JPH0552849A

JPH0552849A - 検体の特異的検出および特異的分離方法

Info

Publication number: JPH0552849A
Application number: JP24021691A
Authority: JP
Inventors: Ikuo Miyamoto; 郁夫宮本
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1991-08-28
Filing date: 1991-08-28
Publication date: 1993-03-02

Abstract

(57)【要約】【構成】検体中の測定対象物質を、それと特異的に
反応する磁性を有する物質及び該磁性を有する物質とは
異なる部位で該測定対象物質と特異的に反応する標識さ
れた物質と反応させるか、又はそれと特異的に反応す
る磁性を有する物質と該磁性を有する物質に対して測定
対象物質と競合的に反応する標識された物質の存在下に
反応させるか、或いはそれと特異的に反応する標識さ
れた物質と該標識された物質に対して該測定対象物質と
競合的に反応する磁性を有する物質の存在下に反応させ
た後、〜で生成した磁性を有する反応物を毛管移動
させ特定の位置で磁力で捕捉して特異的に検出する方
法。【効果】検体中の測定対象物質と特異的に反応する物
質等のクロマトグラフ媒体上への固定化や固液分離が不
要であり、検体中の測定対象物質を極めて簡単に且つ高
感度で検出することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は検体中の測定対象物質を
磁力を利用して特異的に検出する方法に関し、特に磁力
を利用して免疫学的方法により検体中の測定対象物質を
特異的に検出する方法に関する。更に、本発明は、検体
中の分離対象物質を磁力を利用して特異的に分離する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】検体中の測定対象物質を特異的に検出す
る方法として、従来から免疫測定法、すなわちイムノア
ッセイが広く用いられている。イムノアッセイには、検
出に使用される標識の種類に応じて、ラジオイムノアッ
セイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光
イムノアッセイ、色素イムノアッセイ等がある。

【０００３】イムノアッセイでは、検体中の測定対象物
質である特定の抗原または抗体等と特異的に反応する物
質（抗体、抗原等）に放射線、酵素、蛍光体、色素等に
よって標識を付けた標識体を予め準備し、この標識体を
検体中の該測定対象物質と特異的に反応させて、反応物
における標識の発現の有無や強弱等に応じて、該測定対
象物質の有無や量を検出する。しかしながら、その場合
には、測定対象物質および標識体の一方をビーズ、マイ
クロプレート等の固体に固定化して、測定対象物質と標
識体との反応物を固相として未反応の標識体等を含む液
相から分離するか、または測定対象物質と標識体との反
応物を含む液相を未反応の標識体を固定化した固相から
分離するというＢ／Ｆ分離工程が必要であり、このＢ／
Ｆ分離工程はイムノアッセイを繁雑なものにしていた。

【０００４】近年、クロマトグラフィー技術をイムノア
ッセイに利用したイムノクロマトグラフ法と称される方
法が開発された(U.R.Chakradorty et al., Ann. Biol.c
lin.,1990,48, 403-408 ; R.F.Zuk et al., CLINICAL C
HEMISTRY, Vol.31, No.7, 1985)。これらの文献に記載
されているイムノクロマトグラフ法による場合は、クロ
マトグラフ媒体の固相上で、抗原・抗体反応と同時に毛
管移動によって抗原・抗体反応物と未反応物との分離が
行われる。その結果、金コロイド（色素）または酵素で
標識された抗体または抗原による特定の標識がクロマト
グラフ媒体上に出現し、それによって検体中の測定対象
物質の有無や多少を測定することができ、従来のイムノ
アッセイにおけるＢ／Ｆ分離工程を別途行う必要がな
い。

【０００５】しかしながら、上記のイムノクロマトグラ
フ法による場合は、検体中の測定対象物質と特異的に反
応する抗体または抗原（大半は抗体）を、標識された抗
体または抗原とは別に、クロマトグラフ媒体上に予め固
定化しておくことが必要であり、そのためにクロマトグ
ラフ媒体としては、試料の毛管移動に適しているだけで
なく、抗体または抗原の固定化に適した特性を有する必
要があり、クロマトグラフ媒体の素材に対して種々の厳
しい要件が求められる。

【０００６】また、上記のイムノクロマトグラフ法で
は、クロマトグラフ媒体上に固定化した抗体と標識した
抗原および／または測定対象抗原との反応に伴う表現外
形（−、＋のサイン等）、或いは固定化した抗原と標識
した抗体および／または測定対象抗体との反応に伴う表
現外形を、抗体または抗原をクロマトグラフ媒体に固定
化するときに予め定めておかねばならず後で変更するこ
とができない。

【０００７】更に、上記のイムノクロマトグラフ法で
は、例えば測定対象物質である抗原（抗体）とクロマト
グラフ媒体上に固定化した抗体（抗原）および標識され
た抗体（抗原）等の反応は、毛管移動時のほんの一瞬で
ある。そのため、測定対象物質である抗原（抗体）を高
感度で検出するには、クロマトグラフ媒体上に固定化す
る抗体または抗原としては、測定対象物質である抗原ま
たは抗体、および標識された抗体または抗原と、高レベ
ルで結合する結合定数の高いものが要求され、クロマト
グラフ媒体上に固定化する抗体または抗原の種類が限ら
れる。

【０００８】

【発明の内容】上記の点から、本発明者は、従来のイム
ノアッセイにおけるようなＢ／Ｆ分離工程を別途行う必
要がなく、しかも上記した従来のイムノクロマトグラフ
法におけるような種々の厳しい条件を必要とせず、簡単
に且つ高感度で検体中の測定対象物質を検出できる方法
を得ることを目的として研究を続けてきた。その結果、
検体中の測定対象物質と特異的に反応する物質に磁性を
付与しておき、測定対象物質と該特異的反応物質とから
磁性を有する反応生成物を形成させ、これをクロマトグ
ラフ媒体の特定位置に設けた磁場に磁力で捕捉すると、
上記目的を達成できることを見出して本発明を完成し
た。

【０００９】すなわち、本発明は、検体中の測定対象
物質を、それと特異的に反応する磁性を有する物質、お
よび該磁性を有する物質とは異なる部位で該測定対象物
質と特異的に反応する標識された物質と反応させ、磁性
を有し且つ標識された反応生成物を毛管移動させると共
に毛管移動媒体の特定の位置で磁力によって捕捉するこ
とを特徴とする検体中の測定対象物質の特異的検出方法
である。

【００１０】更に、本発明は、検体中の測定対象物質
を、それと特異的に反応する磁性を有する物質と、該磁
性を有する物質に対して該測定対象物質と競合的に反応
する標識された物質の存在下に反応させ、反応生成物を
毛管移動させると共に、毛管移動媒体の特定の位置に磁
力によって磁性を有する反応生成物を捕捉することを特
徴とする検体中の測定対象物質の特異的検出方法であ
る。

【００１１】また、本発明は、検体中の測定対象物質
を、それと特異的に反応する標識された物質と、該標識
された物質に対して該測定対象物質と競合的に反応する
磁性を有する物質の存在下に反応させ、反応生成物を毛
管移動させると共に、毛管移動媒体の特定の位置に磁力
によって磁性を有する反応生成物を捕捉することを特徴
とする検体中の測定対象物質の特異的検出方法である。

【００１２】上記〜の方法に限定されるものではな
いが、本発明を検体中の測定対象物質が特定の抗原であ
り測定対象物質と特異的に反応する物質が抗体であり、
そして毛管移動媒体がクロマトグラフである場合を例に
とって、以下に図１〜４を参照して具体的に説明する。
図１は磁石付きのクロマトグラフを側面から見た図であ
り、図２〜図４は〜の方法による検出結果を正面か
ら見た図である。図１〜図４において、１は検体を入れ
る容器、２はクロマトグラフ媒体、３は裏打ちフイル
ム、４は磁石（ゴム磁石等）、５は吸水体、そして６は
検体を示す。

【００１３】まず、の方法について説明すると、容器
１に測定対象物質である抗原（○）を含む通常液状をな
す検体６を入れ、これに抗原（○）と特異的に反応する
磁性を有する抗体（＞*）（ここで＞は抗体、*は磁性；
以後同じ）、および該磁性を有する抗体（＞*）とは異
なる部位で抗原（○）と特異的に反応する標識された抗
体（＞☆）（ここで＞は抗体、☆は標識；以後同じ）を
加えると、抗原・抗体反応によって、磁性と標識の両方
を有する抗原・抗体反応生成物（*＜○＞☆）が生成す
る。

【００１４】そして、反応生成物（*＜○＞☆）を含む
検体がクロマトグラフ媒体上を吸水体５の方に向かって
徐々に毛管移動によって吸い上げられてゆくと、図２に
見るように、該磁性を有する反応生成物（*＜○＞☆）
が磁石４を設けた位置で磁石４の形状にほぼ一致した形
状に磁力によりクロマトグラフ媒体上に捕捉されと共に
その位置で標識（☆）による発現を行う。したがって、
クロマトグラフ媒体上の磁石４位置における該標識の発
現の有無や強弱、色調等を調べることによって、検体６
中における抗原（○）の有無や多少を検出することがで
きる。その場合に、磁石４はどのような形状であっても
よいが、例えば方形、円形、星型、花型等々の任意の形
状にしておくと、その形状に合致して標識が発現し、測
定対象物質の有無の検出がより容易に行われる。また、
磁石として電気磁石等を使用してもよい。

【００１５】次に、の方法について説明すると、容器
１に入れた測定対象物質である抗原（○）を含む検体６
に、抗原（○）と特異的に反応する磁性を有する抗体
（＞*）と、該磁性を有する抗体に対して抗原（○）と
競合的に反応する標識された抗原（●☆）（ここで●は
抗原、☆は標識；以後同じ）を加えると、競合を伴った
抗原・抗体反応によって、磁性を有する反応生成物（○
＞*）、および磁性と標識の両方を有する反応生成物（*
＜●☆）の２者が生成する。

【００１６】そこで、これらの反応生成物を含む検体が
クロマトグラフ媒体上を吸水体５の方に向かって徐々に
毛管移動によって吸い上げられてゆくと、図３に見るよ
うに、磁石４を設けた位置に、上記で生成した２つの反
応生成物（○＞*）と（*＜●☆）の両方が磁性を有して
いるため、両者が磁力によって捕捉される。この場合
に、検体６中に抗原（○）が存在しない場合には、磁性
のみを有する反応生成物（○＞*）は形成されず、磁性
と標識の両方を有する抗原・抗体反応生成物（*＜●
☆）のみが形成され、それが磁石４のある位置に捕捉さ
れてその標識の発現が強くなる。これに対して、検体６
中に抗原（○）が含まれる場合には、標識を持たず磁性
のみを有する反応生成物（○＞*）も磁石４のある位置
に捕捉される結果、その位置における標識の発現の程度
が低くなる。したがって、磁石４位置におけるクロマト
グラフ媒体上の標識の発現の強弱によって、検体中の抗
原（○）の有無または多少を検出することができる。

【００１７】また、上記の方法について説明すると、
容器１に入れた抗原（○）を含む検体６に、抗原（○）
と特異的に反応する標識された抗体（＞☆）および該標
識された抗体（＞☆）に対して抗原（○）と競合的に反
応する磁性を有する抗原（●*）を加えると、競合を伴
った抗原・抗体反応により、検体中に標識のみを有する
反応生成物（○＞☆）と、磁性と標識の両方を有する反
応生成物（☆＜●*）の２者が形成される。

【００１８】そこで、これらの反応生成物を含む検体が
クロマトグラフ媒体上を吸水体５の方に向かって徐々に
毛管移動によって吸い上げられてゆくと、図４に見るよ
うに、磁石４を設けた位置に、磁性と標識の両方を有す
る反応生成物（☆＜●*）のみが磁力によって捕捉さ
れ、標識のみを有する反応生成物（○＞ ☆）は磁石４位置に捕捉されず、それよりも上部の位置
で標識による発現を生ずの場合に、検体中に抗原（○）
が存在しない場合には、標識のみを有する反応生成物
（○＞☆）は形成されず、磁性と標識の両方を有する抗
原・抗体反応生成物（☆＜●*）のみが形成されて、そ
れが磁石４位置に捕捉される結果、標識は主に磁石４位
置のみ発現するが、検体中に抗原（○）が含まれる場合
は、磁石４を経過した位置にも標識による発現が生ずる
ことになり、このことから検体中の抗原（○）の有無や
多少を検出することができる。

【００１９】そして、上記〜の方法を実施するのに
使用する、検体中の測定対象物質と特異的に反応する磁
性を有する物質(以後「物質ａｂ*」で示す）、物質ａｂ
*とは異なる部位で測定対象物質と特異的に反応する標
識された物質（以後「物質ａｂ☆」で示す）、物質ａｂ*
に対して測定対象物質と競合的に反応する標識された物
質（以後「物質ａｇ☆」で示す）、および物質ａｂ☆に
対して測定対象物質と競合的に反応する磁性を有する物
質（以後「物質ａｇ*」で示す）は、上記〜の検出を
行うたびごとに形成してもよい。しかしながら、本発明
で使用する上記物質ａｂ*、物質ａｂ☆、物質ａｇ☆お
よび物質ａｇ*はいずれも凍結乾燥等の乾燥処理を施す
ことによって、変質することなく長期間安定に保存する
ことができるので、物質ａｂ*、物質ａｂ☆、物質ａｇ
☆および物質ａｇ*の乾燥物を予め形成し保存しておい
て、実際の検出を行う際にその必要量を使用するように
するのが便利である。したがって本発明は、上記〜
の方法を実施するのに使用する物質ａｂ*、物質ａｂ
☆、物質ａｇ☆および物質ａｇ*の乾燥物、更に、それ
らの乾燥物を上記〜の検査方法が容易に行えるよう
に組み合わせたものを包含する。

【００２０】そして、上記した物質ａｂ*、物質ａｂ
☆、物質ａｇ☆および物質ａｇ*を乾燥状態でクロマト
グラフ媒体等の毛管移動媒体の特定位置に予め配置した
検査用キット、更に該検査用キットの特定位置に磁石等
の磁場発生部材を配置した検査用キットは、長期保存が
可能であり、しかもそのまま直ちに上記した〜の検
出を行うのに使用することができて極めて便利であり、
したがって本発明はそのような検出用キットをも包含す
る。

【００２１】上記検査用キットの例を図５および図６に
より具体的に説明する。図５および図６において、２は
クロマトグラフ媒体、３は裏打ちフイルム、４はゴム磁
石等の磁石、５は吸水体、および７は試料（検体）採取
部を示す。図５の検査用キットでは、試料採取部７と磁
石４との間の試料採取部７に近い位置８に、測定対象物
質と特異的に反応する物質ａｂ*および物質ａｂ☆の両
方が乾燥状態で同時に施してある。そして、この図５の
検査用キットを使用する場合は、試料採取部７に液状の
検体を施すと、検体中に含まれる成分が液体と共に毛管
移動によって吸水体５の方向に移動し、位置８に到達す
ると検体中の測定対象物質が物質ａｂ*および物質ａｂ
☆の両方と反応して磁性と標識の両方を有する反応生成
物を形成し、その反応生成物が磁石４の位置で磁力によ
って捕捉されて、その位置で標識による発現を生ずる。

【００２２】また、図６の検査用キットでは、試料採取
部７と磁石４との間の最初の位置９に物質ａｂ*を乾燥
状態で施し、それと少し離れた第２の位置１０に物質ａ
ｂ☆が乾燥状態で施してある。そして、この図６の検査
用キットを使用する場合は、試料採取部７に液状の検体
を施すと、検体中に含まれる成分が液体と共に毛管移動
によって吸水体５の方向に移動し、位置９に到達すると
検体中の測定対象物質が物質ａｂ*と反応して磁性を有
する反応生成物を形成し、その反応生成物が毛管移動に
より更に吸水体５へと移動すると、位置１０において更
に物質ａｂ☆と反応して磁性と標識の両方を有する反応
生成物を形成し、その反応生成物が磁石４の位置で磁力
によって捕捉されて、その位置で標識による発現を生ず
る。

【００２３】上記した検査用キットにおいて、検出に用
いる物質ａｂ*、物質ａｂ☆、物質ａｇ☆および物質ａ
ｇ*が互いに反応しないときは、クロマトグラフ媒体上
の同じ位置に施しておいても、または離しておいてもよ
い。一方、それらの物質が互いに反応し易い場合は、同
じ位置に施さず、互いに離れた位置に施しておくのが望
ましい。また、該検査用キットにおいて、磁石等の磁場
発生部材は、最初から検査用キットと一体に設けておい
ても、または着脱自在に設けておいても、或いは個別に
準備しておき各々の検査内容等に応じて検出操作時に適
当な磁場発生部材を配置または取り付けるようにしても
よい。

【００２４】図５および図６に示した検査用キットは、
ほんの一例であり、本発明はそれに限定されるものでは
ない。検査用キットに用いる毛管移動媒体、吸水体、裏
打ちフイルム等の材質は、この種の検査用キットにおい
て従来から知られているいずれのものを使用してもよ
く、またそれらの形状もストリップ状だけでなく種々の
形状とすることができる。また、磁性を有する物質ａｂ
*および物質ａｇ*と、標識を有する物質ａｂ☆とａｇ☆
とを互いに異なった色にしておくと、検体検査により、
それら複数の色が混ざった種々の色調が得られるので、
その色調を調べることによって測定対象物質の多少や濃
度等を目視等により判定できる。

【００２５】そして、本発明の方法は、免疫学的に特異
的に反応する相手が存在する物質（測定対象物質）の検
出に特に有効に使用することができる。該測定対象物質
は、１つまたは２つ以上の免疫学的に活性な部位を有す
る生理学的流体、細胞抽出物、組織抽出物中のどのよう
な構成成分でもよく、例えばペプチド、タンパク質、リ
ポタンパク質、糖タンパク、ステロール、ステロイド、
糖脂質、核酸、酵素、ホルモン、多糖類、アルカロイ
ド、薬物等を挙げることができる。そのうちでも、本発
明は、測定対象物質が特定の抗原または抗体である場合
に有効であり、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、
癌胚抗原（ＣＥＡ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、プ
ロラクチン、エストロゲン、潜血ヘモグロビン、ジゴキ
シン、バルビツール、モルヒネ等の検出に特に有効であ
る。そして、これらの抗原の検出に際しては、それと特
異的に反応することが広く知られている抗体を使用する
ことができる。また、本発明のおける特異的反応は、免疫学的な抗原・
抗体反応の他にも、ＤＮＡ・ＲＮＡの相互作用や酵素基
質の反応、更にホルモンとリセプターの反応等の一般的
に知られる他の特異的反応であってもよい。

【００２６】本発明の上記したおよびの方法で使用
する、検体中の測定対象物質と特異的に反応する磁性を
有する物質、すなわち物質ａｂ*は、例えば磁性ポリス
チレンラテックス、磁性ゴムラテックス等の磁性を付与
した（磁性物質を結合させた）ポリマー微粒子；鉄、コ
バルト、ニッケルまたはそれらの化合物等からなる磁性
物質自体；有機ポリマー、ラテックス自体のスピンを変
えて磁性にした有機磁性ポリマーやラテックス；または
上記のものを組み合わせた物質等；の磁性を有する材料
（通常微粒子）の表面に測定対象物質と特異的に反応す
る物質を物理吸着、化学反応、結合剤により結合等の方
法によって付着させることにより形成することができ
る。また、測定対象物質と特異的に反応する物質がそれ
自体で磁性を有するもの（例えば体内にマグネタイトを
持っている細菌等）の場合は、上記のような磁性付与処
理を行うことなくそのまま直接使用することができる。
また、本発明のの方法で使用する標識された物質（物
質ａｂ☆）に対して測定対象物質と競合的に反応する磁
性を有する物質（物質ａｇ*）も、物質ａｂ*の場合と同
様の方法によって形成することができる。

【００２７】更に、本発明の方法により、検体中の複数
種の測定対象物質を同時に検出することも可能である。
その場合には、例えば、検体中の複数の測定対象物質の
各々に特異的に反応する物質を各々準備し、それらに例
えば強さの異なる磁性を付与し、毛管移動媒体にも各々
の磁性に適合した複数の磁場を位置をずらして設けてお
き、毛管移動によって各磁場に反応生成物（例えば上記
した抗原・抗体反応生成物）の各々を別々に捕捉するよ
うにするとよい。

【００２８】測定対象物質と特異的に反応する物質また
は測定対象物質と競合的に反応する物質に付ける標識と
しては、イムノアッセイ等のこの種の検出方法において
通常使用されている標識のいずれもが採用でき、例えば
放射性物質、酵素、蛍光物質、色素等による標識を挙げ
ることができる。特に、色素標識を使用した場合には、
磁場に発現した標識をそのまま直接目視により観察でき
て便利であり、色素標識の例としては金コロイド、銀コ
ロイド等の金属コロイド、セレン等の非金属コロイド、
染料や色素の重合体、着色ラテックス等を挙げることが
できる。

【００２９】また本発明においては、標識された物質
（物質ａｂ☆または物質ａｇ☆）を使用せずに、検体中
の特定物質をそれと特異的に反応する磁性を有する物質
（物質ａｂ*）と反応させ、その磁性を有する反応生成
物を毛管移動させると共に毛管移動媒体の特定の位置で
磁力によって捕捉する方法を採用することが可能であ
り、この場合には、標識がないために該特定物質は検出
できないものの、該特定物質を毛管移動媒体の特定位置
に磁力によって捕捉し分離することが可能になる。そし
て、磁力によるこのような捕捉・分離方法を使用した場
合には、検体中に含まれていて特定の測定対象物質の検
出に妨害となる他の特定の物質を予め分離することがで
き、測定対象物質の検出をより精密に行うことが可能に
なる。

【００３０】そして、本発明において、上記〜の方
法の一つと上記の方法を組み合わせた場合には、検体
中の測定対象物質の検出・測定と検体中の分離対象物質
の分離を一つの操作で同時に行うことができる。具体的
には、例えば、検体中の測定対象物質と分離対象物質の
各々に特異的に反応する物質を各々準備しそれらに強さ
の異なる磁性を各々付与しておき、同時に測定対象物質
とのみ特異的に反応する標識された物質を準備し、毛管
移動媒体に各々の磁性に適合した２つの磁場を位置をず
らして設けておき、毛管移動によって一方各磁場には磁
性を有し且つ標識された測定対象物質の反応生成物を捕
捉し、もう一方の磁場には磁性を有する分離対象物の反
応生成物を捕捉することによって、検体中の測定対象物
質を検出・測定すると共に、検体中の分離対象物を同時
に分離することができる。以下に本発明を実施例により
具体的に説明するが、本発明はそれにより限定されな
い。

【００３１】

【実施例】

《実施例１》［上記の方法によるＨＣＧの検出試
験］磁性ポリスチレン粒子の調製 Polyscience Inc．製の磁性ポリスチレン粒子を蒸留水
４ｍｌに懸濁し、Advanced Magnetic Inc.製のBioMag^R
で３０秒処理し、凝集した粒子を除去し、更に１０分間
処理して磁性ポリスチレン粒子を沈殿させて回収した。

【００３２】磁性を有する抗ＨＣＧポリクロナール抗体
（PoAb）の調製上記で調製した磁性ポリスチレン粒子の沈殿物１００ｍ
ｇにPoAb０.１ｍｇ／ｍｌ５０ｍＭ炭酸緩衝液(ｐＨ９.
５）を１ｍｌ加え、４℃で一昼夜震盪して、磁性ポリス
チレン粒子表面にPoAbを物理吸着させた後、遠心分離を
行って磁性を有するPoAbを回収した。

【００３３】金コロイド標識を有する抗ＨＣＧモノクロ
ナール抗体（MoAb）の調製蒸留水１リットルを８０℃に加熱して、これにＨＡuＣl
₄ ０.１ｇ／１０ｍｌ蒸留水の溶液を加えた。水酸化カ
リウムでｐＨを４.０〜４.５に調節したリンゴ酸０．２
ｇ／２０ｍｌ蒸留水の溶液を急速に加えて激しく撹拌し
た。３０〜９０秒以内に溶液の色が黄白色から赤褐色に
変化して、金コロイドヒドロゾルが形成された。８０℃
で更に１時間加熱した後、室温に冷却して、遠心分離し
て金コロイドヒドロゾルを分取した。MoAb １５μｇ／
ｍｌ３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８.０）中に上記で調製
した金コロイドヒドロゾルを光波長５３０ｎｍにおける
吸光度Ａ₅₃₀（以後同様に標記する）が１.０になるよう
に加えて一昼夜震盪してMoAbに金コロイドを吸着させた
後、遠心分離を行って金コロイドで標識されたMoAbを回
収した。

【００３４】検査用キットの作成図１に示すように、厚さ５０μｍのポリエチレンテレフ
タレート製の裏打ちフイルム４にナイロン・テトロン混
紡織物（厚さ２５０μｍ）からなる毛管移動媒体２を貼
付けた幅８ｍｍ、長さ５０ｍｍの細長いストリップの上
部にセルロース濾紙からなる縦×横×厚さ＝２０ｍｍ×
２０ｍｍ×５ｍｍの吸水体５を取り付け、また該ストリ
ップの下端から約２０ｍｍの位置で裏打ちフイルム側に
幅×長さ×厚さ＝８ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍのゴム磁石４
（パイロット社製；マグシート）を取り付けて検査用キ
ットを作成し、この検査用キットを複数個用意した。

【００３５】ＨＣＧの検出試験１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）０.１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７.０）１ｍｌに、上記で調製した磁性を有す
るPoAbをＡ₄₅₀が１.０になるように加え、更にこの液に
上記で調製した金コロイドで標識されたMoAbをＡ₅₃₀が
１.０になるように加えた液を３つ準備した。そのうち、第１の液にはＨＣＧを５０ｍＩＵ／ｍｌ、第
２の液にはＨＣＧを５００ｍＩＵ／ｍｌ加え、そして第
３の液にはＨＣＧを加えないで検査用の液（検体）をつ
くり、各検査用液を図１に示した容器１の各々に区別し
て入れた。上記で作成した検査用キットを、ＨＣＧを含
有するまたは含有しない上記の検査用液を入れた容器１
の各々に、その下端から４ｍｍまでが液中に浸かるよう
にして５分間浸漬した。その後、各検査用キットを容器
１から取り出して、磁石４を取り付けた位置における着
色（紫色）の有無を目視により観察したところ、下記の
表１に示す結果を得た。

【００３６】

【表１】ＨＣＧ濃度(mIU／ml) ０５０５００判定結果着色なし薄紫色に着色濃紫色に着色

【００３７】上記表１の結果から、本発明の方法による
場合は、検体中の測定対象物質（ＨＣＧ）が極めて簡単
な操作で、感度よく検出できることがわかる。

【００３８】《実施例２》［上記の方法によるＨＣ
Ｇの検出試験］酵素（ペルオキシダーゼ）で標識したＨＣＧの調製ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）にモル比で１０倍のＮ−サ
クシンイミジルー３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネ
ート(ＳＰＤＰ）を０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）
中で３０℃で３０分反応させた後、０．１Ｍクエン酸緩
衝液（ｐＨ４．５）中で透析した。次に、ジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）を５０ｍＭになるように加えてＰＯＤ
に導入したＳＰＤＰを還元してＳＨ基を露出させた。次
いで、５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）を用いて脱塩カラムにかけて過剰のＤＴ
Ｔを除いて、ＳＨ導入ＰＯＤを調製した。一方、ＨＣＧ
にモル比で１０倍のスルホサクシンイミジル−４−ＣＮ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（Ｓ−ＳＭＣＣ）を０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７.０）中で３０℃で３０分反応させた後、同じリン酸
緩衝液を使用して脱塩カラムにかけて、マレイミド化Ｈ
ＣＧを１０ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する液を調製した。
上記で調製したマレイミド化ＨＣＧ含有液に、上記で調
製したＳＨ導入ＰＯＤを５ｍｇ／ｍｌ以上の割合で混和
し、４℃で一昼夜反応させた。反応物をセファクリルＳ
−３００カラム（ファルマシア社製）を使用して精製し
てＰＯＤ標識ＨＣＧを得た。

【００３９】ＨＣＧの検出試験１％ＢＳＡ０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）１ｍｌ
に、実施例１で使用したのと同じ磁性を有するPoAbをＡ
₄₅₀が１.０になるように加え、更にこの液に上記で調製
したＰＯＤ標識ＨＣＧを０.０１μｇ／ｍｌの割合で加
えた液を４つ準備した。そのうち、第１の液にはＨＣＧを１０ｍＩＵ／ｍｌ、第
２の液にはＨＣＧを１００ｍＩＵ／ｍｌ加え、第３の液
にはＨＣＧを１０００ｍＩＵ／ｍｌ加え、そして第４の
液にはＨＣＧを加えないで検査用の液（検体）をつく
り、各検査用液を実施例１で使用したのと同じ検査用キ
ットを使用して実施例１と同様にして５分間浸漬した。
その後、各検査用キットを容器１から取り出して、更に
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に５分間浸漬し
てクロマト処理した。次いで、０.０１５％Ｈ₂Ｏ₂、２,
２'−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリンー６−
スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）を含む０.
１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）０.１ｍｌを検査用
キットの磁石取り付け位置に相当する毛管移動媒体上に
施して室温で５分間反応させた後、その部分における４
１０ｎｍにおける反射吸光度を測定した。その結果を図
７に示す。

【００４０】図７の結果から、検体中のＨＣＧの濃度と
４１０ｎｍにおける反射吸光度とはほぼ一定の直線関係
にあることがわかる。したがって、特定の検査用キット
に対して図７に見るような検量線を予め作成しておき、
該検査用キットを使用して実際の検体を試験した時に得
られた値（反射吸光度）を該検量線に対比することによ
って、実際の検体中のＨＣＧの有無や濃度の検出ができ
る。

【００４１】《実施例３》［図５の検査用キットを使
用したの方法のよるＨＣＧの検出]黄色を有する磁性ポリスチレン粒子の調製実施例１で使用したのと同じ磁性ポリスチレンラテック
ス０．５ｍｌを精製水４ｍｌに懸濁した後、Advanced M
agnetic Inc.製のBioMag^R Separatorを使用して１分間
処理して、重い磁性粒子や磁気量の多い粒子を磁力で吸
引して沈殿させて除去した。上澄み液を分別して容器に
入れ、上記のBioMag^R Separatorを使用して更に１０分
処理して、磁性を有するポリスチレン微粒子を磁力で集
めて回収した。

【００４２】黄色を有する磁性PoAbの調製上記で回収した磁性を有するポリスチレン微粒子の表面
に実施例１におけるのと同様にしてPoAbを物理吸着させ
た後、遠心分離を行って黄色を有する磁性PoAbを得た。

【００４３】青色標識を有するMoAbの調製アミノ基を有するポリスチレンラテックス粒子（青色）
０.１ｇを０.１％グルタルアルデヒド水溶液１ｍｌ中に
入れて、室温で３０分間処理した後、遠心分離して回収
した。これをMoAb １ｍｇ／ｍｌ１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ８.０）２ｍｌ中に懸濁し、室温で２時間反応さ
せた後、１Ｍグリシン水溶液(ｐＨ８.０）を１ｍｌ加え
て更に２時間反応させた。遠心分離により反応物を回収
して、１％ＢＳＡ０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）
に懸濁させた後、遠心分離して青色標識を有するMoAbを
回収した。

【００４４】検査用キットの作成厚さ５０μｍのポリエステル製の裏打ちフイルム４にナ
イロン・テトロン混紡織物（厚さ２５０μｍ）からなる
毛管移動媒体２を貼付けた幅８ｍｍ、長さ８０ｍｍの細
長いストリップを用意した。上記で調製した黄色を有す
る磁性PoAbおよび青色標識を有するMoAbをそれぞれＡ
₄₅₀１.０１、Ａ₄₂₀１.０１になるような量で３％ＢＳＡ
０.１Ｍショ糖液に加えた液１０μｌを、レーヨン不織
布（厚さ１５０μｍ、長さ１０ｍｍ、幅１０ｍｍ）に含
浸させ、凍結乾燥した後、この不織布を、上記のストリ
ップの左端から１０〜２０ｍｍの位置に亙って軽く圧着
した。次に、該ストリップの右端部に縦×横＝２０ｍｍ
×２０ｍｍのＮｏ．１濾紙からなる吸水体５を取り付
け、また左端には親水性多孔性プラスチックからなる幅
×長さ×厚さ＝８ｍｍ×４０ｍｍ×４ｍｍの試料採取部
７を取り付け、更に該ストリップの左端から約５０ｍｍ
の位置で裏打ちフイルム側に幅×長さ×厚さ＝８ｍｍ×
２ｍｍ×１ｍｍのゴム磁石４（パイロット社製；マグシ
ート）を取り付けて、図５に示した検査用キットを作成
した。

【００４５】ＨＣＧの検出試験ＨＣＧを各１００ｍＩＵ／ｍｌ、５００ｍＩＵ／ｍｌを
加えた液、更にＨＣＧを加えない液の３種類の液を調製
し、上記で作成した検査用キット３個の各々の試料採取
部７に各液を１ｍｌ含ませた。５分放置した後、毛管移
動媒体２の磁石４取り付け位置における呈色状態を目視
により観察したところ、下記の表２に示す結果を得た。

【００４６】

【表２】ＨＣＧ濃度(mIU／ml) ０１００５００呈色状態黄色緑色ほぼ青色

【００４７】上記表２の結果から、測定対象物質と特異
的に反応する磁性を有する物質（物質ａｂ*）と標識を
有する物質（物質ａｂ☆）とを異なった色にしておく
と、検体中の測定対象物質の濃度に応じて磁石位置に発
現する呈色状態が変化すること、したがって濃度の変化
に応じた標準色調表を作成しておくと、その標準色調表
との対比によって、実際の検体中の測定対象物質の濃度
を知ることができることがわかる。

【００４８】《実施例４》[図６の検査用キットを使
用したの方法のよるＨＣＧの検出]検査用キットの作成ポリエチレンテレフタレート製の裏打ちフイルム４にテ
トロン・ナイロン混紡織物からなる毛管移動媒体２を貼
付けた実施例３で用いたのと同じ細長いストリップ複数
個用意した。該ストリップの左端から１０ｍｍの位置に
実施例１におけるのと同様に調製した磁性を有するPoAb
を含有するＡ₄₅₀が１.０の１％ＢＳＡ０.１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７.０）を施し、更に該ストリップの左端か
ら３０ｍｍの位置に実施例１におけるのと同様に調製し
た金コロイド標識を有するMoAbを含有するＡ₅₃₀が１.０
の１％ＢＳＡ０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）を施
した後凍結乾燥した。次に、該ストリップの右端部に実
施例３と同様にしてＮｏ．１濾紙からなる吸水体５を取
り付け、また左端には多孔質の親水性試料採取部７を取
り付け、更に該ストリップの左端から約６０ｍｍの位置
で裏打ちフイルム側に実施例３と同様にゴム磁石４を取
り付けて、図６に示した検査用キットを作成した。

【００４９】ＨＣＧの検出試験ＨＣＧを各々０、２０、５０、１００および２００ｍＩ
Ｕ／ｍｌ加えた試験液調製し、上記で作成した検査用キ
ットの各々の試料採取部７に各試験液を１ｍｌ含ませ
た。５分放置した後、毛管移動媒体２の磁石４取り付け
位置における呈色状態を目視により観察したところ、そ
の検出限界は５０ｍＩＵ／ｍｌであった。

【００５０】《比較例１》実施例４に使用した検査用
キットの磁石４を取り外し、毛管移動媒体２の磁石４の
あった位置に、キット上に施した磁性を有するPoAb量と
等しくなるように極細ニードルを使用してPoAb液を更に
スポット状に施して(PoAb約０.２μｇ）、比較用の検査
用キットを複数個作成した。この比較用の検査用キット
の各々に、実施例４と同様にしてＨＣＧを各々０、２
０、５０、１００および２００ｍＩＵ／ｍｌ加えた試験
液をその試料採取部７に各１ｍｌ含ませた。５分間放置
した後、毛管移動媒体２のPoAbスポットを施した位置に
おける呈色状態を目視により観察したところ、その検出
限界は１００ｍＩＵ／ｍｌであった。

【００５１】上記実施例４および比較例１の結果から、
特定の位置に磁石を取り付けた実施例４の本発明の検査
用キットの場合は、磁石のない比較例１の検査用キット
に比べてその検出感度が２倍にもなり大幅に向上するこ
とがわかる。

【００５２】

【発明の効果】本発明による場合は、従来のイムノアッ
セイにおけるような測定対象物質および標識体の一方を
ビーズ、マイクロプレート等の固体に固定化して、測定
対象物質と標識体との反応物を固相として未反応の標識
体等を含む液相から分離するか、または測定対象物質と
標識体との反応物を含む液相を未反応の標識体を固定化
した固相から分離するというＢ／Ｆ分離工程が不要であ
り、検体中の測定対象物質を簡単に検出することができ
る。

【００５３】また、本発明による場合には、これまで知
られたイムノクロマト法と異なり、検体中の測定対象物
質と特異的に反応する抗体または抗原（大半は抗体）を
標識された抗体または抗原とは別に、クロマトグラフ媒
体上に予め固定化しておくことが不要であるため、毛管
移動媒体（クロマトグラフ媒体）は試料の毛管移動に適
した特性を備えているだけでよく、毛管移動媒体の素材
に対して厳しい要件が不要である。

【００５４】更に、本発明による場合には、標識の発現
外形を適宜変更した形で設定でき、測定対象物質とそれ
と特異的に反応する物質は毛管移動媒体上を徐々に移動
しながら長時間に亙って確実に行われるので、測定対象
物質との結合定数が比較的低い物質でも使用でき、しか
も測定対象物質を高感度で検出できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で使用する磁石付きのクロマトグラフを
側面から見た図である。

【図２】図１の磁石付きのクロマトグラフを使用して、
の方法により検出を行った結果を正面から見た図であ
る。

【図３】図１の磁石付きのクロマトグラフを使用して、
の方法により検出を行った結果を正面から見た図であ
る。

【図４】図１の磁石付きのクロマトグラフを使用して、
の方法により検出を行った結果を正面から見た図であ
る。

【図５】本発明の検査用キットの一例を示す図である。

【図６】本発明の検査用キットの別の例を示す図であ
る。

【図７】実施例２の測定結果を示した図である。

【符号の説明】

１検体を入れる容器２クロマトグラフ媒体３裏打ちフイルム４磁石５吸水体６検体７試料採取部８磁性物質（物質ａｂ*）および標識物質（物質ａｂ
☆）の配置位置９磁性物質（物質ａｂ*）の配置位置１０標識物質（物質ａｂ☆)の配置位置

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】検体中の測定対象物質を、それと特異的
に反応する磁性を有する物質、および該磁性を有する物
質とは異なる部位で該測定対象物質と特異的に反応する
標識された物質と反応させ、磁性を有し且つ標識された
反応生成物を毛管移動させると共に毛管移動媒体の特定
の位置で磁力によって捕捉することを特徴とする検体中
の測定対象物質の特異的検出方法。
【請求項２】検体中の測定対象物質を、それと特異的
に反応する磁性を有する物質と、該磁性を有する物質に
対して該測定対象物質と競合的に反応する標識された物
質の存在下に反応させ、反応生成物を毛管移動させると
共に、毛管移動媒体の特定の位置に磁力によって磁性を
有する反応生成物を捕捉することを特徴とする検体中の
測定対象物質の特異的検出方法。
【請求項３】検体中の測定対象物質を、それと特異的
に反応する標識された物質と、該標識された物質に対し
て該測定対象物質と競合的に反応する磁性を有する物質
の存在下に反応させ、反応生成物を毛管移動させると共
に、毛管移動媒体の特定の位置に磁力によって磁性を有
する反応生成物を捕捉することを特徴とする検体中の測
定対象物質の特異的検出方法。
【請求項４】請求項１〜３のいずれか１項の方法を実
施するのに使用する、検体中の測定対象物質と特異的に
反応する磁性を有する物質、該磁性を有する物質とは異
なる部位で該測定対象物質と特異的に反応する標識され
た物質、該磁性を有する物質に対して該測定対象物質と
競合的に反応する標識された物質、該測定対象物質と特
異的に反応する標識された物質および該標識された物質
に対して該測定対象物質と競合的に反応する磁性を有す
る物質の各々の乾燥物、またはそれらの乾燥物の組み合
わせ体。
【請求項５】請求項４の乾燥物質を、請求項１〜３の
いずれか１項の方法を実施し得るように、毛管移動媒体
の特定位置に予め配置した検査用キット。
【請求項６】毛管移動媒体の特定位置に磁場発生部材
を配置した請求項５の検査用キット。
【請求項７】検体中の分離対象物質を、それと特異的
に反応する磁性を有する物質と反応させ、その磁性を有
する反応生成物を毛管移動させると共に毛管移動媒体の
特定の位置で磁力によって捕捉し分離することを特徴と
する検体中の分離対象物質の分離方法。
【請求項８】請求項７の分離対象物質が測定対象物質
と異なる請求項１〜７のいずれか１項による測定対象物
質の検出方法、およびこれに関する検出試薬、キットお
よび装置。