JP5500791B2 - 新規検査方法及びそれに用いる検査キット - Google Patents
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[1] 下記成分をそれぞれ含有する試薬組成物R1、試薬組成物R2及び試薬組成物R3並びに固相支持体を用いて検体中の被検出物を検出する方法であって、固相支持体に試薬組成物R1を固相化し検出部を設け、試薬組成物R2及び検体の混合物を固相支持体に供給し、次いで試薬組成物R3を固相支持体上の検出部に供給することを含み、固相支持体上の検出部で被検出物捕捉試薬-被検出物-アルカリホスファターゼ標識試薬の複合体を形成させ、検出部で酵素サイクリング反応を行わせる、検体中の被検出物を検出する方法。
試薬組成物R1: 脱水素酵素及び/若しくは電子伝達物質並びに被検出物捕捉試薬
試薬組成物R2: 被検出物と結合する物質をアルカリホスファターゼで標識したアルカリホスファターゼ標識試薬
試薬組成物R3: 脱水素酵素及び電子伝達物質のうち試薬組成物R1に含まれていないもの、脱水素酵素の基質、テトラゾリウム並びにニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)若しくはその還元型(NADPH)
[2] 脱水素酵素がアルコール脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素からなる群から選択される1種以上である、[1]の検体中の被検出物を検出する方法。
[3] 電子伝達物質がジアホラーゼである、[1]又は[2]の検体中の被検出物を検出する方法。
[4] 試薬組成物R2が界面活性剤0.2〜10(w/v)%及び動物由来血清アルブミン1〜10(w/v)%を含有する、[1]〜[3]のいずれかの検体中の被検出物を検出する方法。
[5] 試薬組成物R1を担体に結合させ、該担体を固相支持体に固相化する、[1]〜[4]のいずれかの検体中の被検出物を検出する方法。
[6] 担体が微小樹脂粒子である、[5]の検体中の被検出物を検出する方法。
[7] 被検出物捕捉試薬と被検出物が抗原抗体反応により結合する[1]〜[6]のいずれかの検体中の被検出物を検出する方法。
[8] フロースルー方式であり、試薬組成物R2及び検体の混合物を固相支持体に供給し、固相支持体上の検出部で被検出物捕捉試薬-被検出物-アルカリホスファターゼ標識試薬の複合体を形成させ、次いで試薬組成物R3を固相支持体上の検出部に供給して酵素サイクリング反応を行わせる、[1]〜[7]のいずれかの検体中の被検出物を検出する方法。
[9] 試薬組成物R2を含み、濾過フィルターを有する検体添加用デバイスに検体を入れ、検体及び試薬組成物R2の混合物を調製し、固相支持体に供給する、[8]の検体中の被検出物を検出する方法。
[10] ラテラルフロー方式であり、試薬組成物R2及び検体の混合物を固相支持体に供給し、次いで試薬組成物R3を固相支持体に供給し、検体及び試薬組成物R2の混合物を固相支持体上を展開させ、固相支持体上の検出部で被検出物捕捉試薬-被検出物-アルカリホスファターゼ標識試薬の複合体を形成させて酵素サイクリング反応を行わせる、[1]〜[7]のいずれかの検体中の被検出物を検出する方法。
[11] 下記成分をそれぞれ含有する試薬組成物R1、試薬組成物R2及び試薬組成物R3を別々に含む、請求項1に記載の方法により固相上で酵素サイクリング反応を行わせて検体中の被検出物を検出するための検査キットであり、試薬組成物R1が固相支持体上に固相化されている検査キット。
試薬組成物R1: 脱水素酵素及び/若しくは電子伝達物質並びに被検出物捕捉試薬
試薬組成物R2: 被検出物と結合する物質をアルカリホスファターゼで標識したアルカリホスファターゼ標識試薬
試薬組成物R3: 脱水素酵素及び電子伝達物質のうち試薬組成物R1に含まれていないもの、脱水素酵素の基質、テトラゾリウム並びにニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)若しくはその還元型(NADPH)
[12] 脱水素酵素がアルコール脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素からなる群から選択される1種以上である、[11]の検査キット。
[13] 電子伝達物質がジアホラーゼである、[11]又は[12]の検査キット。
[14] 試薬組成物R2が界面活性剤0.2〜10(w/v)%及び動物由来血清アルブミン1〜10(w/v)%を含有する、[11]〜[13]のいずれかの検査キット。
[15] 試薬組成物R1を担体に結合させ、該担体が固相支持体に固相化されている、[11]〜[14]のいずれかの検査キット。
[16] 担体が微小樹脂粒子である、[15]の検査キット。
[17] 被検出物捕捉試薬と被検出物が抗原抗体反応により結合する、[11]〜[16]のいずれかの検査キット。
[18] フロースルー方式である、[12]〜[17]のいずれかの検査キット。
[19] さらに、試薬組成物R2を含み、濾過フィルターを有する検体添加用デバイスを含む、[18]の検査キット。
[20] ラテラルフロー方式である、[11]〜[17]のいずれかの検査キット。
固相化する場合の液量は支持体の材質、厚み、検出部の面積によって変わるが、この分野の技術を有する者にとって最適化は容易である。
NADPH又はNADP 0.05〜0.4mM
アルコール 3〜8%
テトラゾリウムのナトリウム塩 0.6〜1.2mM
塩化マグネシウム 2〜6mM
界面活性剤 0.01〜0.5(w/v)%
(1)試薬組成物R1をメンブレン上に固相化し、検出部とする。
(2)患者から採取した検体を検体浮遊用緩衝液で希釈し、濾過フィルター及び/又は標識試薬部を備えた検体添加用デバイスを用い、検体に試薬組成物R2を混合しながら濾過し、検出部上に滴下する。
(3)装置のアダプターを取り外す。
(4)試薬組成物R3を検出部に滴下し所定時間反応させる。
(5)所定反応時間後に検出部の発色の有無により判定する。
1.抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の作製
(1)抗A型インフルエンザウイルスNP抗体
A型インフルエンザウイルス抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3×63)と融合した。得られた融合細胞(ハイブリドーマ)は、37℃インキュベーター中で維持した。
B型インフルエンザウイルス抗原を用い、(1)と同様の方法で、2種類の精製抗B型インフルエンザウイルスNP抗体を得た。
(1)酵素標識抗A型インフルエンザウイルス抗体の作製
精製抗A型インフルエンザウイルスNP抗体のうち1種類について45mgを0.1Mクエン酸緩衝液(pH3.6)で透析後、ペプシン10mgを添加し、37℃で1時間、Fab’消化処理を行った。処理液をウルトロゲルAcA34カラムで分画して抗A型インフルエンザウイルスNP抗体F(ab’)2精製画分を得た。前記画分を約10mg/mLまで濃縮後、0.1Mメルカプトエチルアミンと10:1の体積比で混合し、37℃で90分間還元処理を行った。処理液をウルトロゲルAcA34カラムで分画して抗A型インフルエンザウイルスNP抗体Fab’精製画分を得た後、約1mLにまで濃縮した。
精製抗B型インフルエンザウイルスNP抗体のうち1種類について、(1)と同様の方法で、酵素標識抗B型インフルエンザウイルス抗体(B型インフルエンザウイルス用の試薬組成物R2)を得た。
(使用材料)
電子伝達物質:ジアホラーゼ(DIA、ユニチカ社製、市販品)
脱水素酵素:アルコール脱水素酵素(ADH、ロシュ社製、市販品)
被検出物捕捉試薬A:精製抗A型インフルエンザウイルスNP抗体
被検出物捕捉試薬B:精製抗B型インフルエンザウイルスNP抗体
インフルエンザウイルス検出用検査キットは、図1及び図2に示すフロースルー型の構成のものを用いた。メンブレンは、孔径3μmを有するニトロセルロースメンブレン(サイズ2×3cm、厚さ125μm)を用いた。
検体として、ふ化鶏卵内で培養した下記ウイルスを使用した。
A型インフルエンザウイルス:A/Beijing/32/92(H3N2)、
B型インフルエンザウイルス:B/Shangdong/7/97
50mMトリス緩衝液、pH8.0を主体とし、界面活性剤Triton X-100を1(w/v)%、ウシ血清アルブミン3(w/v)%、正常マウス免疫グロブリン0.1(w/v)%、アジ化ナトリウム0.09(w/v)%となるよう調製した。
A型インフルエンザ/Beijing
1:1×104
1:2×104
1:4×104
1:6×104
1:8×104
B型インフルエンザ/Shangdong
1:1×103
1:2×103
1:4×103
1:6×103
1:8×103
調製した検体が入った検体添加用デバイス本体部に酵素標識試薬を含む標識試薬部を備えた検体添加用デバイス先端部を取り付け、検体で標識試薬を溶解した後、孔径0.5μmの濾過フィルターで濾過し、検査キットのアダプターに300μL滴下し、ニトロセルロースメンブレンの下部に備えられた液体吸収部材に液が完全に吸収されるまで静置した。
試薬組成物R3(発色試薬):
トリス緩衝液(pH9.0) 100mM
p-ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット 1mM
NADPH 0.1mM
エチルアルコール 4%
塩化マグネシウム 5mM
界面活性剤(ポリオキシエチレン系) 0.02(V/W)%
BCIP: 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸
NTB : ニトロテトラゾリウムブルー
を用いた点以外は、上記と同様に行い検出感度を評価した。判定は、5分間後に実施例1と同様にして行った。
表1及び表2に示すように、A/Beijing/32/92(H3N2)は、1:4×104希釈までA型検出部が陽性を示し、B型検出部は陰性で特異的にA型インフルエンザウイルスを検出しており、比較例の1:1×104と比べ4倍検出感度が高かった。
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)のペニシリン結合蛋白2'(PBP2')に対するモノクローナル抗体2種類(デンカ生研社製)をペプシン処理してF(ab')2精製画分(抗PBP2'精製画分)を得た。
PBP2'検出用検査キットは、図5の構成のものを用いた。メンブレンは、ニトロセルロースメンブレン(Hiflow Plus HF120 ミリポア社製)を用いた。
黄色ブドウ球菌のPBP2'産生菌(菌株1、2、3)を培養し、アルカリ抽出法を用いてスライドラテックス凝集反応用試料を調製した。
比較例2として、MRSA-La「生研」(デンカ生研社製)を用いたスライドラテックス凝集反応により検出感度を評価した。
本発明法及びスライドラテックス法の検出下限濃度を表3に示す。
O2:開口部
a:アダプター
b:メンブレン
c:液体吸収部材
d:先端部
e:本体部
f:濾過フィルター
g:標識試薬部
h:濾過フィルターキット
イ:メンブレン
ロ:検出部
ハ:標識試薬部
ニ:検体供給部
ホ:液体吸収部材
ヘ:発色試薬供給部
ト:プラスチック板
Claims (16)
- 下記成分をそれぞれ含有する試薬組成物R1、試薬組成物R2及び試薬組成物R3を用いて検体中の被検出物を検出する方法であって、
(i) 試薬組成物R1を固相化し検出部を設けた固相支持体に試薬組成物R2及び検体の混合物を供給し、
(ii) 次いで試薬組成物R3を固相支持体上の検出部に供給することを含み、1つの試薬組成物中にアルコール脱水素酵素とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)若しくはその還元型(NADPH)が混合された状態で含まれることはなく、1つの試薬組成物中にテトラゾリウムとニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)若しくはその還元型(NADPH)が混合された状態で含まれており、検査時に固相支持体上の検出部において酵素サイクリング反応に必要な成分であるアルコール脱水素酵素、ジアホラーゼ、アルコール脱水素酵素の基質であるアルコール、テトラゾリウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)若しくはその還元型(NADPH)並びに被検出物と結合する物質をアルカリホスファターゼで標識したアルカリホスファターゼ標識試薬が混合され、検出部においてB/F分離により被検出物捕捉試薬-被検出物-アルカリホスファターゼ標識試薬の複合体を形成させ、検出部で酵素サイクリング反応を行わせ、発色を測定することにより、検体中の被検出物を検出する方法。
試薬組成物R1: アルコール脱水素酵素、ジアホラーゼ及び被検出物捕捉試薬、あるいはアルコール脱水素酵素及び被検出物捕捉試薬
試薬組成物R2: 被検出物と結合する物質をアルカリホスファターゼで標識したアルカリホスファターゼ標識試薬
試薬組成物R3: アルコール脱水素酵素の基質であるアルコール、テトラゾリウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)若しくはその還元型(NADPH)、並びに試薬組成物R1にジアホラーゼが含まれない場合はジアホラーゼ - 試薬組成物R2が界面活性剤0.2〜10(w/v)%及び動物由来血清アルブミン1〜10(w/v)%を含有する、請求項1に記載の検体中の被検出物を検出する方法。
- 試薬組成物R1を担体に結合させ、該担体を固相支持体に固相化する、請求項1又は2に記載の検体中の被検出物を検出する方法。
- 担体が微小樹脂粒子である、請求項3記載の検体中の被検出物を検出する方法。
- 被検出物捕捉試薬と被検出物が抗原抗体反応により結合する請求項1〜4のいずれか1項に記載の検体中の被検出物を検出する方法。
- フロースルー方式であり、試薬組成物R2及び検体の混合物を固相支持体に供給し、固相支持体上の検出部で被検出物捕捉試薬-被検出物-アルカリホスファターゼ標識試薬の複合体を形成させ、次いで試薬組成物R3を固相支持体上の検出部に供給して酵素サイクリング反応を行わせる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の検体中の被検出物を検出する方法。
- 試薬組成物R2を含み、濾過フィルターを有する検体添加用デバイスに検体を入れ、検体及び試薬組成物R2の混合物を調製し、固相支持体に供給する、請求項6記載の検体中の被検出物を検出する方法。
- ラテラルフロー方式であり、試薬組成物R2及び検体の混合物を固相支持体に供給し、次いで試薬組成物R3を固相支持体に供給し、検体及び試薬組成物R2の混合物を固相支持体上を展開させ、固相支持体上の検出部で被検出物捕捉試薬-被検出物-アルカリホスファターゼ標識試薬の複合体を形成させて酵素サイクリング反応を行わせる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の検体中の被検出物を検出する方法。
- 下記成分をそれぞれ含有する試薬組成物R1、試薬組成物R2及び試薬組成物R3を別々に含む、請求項1に記載の方法により固相上で酵素サイクリング反応を行わせて発色を測定することにより検体中の被検出物を検出するための検査キットであり、試薬組成物R1が固相支持体上に固相化されており、1つの試薬組成物中にアルコール脱水素酵素とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)若しくはその還元型(NADPH)が混合された状態で含まれることはなく、1つの試薬組成物中にテトラゾリウムとニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)若しくはその還元型(NADPH)が混合された状態で含まれており、検査時に固相支持体上の検出部において酵素サイクリング反応に必要な成分であるアルコール脱水素酵素、ジアホラーゼ、アルコール脱水素酵素の基質であるアルコール、テトラゾリウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)若しくはその還元型(NADPH)並びに被検出物と結合する物質をアルカリホスファターゼで標識したアルカリホスファターゼ標識試薬が混合される検査キット。
試薬組成物R1: アルコール脱水素酵素、ジアホラーゼ及び被検出物捕捉試薬、あるいはアルコール脱水素酵素及び被検出物捕捉試薬
試薬組成物R2: 被検出物と結合する物質をアルカリホスファターゼで標識したアルカリホスファターゼ標識試薬
試薬組成物R3: アルコール脱水素酵素の基質であるアルコール、テトラゾリウム、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)若しくはその還元型(NADPH)、並びに試薬組成物R1にジアホラーゼが含まれない場合はジアホラーゼ - 試薬組成物R2が界面活性剤0.2〜10(w/v)%及び動物由来血清アルブミン1〜10(w/v)%を含有する、請求項9に記載の検査キット。
- 試薬組成物R1を担体に結合させ、該担体が固相支持体に固相化されている、請求項9又は10に記載の検査キット。
- 担体が微小樹脂粒子である、請求項11記載の検査キット。
- 被検出物捕捉試薬と被検出物が抗原抗体反応により結合する、請求項9〜12のいずれか1項に記載の検査キット。
- フロースルー方式である、請求項9〜13のいずれか1項に記載の検査キット。
- さらに、試薬組成物R2を含み、濾過フィルターを有する検体添加用デバイスを含む、請求項14記載の検査キット。
- ラテラルフロー方式である、請求項9〜13のいずれか1項に記載の検査キット。
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