KR20010109843A - 포획 항체를 사다리와 같은 형태로 다중 고정하고, 폭이좁게 제작된 멤브레인 스트립 여러개를 동시에 사용하여용액의 전개 효율을 증대시켜 시료내 특정 성분을 정량검사하고자 하는 경우에 활용하는 멤브레인 이뮤노크로마토그래피 기법. - Google Patents

Abstract

기존의 간편 진단 시약의 경우 검사대상 성분의 유무만을 판정하는 정성검사 만이 가능하였으며 이로 인하여 정량성이 요구되는 많은 종류의 면역 검사의 경우에는 간편 진단 시약의 개발 및 활용이 불가능하였다.

이에 본 발명의 실험 기법에서는 이러한 문제를 해결하고자 membrane strip 상에 시료의 전개 과정에서 분석 대상 물질의 농도에 따라 각기 다른 수의 band가 형성 될 수 있도록 사다리 형태로 여러개의 포획 항체 선들을 준비하였으며 membrane strip의 폭을 1/2-1/3 정도로 좁게 절단하여 membrane 상에서 시료 용액이 전개되는 과정이 원활히 이루어 질 수 있도록 하여 시료의 분석대상물질의 농도를 발생한 band의 수량으로 간접적인 해석이 가능하도록 하였다.

Description

포획 항체를 사다리와 같은 형태로 다중 고정하고, 폭이 좁게 제작된 멤브레인 스트립 여러개를 동시에 사용하여 용액의 전개 효율을 증대시켜 시료내 특정 성분을 정량 검사하고자 하는 경우에 활용하는 멤브레인 이뮤노 크로마토그래피 기법.{Quantificational membrane immuno chromatography method on membrane strip with use the multi printed capture antibody line( as like ladder or bar-code ) and use the two or more narrow membrane strip( 1 - 1.5mm )}

본 발명은 정량 검사가 불가능하였던 기존의 membrane strip 형태와 전개 방식을 수정하여 이를 가능하게 하는 기법이다. 먼저 membrane 내에 고정되어 있는 대상 시료에 대한 capture antibody line을 사다리 혹은 bar-code 와 같은 형태로 여러개의 line으로 제작하여 시료내의 대상 성분이 membrane상에서 전개되면서 각 capture antibody( 이하 포획 항체 ) line에서 포획되고 이에 의하여 대상 성분에 결합된 gold conjugate가 각 line에 축적되어 band를 형성하고 시료내의 대상 성분의 농도에 따라 각기 다른 수의 band가 형성되는 것으로 대상 성분의 농도를 확인하는 기법이며. 아울러 시료 용액이 전개되는 과정에서 기존의 Membrane은 각 절단 모서리 부위가 중앙 부위에 비하여 빠른 속도로 전개되는 것을 확인할 수 있었다이에 기존의 membrane을 1/2 혹은 1/3의( 약 1 - 1.5mm ) 좁은 폭으로 제작하여 membrane 중앙 부위에서도 한 두개의 절단 모서리를 추가적으로 형성시켜주어 원활하게 용액이 전개될 수 있도록 제작하여 주는 기법이다.

그리고 본 기법을 활용할 경우 전통적인 Enzyme Immuno Assay( 이하 EIA )기법과 Radio Immuno Assay( 이하 RIA )기법으로 이루어지고 있는 여러 생체 물질들에 대한 정량을 간편하게 시행할 수 있게 하여주며 별도의 결과 분석기기를 필요로 하지 않기에 분석기기가 준비 되어있지 않은 곳에서도 검사를 시행할 수 있다. 아울러 검사의 과정이 간편하기에 현장 검사로 활용되어 질 수 있고 이로 인해 기존의 검사 기법들과 보완적인 형태로 활용되어 질 수 있을 것으로 예상된다. 기존의 기법으로는 전통적인 EIA 기법과 RIA기법이 활용되고 있으며 최근 membrane strip을 활용한 정량 기법이 개발되고 있다. 각 방법의 특징과 단점은 아래와 같다.

첫 번째 방법인 EIA ( Enzyne Immuno Assay )은 Micro well plate의 각 well 바닥 표면에 1 차 포획 항체( 시료내의 항원을 검사하려는 경우 )나 항원( 시료내의 항체를 검사하려는 경우 )을 고정하여주고 여기에 환자 혈청을 주입하여주고 면역 반응으로 검사하고자 하는 생체 물질이 well plate에 고정 되도록 한다. 여기에 효소가 부착된 2 차 항체를 주입하여 well plate에 고정된 생체물질이나 항체에 면역 반응으로 결합할 수 있도록 하여준다. 이후 당 효소에 대한 발색 기질을 주입하여 반응을 시켜주고 발색 정도를 확인하여 정성 및 정량 검사를 시행한다.

단점은 기본적으로 시간이 오래 소요되며 과정과 절차가 매우 복잡한 것이 특징이며 다량 검체를 처리하는데 유용하다는 장점이 있으나 별도의 장비들을 필요로 하는 단점을 갖고 있다.

두 번째 방법인 RIA ( Radio Immuno Assay )은 Micro well plate의 각 well 바닥 표면에 1 차 포획 항체( 시료내의 항원을 검사하려는 경우 )나 항원( 시료내의 항체를 검사하려는 경우 )을 고정하여주고 여기에 환자 혈청을 주입하여주고 면역 반응으로 검사하고자 하는 생체 물질이 well plate에 고정 되도록 한다. 여기에 방사선 동위원소가 부착된 2 차 항체를 주입하여 well plate에 고정된 생체물질이나 항체에 면역 반응으로 결합할 수 있도록 하여준다. 이후 각 tube well에 고정되어진 방사선 동위원소로부터 방출되는 방사능의 정도를 확인하여 정성 및 정량 검사를 시행한다.

단점은 기본적으로 시간이 오래 소요되며 과정과 절차가 매우 복잡한 것이 특징이며 다량 검체를 처리하는데 유용하다는 장점이 있으나 별도의 장비들을 필요로 하는 단점을 갖고 있다. 그리고 방사선 동위원소를 활용하기에 방사능에의 노출 위험과 반감기에 의하여 검사 감도의 저하 및 보관상의 문제점들을 갖고있다.

세 번째 방법인 Membrane strip을 활용한 정량 기법은 기존의 정성용 membrane strip에 비하여 많은 양의 포획 항체를 넓게 print 하여주고 검사시료와 반응 시켜주어 얻어진 band의 진하기 정도를 ccd camera등을 활용하여 시료내의 검사대상 생체물질의 농도를 추정하는 기법이다.

단점은 현재 개발되고있는 현장 진단용 검사시약의 한 형태로서 결과의 확인에도 별도의 장비를 필요로 하는 단점을 갖고있다.

상기와 같은 기존의 기법들은 각각의 불편한 점을 내포하고 있기에 새로운기법의 발명이 요구되었으며 본 발명은 이러한 요구에 부합하는 경제적이며 효율적인 실험 기법이다.

이에 본 발명의 실험 기법에서는 이러한 문제를 해결하고자 membrane strip 상에 시료의 전개 과정에서 분석 대상 물질의 농도에 따라 각기 다른 수의 band가 형성 될 수 있도록 사다리 형태로 여러개의 포획 항체 선들을 준비하였으며 membrane strip의 폭을 1/2-1/3 정도로 좁게 절단하여 membrane 상에서 시료 용액이 전개되는 과정이 원활히 이루어 질 수 있도록 하여 시료의 분석대상물질의 농도를 발생한 band의 수량으로 간접적인 해석이 가능하도록 하였다.

본 발명을 살펴보면 다음과 같다.

(1) membrane strip 위에 고정되어지는 포획 항체가 gold conjugate와 결합한 분석 대상 물질과의 결합 반응으로 band를 형성시킬 수 있는 최소한의 양을 결정하여 membrane의 각 포획 항체 line에 고정하여 준다.

(2) membrane strip 상에 포획 항체 line을 사다리와 같은 형태로 시료내에 존재하는 일정 농도 이상의 검사대상 물질을 포획 할 수 있을 정도의 여러개의 line을 설치한다.

(3) 1차 항체가 부착된 conjugate와 포획 항체가 처리된 membrane 패드를 기존에 활용하는 폭에 비하여 약 1/2 - 1/3 정도로 좁게 제작한다.

(4)폭이 좁게 제작된 membrane 패드를 2-3개 정도를 반응기틀( 이하cassette )내에 기존의 단일 패드처럼 붙여서 설치하여 준다.

(5) 검사하고자 하는 시료를 시료 패드에 가하여 주면 시료내의 검사 대상 물질이 용액의 흐름과 함께 conjugate 패드로 이동하게 되고 여기에서 1차 항체가 부착된 gold conjugate와 면역 반응으로 결합하게 된다.

(6) 상기 (5)에서 conjugate와 결합한 검사 대상 물질은 용액과 함께 분리 membrane으로 이동하게 되고 최초의 포획 항체 line에 도달하여 면역반응으로 포획항체와 결합하게 되고 이로 인하여 gold particle이 포획항체 line에 축적되어 band를 형성하게 된다.

(7) 상기 (6)에서 반응 이루지 못하고 남은 검사 대상물질과 conjugate결합체들 중 최초 포획 항체 line에서 결합을 이루지 못한 결합체들은 용액과 함께 다음 포획 항체 line으로 진행하게 된다.

(8) 상기 (6)에서와 같이 두 번째 포획 항체 line에서 대상 물질은 포획 항체와 결합을 이루고 gold conjugate의 축적에 의해 band를 형성하게 된다.

(9) 상기의 (6) 과 (7) 그리고 (8)의 과정을 반복하면서 시료내의 대상물질의 농도에 따라 각기 다른 수의 band를 형성하게 되고 이를 통해 대상물질의 농도를 확인할 수 있게 된다.

그림 1. 대 표 도.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

[실시예 1]

(1) 검사하고자 하는 시료를 시료패드에 주입한다.

(2) 시료를 포함하고 있는 용액은 conjugate 패드에서 1차 면역 반응에 의하여 gold particle이 부착된 conjugate와 결합하게 된다.

(3) 상기 (2)의 용액은 분리 membrane으로 흡수 전개되어진다.

(4) 용액이 포획 항체 line에 도달하여 2차 면역 반응에 의하여 포획항체에 의하여 고정되어지고 이와 함께 gold particle도 축적되어진다.

(5) 상기 (4)와 같이 축적된 gold는 유관으로 관찰되는 band를 형성한다.

(6) 상기 (4)에서 면역반응에 참여치 못한 분석 대상물질은 용액과 함께 계속 전개되어 다음 포획항체 line에 도달하게 된다.

(7) 두 번째 포획 항체 line에서 상기 (4)에서 와 같은 반응으로 두 번째 band를 형성하게 된다.

(8) 상기 (4),(5),(6),(7)과 같이 용액이 계속 전개되면서 시료내의 분석 대상물질의 양에 따라 각기 다른 수의 band가 형성된다.

그림 2. 실시예 1의 결과 예상도.

시험 결과 : 본 시험에 활용된 시료내의 검사 대상 물질은 4개의 band를 형성하여 평균정도의 수치를 나타내었다.

[실시예 2]

(1) 검사하고자 하는 시료를 시료패드에 주입한다.

(2) 시료를 포함하고 있는 용액은 conjugate 패드에서 1차 면역 반응에 의하여 gold particle이 부착된 conjugate와 결합하게 된다.

(3) 상기 (2)의 용액은 분리 membrane으로 흡수 전개되어진다.

(4) 용액이 포획 항체 line에 도달하여 2차 면역 반응에 의하여 포획항체에 의하여 고정되어지고 이와 함께 gold particle도 축적되어진다.

(5) 상기 (4)와 같이 축적된 gold는 유관으로 관찰되는 band를 형성한다.

(6) 상기 (4)에서 면역반응에 참여치 못한 분석 대상물질은 용액과 함께 계속 전개되어 다음 포획항체 line에 도달하게 된다.

(7) 두 번째 포획 항체 line에서 상기 (4)에서 와 같은 반응으로 두 번째 band를 형성하게 된다.

(8) 상기 (4),(5),(6),(7)과 같이 용액이 계속 전개되면서 시료내의 분석 대상물질의 양에 따라 각기 다른 수의 band가 형성된다.

그림 3. 실시예 2의 결과 예상도

시험 결과 : 본 시험에 활용된 시료내의 검사 대상 물질은 6개의 band를 형성하여 평균에 비하여 다소 높은 수치를 나타내었다.

[실시예 3]

(1) 검사하고자 하는 시료를 시료패드에 주입한다.

(2) 시료를 포함하고 있는 용액은 conjugate 패드에서 1차 면역 반응에 의하여 gold particle이 부착된 conjugate와 결합하게 된다.

(3) 상기 (2)의 용액은 분리 membrane으로 흡수 전개되어진다.

(4) 용액이 포획 항체 line에 도달하여 2차 면역 반응에 의하여 포획항체에 의하여 고정되어지고 이와 함께 gold particle도 축적되어진다.

(5) 상기 (4)와 같이 축적된 gold는 유관으로 관찰되는 band를 형성한다.

(6) 상기 (4)에서 면역반응에 참여치 못한 분석 대상물질은 용액과 함께 계속 전개되어 다음 포획항체 line에 도달하게 된다.

(7) 두 번째 포획 항체 line에서 상기 (4)에서 와 같은 반응으로 두 번째 band를 형성하게 된다.

(8) 상기 (4),(5),(6),(7)과 같이 용액이 계속 전개되면서 시료내의 분석 대상물질의 양에 따라 각기 다른 수의 band가 형성된다.

그림 4. 실시예 3의 결과 예상도.

시험 결과 : 본 시험에 활용된 시료내의 검사 대상 물질은 10개의 band를 형성하여 평균에 비하여 매우 높은 수치를 나타내었다.

[실시예 4]

(1) 검사하고자 하는 시료를 시료패드에 주입한다.

(2) 시료를 포함하고 있는 용액은 conjugate 패드에서 1차 면역 반응에 의하여 gold particle이 부착된 conjugate와 결합하게 된다.

(3) 상기 (2)의 용액은 분리 membrane으로 흡수 전개되어진다.

(4) 용액이 포획 항체 line에 도달하여 2차 면역 반응에 의하여 포획항체에 의하여 고정되어지고 이와 함께 gold particle도 축적되어진다.

(5) 상기 (4)와 같이 축적된 gold는 유관으로 관찰되는 band를 형성한다.

(6) 상기 (4)에서 면역반응에 참여치 못한 분석 대상물질은 용액과 함께 계속 전개되어 다음 포획항체 line에 도달하게 된다.

(7) 두 번째 포획 항체 line에서 상기 (4)에서 와 같은 반응으로 두 번째 band를 형성하게 된다.

(8) 상기 (4),(5),(6),(7)과 같이 용액이 계속 전개되면서 시료내의 분석 대상물질의 양에 따라 각기 다른 수의 band가 형성된다.

그림 5. 실시예 4의 결과 예상도.

시험 결과 : 본 시험에 활용된 시료내의 검사 대상 물질은 2개의 band를 형성하여 평균에 비하여 매우 낮은 수치를 나타내었다.

[비교예 1]

본 발명의 기법과 전통적인 EIA 기법을 비교하였다.

(1) 분석하고자 하는 시료를 분석장비 등이 구비되어 있는 장소로 운반하여 이를 정해진 순서에 따라 아래의 그림과 같은 micro well plate에 일정량을 주입한다.

(2) 이때 분석의 기준이 되는 표준 시료를 함께 주입하여 분석한다.

(3) 각 micro well plate의 내부 표면에 고정되어 있는 1차 포획 항체와의 결합 반응에 의하여 대상 물질은 well plate 표면에 부착된다.

(4) 각 micro well을 세척하여 불순물을 제거하고 여기에 발색 효소가 부착된 2차 항체를 주입하여 분석 대상 물질과 결합 반응을 이루도록 하고 세척한다.

(5) 상기의 (4)에 발색 시약을 가하여 효소에 의한 분해를 이루도록 하여 발색을 시켜주고 이를 micro well plate reader등의 분석 장비로 확인한다. 이때 시료내의 분석 대상 물질의 농도는 표준 시료의 수치와 각 시료의 수치를 비교하여 판정한다.

그림 6. 비교예 1에 활용되는 micro well plate.

비교 결과 : 상기의 EIA 기법은 과정의 복잡함에의 하고 오랜 시간이 소요된다. 그리고 본 기법은 분석 장비 등이 필요하여 이러한 장비가 없는 곳에서는 시행이 불가능하다.

이에 반하여 본 발명의 기법은 환자의 혈청을 직접 시료로 사용하여 단시간 내에 별도의 장비 없이 간편하게 현장에서 결과를 확인할 수 있었다.

[비교예 2]

본 발명의 기법과 전통적인 RIA 기법을 비교하였다.

(1) 분석하고자 하는 시료를 분석장비 등이 구비되어 있는 장소로 운반하여 이를 정해진 순서에 따라 비교예 1에서 활용된 것과 유사한 형태의 micro well plate( 그림 6. )에 일정량을 주입한다.

(2) 이때 분석의 기준이 되는 표준 시료를 함께 주입하여 분석한다.

(3) 각 micro well plate의 내부 표면에 고정되어 있는 1차 포획 항체와의 결합 반응에 의하여 대상 물질은 well plate 표면에 부착된다.

(4) 각 micro well을 세척하여 불순물을 제거하고 여기에 방사선 동위 원소가 부착된 2차 항체를 주입하여 분석 대상 물질과 결합 반응을 이루도록 하고 세척한다.

(5) 상기(4)의 micro well plate를 방사선 동위원소 분석 장비 등의 분석 장비로 확인한다. 이때 시료내의 분석 대상 물질의 농도는 표준 시료의 수치와 각 시료의 수치를 비교하여 판정한다.

비교 결과 : 상기의 RIA 기법은 과정의 복잡함에의 하고 오랜 시간이 소요된다. 그리고 본 기법은 방사선 동위 원소 분석 장비 등이 필요하여 이러한 장비가 없는 곳에서는 시행이 불가능하다.아울러 분석에 사용되는 시약이 방사선 동위 원소이기에 보관과 관리에 각별히 주의하여야 하며 이와 함께 시약의 제조일이 많이 경과하게 되면 사용을 할 수 없게 된다.

이에 반하여 본 발명의 기법은 환자의 혈청을 직접 시료로 사용하여 단시간 내에 별도의 장비 사용 없이 현장에서 결과를 확인 할 수 있었다.

Claims (1)

1. membrane 내에 고정되어 있는 대상 시료에 대한 포획 항체를 사다리 혹은 bar-code 와 같은 형태로 여러개의 line으로 제작 하여주고,사용하는 membrane을 기존의 membrane에 비하여 1/2 혹은 1/3 정도로 ( 약 1 - 1.5mm ) 좁게 제작하여 membrane 중앙 부위에서도 한 두 개의 절단 모서리를 추가적으로 형성시켜주어 원활하게 용액이 전개될 수 있도록 제작하여 주고, 시료내의 분석대상 물질이 membrane상에서 전개되면서 각 포획 항체 line에 포획되어 gold conjugate의 축적으로 band가 형성될 때 시료내의 분석 대상 물질의 농도에 따라 각기 다른 수의 band가 형성 될 수 있도록 하여주어 간편하게 membrane immuno chromatography기법으로 분석하고자 하는 대상 물질의 농도를 확인할 수 있는실험기법.