JPH04299262A - イムノクロマトグラフ法による物質検出法 - Google Patents
イムノクロマトグラフ法による物質検出法Info
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- JPH04299262A JPH04299262A JP3064504A JP6450491A JPH04299262A JP H04299262 A JPH04299262 A JP H04299262A JP 3064504 A JP3064504 A JP 3064504A JP 6450491 A JP6450491 A JP 6450491A JP H04299262 A JPH04299262 A JP H04299262A
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
- G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
- G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
-
- G—PHYSICS
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【0001】本発明は、いわゆるサンドイッチイムノア
ッセイと、反応・未反応成分の分離(一般的にはBF分
離と呼ばれる)のためのクロマトグラフを併用したイム
ノクロマトグラフ法により、試料中の被検出物質の存在
の有無を文字の出現により判定する方法の改良法に関す
るものである。本発明方法は、体外診断薬分野、殊に目
視判定による診断が利用される分野で利用され、判定結
果が鮮明な文字として表示される為、特に訓練をしてい
ない人でも容易に診断結果を知ることができるものであ
る。
ッセイと、反応・未反応成分の分離(一般的にはBF分
離と呼ばれる)のためのクロマトグラフを併用したイム
ノクロマトグラフ法により、試料中の被検出物質の存在
の有無を文字の出現により判定する方法の改良法に関す
るものである。本発明方法は、体外診断薬分野、殊に目
視判定による診断が利用される分野で利用され、判定結
果が鮮明な文字として表示される為、特に訓練をしてい
ない人でも容易に診断結果を知ることができるものであ
る。
【0002】従来から知られているイムノクロマトグラ
フ法の測定原理は以下の通りである。即ち、まず通常長
方形のクロマトグラフ媒体、例えば濾紙、のほぼ中央部
に被検出物質と特異的に結合する第一抗体を固定してお
く。別に、被検出物質と特異的に結合する第一抗体とは
異なる抗体、即ち第二抗体を用意し、これを検出しやす
い標識物質に結合させ、標識化された第二抗体を調製す
る。この第二抗体と、被検出物質を含んでいると思われ
る試料溶液を混合すると、(標識物質)−(第二抗体)
−(被検出物質)の結合物が生成する。この結合物を含
む試料溶液をクロマトグラフ媒体の末端に接触させて展
開すると、結合物が展開方向に順次移動し、固定化され
た第一抗体に到達し、(標識物質)−(第二抗体)−(
被検出物質)−(第一抗体)からなる複合体が形成され
る。この様にして、第一抗体を固定した位置に、標識物
質によるマーク、例えば色が残存することとなり、これ
により被検出物質の存在を確認することができるのであ
る。
フ法の測定原理は以下の通りである。即ち、まず通常長
方形のクロマトグラフ媒体、例えば濾紙、のほぼ中央部
に被検出物質と特異的に結合する第一抗体を固定してお
く。別に、被検出物質と特異的に結合する第一抗体とは
異なる抗体、即ち第二抗体を用意し、これを検出しやす
い標識物質に結合させ、標識化された第二抗体を調製す
る。この第二抗体と、被検出物質を含んでいると思われ
る試料溶液を混合すると、(標識物質)−(第二抗体)
−(被検出物質)の結合物が生成する。この結合物を含
む試料溶液をクロマトグラフ媒体の末端に接触させて展
開すると、結合物が展開方向に順次移動し、固定化され
た第一抗体に到達し、(標識物質)−(第二抗体)−(
被検出物質)−(第一抗体)からなる複合体が形成され
る。この様にして、第一抗体を固定した位置に、標識物
質によるマーク、例えば色が残存することとなり、これ
により被検出物質の存在を確認することができるのであ
る。
【0003】以上述べた様なイムノクロマトグラフ法を
利用した体外診断薬キットは現在、数多く知られており
、かつ市販されているが、その判定方法は第一抗体部位
に於けるスポットあるいはラインの着色の有無で検出す
るものがほとんどである。この様な判定方法では、着色
の程度により陰性、陽性の判定が紛らわしい場合が起こ
りうる。そこで使用者にとって判定が容易である(+)
(−)による表示が提案されている(公開特許公報昭6
4−32169号公報)。この方法は、クロマトグラフ
媒体上に(+)文字のいずれか一方のライン、例えば縦
方向ラインに第一抗体を結合させ、一方、横方向ライン
には被検出物質標品または第二抗体に対する抗体を予め
結合させておくというものである。もし試料溶液が被検
出物質を含んでいない場合は、横方向のラインにのみ(
標識物質)−(第二抗体)−(被検出物質標品)または
(標識物質)−(第二抗体)−(第二抗体に対する抗体
)からなる複合体が形成され、結果として(−)文字が
表われ、一方、試料溶液中に被検出物質が含まれている
場合には、(+)文字の横方向のラインには上記複合体
が、縦方向ラインには(標識物質)−(第二抗体)−(
被検出物質)−(第一抗体)からなる複合体が形成され
、その結果、(+)文字が表われることになる。この方
法によれば、仮にクロマトグラフ媒体上に固定した被検
出物質標品および/または標識物質と予め結合させた第
二抗体が何らかの理由で失活していた場合、あるいは操
作上に何らかの重大なミスがあった場合には、横方向の
ラインも表われないこととなり、診断試験が正しく行わ
れたか否かを判断することが出来る。この様に、この(
+)(−)表示法は、診断試験の正当性を確認できると
いう大きな特徴も持っているものである。
利用した体外診断薬キットは現在、数多く知られており
、かつ市販されているが、その判定方法は第一抗体部位
に於けるスポットあるいはラインの着色の有無で検出す
るものがほとんどである。この様な判定方法では、着色
の程度により陰性、陽性の判定が紛らわしい場合が起こ
りうる。そこで使用者にとって判定が容易である(+)
(−)による表示が提案されている(公開特許公報昭6
4−32169号公報)。この方法は、クロマトグラフ
媒体上に(+)文字のいずれか一方のライン、例えば縦
方向ラインに第一抗体を結合させ、一方、横方向ライン
には被検出物質標品または第二抗体に対する抗体を予め
結合させておくというものである。もし試料溶液が被検
出物質を含んでいない場合は、横方向のラインにのみ(
標識物質)−(第二抗体)−(被検出物質標品)または
(標識物質)−(第二抗体)−(第二抗体に対する抗体
)からなる複合体が形成され、結果として(−)文字が
表われ、一方、試料溶液中に被検出物質が含まれている
場合には、(+)文字の横方向のラインには上記複合体
が、縦方向ラインには(標識物質)−(第二抗体)−(
被検出物質)−(第一抗体)からなる複合体が形成され
、その結果、(+)文字が表われることになる。この方
法によれば、仮にクロマトグラフ媒体上に固定した被検
出物質標品および/または標識物質と予め結合させた第
二抗体が何らかの理由で失活していた場合、あるいは操
作上に何らかの重大なミスがあった場合には、横方向の
ラインも表われないこととなり、診断試験が正しく行わ
れたか否かを判断することが出来る。この様に、この(
+)(−)表示法は、診断試験の正当性を確認できると
いう大きな特徴も持っているものである。
【0004】しかしながら、この(+)(−)表示法は
展開方向に平行に描かれているライン、即ち(+)文字
の縦方向のラインは鮮明に発色させることが難しいとい
う重大な欠点を有する。これは、次の様な理由による。 即ち、試料溶液中に被検出物質が含まれていた場合、(
標識物質)−(第二抗体)−(被検出物質)からなる結
合物が(+)文字の縦方向のラインの下端に達した時、
第一抗体と反応して(標識物質)−(第二抗体)−(被
検出物質)−(第一抗体)からなる複合体を形成するが
、このラインの下端部で形成された複合体が試料溶液の
移動を妨げ、縦方向ラインの上部の固定化第一抗体には
試料溶液が接触しないこととなり、その結果、添付の図
面を参照すれば理解される様に、横方向ラインより下部
にあるラインだけが反応したり、あるいは縦方向のライ
ンの上端、下端のみが反応したりして、正しい(+)文
字が形成されないからである。
展開方向に平行に描かれているライン、即ち(+)文字
の縦方向のラインは鮮明に発色させることが難しいとい
う重大な欠点を有する。これは、次の様な理由による。 即ち、試料溶液中に被検出物質が含まれていた場合、(
標識物質)−(第二抗体)−(被検出物質)からなる結
合物が(+)文字の縦方向のラインの下端に達した時、
第一抗体と反応して(標識物質)−(第二抗体)−(被
検出物質)−(第一抗体)からなる複合体を形成するが
、このラインの下端部で形成された複合体が試料溶液の
移動を妨げ、縦方向ラインの上部の固定化第一抗体には
試料溶液が接触しないこととなり、その結果、添付の図
面を参照すれば理解される様に、横方向ラインより下部
にあるラインだけが反応したり、あるいは縦方向のライ
ンの上端、下端のみが反応したりして、正しい(+)文
字が形成されないからである。
【0005】この様な理由で、(+)(−)表示法によ
る現在市販されている診断薬キットには、上端あるいは
中央部の欠けた不完全な(+)文字でも陽性と判定する
旨の指示書が付されているのが現状である。
る現在市販されている診断薬キットには、上端あるいは
中央部の欠けた不完全な(+)文字でも陽性と判定する
旨の指示書が付されているのが現状である。
【0006】上記の欠点を克服する為、以下に示す様な
工夫がなされてはいる。
工夫がなされてはいる。
【0007】(1) 最初から展開方向と平行なライ
ン(縦方向ライン)を標識と同じ色で印刷しておき、展
開方向に垂直なライン(横方向ライン)上で反応が起っ
た場合に「+」として表示されるもの、例えば、市販の
PACIFIC BIOTEC社製C・A・R・D・S
±RO・STMがある。
ン(縦方向ライン)を標識と同じ色で印刷しておき、展
開方向に垂直なライン(横方向ライン)上で反応が起っ
た場合に「+」として表示されるもの、例えば、市販の
PACIFIC BIOTEC社製C・A・R・D・S
±RO・STMがある。
【0008】(2) クロマトグラフ展開方向を縦横
のラインに対し斜めにする方法、例えば、市販のABB
OTT LAB.社製TESTPACK+PlusTM
がある。
のラインに対し斜めにする方法、例えば、市販のABB
OTT LAB.社製TESTPACK+PlusTM
がある。
【0009】しかしながら、これらの方法も、種々の欠
点を有し、満足し得るものではない。即ち、(1)の方
法では、先に述べた診断試験の正当性を確認するための
手段、即ち横方向のラインに予め被検出物質標品を結合
させておく、という方法を採用することができず、診断
試験の信頼性を担保することができない。また、(2)
の方法では、「く」の字状に反応が起るのみで、何ら上
記欠点を克服することができず、正しく(+)文字を形
成させることができない。
点を有し、満足し得るものではない。即ち、(1)の方
法では、先に述べた診断試験の正当性を確認するための
手段、即ち横方向のラインに予め被検出物質標品を結合
させておく、という方法を採用することができず、診断
試験の信頼性を担保することができない。また、(2)
の方法では、「く」の字状に反応が起るのみで、何ら上
記欠点を克服することができず、正しく(+)文字を形
成させることができない。
【0010】本発明者らは、かかる状況に鑑み、明瞭に
(+)(−)表示が現れる方法を開発すべく、種々検討
を重ねた結果、驚くべきことに、試料溶液の移動通路上
に適当な妨害手段を設けて展開液の流れを乱すという極
めて原始的な手段を施すことにより、(+)文字の縦方
向のライン上の第一抗体を完全に反応させることができ
ることを見い出した。更に研究を続けた結果、(+)(
−)表示を他の文字、例えばYES、NOを表わす「Y
」、「N」文字にしても、同様に鮮明に描き得ることを
確認した。本発明は、かかる知見に基いて完成されたも
のである。
(+)(−)表示が現れる方法を開発すべく、種々検討
を重ねた結果、驚くべきことに、試料溶液の移動通路上
に適当な妨害手段を設けて展開液の流れを乱すという極
めて原始的な手段を施すことにより、(+)文字の縦方
向のライン上の第一抗体を完全に反応させることができ
ることを見い出した。更に研究を続けた結果、(+)(
−)表示を他の文字、例えばYES、NOを表わす「Y
」、「N」文字にしても、同様に鮮明に描き得ることを
確認した。本発明は、かかる知見に基いて完成されたも
のである。
【0011】即ち本発明は、試料溶液中に存在しうる被
検出物質と特異的に結合する第一抗体をクロマトグラフ
媒体のほぼ中央部に文字状に固定し、該クロマトグラフ
媒体の下部または上部から該被検出物質と特異的に結合
する標識化された第二抗体を含有している該試料溶液を
展開させ、標識化された第二抗体と結合した試料溶液中
に存在しうる該被検出物質を文字状に固定化された第一
抗体に捕捉させることによって、該試料溶液中の被検出
物質の存在または非存在を、標識物質により視覚的に検
出可能となった文字により判定することからなるイムノ
クロマトグラフ法による物質検出法であって、固定化さ
れた第一抗体の直前、あるいは直前および直後に展開液
通過妨害手段を設けることにより、標識化された第二抗
体と結合した被検出物質と文字状に固定化された第一抗
体との接触を良好ならしめることを特徴とする方法を提
供するものである。
検出物質と特異的に結合する第一抗体をクロマトグラフ
媒体のほぼ中央部に文字状に固定し、該クロマトグラフ
媒体の下部または上部から該被検出物質と特異的に結合
する標識化された第二抗体を含有している該試料溶液を
展開させ、標識化された第二抗体と結合した試料溶液中
に存在しうる該被検出物質を文字状に固定化された第一
抗体に捕捉させることによって、該試料溶液中の被検出
物質の存在または非存在を、標識物質により視覚的に検
出可能となった文字により判定することからなるイムノ
クロマトグラフ法による物質検出法であって、固定化さ
れた第一抗体の直前、あるいは直前および直後に展開液
通過妨害手段を設けることにより、標識化された第二抗
体と結合した被検出物質と文字状に固定化された第一抗
体との接触を良好ならしめることを特徴とする方法を提
供するものである。
【0012】本明細書に於いて試料溶液とは、検出しよ
うとする物質、即ち被検出物質が含まれている、あるい
は含まれている疑いのある生体から採取した体液、例え
ば血液、尿、あるいはその適当な希釈液を意味する、被
検出物質とは、免疫反応に関与する物質、特に各種の診
断に於いて検出の対象となっている抗原性物質、ハプテ
ンおよび抗体を意味する。本発明において、検出の対象
として適した抗原性物質としては甲状腺刺激ホルモン(
TSH)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、ヒト絨毛性腺
刺激ホルモン(hCG)、黄体形成ホルモン(LH)が
挙げられる。本発明において検出の対象として適したハ
プテンとしては、エストロン、エストラジオール、テス
トステロン、プロゲステロンおよびそれらのエステル誘
導体が挙げられる。
うとする物質、即ち被検出物質が含まれている、あるい
は含まれている疑いのある生体から採取した体液、例え
ば血液、尿、あるいはその適当な希釈液を意味する、被
検出物質とは、免疫反応に関与する物質、特に各種の診
断に於いて検出の対象となっている抗原性物質、ハプテ
ンおよび抗体を意味する。本発明において、検出の対象
として適した抗原性物質としては甲状腺刺激ホルモン(
TSH)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、ヒト絨毛性腺
刺激ホルモン(hCG)、黄体形成ホルモン(LH)が
挙げられる。本発明において検出の対象として適したハ
プテンとしては、エストロン、エストラジオール、テス
トステロン、プロゲステロンおよびそれらのエステル誘
導体が挙げられる。
【0013】クロマトグラフ媒体とは、クロマトグラフ
ィーに通常使用されている担体、例えばガラスフィルタ
ー、ニトロセルロース、ナイロン、濾紙などをいう。標
識物質としては、金コロイド粒子、着色ラテックス、不
溶性染料ポリマーなどの着色物質が望ましいが、発色試
薬を接触させることにより発色する様な非着色物質であ
ってもよい。
ィーに通常使用されている担体、例えばガラスフィルタ
ー、ニトロセルロース、ナイロン、濾紙などをいう。標
識物質としては、金コロイド粒子、着色ラテックス、不
溶性染料ポリマーなどの着色物質が望ましいが、発色試
薬を接触させることにより発色する様な非着色物質であ
ってもよい。
【0014】本発明において、展開液通過妨害手段とは
、第二抗体を含んでいる試料溶液からなる展開液の流れ
を乱すための手段をいい、典型的にはクロマトグラフ媒
体に設けられた切欠き、媒体上に塗布された疎水性物質
などを意味する。かかる妨害手段を設ける位置は特に厳
密な選択を要するものではないが、展開液の展開方向に
照らして、第一抗体固定部位の上流であって、特にクロ
マトグラフ媒体の側縁部が望ましい。更に、下流側にも
設けることが好ましいこともある。
、第二抗体を含んでいる試料溶液からなる展開液の流れ
を乱すための手段をいい、典型的にはクロマトグラフ媒
体に設けられた切欠き、媒体上に塗布された疎水性物質
などを意味する。かかる妨害手段を設ける位置は特に厳
密な選択を要するものではないが、展開液の展開方向に
照らして、第一抗体固定部位の上流であって、特にクロ
マトグラフ媒体の側縁部が望ましい。更に、下流側にも
設けることが好ましいこともある。
【0015】切欠きの形状には特に限定はなく、直方形
、半円形、三角形、略三角形など、あらゆる形状のもの
が有効である。従って、疎水性物質を塗布する場合も、
あらゆる形状で適用することができる。
、半円形、三角形、略三角形など、あらゆる形状のもの
が有効である。従って、疎水性物質を塗布する場合も、
あらゆる形状で適用することができる。
【0016】疎水性物質としては、クロマトグラフ媒体
に付着させ得るものであればいかなる物質であってもよ
く、塗布時点では親水性であってもその後に重合などに
よって疎水性に変化させ得る例えば親水性ポリマーなど
も含まれる。使用に便利な具体例は油性インキである。
に付着させ得るものであればいかなる物質であってもよ
く、塗布時点では親水性であってもその後に重合などに
よって疎水性に変化させ得る例えば親水性ポリマーなど
も含まれる。使用に便利な具体例は油性インキである。
【0017】クロマトグラフ媒体に第一抗体を固定する
方法はよく知られている。すなわち、抗体試薬を直接的
あるいは間接的に固定化する方法が考えられる。直接的
に固定化する方法としては(1)臭化シアン、グルタル
アルデヒドおよびカルボジイミドを用いて共有結合で固
定化する方法(共有結合法)、(2)物理的吸着により
固定化する方法(非共有結合法)がある。間接的に固定
化する方法としては、ラテックス粒子などの不溶性の微
粒子に抗体試薬を結合させた後に固定化する方法があり
、結合方法としては共有結合法、非共有結合法のいづれ
の手段も可能である。この場合、ラテックス粒子の粒径
は、クロマトグラフ媒体に十分に捕獲されるが、クロマ
トグラフ展開中に移動しない様な適度のサイズのものを
選択する。
方法はよく知られている。すなわち、抗体試薬を直接的
あるいは間接的に固定化する方法が考えられる。直接的
に固定化する方法としては(1)臭化シアン、グルタル
アルデヒドおよびカルボジイミドを用いて共有結合で固
定化する方法(共有結合法)、(2)物理的吸着により
固定化する方法(非共有結合法)がある。間接的に固定
化する方法としては、ラテックス粒子などの不溶性の微
粒子に抗体試薬を結合させた後に固定化する方法があり
、結合方法としては共有結合法、非共有結合法のいづれ
の手段も可能である。この場合、ラテックス粒子の粒径
は、クロマトグラフ媒体に十分に捕獲されるが、クロマ
トグラフ展開中に移動しない様な適度のサイズのものを
選択する。
【0018】標識化された第二抗体は、凍結乾燥物とし
て準備しておき、診断試験を行う際、試料溶液と混合す
る。あるいはまた、この標識化された第二抗体を不織布
などの多孔性ポリマーに含浸させて凍結乾燥し、これを
クロマトグラフ媒体上の第一抗体固定部位の上流側にセ
ットしておいてもよい。この場合、試験者は、試料溶液
にクロマトグラフ媒体の末端を接触させるだけでよく、
標識化された第二抗体と試料溶液を混合するという操作
を省略することができる。即ち、標識化された第二抗体
は試料溶液の展開方向にセットされているので、展開途
中で試料溶液により溶出されると共に、(標識物質)−
(第二抗体)−(被検出物質)からなる結合物が生成し
、これが固定化された第一抗体まで運ばれることとなる
。
て準備しておき、診断試験を行う際、試料溶液と混合す
る。あるいはまた、この標識化された第二抗体を不織布
などの多孔性ポリマーに含浸させて凍結乾燥し、これを
クロマトグラフ媒体上の第一抗体固定部位の上流側にセ
ットしておいてもよい。この場合、試験者は、試料溶液
にクロマトグラフ媒体の末端を接触させるだけでよく、
標識化された第二抗体と試料溶液を混合するという操作
を省略することができる。即ち、標識化された第二抗体
は試料溶液の展開方向にセットされているので、展開途
中で試料溶液により溶出されると共に、(標識物質)−
(第二抗体)−(被検出物質)からなる結合物が生成し
、これが固定化された第一抗体まで運ばれることとなる
。
【0019】本明細書に於いては、記述の都合上、第一
抗体−被検出物質(抗原)−第二抗体のサンドイッチ法
に基いて説明しているが、本発明は抗原−被検出物質(
抗体)−被検出物質に対する抗体からなる系でも実施で
きることは当業者には容易に理解されよう。従って、本
発明は、被検出物質が抗原である場合に限らず抗体であ
る場合も包含するものであり、その場合は、本明細書中
の抗体と抗原なる文字を適宜読みかえることにより、本
発明を実施することができる。
抗体−被検出物質(抗原)−第二抗体のサンドイッチ法
に基いて説明しているが、本発明は抗原−被検出物質(
抗体)−被検出物質に対する抗体からなる系でも実施で
きることは当業者には容易に理解されよう。従って、本
発明は、被検出物質が抗原である場合に限らず抗体であ
る場合も包含するものであり、その場合は、本明細書中
の抗体と抗原なる文字を適宜読みかえることにより、本
発明を実施することができる。
【0020】
【実施例】以下に実施例をあげて本発明をより詳細に説
明するが、本発明はこの実施例によりなんら限定される
ものではない。
明するが、本発明はこの実施例によりなんら限定される
ものではない。
【0021】実施例1
(1) 固相ラテックスAの調製市販ラテックス
エマルジョン(積水化学製、N−450)を固形分濃度
が0.6重量%となるようリン酸緩衝生理食塩水(以下
「PBS」という)により希釈し、その1mlと、ヒト
絨毛性性腺刺激ホルモン(以下「hCG」という)に対
するウサギ抗体(濃度600μg/ml)1mlとをエ
ッペンドルフ遠沈管に採り、室温で2時間振盪してラテ
ックス粒子にウサギ抗体を結合させた。ついで濃度0.
1重量%のウシ血清アルブミン(以下「BSA」という
)を含有するPBSを用いてラテックス粒子を3回遠心
沈降処理によって洗浄し、最終的に2mlとなるようP
BSに再懸濁することにより、固相ラテックスAを調製
した。
エマルジョン(積水化学製、N−450)を固形分濃度
が0.6重量%となるようリン酸緩衝生理食塩水(以下
「PBS」という)により希釈し、その1mlと、ヒト
絨毛性性腺刺激ホルモン(以下「hCG」という)に対
するウサギ抗体(濃度600μg/ml)1mlとをエ
ッペンドルフ遠沈管に採り、室温で2時間振盪してラテ
ックス粒子にウサギ抗体を結合させた。ついで濃度0.
1重量%のウシ血清アルブミン(以下「BSA」という
)を含有するPBSを用いてラテックス粒子を3回遠心
沈降処理によって洗浄し、最終的に2mlとなるようP
BSに再懸濁することにより、固相ラテックスAを調製
した。
【0022】(2) 固相ラテックスBの調製前記固
相ラテックスAのウサギ抗hCG抗体の代わりに、hC
G(帝国臓器製薬製)を用い、同様の処理をして固相ラ
テックスBを調製した。
相ラテックスAのウサギ抗hCG抗体の代わりに、hC
G(帝国臓器製薬製)を用い、同様の処理をして固相ラ
テックスBを調製した。
【0023】(3) 金コロイド粒子の調製濃度0.
01重量%の塩化金水溶液200mlを沸騰させ、これ
に濃度1重量%のクエン酸ナトリウム水溶液を加え、溶
液の色が薄い黄色から紫色あるいは赤色に変わるまで加
熱沸騰を行って、平均粒径が0.03μmの金コロイド
分散液を調製した。
01重量%の塩化金水溶液200mlを沸騰させ、これ
に濃度1重量%のクエン酸ナトリウム水溶液を加え、溶
液の色が薄い黄色から紫色あるいは赤色に変わるまで加
熱沸騰を行って、平均粒径が0.03μmの金コロイド
分散液を調製した。
【0024】(4) 金コロイド粒子標識抗体の調製
金濃度が0.01重量%である上記の金コロイド分散液
に炭酸カリウム溶液を加えてpHを7.6に調製し、こ
れにhCGに対するモノクローナル抗体(周知のハイブ
リドーマ法によって得られたもので、マウス腹水、ある
いは細胞培養上清より調製されたもの)を、金コロイド
分散液1ml当り10μgとなる割合で加え、その10
mlに濃度30重量%のBSAを0.1ml加え、遠心
沈降処理して上澄液を除去し、BSAを濃度0.1重量
%で含有するPBSを用いて3回遠心沈降処理により洗
浄し、上記PBS10mlに再分散させた後、その0.
25mlを試験管に分注した(A法)。
金濃度が0.01重量%である上記の金コロイド分散液
に炭酸カリウム溶液を加えてpHを7.6に調製し、こ
れにhCGに対するモノクローナル抗体(周知のハイブ
リドーマ法によって得られたもので、マウス腹水、ある
いは細胞培養上清より調製されたもの)を、金コロイド
分散液1ml当り10μgとなる割合で加え、その10
mlに濃度30重量%のBSAを0.1ml加え、遠心
沈降処理して上澄液を除去し、BSAを濃度0.1重量
%で含有するPBSを用いて3回遠心沈降処理により洗
浄し、上記PBS10mlに再分散させた後、その0.
25mlを試験管に分注した(A法)。
【0025】上記金コロイド標識抗体再分散液0.25
mlを12×12mmのベンリーゼR不織布(旭化成製
)に含浸させ凍結乾燥することにより、金コロイド標識
抗体含有不織布を調製した(B法)。
mlを12×12mmのベンリーゼR不織布(旭化成製
)に含浸させ凍結乾燥することにより、金コロイド標識
抗体含有不織布を調製した(B法)。
【0026】(5) クロマトグラフストリップAの
調製市販ガラスフィルター(東洋濾紙製、GC−50)
より12×60mmの膜ストリップを裁断し、これをガ
ラス板(TLC板)上に置き、取り扱い易くするために
テープでとめた。ストリップの下端から30mmの位置
に、アキュラジェッターTM液体噴射装置(ノードソン
社製)およびXYテーブルエアロステージ(THK社製
)を用いて、展開方向に沿って即ちストリップの長手方
向と平行に固相ラテックスA0.1μl/mmを10m
mの長さに噴射印刷した。風乾後、展開方向に垂直即ち
ストリップの短辺に平行に固相ラテックスB 0.1μ
l/mmを10mmの長さに噴射印刷し、「+」を印字
した。
調製市販ガラスフィルター(東洋濾紙製、GC−50)
より12×60mmの膜ストリップを裁断し、これをガ
ラス板(TLC板)上に置き、取り扱い易くするために
テープでとめた。ストリップの下端から30mmの位置
に、アキュラジェッターTM液体噴射装置(ノードソン
社製)およびXYテーブルエアロステージ(THK社製
)を用いて、展開方向に沿って即ちストリップの長手方
向と平行に固相ラテックスA0.1μl/mmを10m
mの長さに噴射印刷した。風乾後、展開方向に垂直即ち
ストリップの短辺に平行に固相ラテックスB 0.1μ
l/mmを10mmの長さに噴射印刷し、「+」を印字
した。
【0027】(6) クロマトグラフストリップBの
調製上記のクロマトグラフストリップAの下端より10
mmから15mmの間を切断し、その部分を上記の金コ
ロイド標識抗体含有不織布にて再度全長60mmのスト
リップになるようにホッチキスにてつなぎ合わせた。
調製上記のクロマトグラフストリップAの下端より10
mmから15mmの間を切断し、その部分を上記の金コ
ロイド標識抗体含有不織布にて再度全長60mmのスト
リップになるようにホッチキスにてつなぎ合わせた。
【0028】(7) クロマトグラフストリップCの
調製上記市販ガラスフィルターより12×80mmの膜
ストリップを裁断し、これをガラス板(TLC板)上に
固定した。ストリップの下端より30mmの位置に、上
記印刷装置を用いて固相ラテックスA 0.1μl/m
mにより「Y」を、ストリップの下端より50mmの位
置に固相ラテックスB 0.1μl/mmにより「N」
を印刷した。
調製上記市販ガラスフィルターより12×80mmの膜
ストリップを裁断し、これをガラス板(TLC板)上に
固定した。ストリップの下端より30mmの位置に、上
記印刷装置を用いて固相ラテックスA 0.1μl/m
mにより「Y」を、ストリップの下端より50mmの位
置に固相ラテックスB 0.1μl/mmにより「N」
を印刷した。
【0029】(8) hCG含有試料の調製注射用h
CG「ゴナトロピン5000」(帝国臓器製薬製)を、
濃度0.1重量%のBSAを含有するPBSにより希釈
して、1ml中のhCG濃度がそれぞれ25mIU、5
0mIUおよび100mIUのhCG含有試料を調製し
た。
CG「ゴナトロピン5000」(帝国臓器製薬製)を、
濃度0.1重量%のBSAを含有するPBSにより希釈
して、1ml中のhCG濃度がそれぞれ25mIU、5
0mIUおよび100mIUのhCG含有試料を調製し
た。
【0030】(9) ツーステップイムノクロマトグ
ラフィーにおける「+」 「−」表示に対する切欠きの
検討上記クロマトグラフストリップAに、反応部位(第
一抗体固定部位)をはさんで種々の切欠きを入れ(図1
参照)、その切欠いた部分では試料溶液と金コロイド標
識抗体の混合液が展開できないようにした。
ラフィーにおける「+」 「−」表示に対する切欠きの
検討上記クロマトグラフストリップAに、反応部位(第
一抗体固定部位)をはさんで種々の切欠きを入れ(図1
参照)、その切欠いた部分では試料溶液と金コロイド標
識抗体の混合液が展開できないようにした。
【0031】上記の金コロイド標識抗体を入れた試験管
に、上記のhCG含有試料の各々の500μlまたはブ
ランクとして濃度0.1重量%のBSAを含有するPB
S500μlを加えて攪拌し、得られた混合液に、上記
種々の切欠きを入れたクロマトグラフストリップAまた
はコントロールとして切欠きを入れていないクロマトグ
ラフストリップAの下端を5mmだけ浸漬し、当該試料
溶液を展開させた。5分経過後、反応部位における「+
」あるいは「−」表示を目視で比較した。表示の出現形
式の結果を図1に示す。
に、上記のhCG含有試料の各々の500μlまたはブ
ランクとして濃度0.1重量%のBSAを含有するPB
S500μlを加えて攪拌し、得られた混合液に、上記
種々の切欠きを入れたクロマトグラフストリップAまた
はコントロールとして切欠きを入れていないクロマトグ
ラフストリップAの下端を5mmだけ浸漬し、当該試料
溶液を展開させた。5分経過後、反応部位における「+
」あるいは「−」表示を目視で比較した。表示の出現形
式の結果を図1に示す。
【0032】(10) ツーステップイムノクロマト
グラフィーにおける「+」 「−」表示に対する油性イ
ンキの塗布の検討 上記クロマトグラフストリップAに、反応部位をはさん
で種々のパターンに市販の油性インキ(修正液、ゼブラ
株式会社製)を塗布し(図2参照)、乾燥後上記(9)
と同じ試料溶液と金コロイド標識抗体の混合液に浸漬し
、5分間の展開後目視にて反応部位における「+」ある
いは「−」表示を比較した。表示の出現形式の結果を図
2に示す。
グラフィーにおける「+」 「−」表示に対する油性イ
ンキの塗布の検討 上記クロマトグラフストリップAに、反応部位をはさん
で種々のパターンに市販の油性インキ(修正液、ゼブラ
株式会社製)を塗布し(図2参照)、乾燥後上記(9)
と同じ試料溶液と金コロイド標識抗体の混合液に浸漬し
、5分間の展開後目視にて反応部位における「+」ある
いは「−」表示を比較した。表示の出現形式の結果を図
2に示す。
【0033】(11) ワンステップイムノクロマト
グラフィーにおける「+」 「−」表示に対する切欠き
の検討上記イムノクロマトグラフストリップBに、上記
(9)と同じく種々の切欠きを入れ(図3参照)、それ
を(9)と同じ濃度のhCG含有試料およびブランクと
したBSA含有PBS500μlを入れた試験管に、そ
の下端5mmだけ浸漬し、5分間の展開後目視にて反応
部位における「+」あるいは「−」表示を比較した。表
示の出現形式の結果を図3に示す。
グラフィーにおける「+」 「−」表示に対する切欠き
の検討上記イムノクロマトグラフストリップBに、上記
(9)と同じく種々の切欠きを入れ(図3参照)、それ
を(9)と同じ濃度のhCG含有試料およびブランクと
したBSA含有PBS500μlを入れた試験管に、そ
の下端5mmだけ浸漬し、5分間の展開後目視にて反応
部位における「+」あるいは「−」表示を比較した。表
示の出現形式の結果を図3に示す。
【0034】(12) ワンステップイムノクロマト
グラフィーにおける「+」 「−」表示に対する油性イ
ンキの塗布の検討 上記クロマトグラフストリップBに、(10)と同じく
市販の油性インキの塗布を行い、乾燥後それを(11)
と同じ試料溶液にその下端5mmだけ浸漬し、5分間の
展開後目視にて反応部位における「+」あるいは「−」
表示を比較した。表示の出現形式の結果を図4に示す。
グラフィーにおける「+」 「−」表示に対する油性イ
ンキの塗布の検討 上記クロマトグラフストリップBに、(10)と同じく
市販の油性インキの塗布を行い、乾燥後それを(11)
と同じ試料溶液にその下端5mmだけ浸漬し、5分間の
展開後目視にて反応部位における「+」あるいは「−」
表示を比較した。表示の出現形式の結果を図4に示す。
【0035】(13) ツーステップイムノクロマト
グラフィーにおける「Y」 「N」表示に対する切欠き
の検討上記イムノクロマトグラフストリップCの「Y」
「N」の印刷部位をはさんで切欠きを入れ(図5参照
)、それを(9)と同じくhCG含有試料およびブラン
クとしたBSA含有PBS500μlを入れた試験管に
、その下端5mmだけ浸漬し、10分間の展開後目視に
て反応部位における「Y」あるいは「N」表示を比較し
た。表示の出現形式の結果を図5に示す。
グラフィーにおける「Y」 「N」表示に対する切欠き
の検討上記イムノクロマトグラフストリップCの「Y」
「N」の印刷部位をはさんで切欠きを入れ(図5参照
)、それを(9)と同じくhCG含有試料およびブラン
クとしたBSA含有PBS500μlを入れた試験管に
、その下端5mmだけ浸漬し、10分間の展開後目視に
て反応部位における「Y」あるいは「N」表示を比較し
た。表示の出現形式の結果を図5に示す。
【0036】図1〜図5から明らかな様に、本発明方法
に従ってクロマトグラフ媒体上に展開液通過妨害手段を
設けた場合は(+)文字のみならず(Y)、(N)など
の複雑な文字ですら鮮明に表現される。
に従ってクロマトグラフ媒体上に展開液通過妨害手段を
設けた場合は(+)文字のみならず(Y)、(N)など
の複雑な文字ですら鮮明に表現される。
【図1】 切欠きを設けたクロマトグラフストリップ
上の(+)(−)表示の結果を示す模式図。
上の(+)(−)表示の結果を示す模式図。
【図2】 油性インクを塗布したクロマトグラフスト
リップ上の(+)(−)表示の結果を示す模式図。
リップ上の(+)(−)表示の結果を示す模式図。
【図3】 切欠きを設け、第二抗体を予め結合させた
クロマトグラフストリップ上の(+)(−)表示の結果
を示す模式図。
クロマトグラフストリップ上の(+)(−)表示の結果
を示す模式図。
【図4】 油性インクを塗布し、第二抗体を予め結合
させたクロマトグラフストリップ上の(+)(−)表示
の結果を示す模式図。
させたクロマトグラフストリップ上の(+)(−)表示
の結果を示す模式図。
【図5】 切欠きを設けたクロマトグラフストリップ
上の(Y)(N)表示の結果を示す模式図。
上の(Y)(N)表示の結果を示す模式図。
Claims (9)
- 【請求項1】 試料溶液中に存在しうる被検出物質と
特異的に結合する第一抗体をクロマトグラフ媒体のほぼ
中央部に文字状に固定し、該クロマトグラフ媒体の末端
から該被検出物質と特異的に結合する標識化された第二
抗体を含有している該試料溶液を展開させ、標識化され
た第二抗体と結合した試料溶液中に存在しうる該被検出
物質を文字状に固定化された第一抗体に捕捉させること
によって、該試料溶液中の被検出物質の存在または非存
在を、標識物質により視覚的に検出可能となった文字に
より判定することからなるイムノクロマトグラフ法によ
る物質検出法であって、試料溶液の展開方向に照して固
定化された第一抗体の直前、あるいは直前および直後に
展開液通過妨害手段を設けることにより、標識化された
第二抗体と結合した被検出物質と文字状に固定化された
第一抗体との接触を良好ならしめることを特徴とする方
法。 - 【請求項2】 被検出物質と特異的に結合する標識化
された第二抗体を含有している試料溶液が、試料溶液と
標識化された第二抗体とを予め混合することにより調製
されるものである請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 被検出物質と特異的に結合する標識化
された第二抗体を含有している試料溶液が、試料溶液の
展開方向に照らして第一抗体の前方に結合させた第二抗
体に、第二抗体不含の試料溶液が展開途上で接触するこ
とにより調製されるものである請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 クロマトグラフ媒体がガラスフィルタ
ー、ニトロセルロースおよびナイロンからなる群から選
ばれる請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 - 【請求項5】 標識物質が金コロイド粒子、着色ラテ
ックスおよび不溶性染料ポリマーからなる群から選ばれ
る請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 - 【請求項6】 第一抗体の水溶液でクロマトグラフ媒
体上に直接印刷することにより第一抗体を固定する請求
項1〜5のいずれかに記載の方法。 - 【請求項7】 第一抗体を結合させたラテックスでク
ロマトグラフ媒体上に印刷することにより第一抗体を固
定する請求項1〜5のいずれかに記載の方法。 - 【請求項8】 展開液通過妨害手段がクロマトグラフ
媒体の長手方向の側縁部に設けられた切欠きである請求
項1〜7のいずれかに記載の方法。 - 【請求項9】 展開液通過妨害手段がクロマトグラフ
媒体に塗布された疎水性物質である請求項1〜7のいず
れかに記載の方法。
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