CN104749359A - 一种多项联合检测的免疫层析检测方法及试纸 - Google Patents

一种多项联合检测的免疫层析检测方法及试纸 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多项联合检测的免疫层析检测方法及试纸，将多种特异性抗体或抗原以二个或多个圆点状、多边形状、其它图形状或不同图形状的组合，亦可为条带图形状与其它图形状的组合固定于反应膜上，结合物释放垫上吸附有标记的特异性抗体或抗原，当待检样本滴加到样本垫上后，待检样本在毛细管作用下向前移动，溶解结合物释放垫上的标记物后相互反应，形成结合物，再移动至检测区T和质控区C时，结合物与检测点和质控点上的抗体或抗原发生结合而被截留，聚集在检测点和质控点上。通过肉眼观察或仪器扫描检测点和质控点上不同的显色结果，可实现对待检样本中不同的待检目标物的定性、半定量或定量检测。操作简单、快速，广泛应用于体外诊断试剂领域。

Description

一种多项联合检测的免疫层析检测方法及试纸
技术领域
本发明属于体外诊断试剂领域，具体涉及一种多项联合检测的免疫层析检测方法以及所使用的试纸和试纸盒。
背景技术
免疫层析法是九十年代兴起的一种基于免疫胶体金技术的快速诊断技术，其原理是将特异性的抗体先固定于反应膜2上，当试纸的样本垫4浸入待检样本后，由于毛细管作用，待检样本将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，待检样本中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。
以胶体金试纸为主要代表的免疫层析试纸技术现已广泛用于免疫检测的各个方面，该技术主要是将特异性的抗体或抗原以条带状固定在反应膜2上，通过检测区T一条条带状检测线8的显色结果进行定性分析，多条条带状检测线8的显色结果进行半定量检测。
现有的免疫层析检测方法及试纸，试纸上的每条检测线8只提供一种检测信息，在一定面积中增加较多的检测线8数量会给识别造成信息混乱甚至判读错误。
目前，检测区T采用圆点状、多边形状、其它图形状、不同图形状的组合，或者条带图形状与其它图形状组合的图形作为检测点6，且检测点6的设定可以是同浓度或者不同浓度的多种抗体或抗原。通过肉眼观察多个检测点6和质控点7的显色情况进行定性、半定量检测或采用具有信号检测功能的仪器采集试纸上检测点6和质控点7的特征信号对待检样本中不同的待检目标物定量检测的免疫层析检测方法从未有报道过。
免疫层析技术包括但不限于双抗体夹心法、间接法、竞争抑制法。
双抗体夹心法，属于非竞争结合测定，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。其基本工作原理是：利用连接于反应膜2上的抗体和标记抗体分别与待检样本中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体免疫复合物。
间接法，测定抗体最常用的方法，属非竞争结合测定。其原理是将抗原固化于反应膜2，待检样本中待测抗体首先与标记分子结合，形成复合物，再与反应膜2上的抗原结合，形成标记分子-待检抗体-抗原复合物。
竞争法可用于抗原和抗体测定。以测定抗原为例，其基本原理是待检样本中的受检抗原和固相的包被抗原竞争与标记抗体结合，当待检样本中的受检抗原的量大于试剂的阈值，标记抗体则不会与固相的包被抗原结合；若待检样本中无受检抗原，标记抗体直接与固相的包被抗原结合。
免疫层析检测方法的测定方法包括用肉眼观察确定检测区T的检测线8颜色的定性方法、用肉眼观察检测区T的多个检测线8显色情况的半定量方法和通过专用仪器设备测定检测区T的检测线8颜色强度的定量方法。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术，提供一种多项联合检测的免疫层析检测方法及试纸，可实现对待检样本中不同的待检目标物的定性、半定量或定量检测。
一种多项联合检测的免疫层析检测方法，采用如下步骤：
（1）反应膜2包被：根据待检样本中的待检目标物确定包被抗体或抗原的种类，设定检测点6及质控点7的浓度和数量；
（2）根据待检样本中的待检目标物制备结合物释放垫5；    
（3）样本垫4制备；
（4）组装试纸：试纸由底板1，及依次设置在底板1上的样本垫4、结合物释放垫5、反应膜2、吸收垫3构成；
（5）对待检样本进行检测：在试纸样本垫4中加入待检样本，先根据多个检测点6的显色情况确定待检样本中的待检目标物，再通过肉眼观察多个检测点6和质控点7的显色情况可以对待检样本中不同的待检目标物进行定性或者半定量检测，或采用具有信号检测功能的仪器采集试纸上检测点6和质控点7的特征信号可以进行定量检测。
一种多项联合检测的免疫层析检测试纸，用于实现对待检样本的定性、半定量或定量检测；试纸由底板1，及依次设置在底板1上的样本垫4、结合物释放垫5、反应膜2、吸收垫3构成。
所述反应膜2分成两个区域，一个是与结合物释放垫5相邻接的检测区T，一个是与吸收垫3相邻接的质控区C。
所述检测区T设有2至30个检测点6，检测点6不包括仅有条带图形状，检测点6为圆点状、多边形状、其它图形状或不同图形状的组合，亦可为条带图形状与其它图形状的组合。检测点6包被有同浓度或者不同浓度的多种抗体或抗原，首先根据多个检测点6的显色情况确定待检样本中的待检目标物，再通过肉眼观察多个检测点6和质控点7的显色情况可以对待检样本中不同的待检目标物进行定性或者半定量检测，或采用具有信号检测功能的仪器采集试纸上检测点6和质控点7的特征信号可以进行定量检测。
所述质控区C设有1至30个质控点7，质控点7为圆点状、多边形状、条带图形状、其它图形状或不同图形状的组合；质控点7包被有可与结合物释放垫5上结合物结合的抗体或抗原。
所述结合物释放垫5上标记有单一待检目标物相关的特异性抗体或抗原，或标记有各待检目标物相关的多个特异性抗体或抗原。
所述的多项联合检测的免疫层析检测方法，其标记方法包括但不限于量子点标记法、胶体金标记法、胶体硒标记法、有色或荧光乳胶标记法、磁性颗粒标记法、时间分辨层析法、化学发光法。
所述的待检样本，是来自临床或非临床的血液、体液、尿液、唾液、生殖道分泌液或其他液态样品或粘稠状样品。
所述底板1材料包括但不限于PVC( 聚氯乙烯)板，反应膜2材料包括但不限于硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜，吸收垫3的材料包括但不限于滤纸，样本垫4材料包括但不限于玻璃纤维和无纺布，结合物释放垫5包括但不限于玻璃纤维或无纺布。
一种多项联合检测的免疫层析检测方法及试纸，包括权利要求1-8 任一项的免疫层析试纸。
技术效果
本发明是一种多项联合检测的免疫层析检测方法及试纸，该方法使用的试纸操作简单，快速，使用方便，不需要本领域的专业人员进行操作，能够满足不同层次人员的需要，容易普及到基层社区医院及普通家庭。且检测区T采用圆点状、多边形状、其它图形状、不同图形状的组合，或者条带图形状与其它图形状组合的图形作为检测点6，首先根据多个检测点6的显色情况确定待检样本中的待检目标物，再通过肉眼观察多个检测点6和质控点7的显色情况或采用具有信号检测功能的仪器采集试纸上检测点6和质控点7的特征信号，可实现对待检样本中不同的待检目标物的定性、半定量或定量检测。操作简单、快速，广泛应用于体外诊断试剂领域。
本发明的一种多项联合检测的免疫层析检测方法及试纸不同于现有的方法和试纸之处在于：
现有的免疫层析检测方法及试纸检测区T只是一条或多条条带状检测线8，每一条检测线8只提供一个信息，在一定面积中增加较多的检测线8数量会给识别造成信息混乱甚至判读错误。
本发明的一种多项联合检测的免疫层析检测方法及其试纸的检测区T设有2至30个检测点6，检测点6不包括仅有条带图形状，检测点6为圆点状、多边形状、其它图形状或不同图形状的组合，亦可为条带图形状与其它图形状的组合。检测点6可以设定为同浓度或者不同浓度的多种抗体或抗原，且不同种抗体或抗原的检测点6可以用不同的图形状表示。
本发明的一种多项联合检测的免疫层析检测方法及其试纸，首先根据多个检测点6的显色情况确定待检样本中的待检目标物，再通过肉眼观察多个检测点6和质控点7的显色情况可以对待检样本中不同的待检目标物进行定性或者半定量检测，或采用具有信号检测功能的仪器采集试纸上检测点6和质控点7的特征信号可以进行定量检测。
相比较现有的方法本发明提供了更多的不同的检测点6和更好识别的不同图形信息。
附图说明
附图1是本发明的一种多项联合检测的免疫层析检测方法及试纸的示意图。
附图2是现有的免疫层析检测方法及试纸的示意图。
附图3尿微量白蛋白、尿β2微球蛋白、抑胱素C三项联合检测试纸（胶体金免疫层析法）示意图。
实施方案描述
实施步骤：
（1）反应膜2包被：根据待检样本中的待检目标物确定包被抗体或抗原的种类，设定检测点6及质控点7的浓度和数量；
（2）根据待检样本中的待检目标物制备结合物释放垫5；
（3）样本垫4制备；
（4）组装试纸：试纸由底板1，及依次设置在底板1上的样本垫4、结合物释放垫5、反应膜2、吸收垫3构成；
（5）对待检样本进行检测：在试纸样本垫4中加入待检样本，首先根据多个检测点6的显色情况确定待检样本中的待检目标物，再通过肉眼观察多个检测点6和质控点7的显色情况可以对待检样本中不同的待检目标物进行定性或者半定量检测，或采用具有信号检测功能的仪器采集试纸上检测点6和质控点7的特征信号可以进行定量检测。
反应膜2分成两个区域，一个是与结合物释放垫5相邻接的检测区T，一个是与吸收垫3相邻接的质控区C。
所述检测区T设有2至30个检测点6，检测点6不包括仅有条带图形状，检测点6为圆点状、多边形状、其它图形状或不同图形状的组合，亦可为条带图形状与其它图形状的组合。检测点6的设定可以是同浓度或者不同浓度的多种抗体或抗原，首先根据多个检测点6的显色情况确定待检样本中的待检目标物，再通过肉眼观察多个检测点6和质控点7的显色情况可以对待检样本中不同的待检目标物进行定性或者半定量检测，或采用具有信号检测功能的仪器采集试纸上检测点6和质控点7的特征信号可以进行定量检测。
所述质控区C设有1至30个质控点7，质控点7为圆点状、多边形状、条带图形状、其它图形状或不同图形状的组合；质控点7包被有可与结合物释放垫5上结合物结合的抗体或抗原。
所述结合物释放垫5上标记有单一待检目标物相关的特异性抗体或抗原，或标记有各待检目标物相关的多个特异性抗体或抗原。
在本发明中，标记试剂通常是在免疫层析检测中可用作固定抗体或抗原的载体。例如，胶体金颗粒，胶体硒颗粒，有色或荧光乳胶颗粒和磁性颗粒，特别优选胶体金颗粒。
在本发明中，底板1支撑层为不吸水的材料，避免支撑材料吸收待检样本从而影响水平方向的移动。底板1的材料包括PVC( 聚氯乙烯)板及其他塑料材料，优选PVC( 聚氯乙烯)板。
在本发明中，反应膜2的材料包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜或醋酸纤维素膜。优选硝酸纤维素膜。
在本发明中，吸收垫3指吸收通过反应膜2的待检样本以控制样品扩散的液体吸收部分。吸收垫3的材料可以是但不限于滤纸。吸收垫3可以使用一层也可以使用多层。
在本发明中，样本垫4是接收待检样本的部分，包含任何材料和形式，只要能让液体和待检目标物通过。适合于样本垫4的材料的具体包括但不限于：玻璃纤维、丙烯酸纤维、亲水聚乙烯材料、干燥的纸、无纺布和纤维织物。优选使用玻璃纤维和无纺布。样本垫4可以使用一层也可以使用多层。
在本发明中，适合于结合物释放垫5的材料包括但不限于纸、纤维素混合物、硝酸纤维素、聚酯纤维、丙烯腈共聚物、玻璃纤维、和无纺布。优选使用无纺布。
在本发明中，除了一种多项联合检测的免疫层析法检测方法及试纸，还包括塑料卡，可以将试纸安装在塑料卡之内使用。所述的塑料卡与试纸的尺寸、样本加入的方式和位置、抗体或抗原在反应膜2上固化的位置相吻合。
具体实施方法
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明的其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均属于本发明的保护范围之内。
本发明的免疫层析检测试纸的制备实施例，制备及检测尿微量白蛋白、尿β2微球蛋白、抑胱素C三项联合检测试纸（胶体金免疫层析法）。
生物活性原料：人白蛋白单克隆抗体、鼠抗人白蛋白单克隆抗体、Cys-C（抑胱素C）单克隆抗体、鼠抗人Cys-C（抑胱素C）抗体、β2微球蛋白单克隆抗体、鼠抗人β2微球蛋白抗体、IgG多克隆抗体均来自市场购买。
试剂：牛血清白蛋白来自市场购买。
硝酸纤维素膜来自市场购买。
试纸制备程序如下：
步骤1.反应膜2包被
根据待检样本中的待检目标物确定包被抗体种类：人白蛋白单克隆抗体、Cys-C（抑胱素C）单克隆抗体、β2微球蛋白单克隆抗体、IgG多克隆抗体。
根据待检样本中的待检目标物设定检测点10及质控点11的浓度和数量：检测点10设置3个点，每个点为一种检测抗体；质控点11设置2个点，1个浓度。
将2.5mg/ml的人白蛋白单克隆抗体、2.26mg/ml的β2微球蛋白单克隆抗体、2.42mg/ml的Cys-C（抑胱素C）单克隆抗体、8.02mg/ml的IgG多克隆抗体根据附图3的图形包被于硝酸纤维素膜上，干燥24h，温度为37℃，湿度≦40%RH。
步骤2.结合物释放垫5制备
尿微量白蛋白金标结合物释放垫制备
取40nm的胶体金溶液，按1.2%比例加入0.2M的K2CO3（碳酸钾）调节PH值，按12μg/ml比例加入鼠抗人白蛋白单克隆抗体，制成标记物，放置室温5min，按0.8%比例加入BSA（牛血清白蛋白）稳定剂。
4500r离心30min，取浓缩沉淀物；将上清液继续6500r离心45min，取浓缩沉淀物；将上清液继续9000r离心60min，取浓缩沉淀物；将三次离心浓缩沉淀物混合均匀。
将离心好的浓缩液稀释好，铺于90cm×30cm的无纺布上，加液量10-11ml/张，干燥24h，温度37℃，湿度≦40%RH。
尿β2微球蛋白金标结合物释放垫制备
取40nm的胶体金溶液，按1.2%比例加入0.2M的K2CO3（碳酸钾）调节PH值，按10μg/ml比例加入鼠抗人β2微球蛋白抗体，制成标记物，放置室温5min，按0.8%比例加入BSA（牛血清白蛋白）稳定剂。
4500r离心30min，取浓缩沉淀物；将上清液继续6500r离心45min，取浓缩沉淀物；将上清液继续9000r离心60min，取浓缩沉淀物；将三次离心浓缩沉淀物混合均匀。
将离心好的浓缩液按规定浓度稀释好，铺于90cm×30cm的无纺布上，加液量10-11ml/张，干燥24h，温度37℃，湿度≦40%RH。
抑胱素C金标结合物释放垫制备
取40nm的胶体金溶液，按1.2%比例加入0.2M的K2CO3（碳酸钾）调节PH值，按11μg/ml比例加入鼠抗人Cys-C（抑胱素C）抗体，制成标记物，放置室温5min，按0.8%比例加入BSA（牛血清白蛋白）稳定剂。
4500r离心30min，取浓缩沉淀物；将上清液继续6500r离心45min，取浓缩沉淀物；将上清液继续9000r离心60min，取浓缩沉淀物；将三次离心浓缩沉淀物混合均匀。
将离心好的浓缩液按规定浓度稀释好，铺于90cm×30cm的无纺布上，加液量10-11ml/张，干燥24h，温度37℃，湿度≦40%RH。
步骤3.样本垫4的制备
将切割成83.5cm×30cm的玻璃纤维和无纺布垫用包含0.5%NaCl（氯化钾）、0.5% 蔗糖、0.1%BSA（牛血清白蛋白）和Tris- HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)(pH7.4) 工作液浸泡。在37℃将所述垫干燥24h，获得样本垫4。
步骤4.组装试纸
将底板1平放在操作台上，贴上双面胶。
将包被好的反应膜2贴在底板1上。
将吸收垫3压反应膜2的2mm贴上，另一端与底板1对齐。
将一层无纺布垫压反应膜2的2mm处贴上。
将尿微量白蛋白结合物释放垫、尿β2微球蛋白结合物释放垫、抑胱素C结合物释放垫依次齐压于无纺布垫上面。
将玻璃纤维压于结合物释放垫5一半位置，另一端与底板1对齐。
再将一层无纺布垫一端与结合物释放垫5上端对齐，另一端与底板1对齐。
步骤5.产品检测
取待检样本尿液样本垫4上，8min时，判读结果，T1显色，表示待检样本尿液中尿微量白蛋白为阳性；T2显色，表示待检样本尿液中含尿β2微球蛋白为阳性；T3显色，表示待检样本尿液中含抑胱素C为阳性。
以上所述仅为本发明的实施例，并不限制本发明，凡在本发明基础上，所作的任何修改、改进等，均应包含在发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多项联合检测的免疫层析检测方法，用于实现对待检样本中不同的待检目标物的定性、半定量或定量检测；其特征在于：采用如下步骤：
（1）反应膜包被：根据待检样本中的待检目标物确定包被抗体或抗原的种类，设定检测点及质控点的浓度和数量；
（2）根据待检样本中的待检目标物制备结合物释放垫；
（3）制备样本垫；
（4）组装试纸：试纸由底板，及依次设置在底板上的样本垫、结合物释放垫、反应膜、吸收垫构成；
（5）对待检样本进行检测：在试纸样本垫中加入待检样本，首先根据多个检测点的显色情况确定待检样本中的待检目标物，再通过肉眼观察多个检测点和质控点的显色情况可以对待检样本中不同的待检目标物进行定性或者半定量检测，或采用具有信号检测功能的仪器采集试纸上检测点和质控点的特征信号可以进行定量检测。
2.根据权利要求1所述的多项联合检测的免疫层析检测方法，其特征在于：反应膜分成两个区域，一个是与结合物释放垫相邻接的检测区，一个是与吸收垫相邻接的质控区；检测区设有2至30个检测点，检测点不包括仅有条带图形状，检测点为圆点状、多边形状、其它图形状或不同图形状的组合，亦可为条带图形状与其它图形状的组合；检测点的设定可以是同浓度或者不同浓度的多种抗体或抗原；所述质控区设有1至30个质控点，质控点为圆点状、多边形状、条带图形状、其它图形状或不同图形状的组合；质控点包被有可与结合物释放垫上结合物结合的抗体或抗原。
3.根据权利要求1所述的多项联合检测的免疫层析检测方法，其特征在于：所述结合物释放垫上标记有单一待检目标物相关的特异性抗体或抗原，或标记有各待检目标物相关的多个特异性抗体或抗原。
4.根据权利要求1所述的多项联合检测的免疫层析检测方法，其特征在于：所述标记方法包括量子点标记法、胶体金标记法、胶体硒标记法、有色或荧光乳胶标记法、磁性颗粒标记法、时间分辨层析法、化学发光法。
5.根据权利要求1所述的多项联合检测的免疫层析检测方法，其特征在于：所述方法包括双抗体夹心法、间接法、竞争抑制法。
6.根据权利要求1所述的多项联合检测的免疫层析检测方法，其特征在于：所述待检样本是来自临床或非临床的血液、体液、尿液、唾液、生殖道分泌液或其他液态样品或粘稠状样品。
7.根据权利要求1所述的多项联合检测的免疫层析检测试纸，用于实现对待检样本中不同的待检目标物的定性、半定量或定量检测；其特征在于：试纸由底板，及依次设置在底板上的样本垫、结合物释放垫、反应膜、吸收垫构成。
8.根据权利要求1所述的免疫层析检测试纸，其特征在于：所述底板材料是PVC( 聚氯乙烯)板，反应膜材料是硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，吸收垫的材料是滤纸，样品垫材料为玻璃纤维和无纺布，结合物释放垫材料是玻璃纤维或无纺布。
9.根据权利要求1-8所述的多项联合检测的免疫层析检测试纸，其特征在于：试纸还可装配在与试纸的尺寸、样本加入的方式和位置、抗体或抗原在反应膜上固化的位置相吻合的塑料卡内成为试纸盒。
10.一种多项联合检测的免疫层析检测方法的成套试纸盒，其特征在于：包括待检样本稀释液和上述权利要求1-9所述试纸和试纸盒。
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