CN111033226A - 用于定量分析的新型通用检验系统 - Google Patents

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A·惠勒
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Abstract

本文公开的是一种盒，其允许使用仪器对样品进行检验时进行定量分析，而无需终端用户采用额外步骤。所述盒包括校准带和样品带。所述校准带包含已知量的分析物，可从中建立校准曲线并将其应用于对样品带的分析。本公开的盒可以采用光透射技术或光反射技术。所述盒可以包括单独的清洗口，该清洗口用于快速清洗高本底样品。本公开的盒可以对人、动物、环境样品和/或食物样品进行诊断测试。在某些情况下，本公开的装置和技术可以用于在即时检测设置点监测药物治疗的功效以及患者对医生开具的药物的依从性。

Description

用于定量分析的新型通用检验系统
相关申请的交叉引用
本申请要求申请日为2017年9月20日、序列号为No.15/710,223的美国专利申请的优先权，该美国专利申请本身要求申请日为2017年6月9日、序列号为No.62/517,441的美国临时申请的优先权，上述两件美国专利申请的内容通过引用并入本文。
背景技术
血液测试占人类医学测试需求的绝大部分。随着医生对药物治疗功效监控需求的日益增长，对便携式定量即时(point of care,POC)检验系统的需求也日益增长。POC检验预计将在2022年的某个时间达到220亿美元。通常，大部分血液检验都是在中央实验室中使用昂贵且复杂机器人进行的。为了使许多血液检验进入POC市场，这些检验至少必须是简单易行的，并提供与中央实验室相同的精度和准确性。中等复杂的技术(例如，ELISA)使医生在某些情况下可以避免使用中央实验室。但是，这些技术通常不适用于得到临床实验室改进修正案(CLIA)许可的POC医生，并且这些技术通常不受食品和药物管理局(FDA)的CLIA认证，因此无法用于即时检验。以前提供定量即时检验的工作依赖于在制造日期设定的预制校准曲线，并通过与一次性测试一起出售的条形码或芯片装置进行传输。但是，预制的校准曲线具有很大的局限性。
发明内容
本公开的技术可以克服先前使用的技术存在的问题，因为本公开的技术使含有目标分析物的样品和校准带同时运行，该校准带含有不同浓度的被测目标分析物或对照分析物(即，与目标分析物不同的分析物)，同时还使用了相同的结合剂。因此，检测器结合剂的任何微小的不稳定性都会在校准曲线和患者样本的构建中起到同等程度的作用。换句话说，本公开的系统是自校正的并能够产生可重复且准确的结果。
本公开描述了多种定量和定性分析的装置和方法。具体地，公开了一种包括“板载(on-board)”校准器的盒。在许多情况下，该盒包括用于校准的侧流带和用于样品的侧流带。侧流带由允许流体毛细运动的多孔膜组成。“校准带”包括至少两个具有已知浓度的分析物的区域，在某些情况下，“校准带”包括三个、四个或更多个具有已知浓度的分析物(样品中的目标分析物或对照分析物)的区域。为了使用盒进行检测，将样品放置在“样品带”上，并向样品带和校准带两者提供示踪流体(chase fluid)。示踪流体与样品带和校准带的垫接触并从中释放结合物，然后结合物沿带向上移动。该结合物是目标分析物的结合配偶体，可以含有标记物或由标记物组成。在所述校准带上，结合物遇到分析物并与存在的分析物结合。一旦与分析物结合(直接结合或通过独特的结合配偶体间接结合)，标记物就会发出信号，该信号与存在的分析物的量成正比。然后用仪器对在校准带上产生的信号进行光学判读，以生成校准曲线，该校准曲线用于计算或判读在样品带上产生的并发信号。本公开的盒可以与能够通过光透射或光反射来判读图像的仪器兼容。在需要增加灵敏度的实施方式中，可以使用光透射。
本公开的盒可被配置成测量任何所需的目标分析物。例如，该盒可以配置成测量抗原、抗体、激素、蛋白质、受体、DNA、RNA、酶、药物和/或环境污染物。可根据所选的目标分析物和/或对照分析物来选择合适的结合配偶体和/或标记物，并将其用于建立合适的校准带和样品带。
在一种具体的示例性实施方式中，盒被设计为测量目标抗原。所述盒的校准带包括已知浓度的抗原和与抗原免疫结合的抗体。在该示例性实施方式中，盒包括含有标记物(例如，金颗粒)的结合垫。当引入示踪流体时，所述标记物被重构，并移动到与抗体结合的抗原上且与该抗原结合。在所述样品带上，样品混合并与示踪流体一起重构标记物(在此示例中，为胶体金检测器颗粒)并移动到多孔膜上。如果存在抗原，则产生信号。
在一种不同的示例性实施方式中，盒被设计为测量目标抗原，所述校准带包括已知浓度的与标记物结合的抗原。在这个示例性实施方式中，结合垫含有抗体，当引入示踪流体时，所述抗体移动到与标记物结合的抗原上并与该抗原结合。本公开的盒可以包括校准带和样品带，校准带和样品带具有适用于特定目标分析物的合适的结合配偶体和/或标记物的多种可行的组合。尽管详细讨论了抗体和抗原，但是本公开内容并不仅限于此。例如，包括例如激素、蛋白质、维生素、酶、DNA、RNA、药物物质和/或环境污染物的分析物的样品带和校准带均在本公开的范围内。
出乎意料地，本公开的具有“板载”校准特征的盒能够使流体、样品、结合剂和/或标记物均匀且无明显差异地分布在两个侧流带上。此外，本公开的盒能够从校准带产生稳健(robust)且稳定的校准曲线，并准确地报告来自样品带的未知定量结果。
附图说明
图1示出了根据本公开的某些实施方式的包括校准带和样品带的示例性盒的透视图。
图2示出了根据本公开的某些实施方式的图1所示的示例性盒的分解图。
图3示出了根据本公开的某些实施方式的图1所示的示例性盒的底视图。
图4示出了根据本公开的某些实施方式的图1所示的示例性盒的外壳底部的俯视图。
图5示出了根据本公开的某些实施方式的图1所示的示例性盒的外壳顶部的内视图。
图6示出了根据本公开的某些实施方式配置的示例性校准带的透视图。
图7示出了根据本公开的某些实施方式配置的示例性样品带的透视图。
图8示出了根据某些示例性实施方式中使用板载校准器测量呼吸道合胞病毒(RSV)获得的定量结果的图示。
图9示出了根据某些示例性实施方式中的使用板载校准器以57.5μIU/ml的浓度测量甲状腺刺激激素(TSH)获得的定量动力学结果的图示。
图10示出了根据某些示例性实施方式中的使用板载校准器以5.75μIU/ml的浓度测量TSH获得的定量动力学结果的图示。
图11示出了根据某些示例性实施方式中的使用板载校准器以0.575μIU/ml的浓度测量TSH获得的定量动力学结果的图示。
图12示出了根据某些示例性实施方式中的示例性盒测量的像素面积随样品量的变化的图示。
图13示出了根据某些示例性实施方式中的使用板载校准器测量组织胞浆菌获得的定量结果的图示。
具体实施方式
公开了提供“板载”校准功能的检验装置，即盒。特别地，本公开的盒包括校准带和样品带，校准带和样品带均由多孔材料制成，多孔材料允许液体利用毛细作用力从中流过。校准带包含已知量的分析物，可以从中创建校准曲线并将其应用于样品带的分析。所述盒可以包括单独的清洗端，用于快速洗涤高本底样品。
盒产生信号，可以使用光透射或光反射技术来读取该信号。本公开的盒可用于人类的诊断测试、动物、环境样品和/或食品样品。如果需要的话，本公开的装置和技术可以用于即时(POC)设置中监测药物治疗的疗效和/或患者对医生开具的药物的依从性。关于盒、校准带和样品带的构造的详细信息以及相关的使用方法在下文中详细描述。
盒
根据某些示例性实施方式，图1示出了示例性的盒100的透视图，该盒100包括校准带7和样品带2。如图1所示，盒100包括具有顶部1和底部8的基本上为刚性的外壳。在某些实施方式中，外壳的顶部1和外壳的底部8可以在被一起推动时相互连接，以形成压配合或摩擦配合，并且在没有粘合剂的情况下保持机械固定在一起。在某些实施方式中，顶部的外壳1和底部的外壳8可包括夹紧区域6，夹紧区域6被设计成与相对的外壳形成压配合。在某些实施方式中，盒100包括至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个夹紧区域6。
图1示出了具有样品带2和校准带7的盒100。在盒100内，液体口5与样品带2和校准带7接触。盒100还包括样品口4，在穿过样品带2之前可以将样品引入样品口4。样品口4不与校准带7流体连通。在某些实施例中，盒100包括清洗口3，清洗口3可以用于为高本底样本(例如，溶血或有色样本)提供额外的清洗。当存在清洗口3时，清洗口3与样品带2流体连通，但不一定与校准带7流体连通。
图2示出了图1所示的示例性盒100的分解图。尤其是，流体垫5、校准带7和样品带2更加清晰可见，并且示出了夹紧区域6的特征。例如，图2示出了示例性实施方式，其中外壳的底部8包括两个臂6A，这两个臂6A夹紧在外壳的顶部1相应的凹陷区域6B上。在如图2所示的示例性实施方式中，外壳的顶部1包括四个臂6C，臂6C夹紧在外壳的底部8相应的凹陷区域6D上。
图3示出了图1所示的示例性盒100的底视图。如图3所示，外壳的底部8可以包括定位槽9，该定位槽9使盒100可以容易地定位以进行读取和分析。外壳的底部8还可以包括流动带导光口10，流动带导光口10位于校准带7的下方，其可用于基于透射的检测方法。在一些示例性实施例中，条形码11可以被放置在盒100上，如图3所示。样品带2下方的外壳的底部8也可以包括样品量分析口12。在某些实施方式中，外壳的底部8还可以包括流动带导光口13，流动带导光口13位于样品带2下方，以用于基于透射的检测方法。
图4示出了示例性盒的外壳的底部8的俯视图。如图4所示，盒的外壳底部8包括流动带导光口10、样品量分析口12、流动带导光口13和一个以上的夹紧区域6。此外，外壳底部8还可以包括多个过剩流体通道14，以使多余的液体从流动带上去除。如图4所示，过剩流体通道14可以位于流动带的一个或多个侧面上。在一些示例实施方式中，过剩流体通道14可以形成在流动带2和7之间(如图2所示)。在这些和其他实施方式中，如图4所示，过剩流体通道14(有时也称为“毛细管破坏器”)可以在的样品带2和/或校准带7的内侧和/或外侧上形成。图4示出了示例性的盒外壳，其具有在样品带2和校准带7的内侧和外侧上形成的毛细管破坏器14。
盒子外壳的底部8也可以包括侧壁15，侧壁15围绕条带2和7(如图2所示)。在某些实施方式中，在某些区域中侧壁15可以较低，以允许流体从流动带(例如，样品带或校准带)进入过剩流体通道14。在这些及其他实施方式中，还可以在外壳的底部8形成流体垫定位杆16，以便于流体垫的正确定位。
图5示出了示例性盒外壳的顶部1的内视图。如图所示，顶部1包括流体垫口17，流体垫口17分别与样品带2以及校准带7(如图2所示)流体连通。顶部1还包括将样品引入样品带的样品口4。在一些实施例中，顶部1被设置为包括多个凸起区域(在本文中称为“压力点”)，该凸起区域在样品带2和/或校准带7上施加压力。
在某些实施方式中，顶部1包括多个压力点18，与样品带2接触的压力点的数量18和与校准带7接触的压力点18的数量相等。图5示出了盒顶部1的示例性实施方式，该盒顶部1包括多个压力点18。例如，压力点18a与样品带2接触，压力点18b与校准带7接触。压力点18c围绕样品带2上方的清洗口3。在图5所示的示例性实施方式中，校准带7包括与压力点18c相同形状的压力点18d，尽管下方没有设置清洗口。在校准带和样品带上都具有相匹配的压力点，可以确保在两个带上的侧向流动过程相同，并且从带上获得的测量结果具有可比性。压力点18e与样品带2接触，压力点18f与校准带7接触。为了与围绕样品口4的压力点18g提供的接触相匹配，外壳的顶部1还可以包括压力点18h，尽管该位置没有设置口。如图5所示，可以在流体垫口17周围设置压力点18i，该压力点与样品带2和校准带7接触。
图5示出了具有十七个压力点(18a-18i)的盒，但是在考虑了本公开的内容后将理解，它建立在本公开基础之上，应当理解的是，某些示例性盒可以包括比图5所示的更多或更少的压力点。例如，在一些实施方式中，盒外壳的顶部l在每个流动带上可包括至少两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个压力点。总的来说，外壳的顶部1可以包括任意数量的压力点。例如，顶部1可包括2至30个压力点，5-25个或10-20个压力点。图5所示的示例性实施方式包括17个压力点，但是具有更多或更少压力点的实施例也在本公开的范围内。在各种实施方式中，至少一个压力点既与样品带2接触又与校准带7接触。另外，在盒外壳的顶部1上的压力点可以具有如图5所示的线性、正方形、圆形和椭圆形的形状，而在其他实施方式中，可以使用其他各种形状或形状的排列(arrangements)。
校准带
图6示出了示例性的校准带7。图6所示的校准带7包括可以使流体进行毛细运动的各种基板，基板附着在衬有粘合剂的背衬102上。在某些实施方式中，背衬102由聚合物材料制成，背衬102的长度与校准带7大致相同。在特定的实施方式中，背衬102是光学透明的。特别地，背衬102可以允许透射至少95％的可见光。然后可以将毛细流动基板104粘附到背衬102上。毛细流动基板104可以由任何合适的材料制成，例如硝化纤维或允许流体通过毛细作用流动的另一种多孔材料，例如尼龙或聚苯乙烯。在某些实施方式中，毛细流动基板104沿着背衬102的整个长度延伸，而在其他实施方式中，毛细流动基板104比背衬102短。
校准带7的毛细流动基板104可以包括标记物区域106，该标记物区域106包括已知浓度的分析物、该分析物的结合配偶体和/或标记物，当与分析物结合或与结合了分析物的结合配偶体结合时，该标记物发射出可检测的信号。在某些实施方式中，校准带7上的分析物与样品带中的目标分析物相同，而在其他的实施方式中，校准带7上的分析物是与样品中的目标分析物不同的对照分析物。在使用对照分析物的实施方式中，对照分析物可以是与目标分析物结合到同种结合剂的分析物。基于检测所使用的测试装置的设计，标记物区域106可包括适当的组分。例如，如果将示例性检测设计为检测抗原(作为目标分析物)，则该检测可使用抗体作为结合配偶体，并使用金颗粒作为标记物。在某些这样的实施方式中，标记物区域106可以包括已知量的与抗体结合的抗原或已知量的抗原和金颗粒。在标记物区域106包括与抗体结合的抗原的实施方式中，结合垫110中可以含有金颗粒，在检测时金颗粒向上移动至标记物区域106。一旦金颗粒遇到与抗体结合的抗原，它们可能会结合形成复合物。在标记物区域106包括抗原和金颗粒的实施方式中，结合垫110可以包括抗体，在检测时抗体向上移动到标记物区域106并与抗原和金颗粒形成复合物。
本公开的测试装置所采用的检测可以进行多种配置和变化。例如，在某些实施方式中，目标分析物可以是受体、激素、抗原、抗体、蛋白质、酶、DNA、RNA、维生素、药物和/或环境污染物。在这些情况下，可以根据目标分析物的特征选择合适的结合配偶体。例如，合适的结合配偶体可以是有机化合物、无机化合物、受体、抗原、抗体、激素、酶、蛋白质和/或DNA。除胶体金以外，可用于直接或间接与目标分析物结合的示例性标记物包括但不限于：酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶)、硒、放射性同位素、DNA报告子(DNAreporter)、荧光报告子(fluorogenic reporter)(例如藻红蛋白)，和/或电化学发光标记、无机化合物(例如二氧化硅、氧化铁)以及无机化合物的化学衍生物。
另外，本公开的测试装置的检测可以是竞争性的或非竞争性的，并且可以包括一个、两个或多个结合位点。例如，所述检测可以是单点非竞争性检测，其中，分析物与标记的结合配偶体(例如，标记的抗体)结合，并且检测来自标记的结合配偶体的信号以确定分析物的浓度。在其他实施方式中，检测可以是两点非竞争性检测，其中分析物与第一结合配偶体(例如，抗体位点)和标记的结合配偶体(例如，标记的抗体)结合。这种类型的检测通常被称为“三明治检测”。其他在实施方式中，检测可以是竞争性测定，其中未标记的分析物与标记的分析物竞争性地与结合配偶体(例如，抗体)结合。然后测量标记的且未结合的分析物的量，并将其用于计算样品中(最初未标记的)分析物的浓度。
图6中所示的示例性校准带7包括四个不同的(distinct)标记物区域106，但是在其他实施方式中，可以包括至少两个，至少三个、四个、五个或更多个标记物区域106。在某些实施方式中，不同标记物区域106各自为非零，而在其他实施方式中，至少一个不同标记物区域为零。例如，在一种实施方式中，校准带7可以包括两个不同的标记物区域，一个为零且另一个为非零。在另一种示例性实施方式中，校准带7可以包括两个非零的不同标记物区域。标记物区域106可以是水平线，如图6所示，或者可以是非线性的。在某些实施方式中，每个标记物区域106包括不同浓度的分析物和/或结合配偶体。然而，在其他实施方式中，两个标记物区域106可以包括相同浓度的分析物和/或结合配偶体，以评估测量偏差。例如，在某些实施方式中，校准带的标记物区域106包括浓度范围在0％至100％之间的分析物(具有或不具有结合配偶体)。在某些实施方式中，校准带的标记物区域106包括浓度变化在5％以上、20％以上或50％以上的分析物。在一种具体的示例性实施方式中，校准带包括分析物浓度为40％的第一区域、分析物浓度为60％的第二区域、分析物浓度为80％的第三区域以及分析物浓度为100％的第四区域。在某些实施方式中，标记物区域106可以设置在校准带7上，使得流体在流经分析物浓度较高的区域之前先流经分析物浓度较低的区域。相反地，可以设置标记物区域，以使流体在流经分析物浓度较低的区域之前先流经分析物浓度较高的区域。根据本文提供的教导，许多配置和变化将是显而易见的。
如图6所示，校准带7包括结合垫110，该结合垫110与毛细流动基板104接触。在某些实施方式中，结合垫110可以至少部分地设置于毛细流动基板104下方或者结合垫110至少部分地覆盖毛细流动基板104。结合垫110可以由硝化纤维或其他多孔材料制成。在某些实施例中，结合垫110可能负载有用于检测的合适的材料，例如目标分析物的结合配偶体和/或标记物。在某些具体的示例性实施方式中，结合垫包含与金颗粒结合的干燥的检测抗体(dried detection antibodies)。当通过盒100的液体口5添加示踪流体时，流体同时流至校准带7和样品带2，检测开始。示踪流体可以是任意合适的流体，例如水(例如，去离子水)。在特定的实施方式中，示踪流体可以包括一种或多种缓冲液(buffers)。示踪流体使得负载于结合垫110上的化合物移动或重构。例如，如果结合物垫包括与金颗粒结合的干燥的检测抗体，在继续向上流动到毛细流动基板104之前，示踪流体将重构金标记的检测抗体。当重构的金标记的检测抗体到达校准带上的抗原时，它与抗体-抗原结合并形成复合物(抗体-抗原-Au-抗体)，该复合物产生信号。
在某些实施方式中，样品垫112可以位于校准带7上，样品垫112至少部分与结合垫110重叠。样品垫112可以用任意合适的材料，例如硝化纤维或其他多孔材料。如下面的详细描述，样品带2包括样品垫，样品沉积在样品垫上。在样品带包括不同的样品垫的实施方式中，校准带7也可以包括类似尺寸的样品垫112，如图6所示。
另外，如图6所示，校准带7还可以包括吸收垫108，以收集过剩流体。吸收垫108与毛细流动基板104重叠，并且可以由吸收材料(例如硝化纤维或其他多孔材料)制成。在某些实施方式中，盒外壳顶部1上的一个或多个压力点18可以与吸收垫108接触。
本领域技术人员在考虑本公开的内容之后可以理解的是，校准带7可以包括比图6所示的更少或更多的不同部分。特别地，图6示出了校准带7，校准带7包括用于样品垫112、结合垫110、吸收垫108和毛细流动基板104的单独且不同的多孔构件。然而，在某些实施方式中，校准带7可以由更少的不同的多孔构件组成。例如，在某些实施方式中，校准带7可以由单个一体的多孔构件形成，在某些实施方式中，该单个一体的多孔构件包括与样品垫112、结合垫110、吸收剂垫108和/或毛细管流动基板104相对应的区域。对于本领域技术人员而言，许多配置和变形将是显而易见的。
样品带
图7示出了示例性样品带2，其包括背衬202、毛细管流动基板204和吸收垫208，背衬202与校准带7的背衬102可以相同或不同，毛细管流动基板204与毛细流动基板104可以相同或不同，吸收垫208与吸收垫108可以相同或不同。在某些情况下，在校准带和样品带中使用相同的材料作为背衬、毛细流动基板和吸收垫可能有利于带之间的均匀性，并确保相似的测量环境。样品带2还包括结合垫210和样品垫212，结合垫210可以如关于结合垫110所描述的那样设置；样品垫212可以如关于样品垫112所描述的那样进行设置。在某些实施方式中，校准带7的样品垫112使用的材料与样品带2的样品垫212使用的材料相同。
如图7所示，样品带2可以包括测试线214和对照线216。样品带2可以被设置成使流体在遇到对照线216之前先遇到测试线214(如图7所示)，或者使流体在遇到对照线214之前先遇到测试线216。在某些实施方式中，对照线216包括已知量的分析物(目标分析物或对照分析物)，并且测试线214包括一种或多种目标分析物的结合配偶体。在某些实施方式中，对照线216也可以包括用于分析物和/或标记物的结合配偶体。例如，在一种具体的实施方式中，目标分析物是抗原，对照线216包括已知量的与抗体结合的抗原。在该示例性实施例中，测试线214还包括将与样品中的分析物结合的抗体。该示例性盒的检测采用标记物颗粒，标记物颗粒从结合垫上移出并与样品带2上形成的分析物复合物结合。在一种不同的示例性实施方式中，对照线216包括已知量的分析物和标记物。在该示例性实施方式中，测试线214包括标记物颗粒，并且当抗体结合配偶体从结合垫移动至测试线214和对照线216时，进行检测。在考虑了本公开之后，对照线216和测试线214的许多变化对于本领域技术人员将是显而易见的。
工作例1
在第一示例性实施方式中，设计了一种用于定量检测呼吸道合胞病毒(RSV)的盒，该盒包括样品带和校准带。样品带和校准带的常见侧向流动结构如下所述。
使用罗曼公司(Lohmann Corporation)的胶粘剂背衬塑料(.010"白色或透明的聚酯，与
Figure BDA0002379640250000121
acrylic PSA层压，并用离型纸支撑)构造了一个示例性侧流带。将赛多利斯(Sartorius)的25mm CN140硝化纤维(Nitrocellulose)放置于罗曼背衬材料的顶部，距背衬材料的底部约37mm。将沃特曼/GE(Whatman/GE)的22mm宽的吸收垫材料CF5叠加(indexed)在罗曼背衬材料的顶部，在硝化纤维上形成重叠，并与盒外壳的压力点相对应。在硝化纤维的下方放置结合垫材料(放置14mm的奥斯龙(Ahlstrom)6614和/或奥斯龙1281，以使其在硝化纤维的顶部形成重叠)。最后将24mm的样品施加材料叠加(indexed)到罗曼背衬材料的底部，以在结合垫材料上形成重叠。组装好所有组件后，然后使用比奥多(Biodot)切割刀将层压材料切成6mm宽的带。另外，将奥斯龙6614制成的流体垫切割成10×15mm，并将其置于带的底部。为了免疫结合抗原，硝化纤维用于结合针对目标抗原的抗体，其范围为50pg/ml-3mg/ml。比奥多喷点平台(Biodot dispensing platform)用于精确分配四行抗体。随后将硝化纤维在强制热空气下干燥。使抗原第二次通过比奥多喷点平台后分配到抗体的顶部，然后干燥。为了创造增加的信号强度阶梯，增加每行使用的抗原(ng/mL)(底部最少)的量。将与样品带具有相同批次和浓度的与金颗粒结合的检测抗体施加到结合垫材料上并干燥。
通过使用比奥多喷点系统(Biodot dispensing system)，以1μL/cm的速率将来自爱沙尼亚公司(Virostat Inc)的浓度为1.5mg/mL的单克隆抗RSV抗体沉积到赛多利斯CN140硝化纤维上以制备样品带。以1μL/cm的速率将浓度为0.5mg/mL的山羊抗鸡对照线沉积在RSV线的北部。奥斯龙1281重叠在硝化纤维上，奥斯龙6614用作样品/结合垫。使用比奥多喷点系统以15μL/cm的速率将溶液向下喷洒到奥斯龙6614上并干燥，该溶液含有结合了BBI 60nm胶体金颗粒的爱沙尼亚公司的RSV抗体溶液，并含有结合了BBI 40nm胶体金颗粒的鸡IgY。这些带层压到罗曼背衬材料上之后，使用比奥多切割器(biodot cutter)将其切成6mm宽。
该示例性实施例的校准带构造如下。使用比奥多喷点平台，将来自爱沙尼亚公司的1.5mg/mL的单克隆RSV抗体在赛多利斯CN140硝化纤维上沉积成四条均匀间隔的线并干燥。使来自Zeptometrix公司的RSV抗原阳性对照的稀释液(第1行40％，第2行60％，第3行80％，第4行100％)第二次通过比奥多点胶平台并沉积于抗体线上方并干燥。
使用聚乙二醇辛基苯基醚(Triton x 100)、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Trisbuffer)和普鲁克林300(Proclin 300)制备用于RSV试剂的示踪流体。在添加样品后，将此溶液添加到液体入口。
所述的校准带和样品带与流体垫一起组装到盒中。将20μL的患者样本添加到样品入口，患者样本由鼻拭子、鼻咽拭子、洗鼻液或病毒转运介质制备。将300μL示踪流体添加到流体入口。然后使盒在室温下反应10分钟。使用德泰生物医学(Detekt Biomedical)的光反射侧向流动读取系统记录来自校准带上的四条校准线的信号，并将其与样品带产生的未知信号进行比较。，每个盒都根据在10min的时间点产生的信号计算得出各自的校准。然后将从该示例获得的数据与标准(阳性对照的稀释液)进行比较，以确定盒式装置的准确性。表1示出了获得的结果。图8示出了使用板载校准器测量RSV获得的结果的图示。
表1板载校准器测量RSV的准确性
RSV实际浓度 RSV测量浓度 差值 差值百分比％
0％ -.035％ 0.35％ N/A
5％ 4.99％ 0.01％ 0.20％
10％ 10.52％ 0.52％ 5.19％
25％ 23.30％ 1.70％ 6.8％
50％ 51.70％ 1.70％ 3.4％
100％ 100.90％ 0.90％ 0.90％
如表1所示，示例检测装置准确地预测了阳性对照溶液的稀释百分比。此外，记录的最大差值小于误差测量值的7％。在某些实施方式中，样品中分析物浓度的定量测量的误差百分比小于5％、4％、3％、2％或1％。
工作例2
在另一个示例性实施例中，建立了动力学侧流实验以检测全血中的人类甲状腺刺激激素(TSH)水平。根据以下过程建立示例性测试装置。根据工作例1中所述的通用侧向流结构制备校准带和样品带。
通过使用比奥多喷点系统，以1μL/cm的速率将浓度为2mg/mL的单克隆TSH(Biospacific)抗体沉积到28mm的赛多利斯CN140硝化纤维膜上以制备样品带。以1μL/cm的速率将浓度为0.5mg/mL的山羊抗鸡对照线沉积在TSH线以北。将奥斯龙(Ahlstrom)6614(14mm)与硝化纤维重叠并用作结合垫材料。使用比奥多喷点系统将溶液以15μL/cm的速率向下喷洒到奥斯龙6614上并干燥，该溶液含有与BBI 60nm胶态金颗粒结合的单克隆TSH(Biospacific)抗体和与BBI 40nm胶体金颗粒结合的鸡IgY。将这些带层压到罗曼背衬材料上之后，就使用比奥多切割器将其切成6mm宽。
使用比奥多喷点平台，将四条均匀分布的线沉积到赛多利斯CN140硝化纤维上并干燥制成校准带，四条线的抗体和浓度与样品带使用的抗体和浓度相同。时，将来自斯克里普斯实验室(Scripps Laboratories)的TSH稀释到不含TSH的人血清中(第1行3.6ng，第2行0.36ng，第3行0.036ng，第4行0.0036ng)并第二次通过比奥多点胶平台，沉积在抗体线上方并干燥。
研制示踪流体以与TSH试剂兼容并限制血液溶血。示踪流体包含吐温20(Tween20)、碳酸氢钠和EDTA。在引入样品后，将此溶液添加到流体入口。
将示例性校准带和样品带与流体垫一起组装到盒中。将20μL的患者样本添加到样品入口，将200μL的检测运行液(assay run fluid)添加到流体入口。
然后将盒插入光传输仪器(OIDx)中，该仪器可以随时间动力学分析盒。记录来自四个校准线的信号，并将其与样品产生的未知信号进行比较。每个盒都接收到自己的校准，该校准是根据在不同时间点生成的信号计算得出的。为了确定板载校准系统的准确性，使用已知标准的样品(世界卫生TSH标准稀释液)。图9示出了57.5μlU/ml样品的计算浓度与实际浓度的比较随检测时间的变化，图10示出了57.5μlU/ml样品的计算浓度与实际浓度的比较随检测时间的变化。
如图11所示，0.575μIU/TSH样品在三分钟内达到该值。在其他实施方式中，使用0.0575μIU/ml的较低标准具有相似的结果。通过使用位于样品带或校准带的对照线上的累积信号，结合检测停止功能，可以将动力学检测设计为在检测的检测限(LOD)处产生值。例如，在上述实验中，如果LOD为0.575μIU/ml，则检测将在三分钟内完成。在某些示例性实施例中，LOD可以低至0.1μIU/ml或0.05μIU/ml。在某些实施方式中，本文所述的装置能够在引入示踪流体后的十分钟内以其LOD(例如0.05μIU/ml或更低的浓度)检测到分析物。
工作例3
在另一种示例实施方式中，设计了一种用来检测人类全血中的TSH水平的盒，当全血被用作样本时会引起本底染色。并评估了透光性和样品量分析。根据工作例1中描述的通用侧向流结构制备校准带和样品带。示例性盒的构造如下。
使用比奥多喷点系统，以1μL/cm的速率将浓度为2mg/mL的单克隆TSH(Biospacific)抗体沉积在28mm的赛多利斯CN140硝化纤维上来制备样品带。以1μL/cm的速率将浓度为0.5mg/mL的山羊抗鸡对照线沉积在TSH线以北。使奥斯龙6614(14mm)与硝化纤维重叠，用作结合垫材料。使用比奥多喷点系统，以15μL/cm的速率将溶液向下喷洒到奥斯龙6614上并干燥，该溶液含有与BBI 60nm胶体金颗粒结合的单克隆TSH(Biospacific)抗体和与BBI 40nm胶体金颗粒结合的鸡IgY。将这些带层压到罗曼背衬材料上之后，就使用比奥多切割器将其切成6mm宽。
研制示踪流体以与TSH试剂相容并限制血液溶血。示踪流体包括吐温20、碳酸氢钠和EDTA。引入样品后，将该溶液添加到流体入口。将25μL高度溶血的全血样品添加到样品口，然后按正常情况检测。检测9分钟后，目测评估盒是否存在由于溶血引起的问题。表2描述了观察到的情况以及如何使用清洗口清除背景。
表2使用清洗口的实验技术
Figure BDA0002379640250000161
Figure BDA0002379640250000171
如本示例性实施例所示，清洗口可以提供清除高本底样本的有效方法。此外，清洗口也可以适用于自动化操作。例如，在某些实施方式中，可以将盒设置成当检测到特定信号强度的背景噪声时通过清洗口自动施加溶液。对于本领域技术人员在考虑本项公开的情况下，多种实施技术将是显而易见的。
工作例4
在另一种示例性实施方式中，建立了一种用于测量透光性和样本量的仪器。本示例仪器在本文中被称为“OIDx”。对OIDx仪器及进行了编程，以测量图像中的像素区域。为了对仪器进行编程，将不同量的全血添加到示例性盒的样品口中。在加入全血30秒后捕获到带的图像。图12示出了测量信号(基于像素面积)随样品量变化的曲线图。
如图12所示，在14μL和26μL之间样品量与测得的像素面积呈线性关系。在某些实施方式中，示例性透光仪器可以避免使用移液管来转移一定体积样本(例如来自手指刺伤的血液)的需要。这可能会减少试验程序中其他的操作步骤，从而增加从FDA获得CLIA豁免资格的可能性。
工作例5
在另一种示例性实施方式中，建立了一种用于检测尿液中的组织胞浆的盒。如前所述，使用通用侧向流结构制备了用于盒的样品带。为了制备样品带，使用比奥多点胶系统，以1μL/cm的速度将浓度为1.5mg/mL的兔单克隆抗组织胞浆沉积在25mm的赛多利斯CN140硝化纤维上。以1μL/cm的速率将浓度为0.5mg/mL的山羊抗鸡对照细胞沉积在抗组织细胞浆线以北。使奥斯龙6614与硝化纤维重叠，并用作结合物垫和样品垫。在沉积胶体金之前先对奥斯龙6614进行处理以减少对尿液样品的干扰。使用比奥多喷点系统，以15μL/cm的速率将溶液向下喷洒到奥斯龙6614上并干燥，该溶液含有与IMRA 40nm胶体金颗粒结合的抗组织胞浆和与IMRA 40nm胶体金颗粒结合的鸡IgY。一旦层压到罗曼背衬材料上后，使用比奥多切割器将这些带切成6mm宽。
研制与组织胞浆试剂相容的示踪流体，以限制尿液样本的干扰。示踪流体含有十二烷基硫酸钠、柠檬酸钠和磷酸盐缓冲液。将所述带与流体垫一起放入盒中。
将60μL掺有已知浓度的组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)的尿液添加到样品口。将300μL示踪流体添加到液体口中并运行测试10分钟。在德泰生物医学阅读器上读取结果以量化信号。获得的数据如图13所示。图13所示的数据表明，可以使用本文所述的方法和设备在尿液中检测组织胞浆菌。
其他示例性实施方式
提供以下其他示例性实施方式以更详细地描述当前公开的方法和装置的方面，并且不旨在限制本公开的范围。
在某些示例性实施方式中，提供了用于定量样品分析的通用方法。在某些情况下，该方法可以包括在样品分析的同时获得校准曲线，而不需要额外的用户操作步骤。在这些和其他实施方式中，可以实现基于侧向流动的系统，将样品添加到吸收剂材料中，该吸收材料与示踪流体重新形成干燥的胶体金抗体检测剂结合物或其他合适的检测剂结合剂。通过毛细作用力，样品和胶体金检测剂侧向移动到受控的多孔膜上，诸如抗体、抗原、受体等的结合配偶体已预先吸附在该膜上。如果样品中存在分析物，即抗原或抗体，则特定的结合剂之间会发生反应，从而产生可以通过仪器直观地或定量地读取的信号和校准曲线。这通常被称为“三明治检测”，其中目标分析物被夹在两个合适的结合配偶体之间，其中一个结合配偶体具有与结合剂相关的检测器信号。信号与分析物浓度成正比。在这些和其他实施方式中，仪器会分析与样品带上的信号同时产生的校准带上的信号，以建立与样品进行比较的校准曲线或标准曲线，从而得到样品的定量结果。
根据测得的信号建立校准曲线(有时称为“标准曲线”)的技术是本领域技术人员已知的。例如，可以将分析物浓度与测得的信号进行作图，并在数据点之间生成一条最佳拟合线。在某些情况下，最佳拟合线可能会遵循方程y＝mx+b，其中y是测得的信号，m是灵敏度(即线的斜率)，x是分析物浓度，b是归因于背景的常数。一旦生成最佳拟合线，就可以使用公式确定未知的分析物浓度。在某些系统中，在特定的分析物浓度范围内，分析物浓度与所测得的信号之间的关系可以是线性的或近似线性的。在本文中，将测量信号与分析物浓度具有线性关系的区域称为“线性范围”。在某些情况下，线性范围可以在系统的检测限(LOD)和线性限(LOL)之间扩展。低于LOD，测得的信号可能会受到背景干扰，而高于LOL，测得的信号与分析物浓度呈非线性关系。因此，与在线性范围外的值相比较，在LOD和LOL之间(在线性范围内)获得的测量结果可以生成更可靠的校准曲线。
如前所述，本公开的装置包括具有特定分析物浓度的校准带，选择具有特定分析物浓度的校准带产生信号以生成可靠的校准曲线，从而以量化施加到样品带上的溶液中的分析物浓度。在某些实施方式中，本公开的校准带包括至少一个非零分析物浓度值。在这些和其他实施方式中，校准带可包括分析物浓度为零的区域，从该区域测量信号，然后将其用于生成校准曲线。在某些具体示例性实施方式中，仅有从校准带读取的两个信号(一个来自分析物浓度为非零的区域，另一个是分析物浓度为零的区域)可用于生成校准曲线。在某些这样的示例实施方式中，可以将非零分析物浓度设定于线性范围内，以最大程度地提高准确性。在这些和其他实施方式中，在分析物浓度为零的区域中测得的信号将对应于最佳拟合线方程中的“b”变量的值，且该信号将指示由背景和非特异性结合产生的信号。在多种实施方式中，来自分析物浓度为零的区域的测量信号也可以用于提供其他安全控制。例如，在分析物浓度为零的区域出现可见的颜色可能表示测试失败和/或结果不准确。在考虑本公开的主题后，许多设置和变型对于本领域的技术人员将是显而易见。
本公开的盒可与通过光透射或光反射来分析图像的仪器兼容。在某些实施方式中，可使用基于光反射和基于透射的检测方法来读取盒。在需要增加灵敏度的实施方式中，可以使用光透射。
在某些实施方式中，可提供样品定量分析结果。但应该理解，在某些实施方式中，如果需要的话，定量结果可以定性报告。例如，在TSH测量中，测量结果可能报告为甲状腺机能正常(EUTHYROID)、甲亢(HYPERTHYROID)或甲状腺功能减退(HYPOTHYROID)。
在某些实施方式中，本公开的方法可以用于检测包括处方在内的药物治疗的疾病的进展或消退。在某些实施方式中，该系统可以用于监测患者对处方药物的依从性。
在多种实施方式中，所产生的信号在基于纳米材料的生物传感器的胶体金外还结合了各种检测策略，例如荧光标记、酶、化学发光化学(chemiluminescence chemistries)、铁磁颗粒和二氧化硅颗粒。
在某些情况下，定量结果可以报告为每单位体积的分析物的质量浓度、每单位体积的活性单位或参考值的百分比。
由于在装置内的精确位置设置了压力点并且适当结合屏障，以确保将液体的迁移或流动完全限制在带上，因此本公开的盒可以使液体在样品带和校准带上均匀流动。本公开的系统还可以使用相同的盒和仪器利用基于光反射或透射的检测。对于某些测试，例如不需要数字或定量的妊娠测试，可以目测读取该测试结果。在某些实施方式中，清洗口可以用于定量具有溶血特征的全血或有色样品。通过结合合适的基于膜的过滤器，本公开的系统还可以具有去除某些样品中可能存在的干扰(假阳性)颗粒的能力。本公开的系统还可以成像并记录添加到设备中样品的体积(例如，从刺破的手指滴一滴血，这将不需要精确的移液器)。将胶体金和样品在板外混合以增加灵敏度和灵活性，这可用于任何公开的检测设计中。
在某些实施方式中，本公开的盒可以检测多种类型的样品，包括全血、尿液、唾液、拭子和/或粪便。本公开的系统具有动力学测定性能，可以快速(例如，在两到十分钟之内)报告结果，测试时间取决于样品浓度。本公开的系统具有实施核酸(PCR，rtPCR)检测的能力和/或在同一带上多路分析物的能力。本公开的系统还可以与含胶体金、乳胶颗粒、荧光标记和超顺磁性颗粒相容。在某些实施方式中，校准带可以具有针对特定批次的校准器，该校准器参照在制造日期采用的校准曲线。
本文描述的特征和优点并没有全部包括，尤其是，基于附图、说明书和权利要求书，许多附加特征和优点对于本领域的普通技术人员是显而易见的。此外，应注意，本说明书中使用的语言主要是出于可读性和指导性的目的，而不是为了限制本文所述的发明主题的范围。为了说明的目的，上述已给出了本公开的实施例；但是，本发明不限于本公开的实施例。它并不旨在穷举或将权利要求限制为本公开的精确形式。根据以上公开内容，相关领域的技术人员可以理解，许多修改和变化是可能的。

Claims (29)

1.一种盒，包括：
校准带，所述校准带包括第一区域和第二区域，所述第一区域含有第一浓度的分析物，所述第二区域含有第二浓度的所述分析物，其中所述第一浓度与所述第二浓度不同；
样品带，所述样品带平行于所述校准带放置；
样品口，所述样品口与所述样品带流体连通；以及
液体口，所述液体口与所述校准带和所述样品带流体连通。
2.根据权利要求1所述的盒，其中，所述校准带还含有结合配偶体，所述结合配偶体用于所述第一区域和所述第二区域中的所述分析物。
3.根据权利要求1所述的盒，其中，所述校准带还包括含有标记物的结合垫，所述标记物被设置为与所述分析物或结合配偶体结合。
4.根据权利要求1所述的盒，其中，所述校准带还含有标记物，所述标记物与所述第一区域和所述第二区域中的所述分析物结合，或者所述标记物被设置为与所述第一区域和所述第二区域中的所述分析物结合。
5.根据权利要求4所述的盒，其中，所述校准带还包括结合垫，所述结合垫包括用于所述分析物和/或所述标记物的结合配偶体。
6.根据权利要求1所述的盒，其中，所述校准带还包括第三区域，所述第三区域含有第三浓度的所述分析物，所述第三浓度与所述第一浓度不同且所述第三浓度与所述第二浓度不同。
7.根据权利要求1所述的盒，其中，所述盒还包括与所述样品带流体连通的清洗口。
8.根据权利要求1所述的盒，其中，所述样品带还包括对照线和测试线，所述对照线含有已知浓度的分析物，该分析物与目标分析物不同，所述测试线含有目标分析物的结合配偶体。
9.根据权利要求1所述的盒，其中，所述分析物的所述第一浓度为零，所述分析物的所述第二浓度大于零。
10.根据权利要求1所述的盒，其中，所述分析物的所述第一浓度大于零，所述分析物的所述第二浓度大于零。
11.根据权利要求1所述的盒，其中，所述目标分析物为受体、抗原、抗体、激素、蛋白质、酶、DNA、RNA、药物或环境污染物。
12.根据权利要求1所述的盒，所述盒还包括外壳，所述校准带和所述样品带被固定容纳于所述外壳内，其中，所述外壳至少在两个位置接触所述样品带，并且所述外壳至少在两个位置接触所述校准带。
13.根据权利要求12所述的盒，其中，所述外壳至少在四个位置接触所述样品带，并且所述外壳至少在四个位置接触所述校准带。
14.一种盒，包括：
基本上为刚性的外壳，所述外壳包括顶部和底部；
校准带，所述校准带保持于所述外壳中，所述校准带包括第一区域和第二区域，所述第一区域含有第一浓度的分析物，且所述第二区域含有第二浓度的所述分析物，其中，所述第一浓度与所述第二浓度不同；
样品带，所述样品带保持于所述外壳中；
样品口，所述样品口形成于所述样品带上方的所述外壳的顶部；以及
液体口，所述液体口形成于所述校准带和所述样品带上方的所述外壳的顶部。
15.根据权利要求14所述的盒，其中，所述外壳的顶部还包括清洗口，所述清洗口形成于所述外壳的顶部以提供通向所述样品带的通道。
16.根据权利要求14所述的盒，其中，所述外壳的底部包括位于所述样品带下方或所述样品口下方的样品量分析口。
17.根据权利要求14所述的盒，其中，所述外壳的底部包括位于所述样品带和所述校准带下方的流动带导光口。
18.根据权利要求14所述的盒，其中，所述外壳的顶部包括多个压力点，其中至少两个压力点与所述样品带接触，并且至少两个压力点与所述校准带接触。
19.根据权利要求14所述的盒，其中，所述盒还包括形成在所述外壳的底部的多个过剩流体通道，其中一个或多个所述过剩流体通道与所述样品带流体连通。
20.根据权利要求19所述的盒，其中，一个或多个所述过剩流体通道与所述校准带流体连通。
21.一种测量样品中分析物浓度的方法，所述方法包括：
将所述样品引入具有校准带和样品带的盒中；
将流体引入所述校准带和所述样品带；
对来自所述校准带的至少两个信号进行光学检测；
由所述至少两个信号生成校准曲线；
检测来自所述样品带的信号；以及
根据来自所述样品带的信号和来自所述校准曲线的信号，确定所述样品中所述分析物的浓度的定量测量值。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，使用光透射或光反射检测来自所述校准带的信号。
23.根据权利要求21所述的方法，其中，使用光透射或光反射检测来自所述样品带的信号。
24.根据权利要求21所述的方法，其中，将所述流体同时引入所述校准带和所述样品带。
25.根据权利要求21所述的方法，其中，在引入所述流体后的十分钟之内，对来自所述样品带的信号进行光学检测。
26.根据权利要求21所述的方法，其中，所述样品中的所述分析物浓度的定量测量的误差百分比在1％到10％之间。
27.根据权利要求21所述的方法，其中，该方法用于在即时(POC)设置中监测药物治疗的疗效和/或患者对医生开具的药物的依从性。
28.根据权利要求21所述的方法，其中，从所述校准带光学检测到的至少两个信号是由分析物浓度不为零的区域产生的。
29.根据权利要求21所述的方法，其中，从所述校准带光学检测到的至少一个信号是由分析物浓度为零的区域产生的。
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