  • the quality control zone C is provided with 1 to 15 quadrangular shape control blocks 7, and the control block 7 is coated with an antibody or antigen which can bind to the label on the conjugate release pad 5.
  • the conjugate release pad 5 is labeled with a specific antibody or antigen associated with a single target to be detected, or a plurality of specific antibodies or antigens associated with each target to be detected.
  • the labeling reagent is generally used as a carrier for immobilizing an antibody or an antigen in immunochromatographic assay.
  • colloidal gold particles, colloidal selenium particles, colored or fluorescent latex particles and magnetic particles, colloidal gold particles are particularly preferred.
  • the support layer of the bottom plate 1 is a non-absorbent material, and the support material is prevented from absorbing the sample to be inspected. Affects the movement in the horizontal direction.
  • the material of the bottom plate 1 includes PVC (polyvinyl chloride) sheets and other plastic materials, preferably PVC (polyvinyl chloride) sheets.
  • the material of the reaction film 2 includes, but is not limited to, a nitrocellulose membrane, a cellulose acetate membrane.
  • a nitrocellulose membrane is preferred.
  • the absorbent pad 3 refers to a liquid absorbing portion that absorbs a sample to be inspected through the reaction film 2 to control diffusion of the sample.
  • the material of the absorbent pad 3 may be, but not limited to, a filter paper.
  • the absorbent pad 3 may be used in one layer or in multiple layers.
  • the sample pad 4 is a portion that receives the sample to be inspected, and contains any material and form as long as the liquid and the object to be inspected are allowed to pass.
  • Specific materials suitable for the sample pad 4 include, but are not limited to, glass fibers, acrylic fibers, hydrophilic polyethylene materials, dried paper, nonwoven fabrics, and fiber fabrics. Glass fibers and nonwoven fabrics are preferably used.
  • the sample pad 4 can be used in one layer or in multiple layers.
  • materials suitable for the conjugate release pad 5 include, but are not limited to, paper, cellulose mixture, nitrocellulose, polyester fiber, acrylonitrile copolymer, glass fiber, and nonwoven fabric.
  • a nonwoven fabric is used.
  • a plastic card in addition to an immunochromatographic test strip, a plastic card is included, and the test strip can be installed in a plastic card.
  • the plastic card conforms to the size of the test paper, the manner and location of the sample addition, and the position at which the antibody or antigen is cured on the reaction membrane 2.
  • Bioactive raw materials ot-HCG monoclonal antibodies, ⁇ -HCG monoclonal antibodies, and IgG polyclonal antibodies were all commercially available.
  • Bovine serum albumin is commercially available.
  • Nitrocellulose membranes are commercially available.
  • test paper preparation procedure is as follows:
  • Step 1 Coating of the reaction film 2
  • the coated antibody species is determined according to the target to be detected in the sample to be tested: ot-HCG monoclonal antibody, IgG polyclonal antibody.
  • the concentration and the number of the detection block 10 and the quality control block 11 are set according to the object to be inspected in the sample to be inspected:
  • the centrifuged concentrate was diluted and spread on a 90 cm x 30 cm nonwoven fabric, the amount of liquid added was 10-11 ml/sheet, dried for 24 hours, temperature was 37 ° C, and humidity was ⁇ 40 ⁇ 3 ⁇ 4 RH.
  • the glass fiber and the non-woven fabric which are cut into 83.5 cm ⁇ 30 cm are used to contain 0.5 ⁇ 3 ⁇ 4 NaCl (potassium chloride), 0.5% sucrose, 0.1% BSA (bovine serum albumin) and Tris-HCl buffer (trimethylol). Aminomethane-hydrochloric acid (p H7.4) working solution was soaked. The pad was dried at 37 ° C for 24 h to obtain a sample pad 4.
  • NaCl sodium chloride
  • sucrose 0.1%
  • BSA bovine serum albumin
  • Tris-HCl buffer trimethylol
  • Step 4 Assembling the individual immunochromatographic test strips of the four concentration detection blocks 10 as follows
  • the bottom plate 1 is placed flat on the operation table, and double-sided tape is attached.
  • the coated reaction film 2 is attached to the substrate 1.
  • the absorbent pad 3 was pressed 2 mm of the reaction film 2, and the other end was aligned with the bottom plate 1.
  • a layer of the nonwoven fabric pressure reaction film 2 was attached to 2 mm.
  • the conjugate release pad 5 is pressed against the nonwoven fabric.
  • the glass fibers are pressed against the conjugate release pad 5 at a half position, and the other end is aligned with the bottom plate 1.
  • One end of a nonwoven fabric is aligned with the upper end of the bond release pad 5, and the other end is aligned with the bottom plate 1.
  • Step 5 Assembling the test paper: The five test blocks 10 were coated with four concentrations of individual immunochromatographic test strips and fixed into a test strip according to FIG.
  • Step 6 Product Detection: Take the urine droplets of the sample to be inspected containing HCG and add it to the test paper sample pad 4, and judge the result after 5 minutes.
  • the preparation example 2 of the immunochromatographic test strip of the present invention prepares and detects three combined test strips of urine microalbumin, urine 2 microglobulin and cystatin C (colloidal gold immunochromatography).
  • Bioactive raw materials human albumin monoclonal antibody, mouse anti-human albumin monoclonal antibody, Cys-C (cytosine C) monoclonal antibody, mouse anti-human Cys-C (cytosine C) antibody, 2 microglobulin monoclonal antibodies, murine anti-human 2 microglobulin antibodies, and IgG polyclonal antibodies were purchased from the market.
  • Bovine serum albumin is commercially available.
  • the nitrocellulose membrane is commercially available.
  • test paper preparation procedure is as follows:
  • C cytosine C
  • 2 microglobulin monoclonal antibody 2 microglobulin monoclonal antibody
  • IgG polyclonal antibody 2 microglobulin monoclonal antibody
  • the concentration and the number of the detection block 12 and the quality control block 13 are set according to the object to be inspected in the sample to be inspected:
  • each block is a detection antibody; quality control block 13 set 3, 1 concentration.
  • the G polyclonal antibody was coated on a nitrocellulose membrane according to the position of Figure 4, dried for 24 h, at a temperature of 37 ° C, and at a humidity of ⁇ 40 ⁇ 3 ⁇ 4 RH.
  • coated urine ⁇ 2 microglobulin reaction membrane 1.5 mg / m 2
  • microglobulin monoclonal antibody l.Omg/ml of the IgG polyclonal antibody was coated on a nitrocellulose membrane according to the position of Figure 4, dried for 24 hours, at a temperature of 37 ° C, and at a humidity of ⁇ 40% RH.
  • Coated cystatin C reaction membrane 1.4 mg/ml of Cys-C (cystatin C) monoclonal antibody, 1.0 mg/ml of IgG polyclonal antibody was coated according to the position of FIG. On a nitrocellulose membrane, dried for 24 h at 37 °C
  • a .8% ratio is added to the BSA (bovine serum albumin) stabilizer.
  • the centrifuged concentrate was diluted and spread on a 90 cm x 30 cm nonwoven fabric, the amount of liquid added was 10-11 ml/sheet, dried for 24 hours, temperature was 37 ° C, and humidity was ⁇ 40 ⁇ 3 ⁇ 4 RH.
  • the microglobulin antibody was prepared as a marker and placed at room temperature for 5 min, and a BSA (bovine serum albumin) stabilizer was added in a ratio of 0.8%.
  • BSA bovine serum albumin
  • the centrifuged concentrate is diluted according to the specified concentration, and spread on a 90 cm x 30 cm nonwoven fabric, and the amount of liquid added is 10
  • the centrifuged concentrate is diluted to a predetermined concentration, and spread on a 90 cm x 30 cm nonwoven fabric, and the amount of liquid added is 10
  • the glass fiber and the nonwoven fabric which are cut into 83.5 cm ⁇ 30 cm are composed of 0.5 ⁇ 3 ⁇ 4 NaCl (potassium chloride), 0.5% sucrose, 0.1% BSA (bovine serum albumin) and Tris-.
  • HC1 buffer trishydroxymethylaminomethane-hydrochloric acid (pH 7.4)
  • Step 4 Assembling a single immunochromatographic test strip
  • the bottom plate 1 is placed on the operation table, and double-sided tape is attached.
  • a coated urine microalbumin reaction film was attached to the bottom plate 1.
  • a layer of non-woven fabric urinary microalbumin reaction membrane was attached to 2 mm.
  • the urinary microalbumin conjugate release pad was pressed against the nonwoven fabric.
  • One end of a layer of non-woven fabric is aligned with the upper end of the urinary microalbumin conjugate release pad, and the other end is aligned with the bottom plate 1.
  • the bottom plate 1 is placed on the operation table, and double-sided tape is attached.
  • a coated urinary ⁇ 2 microglobulin reaction membrane was attached to the bottom plate 1.
  • a layer of non-woven fabric urinary ⁇ 2 microglobulin reaction membrane was attached to 2 mm.
  • the urinary ⁇ 2 microglobulin conjugate release pad was pressed onto the nonwoven fabric. [0125] The glass fibers were pressed to a half position of the urine ⁇ 2 microglobulin conjugate release pad, and the other end was aligned with the bottom plate 1.
  • One end of a layer of nonwoven fabric is aligned with the upper end of the urine ⁇ 2 microglobulin conjugate release pad, and the other end is aligned with the bottom plate 1 .
  • the bottom plate 1 is placed on the operation table, and double-sided tape is attached.
  • a coating of a good cystatin C reaction film was attached to the substrate 1.
  • a layer of non-woven fabric was pressed against 2 mm of the cysteine C reaction film.
  • the glass fiber was pressed to the half position of the cystin C conjugate release pad, and the other end was aligned with the bottom plate 1.
  • One end of the nonwoven fabric is aligned with the upper end of the cystin C conjugate release pad, and the other end is aligned with the bottom plate 1.
  • Step 5 Assembling the test paper: 1 sample and 2 blank test strips of urine microalbumin test strip, urine 2 microglobulin test strip, cystatin C test strip 4 The gapless combination is fixed into one test paper.
  • Step 6 Product detection: Take the urine sample pad 4 of the sample to be inspected, 8 min ⁇ , the interpretation result, color development, indicating that the urine microalbumin in the urine of the sample to be tested is positive; ⁇ 2 coloration, indicating that Check urine in urine

Abstract

一种免疫层析检测方法及试纸，试纸是由二条或多条单个免疫层析检测试纸条无间隔组合固定在一起，相当于将特异性抗体或抗原以二个或多个四边形状组合固定于反应膜上，结合物释放垫上吸附有标记的特异性抗体或抗原，当待检样本滴加到样本垫上后，待检样本在毛细管作用下向前移动，溶解结合物释放垫上的标记物后相互反应，形成结合物，再移动至检测区T和质控区C时，结合物与检测块和质控块上的抗体或抗原发生结合而被截留，聚集在检测块和质控块上。通过肉眼观察或仪器扫描检测块和质控块上不同的显色结果，可实现对待检样本的定性、半定量或定量检测。操作简单、决速，广泛应用于体外诊断试剂领域。

Description

说明书 发明名称：一种免疫层析检测方法及试纸 技术领域
[0001] 本发明属于体外诊断试剂领域， 具体涉及一种免疫层析检测方法以及所使用的 试纸和试纸盒。
背景技术
[0002] 免疫层析法是九十年代兴起的一种基于免疫胶体金技术的快速诊断技术， 其原 理是将特异性的抗体先固定于反应膜 2上， 当试纸的样本垫 4浸入待检样本后， 由于毛细管作用， 待检样本将沿着该膜向前移动， 当移动至固定有抗体的区域 吋， 待检样本中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合， 若用免疫胶体金可使 该区域显示一定的颜色， 从而实现特异性的免疫诊断。
[0003] 以胶体金试纸为主要代表的免疫层析检测技术现已广泛用于免疫检测的各个方 面， 该技术主要是将特异性的抗体或抗原以条带状固定在反应膜 2上， 通过一条 试纸条的显色结果进行分析， 或者将多条试纸条置于不同的卡槽内进行分析， 尚未发现由二条或多条单个免疫层析检测试纸条无间隔组合固定在一起， 相邻 的单个免疫层析检测试纸条的检测块 6不在反应膜 2的同一水平位置的免疫层析 检测方法及试纸。
[0004] 申请号为 CN200720005145的专利公幵了一种内分泌激素四合一联合检测板， 该检测板板身内部设有 4个与检测试纸对应的凹槽， 检测试纸 4条固定于板身内 部。 该方法通过凹槽隔幵不同的检测试纸， 避免试纸之间的显色干扰。
[0005] 目前， 试纸由二条或多条单个免疫层析检测试纸条无间隔组合固定在一起， 相 当于将特异性抗体或抗原以二个或多个四边形状组合固定于反应膜 2上； 检测区 T采用四边形状图形作为检测块 6， 且检测块 6的设定可以是同浓度或者不同浓度 的同一种抗体或抗原， 也可以是同浓度或者不同浓度的多种抗体或抗原。 通过 肉眼观察多个检测块 6和质控块 7的显色情况进行定性、 半定量检测或采用具有 信号检测功能的仪器采集试纸上检测块 6和质控块 7的特征信号进行定量检测的 免疫层析检测方法及试纸从未有报道过。 [0006] 免疫层析技术包括但不限于双抗体夹心法、 间接法、 竞争抑制法。
[0007] 双抗体夹心法， 属于非竞争结合测定， 适用于检测分子中具有至少两个抗原决 定簇的多价抗原。 其基本工作原理是： 利用连接于反应膜 2上的抗体和标记抗体 分别与待检样本中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合， 形成标记抗体-抗原- 固相抗体免疫复合物。
[0008] 间接法， 测定抗体最常用的方法， 属非竞争结合测定。 其原理是将抗原固化于 反应膜 2， 待检样本中待测抗体首先与标记分子结合， 形成复合物， 再与反应膜 2上的抗原结合， 形成标记分子 -待检抗体-抗原复合物。
[0009] 竞争法可用于抗原和抗体测定。 以测定抗原为例， 其基本原理是待检样本中的 受检抗原和固相的包被抗原竞争与标记抗体结合， 当待检样本中的受检抗原的 量大于试剂的阈值， 标记抗体则不会与固相的包被抗原结合； 若待检样本中无 受检抗原， 标记抗体直接与固相的包被抗原结合。
[0010] 免疫层析检测方法的测定方法包括用肉眼观察确定检测区 T的检测线 8颜色的定 性方法、 用肉眼观察检测区 T的多个检测线 8显色情况的半定量方法和采用具有 信号检测功能的仪器采集试纸上检测线 8的特征信号进行定量方法。
技术问题
[0011] 本发明的目的在于， 针对现有技术， 提供一种免疫层析检测方法及试纸， 可实 现对待检样本的定性、 半定量或定量检测。
问题的解决方案
技术解决方案
[0012] 一种免疫层析检测方法， 采用如下步骤：
[0013] (1) 反应膜 2包被： 根据待检样本中的待检目标物确定包被抗体或抗原的种类
， 设定检测块 6及质控块 7的浓度和数量；
[0014] (2) 根据待检样本中的待检目标物制备结合物释放垫 5;
[0015] (3) 样本垫 4制备；
[0016] (4) 组装单个免疫层析检测试纸条： 试纸条由底板 1， 及依次设置在底板 1上 的样本垫 4、 结合物释放垫 5、 反应膜 2、 吸收垫 3构成；
[0017] (5) 组装免疫层析检测试纸： 试纸是由二条或多条单个免疫层析检测试纸条 无间隔组合固定在一起， 相当于将特异性抗体或抗原以二个或多个四边形状组 合固定于反应膜 2上；
[0018] (6) 对待检样本进行检测： 在试纸样本垫 4中加入待检样本， 通过肉眼观察多 个检测块 6和质控块 7的显色情况对待检样本进行定性或者半定量检测， 或采用 具有信号检测功能的仪器采集试纸上检测块 6和质控块 7的特征信号进行定量检 测。 或者首先根据多个检测块 6的显色情况确定待检样本中的待检目标物， 再通 过肉眼观察多个检测块 6和质控块 7的显色情况对待检样本中不同的待检目标物 进行定性或者半定量检测， 或采用具有信号检测功能的仪器采集试纸上检测块 6 和质控块 7的特征信号进行定量检测。
[0019] 一种免疫层析检测方法， 用于实现对待检样本的定性、 半定量或定量检测： 试 纸条由底板 1， 及依次设置在底板 1上的样本垫 4、 结合物释放垫 5、 反应膜 2、 吸 收垫 3构成； 试纸是由二条或多条单个免疫层析检测试纸条无间隔组合固定在一 起， 相当于将特异性抗体或抗原以二个或多个四边形状组合固定于反应膜 2上。
[0020] 所述反应膜 2分成两个区域， 一个是与结合物释放垫 5相邻接的检测区 T， 一个 是与吸收垫 3相邻接的质控区 (：。
[0021] 所述检测区 Τ设有 2至 15个四边形状检测块 6， 检测块 6的设定可以是同浓度或者 不同浓度的同一种抗体或抗原， 通过肉眼观察多个检测块 6和质控块 7的显色情 况对待检样本进行定性或者半定量检测， 或采用具有信号检测功能的仪器采集 试纸上检测块 6和质控块 7的特征信号进行定量检测。 或者是检测块 6包被有同浓 度或者不同浓度的不同的抗体或抗原， 首先根据多个检测块 6的显色情况确定待 检样本中的待检目标物， 再通过肉眼观察多个检测块 6和质控块 7的显色情况对 待检样本中不同的待检目标物进行定性或者半定量检测， 或采用具有信号检测 功能的仪器采集试纸上检测块 6和质控块 7的特征信号进行定量检测。
[0022] 所述质控区 C设有 1至 15个四边形状质控块 7， 质控块 7包被有可与结合物释放垫 5上标记物结合的抗体或抗原。
[0023] 所述结合物释放垫 5上标记有单一待检目标物相关的特异性抗体或抗原， 或标 记有各待检目标物相关的多个特异性抗体或抗原。
[0024] 所述的免疫层析检测方法， 其标记方法包括但不限于量子点标记法、 胶体金标 记法、 胶体硒标记法、 有色或荧光乳胶标记法、 磁性颗粒标记法。
[0025] 所述的待检样本， 是来自临床或非临床的血液、 体液、 尿液、 唾液、 生殖道分 泌液或其他液态样品或粘稠状样品。
[0026] 所述底板 1材料包括但不限于 PVC(聚氯乙烯)板， 反应膜 2材料包括但不限于硝 酸纤维素膜和醋酸纤维素膜， 吸收垫 3的材料包括但不限于滤纸， 样本垫 4材料 包括但不限于玻璃纤维和无纺布， 结合物释放垫 5包括但不限于玻璃纤维或无纺 布。
[0027] 一种免疫层析检测方法及试纸， 包括权利要求 1-10任一项的免疫层析方法及试 纸。
发明的有益效果
有益效果
[0028] 本发明是一种免疫层析检测方法及试纸， 试纸是由二条或多条单个免疫层析检 测试纸条无间隔组合固定在一起， 相当于将特异性抗体或抗原以二个或多个四 边形状组合固定于反应膜 2上； 检测区 T相当于设有 2至 15个四边形状检测块 6， 通过肉眼观察多个检测块 6和质控块 7的显色情况或采用具有信号检测功能的仪 器采集试纸上检测块 6和质控块 7的特征信号， 可实现对待检样本的定性、 半定 量或定量检测。 操作简单、 快速， 广泛应用于体外诊断试剂领域。
[0029] 本发明的一种免疫层析检测方法不同于现有的方法之处在于：
[0030] 现有的免疫层析检测方法只能通过一条试纸条的显色结果进行分析， 或者将多 条试纸条置于不同的卡槽内进行分析， 尚未发现由二条或多条单个免疫层析检 测试纸条无间隔组合固定在一起， 相邻的单个免疫层析检测试纸条的检测块 6不 在反应膜 2的同一水平位置的免疫层析检测方法及试纸。
[0031] 本发明的一种免疫层析检测方法及试纸， 试纸由二条或多条单个免疫层析检测 试纸条无间隔组合固定在一起， 相邻的单个免疫层析检测试纸条的检测块 6不在 反应膜 2的同一水平位置。 检测区 T设有 2至 15个四边形状检测块 6， 检测块 6的设 定可以是相同浓度， 亦可为不同浓度的同一种抗体或抗原。 检测块 6还可以设定 为多种抗体或抗原。
[0032] 本发明的一种免疫层析检测方法， 通过肉眼观察多个检测块 6和质控块 7的显色 情况对待检样本进行定性或者半定量检测， 或采用具有信号检测功能的仪器采 集试纸上检测块 6和质控块 7的特征信号进行定量检测。 或者首先根据多个检测 块 6的显色情况确定待检样本中的待检目标物， 再通过肉眼观察多个检测块 6和 质控块 7的显色情况对待检样本中不同的待检目标物进行定性或者半定量检测， 或采用具有信号检测功能的仪器采集试纸上检测块 6和质控块 7的特征信号进行 定量检测。
[0033] 相比较现有的试纸本发明提供了一种由二条或多条单个免疫层析检测试纸条无 间隔组合固定在一起， 相邻的单个免疫层析检测试纸条的检测块 6不在反应膜 2 的同一水平位置的免疫层析检测方法及试纸， 本发明提供了更多的不同的检测 块 6和更好识别的图形信息。
对附图的简要说明
附图说明
[0034] 附图 1是本发明的一种免疫层析检测方法及试纸的示意图。
[0035] 附图 2是现有的免疫层析检测方法及试纸的示意图。
[0036] 附图 3人绒毛膜促性腺激素检测试纸 （胶体金免疫层析法） 示意图。
[0037] 附图 4尿微量白蛋白、 尿 2微球蛋白、 抑胱素 C三项联合检测试纸 （胶体金免疫 层析法） 示意图。
实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0038] 实施步骤：
[0039] ( 1) 反应膜 2包被： 根据待检样本中的待检目标物确定包被抗体或抗原的种类
， 设定检测块 6及质控块 7的浓度和数量；
[0040] (2) 根据待检样本中的待检目标物制备结合物释放垫 5 ;
[0041] (3) 样本垫 4制备；
[0042] (4) 组装单个免疫层析检测试纸条： 试纸条由底板 1， 及依次设置在底板 1上 的样本垫 4、 结合物释放垫 5、 反应膜 2、 吸收垫 3构成；
[0043] (5) 组装免疫层析检测试纸： 试纸是由二条或多条单个免疫层析检测试纸条 无间隔组合固定在一起， 相当于将特异性抗体或抗原以二个或多个四边形状组 合固定于反应膜 2上；
[0044] (6) 对待检样本进行检测： 在试纸样本垫 4中加入待检样本， 通过肉眼观察多 个检测块 6和质控块 7的显色情况对待检样本进行定性或者半定量检测， 或采用 具有信号检测功能的仪器采集试纸上检测块 6和质控块 7的特征信号进行定量检 测。 或者首先根据多个检测块 6的显色情况确定待检样本中的待检目标物， 再通 过肉眼观察多个检测块 6和质控块 7的显色情况对待检样本中不同的待检目标物 进行定性或者半定量检测， 或采用具有信号检测功能的仪器采集试纸上检测块 6 和质控块 7的特征信号进行定量检测。
[0045] 反应膜 2分成两个区域， 一个是与结合物释放垫 5相邻接的检测区 T， 一个是与 吸收垫 3相邻接的质控区^
[0046] 试纸由二条或多条单个免疫层析检测试纸条无间隔组合固定在一起， 相邻的单 个免疫层析检测试纸条的检测块 6不在反应膜 2的同一水平位置。
[0047] 所述检测区 Τ设有 2至 15个四边形状检测块 6， 检测块 6的设定可以是同浓度或者 不同浓度的同一种抗体或抗原， 通过肉眼观察多个检测块 6和质控块 7的显色情 况对待检样本进行定性或者半定量检测， 或采用具有信号检测功能的仪器采集 试纸上检测块 6和质控块 7的特征信号进行定量检测。 或者是检测块 6包被有同浓 度或者不同浓度的不同的抗体或抗原， 首先根据多个检测块 6的显色情况确定待 检样本中的待检目标物， 再通过肉眼观察多个检测块 6和质控块 7的显色情况对 待检样本中不同的待检目标物进行定性或者半定量检测， 或采用具有信号检测 功能的仪器采集试纸上检测块 6和质控块 7的特征信号进行定量检测。
[0048] 所述质控区 C设有 1至 15个四边形状质控块 7， 质控块 7包被有可与结合物释放垫 5上标记物结合的抗体或抗原。
[0049] 所述结合物释放垫 5上标记有单一待检目标物相关的特异性抗体或抗原， 或标 记有各待检目标物相关的多个特异性抗体或抗原。
[0050] 在本发明中， 标记试剂通常是在免疫层析检测中可用作固定抗体或抗原的载体 。 例如， 胶体金颗粒， 胶体硒颗粒， 有色或荧光乳胶颗粒和磁性颗粒， 特别优 选胶体金颗粒。
[0051] 在本发明中， 底板 1支撑层为不吸水的材料， 避免支撑材料吸收待检样本从而 影响水平方向的移动。 底板 1的材料包括 PVC (聚氯乙烯)板及其他塑料材料， 优 选 PVC(聚氯乙烯)板。
[0052] 在本发明中， 反应膜 2的材料包括但不限于硝酸纤维素膜、 醋酸纤维素膜。 优 选硝酸纤维素膜。
[0053] 在本发明中， 吸收垫 3指吸收通过反应膜 2的待检样本以控制样品扩散的液体吸 收部分。 吸收垫 3的材料可以是但不限于滤纸。 吸收垫 3可以使用一层也可以使 用多层。
[0054] 在本发明中， 样本垫 4是接收待检样本的部分， 包含任何材料和形式， 只要能 让液体和待检目标物通过。 适合于样本垫 4的材料的具体包括但不限于： 玻璃纤 维、 丙烯酸纤维、 亲水聚乙烯材料、 干燥的纸、 无纺布和纤维织物。 优选使用 玻璃纤维和无纺布。 样本垫 4可以使用一层也可以使用多层。
[0055] 在本发明中， 适合于结合物释放垫 5的材料包括但不限于纸、 纤维素混合物、 硝酸纤维素、 聚酯纤维、 丙烯腈共聚物、 玻璃纤维、 和无纺布。 优选使用无纺 布。
[0056] 在本发明中， 除了一种免疫层析法检测试纸， 还包括塑料卡， 可以将试纸安装 在塑料卡之内使用。 所述的塑料卡与试纸的尺寸、 样本加入的方式和位置、 抗 体或抗原在反应膜 2上固化的位置相吻合。
本发明的实施方式
[0057] 实施例 1
[0058] 本发明的免疫层析检测试纸的制备实施例 1， 制备及检测人绒毛膜促性腺激素
(HCG) 检测试纸 （胶体金免疫层析法） 。
[0059] 生物活性原料： ot-HCG单克隆抗体、 β-HCG单克隆抗体、 IgG多克隆抗体均来 自市场购买。
[0060] 试剂： 牛血清白蛋白来自市场购买。
[0061] 硝酸纤维素膜来自市场购买。
[0062] 试纸制备程序如下：
[0063] 步骤 1.反应膜 2包被 [0064] 根据待检样本中的待检目标物确定包被抗体种类： ot-HCG单克隆抗体、 IgG多 克隆抗体。
[0065] 根据待检样本中的待检目标物设定检测块 10及质控块 11的浓度和数量： 检测块
10设置 6个， 4个不同浓度； 质控块 11设置 5个， 1个浓度。
[0066] 制备检测块 10包被有不同浓度的单个免疫层析检测试纸条反应膜 2: 将 15.42mg
/ml的 ot-HCG单克隆抗体、 8.02mg/ml的 IgG多克隆抗体根据设置的浓度稀释后， 按照附图 3的位置分别包被于硝酸纤维素膜上， 干燥 24h， 温度为 37°C， 湿度≤40
<¾RH。
[0067] 步骤 2.结合物释放垫 5制备
[0068] 取 40nm的胶体金溶液， 按 1.2%比例加入 0.2M的 K 2CO 3 (碳酸钾） 调节 PH值， 按 15 g/ml比例加入 β-HCG单克隆抗体， 制成标记物， 放置室温 5min， 按 0.8%比 例加入 BSA (牛血清白蛋白） 稳定剂。
[0069] 4500r离心 30min， 取浓缩沉淀物； 将上清液继续 6500r离心 45min， 取浓缩沉淀 物； 将上清液继续 9000r离心 60min， 取浓缩沉淀物； 将三次离心浓缩沉淀物混合 均匀。
[0070] 将离心好的浓缩液稀释好， 铺于 90cmx30cm的无纺布上， 加液量 10- 11ml/张， 干燥 24h， 温度 37°C， 湿度≤40<¾RH。
[0071] 步骤 3.样本垫 4的制备
[0072] 将切割成 83.5cmx30cm的玻璃纤维和无纺布用包含 0.5<¾NaCl (氯化钾） 、 0.5% 蔗糖、 0.1%BSA (牛血清白蛋白） 和 Tris-HCl缓冲液 (三羟甲基氨基甲烷 -盐酸 )(p H7.4)工作液浸泡。 在 37°C将所述垫干燥 24h， 获得样本垫 4。
[0073] 步骤 4.按以下步骤分别组装 4个浓度检测块 10的单个免疫层析检测试纸条
[0074] 将底板 1平放在操作台上， 贴上双面胶。
[0075] 将包被好的反应膜 2贴在底板 1上。
[0076] 将吸收垫 3压反应膜 2的 2mm贴上， 另一端与底板 1对齐。
[0077] 将一层无纺布压反应膜 2的 2mm处贴上。
[0078] 将结合物释放垫 5齐压于无纺布上面。
[0079] 将玻璃纤维压于结合物释放垫 5—半位置， 另一端与底板 1对齐。 [0080] 再将一层无纺布一端与结合物释放垫 5上端对齐， 另一端与底板 1对齐。
[0081] 步骤 5.组装试纸： 将 5条检测块 10包被有 4个浓度的单个免疫层析检测试纸条按 附图 3无间隔组合固定成一个试纸。
[0082] 步骤 6.产品检测： 取含有 HCG的待检样本尿液滴加到试纸样本垫 4上， 5min吋 判读结果，
显色， 其它 T块无显色， 表示待检样本尿液中含 HCG浓度为 25-125mIU/ml; T ,
、 τ 2、 τ 3
显色， 其它 Τ无显色， 表示待检样本尿液中含 HCG浓度为 125-500mIU/ml; Ί , 、 Τ 2、 Τ 3、 Τ 4、 Τ 5显色， Τ 6
无显色， 表示待检样本尿液中含 HCG浓度为 500-2500mIU/ml; T全部显色， 则表 示待检样本尿液中含 HCG浓度为高于 2500mIU/ml。
[0083] 实施例 2
[0084] 本发明的免疫层析检测试纸的制备实施例 2， 制备及检测尿微量白蛋白、 尿 2 微球蛋白、 抑胱素 C三项联合检测试纸 （胶体金免疫层析法） 。
[0085] 生物活性原料： 人白蛋白单克隆抗体、 鼠抗人白蛋白单克隆抗体、 Cys-C (抑 胱素 C) 单克隆抗体、 鼠抗人 Cys-C (抑胱素 C) 抗体、 2微球蛋白单克隆抗体、 鼠抗人 2微球蛋白抗体、 IgG多克隆抗体均来自市场购买。
[0086] 试剂： 牛血清白蛋白来自市场购买。
[0087] 硝酸纤维素膜来自市场购买。
[0088] 试纸制备程序如下：
[0089] 步骤 1.反应膜 2包被
[0090] 根据待检样本中的待检目标物确定包被抗体种类： 人白蛋白单克隆抗体、 Cys-
C (抑胱素 C) 单克隆抗体、 2微球蛋白单克隆抗体、 IgG多克隆抗体。
[0091] 根据待检样本中的待检目标物设定检测块 12及质控块 13的浓度和数量： 检测块
12设置 3个， 每块为一种检测抗体； 质控块 13设置 3个， 1个浓度。
[0092] 包被尿微量白蛋白反应膜： 将 1.2mg/ml的人白蛋白单克隆抗体、 1.0mg/ml的 Ig
G多克隆抗体根据附图 4的位置包被于硝酸纤维素膜上， 干燥 24h， 温度为 37°C， 湿度≤40<¾RH。 [0093] 包被尿 β 2微球蛋白反应膜： 将 1.5mg/m 2
微球蛋白单克隆抗体、 l.Omg/ml的 IgG多克隆抗体根据附图 4的位置包被于硝酸纤 维素膜上， 干燥 24h， 温度为 37°C， 湿度≤40%RH。
[0094] 包被抑胱素 C反应膜： 1.4mg/ml的 Cys-C (抑胱素 C) 单克隆抗体、 l.Omg/ml的 I gG多克隆抗体根据附图 4的位置包被于硝酸纤维素膜上， 干燥 24h， 温度为 37°C
， 湿度≤40<¾RH。
[0095] 步骤 2.结合物释放垫 5制备
[0096] 尿微量白蛋白金标结合物释放垫制备
[0097] 取 40nm的胶体金溶液， 按 1.2%比例加入 0.2M的 K 2C0 3 (碳酸钾） 调节 PH值， 按 12 g/ml比例加入鼠抗人白蛋白单克隆抗体， 制成标记物， 放置室温 5min， 按 0
.8%比例加入 BSA (牛血清白蛋白） 稳定剂。
[0098] 4500r离心 30min， 取浓缩沉淀物； 将上清液继续 6500r离心 45min， 取浓缩沉淀 物； 将上清液继续 9000r离心 60min， 取浓缩沉淀物； 将三次离心浓缩沉淀物混合 均匀。
[0099] 将离心好的浓缩液稀释好， 铺于 90cmx30cm的无纺布上， 加液量 10- 11ml/张， 干燥 24h， 温度 37°C， 湿度≤40<¾RH。
[0100] 尿 β 2微球蛋白金标结合物释放垫制备
[0101] 取 40nm的胶体金溶液， 按 1.2%比例加入 0.2M的 K 2C0 3 (碳酸钾） 调节 PH值， 按 l(Vg/ml比例加入鼠抗人 β 2
微球蛋白抗体， 制成标记物， 放置室温 5min， 按 0.8%比例加入 BSA (牛血清白 蛋白） 稳定剂。
[0102] 4500r离心 30min， 取浓缩沉淀物； 将上清液继续 6500r离心 45min， 取浓缩沉淀 物； 将上清液继续 9000r离心 60min， 取浓缩沉淀物； 将三次离心浓缩沉淀物混合 均匀。
[0103] 将离心好的浓缩液按规定浓度稀释好， 铺于 90cmx30cm的无纺布上， 加液量 10
-11ml/张， 干燥 24h， 温度 37°C， 湿度≤40<¾RH。
[0104] 抑胱素 C金标结合物释放垫制备
[0105] 取 40nm的胶体金溶液， 按 1.2%比例加入 0.2M的 K 2C0 3 (碳酸钾） 调节 PH值， 按 l l g/ml比例加入鼠抗人 Cys-C (抑胱素 C) 抗体， 制成标记物， 放置室温 5min ， 按 0.8%比例加入 BSA (牛血清白蛋白） 稳定剂。
[0106] 4500r离心 30min， 取浓缩沉淀物； 将上清液继续 6500r离心 45min， 取浓缩沉淀 物； 将上清液继续 9000r离心 60min， 取浓缩沉淀物； 将三次离心浓缩沉淀物混合 均匀。
[0107] 将离心好的浓缩液按规定浓度稀释好， 铺于 90cmx30cm的无纺布上， 加液量 10
-11ml/张， 干燥 24h， 温度 37°C， 湿度≤40<¾RH。
[0108] 步骤 3.样本垫 4的制备
[0109] 将切割成 83.5cmx30cm的玻璃纤维和无纺布用包含 0.5<¾NaCl (氯化钾） 、 0.5% 蔗糖、 0.1%BSA (牛血清白蛋白） 和 Tris-
HC1缓冲液 (三羟甲基氨基甲烷-盐酸) (pH7.4)
工作液浸泡。 在 37°C将所述垫干燥 24h， 获得样本垫 4。
[0110] 步骤 4.组装单个免疫层析检测试纸条
[0111] 组装尿微量白蛋白检测试纸条
[0112] 将底板 1放在操作台上， 贴上双面胶。
[0113] 将包被好的尿微量白蛋白反应膜贴在底板 1上。
[0114] 将吸收垫 3压尿微量白蛋白反应膜的 2mm贴上， 另一端与底板 1对齐。
[0115] 将一层无纺布压尿微量白蛋白反应膜的 2mm处贴上。
[0116] 将尿微量白蛋白结合物释放垫齐压于无纺布上面。
[0117] 将玻璃纤维压于尿微量白蛋白结合物释放垫一半位置， 另一端与底板 1对齐。
[0118] 再将一层无纺布一端与尿微量白蛋白结合物释放垫上端对齐， 另一端与底板 1 对齐。
[0119] 组装尿 β 2微球蛋白检测试纸条
[0120] 将底板 1放在操作台上， 贴上双面胶。
[0121] 将包被好的尿 β 2微球蛋白反应膜贴在底板 1上。
[0122] 将吸收垫 3压尿 β 2微球蛋白反应膜的 2mm贴上， 另一端与底板 1对齐。
[0123] 将一层无纺布压尿 β 2微球蛋白反应膜的 2mm处贴上。
[0124] 将尿 β 2微球蛋白结合物释放垫齐压于无纺布上面。 [0125] 将玻璃纤维压于尿 β 2微球蛋白结合物释放垫一半位置， 另一端与底板 1对齐。
[0126] 再将一层无纺布一端与尿 β 2微球蛋白结合物释放垫上端对齐， 另一端与底板 1 对齐。
[0127] 组装抑胱素 C检测试纸条
[0128] 将底板 1放在操作台上， 贴上双面胶。
[0129] 将包被好的抑胱素 C反应膜贴在底板 1上。
[0130] 将吸收垫 3压抑胱素 C反应膜的 2mm贴上， 另一端与底板 1对齐。
[0131] 将一层无纺布压抑胱素 C反应膜的 2mm处贴上。
[0132] 将抑胱素 C结合物释放垫齐压于无纺布上面。
[0133] 将玻璃纤维压于抑胱素 C结合物释放垫一半位置， 另一端与底板 1对齐。
[0134] 再将一层无纺布一端与抑胱素 C结合物释放垫上端对齐， 另一端与底板 1对齐。
[0135] 步骤 5.组装试纸： 将尿微量白蛋白检测试纸条、 尿 2微球蛋白检测试纸条、 抑 胱素 C检测试纸条各 1条及 2条空白试纸条按附图 4无间隔组合固定成一个试纸。
[0136] 步骤 6.产品检测： 取待检样本尿液样本垫 4上， 8min吋， 判读结果， 显色， 表示待检样本尿液中尿微量白蛋白为阳性； τ 2显色， 表示待检样本尿液中含尿 β
2微球蛋白为阳性； τ 3显色， 表示待检样本尿液中含抑胱素 C为阳性。
[0137] 以上所述仅为本发明的实施例， 并不限制本发明， 凡在本发明基础上， 所作的 任何修改、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

权利要求书
[权利要求 1] 一种免疫层析检测方法， 用于实现对待检样本的定性、 半定量或 定量检测； 其特征在于， 采用如下步骤：
反应膜包被： 根据待检样本中的待检目标物确定包被抗体或抗原 的种类， 设定检测块及质控块的浓度和数量；
根据待检样本中的待检目标物制备结合物释放垫；
制备样本垫；
组装单个免疫层析检测试纸条： 试纸条由底板， 及依次设置在底 板上的样本垫、 结合物释放垫、 反应膜、 吸收垫构成； 组装免疫层析检测试纸： 试纸是由二条或多条单个免疫层析检测 试纸条无间隔组合固定在一起， 相当于将特异性抗体或抗原以二 个或多个四边形状组合固定于反应膜上；
对待检样本进行检测： 在试纸样本垫中加入待检样本， 通过肉眼 观察多个检测块和质控块的显色情况对待检样本进行定性或者半 定量检测， 或采用具有信号检测功能的仪器采集试纸上检测块和 质控块的特征信号进行定量检测；
或者首先根据多个检测块的显色情况确定待检样本中的待检目标 物， 再通过肉眼观察多个检测块和质控块的显色情况对待检样本 中不同的待检目标物进行定性或者半定量检测， 或采用具有信号 检测功能的仪器采集试纸上检测块和质控块的特征信号进行定量 检测。
[权利要求 2] 根据权利要求 1所述的免疫层析检测方法， 其特征在于： 试纸的反 应膜分成两个区域， 一个是与结合物释放垫相邻的检测区， 一个 是与吸收垫相邻的质控区； 检测区设有 2至 15个四边形状检测块， 检测块的设定可以是同浓度或者不同浓度的同一种抗体或抗原， 也可以是同浓度或者不同浓度的多种抗体或抗原；
所述质控区设有 1至 15个四边形状质控块， 质控块包被有可与结合 物释放垫上标记物结合的抗体或抗原； 根据权利要求 1所述的免疫层析检测方法， 其特征在于： 相邻的单 个免疫层析检测试纸条的检测块不在反应膜的同一水平位置。
[权利要求 3] 根据权利要求 1所述的免疫层析检测方法， 其特征在于： 所述结合 物释放垫上标记有单一待检目标物相关的特异性抗体或抗原， 或 标记有各待检目标物相关的多个特异性抗体或抗原。
[权利要求 4] 根据权利要求 1所述的免疫层析检测方法， 其特征在于： 所述标记 方法包括量子点标记法、 胶体金标记法、 胶体硒标记法、 有色或 荧光乳胶标记法、 磁性颗粒标记法。
[权利要求 5] 根据权利要求 1所述的免疫层析检测方法， 其特征在于： 所述方法 包括双抗体夹心法、 间接法、 竞争抑制法。
[权利要求 6] 根据权利要求 1所述的免疫层析检测方法， 其特征在于： 所述待检 样本是来自临床或非临床的血液、 体液、 尿液、 唾液、 生殖道分 泌液或其他液态样品或粘稠状样品。
[权利要求 7] 根据权利要求 1所述的免疫层析检测试纸， 其特征在于： 所述底板 材料是 PVC(聚氯乙烯)板， 反应膜材料是硝酸纤维素膜或醋酸纤 维素膜， 吸收垫的材料是滤纸， 样品垫材料为玻璃纤维和无纺布
， 结合物释放垫材料是玻璃纤维或无纺布。
[权利要求 8] 根据权利要求 1-7所述的免疫层析检测试纸， 其特征在于： 试纸还 可装配在与试纸的尺寸、 样本加入的方式和位置、 抗体或抗原在 反应膜上固化的位置相吻合的塑料卡内成为试纸盒。
[权利要求 9] 一种免疫层析检测试纸制备方法， 其特征在于： 准备生物活性原 料： ot-HCG单克隆抗体、 β-HCG单克隆抗体、 IgG多克隆抗体均来 自市场购买； 试剂： 牛血清白蛋白来自市场购买； 硝酸纤维素膜 来自市场购买；
试纸制备程序如下：
步骤 1.反应膜 2包被
根据待检样本中的待检目标物确定包被抗体种类： ot-HCG单克隆 抗体、 IgG多克隆抗体； 根据待检样本中的待检目标物设定检测块 10及质控块 11的浓度和 数量： 检测块 10设置 6个， 4个不同浓度； 质控块 11设置 5个， 1个 浓度；
制备检测块 10包被有不同浓度的单个免疫层析检测试纸条反应膜 2 ： 将 15.42mg/ml的 α-HCG单克隆抗体、 8.02mg/ml的 IgG多克隆抗 体根据设置的浓度稀释后， 按照附图 3的位置分别包被于硝酸纤维 素膜上， 干燥 24h， 温度为 37°C， 湿度≤40<¾RH;
步骤 2.结合物释放垫 5制备
取 40nm的胶体金溶液， 按 1.2%比例加入 0.2M的 K 2C0 3 (碳酸钾） 调节 PH值， 按 15 g/ml比例加入 β-HCG单克隆抗体， 制成标记物， 放置室温 5min， 按 0.8%比例加入 BSA (牛血清白蛋白） 稳定剂； 4500r离心 30min， 取浓缩沉淀物； 将上清液继续 6500r离心 45min， 取浓缩沉淀物； 将上清液继续 9000r离心 60min， 取浓缩沉淀物； 将三次离心浓缩沉淀物混合均匀；
将离心好的浓缩液稀释好， 铺于 90cmx30cm的无纺布上， 加液量 1 0-1 lml/张， 干燥 24h， 温度 37°C， 湿度≤40<¾RH;
步骤 3.样本垫 4的制备
[0061]将切割成 83.5cmx30cm的玻璃纤维和无纺布用包含 0.5<¾NaCl
(氯化钾） 、 0.5%蔗糖、 0.1%BSA (牛血清白蛋白） 和 Tris-HCl 缓冲液 (三羟甲基氨基甲烷-盐酸) (pH7.4)工作液浸泡。
[权利要求 10] 在 37°C将所述垫干燥 24h， 获得样本垫 4;
步骤 4.按以下步骤分别组装 4个浓度检测块 10的单个免疫层析检测 试纸条
将底板 1平放在操作台上， 贴上双面胶；
将包被好的反应膜 2贴在底板 1上；
将吸收垫 3压反应膜 2的 2mm贴上， 另一端与底板 1对齐； 将一层无纺布压反应膜 2的 2mm处贴上；
将结合物释放垫 5齐压于无纺布上面； 将玻璃纤维压于结合物释放垫 5—半位置， 另一端与底板 1对齐； 再将一层无纺布一端与结合物释放垫 5上端对齐， 另一端与底板 1 对齐；
步骤 5.组装试纸： 将 5条检测块 10包被有 4个浓度的单个免疫层析检 测试纸条按附图 3无间隔组合固定成一个试纸；
步骤 6.产品检测： 取含有 HCG的待检样本尿液滴加到试纸样本垫 4 上， 5min吋判读结果， 显色， 其它 T块无显色， 表示待检样本 尿液中含 HCG浓度为 25-125mIU/ml; T T 2、 Τ 3显色， 其它 Τ无 显色， 表示待检样本尿液中含 HCG浓度为 125-500mIU/ml; T Τ 2、 Τ 3、 Τ 4、 Τ 5显色， 丁6无显色， 表示待检样本尿液中含 HCG浓 度为 500-2500mIU/ml; T全部显色， 则表示待检样本尿液中含 HCG 浓度为高于 2500mIU/ml。
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