KR20070090190A - 시료 효율적인 측면 흐름 면역분석법 - Google Patents

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치부에제 치드벨루-에제
샤운 레이 피스터
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킴벌리-클라크 월드와이드, 인크.
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Abstract

시험 시료내에 체류하는 분석물의 존재 또는 양을 검출하기 위한 측면 흐름 분석 장치로서, 접합 패드 및 흡상 패드와 소통하는 다공성 막을 갖는 측면 흐름 분석 장치가 제공된다. 다공성 막은 고정화된 제1 포획 시약이 분석물 및 분석물-접합체 복합체의 적어도 일부와 결합하여 검출 신호를 생성하도록 되어 있는 검출 구역을 갖는다. 다공성 막 상의 검출 구역의 하류에는 조절 구역이 위치할 수 있고, 조절 구역내에는 제2 포획 시약이 고정화되어 있다. 접합 패드는 검출 구역의 상류에 위치하며, 분석물에 특이적으로 결합하는 부재를 갖는 검출 프로브를 갖는다. 시료는 조절 및 검출 구역 사이에 증착된다. 완충액 방출 구역이 접합 패드의 상류에 위치하며, 장치에 완충액 첨가를 제공하고, 완충액은 검출 프로브를 검출 및 조절 구역으로 이동시키는 역할을 한다.

Description

시료 효율적인 측면 흐름 면역분석법 {SAMPLE-EFFICIENT LATERAL FLOW IMMUNOASSAY}
분석물이 분석적으로 검출될 수 있도록 검출가능한 성분으로 표지되어 있는 면역반응물을 사용하는 몇가지 공지된 면역분석법(immunoassay)이 있다. 예를 들면, "샌드위치형(sandwich-type)" 분석은 전형적으로 염색된 라텍스 또는 방사능 동위원소와 같은 검출가능한 프로브를 시험 시료와 혼합하는 것을 포함하는데, 이 프로브는 분석물에 대해 특이적으로 결합하는 부재와 접합된다. 접합된 프로브는 분석물과 함께 복합체를 형성한다. 이러한 복합체는 이어서 고정화된 항체 구역에 이르며, 여기에서 항체와 분석물 사이에 결합이 일어나, 3원(ternary) "샌드위치 복합체(sandwich complex)"를 형성한다. 샌드위치 복합체는 분석물 검출을 위한 구역에 국소화된다. 이러한 기법은 정량적 또는 반-정량적 결과를 얻는데 사용될 수 있다. 대안적인 기법은 "경쟁형(competitive-type)" 분석이다. "경쟁형" 분석에서는 표지가 전형적으로, 시료 중에 존재하는 임의의 미표지 분석물과 항체의 결합에 대해 경쟁하는 표지된 분석물 또는 분석물-유사체이다. 경쟁형 분석은 전형적으로 합텐과 같은 분석물의 검출에 사용되는데, 각 합텐은 일가(monovalent)이고 단 하나의 항체 분자와 결합할 수 있다.
또다른 타입의 분석법은 분석물을 제1 선상에 스트리핑하고(stripe), 접합체 입자상의 항체에 특이적인 항체 (예로서, 염소 항-마우스 또는 "GAM")를 그 다음에 스트리핑하는 저해/월류(overflow) 분석법이다. 상기 분석법에서 존재하는 임의의 분석물은 분석물에 특이적인 항체 (또는 다른 결합체)를 갖는 접합체 입자에 결합할 것이다. 분석물이 특정 역치량 미만의 수준인 경우, 입자는 분석물에 의해 완전하게 차폐(cover)되지 못하고, 즉, 완전하게 저해되지 못하고, 이로써 분석물로 스트리핑된 제1 선에서 여전히 복합체를 형성할 수 있을 것이다. 분석물이 역치 수준 이하일 경우, 상기 저해 선은 본질적으로 접합체를 제거/결합하는 작용을 한다. 접합체 입자상에서 항체를 인지하는 항체로 구성된, 그 다음에 있는 선은 "월류" 선으로서 작용할 것이다. 이는 분석물 수준이 역치 수준 이상일 경우에만 입자에 결합한다 (이로써 착색된 선이 형성된다). 추가로, 양성 대조군 선, 예로서, 상이한 접합체 입자 군집 (예로서, 그 위에 래빗 항체를 갖는 것)을 포획하기 위하여 스트리핑된 염소 항-래빗 ("GAR") 선을 사용할 수 있다. 시험이 실행 가능하고 적절하게 수행되는 한, 상기 선은 항상 형성되어야 한다.
관통 흐름(flow through) 또는 측면-흐름 분석법이 다수의 분석물에 대하여 더욱 보편화되어 있지만, 다수는 측면 흐름 분석법의 특징인, 시료 및 표지 또는 접합체 입자의 흐름을 허용하기 위해서 크기가 상대적으로 큰 시료를 요구한다. 더욱 특히, 현재 이용가능한 측면 흐름 분석법은 시료 증착점으로부터 하류 및 검출 구역으로부터 상류에 위치하는 접합체를 사용한다. 시료 그 자체는 접합체를 재현탁시키고 그를 검출 구역으로 이송시키는데 의존된다. 다르게는, 시료를 접합 패드로 이송하고, 접합체 입자의 재현탁을 돕고, 이어서 검출 구역에 도달하게 하 기 위해서 시료와 함께 추가의 희석제를 첨가할 수 있다. 어느 경우이건, 입자의 재현탁을 돕기 위해서 시료 첨가는 전형적으로 접합체 입자로부터 상류에 적용된다. "상류" 및 "하류"는 분석 장치상의 시료의 흐름 방향에 대하여 상대적인 아이템의 위치를 언급한다는 것에 주의한다.
상기 장치들로부터 이익을 얻음에도 불구하고, 항상 원하는 신호 (선) 강도를 형성하는 것은 아니다. 신호는 저수준의 분석물에서는 가시화될 수 없기 때문에 장치가 사용될 수 있는 환경은 제한을 받는다. 통상의 분석법에서는 또한 (혈액) 시료의 짙은 적색 또는 시료 흐름성과의 문제를 유발할 수 있는 시료의 점성 때문에 신뢰성이 다소 덜 할 수 있다. 그러므로, 다량의 시료를 요하지 않으면서도 강력한 신호 (선) 강도를 제공할 뿐만 아니라, 신뢰할 수 있는 결과를 제공할 수 있는 개선된 분석 기술이 요구되고 있다.
본 발명의 요약
본 발명의 실시태양에 따라, 시험 시료내에 체류하는 분석물의 존재 또는 그의 양을 검출하기 위한 분석 장치를 개시한다. 분석 장치는 흡상 패드와도 소통하는(in communication with) 다공성 막과 액상 소통하는(in liquid communication with) 접합 패드를 포함한다. 접합 패드, 다공성 막 및 흡상 패드는 3개 구역 모두의 기능성을 갖는 단일 물질일 수 있다는 것도 가능하다는 점에 주의하여야 한다.
다공성 막은 예를 들면, 니트로셀룰로오스와 같이 검출 프로브가 통과할 수 있는 임의의 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 다공성 막은 제1 포획 시약이 고정되어 있는 검출 구역을 갖는다. 제1 포획 시약이 분석물 및 분석물-접합체 복합체의 적어도 일부와 결합하여 검출 신호를 생성하도록 되어 있다. 제1 포획 시약은 항원, 합텐, 단백질 A 또는 G, 뉴트라비딘, 아비딘, 스트렙타비딘, 캡타비딘, 1차 또는 2차 항체, 및 그의 복합체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 제1 포획 시약은 예를 들면, 분석물과 접합된 검출 프로브 사이에서 형성된 복합체에 결합할 수 있다.
조절 구역이 다공성 막상에서 검출 구역의 하류에 위치한다. 제2 포획 시약이 조절 구역내에 고정화되어 있고, 이는 접합체, 접합체-분석물 복합체 또는 순수 프로브와 결합하여 분석이 제대로 수행되고 있는지를 표시하도록 한다. 한 실시태양에서, 제2 포획 시약은 항원, 합텐, 고분자 전해질, 단백질 A 또는 G, 뉴트라비딘, 아비딘, 스트렙타비딘, 캡타비딘, 1차 또는 2차 항체, 및 그의 복합체로 구성된 군으로부터 선택된다.
접합 패드는 분석물의 존재를 신호로 알리는 검출 프로브를 포함한다. 접합 패드는 또한 조절 구역에서의 표시를 위한 프로브를 비롯한, 다른 상이한 프로브 군집을 포함할 수 있다. 바람직한 경우, 검출 프로브는 색소원, 촉매, 발광 화합물 (예로서, 형광, 인광 등), 방사성 화합물, 시각적 표지, 입자 (예로서, 염색된, 금, 은, 다른 광학적 고밀도 물질), 리포좀, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 물질을 포함할 수 있다. 특이적 결합 부재는 항원, 합텐, 압타머, 1차 또는 2차 항체, 바이오틴, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
막으로부터 떨어진 접합 패드 말단과 액상 소통하는 완충액 방출 구역이 존재한다. 시료가 접합체 및 검출 구역 사이의 장치상에 증착된 후, 완충액은 완충액 방출 구역내 상류로부터 방출된다. 완충액은 접합 패드로부터 검출 구역 쪽으로 프로브를 세정하여, 거기에서 검출 프로브가 검출 구역에서 존재할 수 있는 분석물에 의해 포획되고 양성 결과를 내게 된다. 시료가 분석물을 함유하지 않는다면, 검출선은 음성이 될 것이다. 여전히 일부의 프로브를 포함하는 (검출 프로브와 상이한 프로브를 포함할 수 있다) 완충액 혼합물은 계속해서 조절 구역으로 유입되는데, 여기에서 시약은 접합체, 접합체-분석물 복합체 또는 순수 프로브를 포획하여 분석이 제대로 기능하고 있는지를 표시한다.
흡상 패드는 막과 액상 소통하고 있고 액체 이동에 대한 구동력을 제공한다.
본 방법은 입자로부터의 상류인 종래의 위치보다는, 입자로부터 하류에 시료를 첨가하는 것을 포함한다. 시료 증착 후, 입자로부터 상류의 시험 스트립상의 지점에서 희석제는 방출된다. 이어서, 희석제는 입자를 재현탁시키기에 요구되는 유체를 제공하여 시험 스트립 아래로 흘러 내릴 수 있도록 한다. 입자와 접촉한 후, 희석제-입자 혼합물은 분석의 잔여물에 대한 시료 (예로서, 혈액)와의 접촉 지점으로 흘러 내려간다. 본 방법이 몇몇 경우에서는 선의 신호 강도를 증가시킨다고 밝혀졌다.
본 발명의 또다른 실시태양에 따라, 시험 시료내에 체류하는 분석물의 존재 또는 그의 양을 검출하기 위한 방법을 개시한다. 본 방법은
i) 접합 패드 및 흡상 패드와 액상 소통하는 다공성 막을 갖되, 접합 패드는 분석물에 대해 특이적으로 결합하는 부재와 접합되는 검출 프로브를 갖고, 다공성 막은 제1 포획 시약이 고정화되어 있는 검출 구역, 및 제2 포획 시약이 고정화되어 있는 조절 구역을 한정하며, 여기에서, 조절 구역은 검출 구역으로부터 하류에 위치하고, 접합 패드는 다공성 막의 상류에 위치하며, 완충액 방출 구역은 접합 패드의 상류에 존재하는, 측면 흐름 분석 장치를 제공하는 단계;
ii) 분석물을 함유하는 시험 시료를 접합 패드로부터 하류의 장치와 접촉시키고;
iii) 완충액 방출 구역에서 완충액을 방출시켜 완충액이 검출 프로브를 시료 적용 구역, 이어서, 검출 및 조절 구역으로 이송하도록 하는 단계; 및
iv) 검출 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 특징 및 측면을 하기에서 더욱 상세하게 논의한다.
도 1은 본 발명의 측면 흐름 분석 장치의 한 실시태양의 투시도이다.
상세한 설명
본 원에서 사용되는 바, 용어 "분석물"은 일반적으로 검출하고자 하는 물질을 언급한다. 예를 들면, 분석물은 항원성 물질, 합텐, 항체, 및 그의 조합물을 포함할 수 있다. 분석물은 제한하는 것은 아니지만, 독소, 유기 화합물, 단백질, 펩티드, 미생물, 아미노산, 핵산, 호르몬, 스테로이드, 비타민, 약물 (치료 목적으로 투여되는 것 뿐만 아니라 불법적인 목적으로 투여되는 것도 포함), 약물 중간체 또는 부산물, 박테리아, 바이러스 입자, 효모, 진균, 원생동물, 및 상기 물질들중 임의의 것의 대사물질, 또는 그에 대한 항체를 포함한다. 몇몇 분석물의 구체적인 일례로 페리틴; 크레아티닌 키나제 MB (CK-MB); 디곡신; 페니토인; 페노바르비톨; 카바마제핀; 반코마이신; 젠타마이신; 테오필린; 밸프로산; 키니딘; 황체형성 호르몬 (LH); 여포자극 호르몬 (FSH); 에스트라디올, 프로게스테론; C-반응성 단백질; 리포칼린; IgE 항체; 사이토카인; 비타민 B2 마이크로-글로불린; 당화 혈색소(glycated hemoglobin) (GIy. Hb); 코르티솔; 디기톡신; N-아세틸프로카인아미드(NAPA); 프로카인아미드; 루벨라에 대한 항체, 예로서, 루벨라-IgG 및 루벨라 IgM; 톡소플라스마증에 대한 항체, 예로서, 톡소플라스마증 IgG (Toxo-IgG) 및 톡소플라스마증 IgM (Toxo-IgM); 테스토스테론; 살리실레이트; 아세트아미노펜; B형 간염 바이러스 표면 항원 (HBsAg); B형 간염 핵 항원에 대한 항체, 예로서, 항-B형 간염 핵 항원 IgG 및 IgM (항-HBC); 인간 면역 결핍 바이러스 1 및 2 (HIV 1 및 2); 인간 T-세포 백혈병 바이러스 1 및 2 (HTLV); B형 간염 e 항원 (HBeAg); B형 간염 e 항원에 대한 항체 (항-HBe); 인플루엔자 바이러스; 갑상선 자극 호르몬 (TSH); 티록신 (T4); 토탈 트리요오드티로닌 (토탈 T3); 유리 트리요오드티로닌 (유리 T3); 암배아 항원 (CEA); 지질단백질, 콜레스테롤, 및 트리글리세리드; 및 알파 태아단백질 (AFP)을 포함한다. 남용 약물 및 규제 약물은 제한하고자 하는 것은 아니지만, 암페타민; 메탐페타민; 바르비튜레이트, 예로서, 아모바르비탈, 세코바르비탈, 펜토바르비탈, 페노바르비탈, 및 바르비탈; 벤조디아제핀, 예로서, 리브륨 및 발륨; 카나비노이드, 예로서, 해시시 및 마리화나; 코카인; 펜타닐; LSD; 메타콸론; 아편제, 예로서, 헤로인, 모르핀, 코데인, 하이드로모르폰, 하이드로코돈, 메타돈, 옥시코돈, 옥시모르폰 및 아편; 펜시클리딘; 및 프로폭시펜을 포함한다. 기타 잠재적 분석물은 미국특허 제 6,436,651호에 기재되어 있을 수 있다.
본 원에서 사용되는 바, 용어 "시험 시료"는 일반적으로 분석물을 함유할 것으로 추정되는 물질을 언급한다. 시험 시료는 예를 들면, 공급원으로부터 직접적으로 수득한 물질 뿐만 아니라, 제한하는 것은 아니지만, 여과, 침전, 희석, 증류, 혼합, 농축, 간섭 성분의 불활성화, 시약 첨가, 분해 등과 같은 기술을 사용하여 전처리된 물질을 포함할 수 있다. 시험 시료는 생물학적 공급원, 예로서, 혈액, 간질액, 타액, 안구 렌즈 체액, 뇌척수액, 땀, 소변, 모유, 복수액, 점액, 윤활액, 복막액, 질액, 양수 등을 비롯한 생리학적 체액으로부터 유래할 수 있다. 생리학적 체액외에도, 다른 액체 시료, 예로서, 물, 음식물 등이 사용될 수 있다. 추가로, 분석물을 함유할 것으로 추정되는 고체 물질 또한 시험 시료로서 사용될 수 있다.
일반적으로, 본 발명은 시험 시료내에 체류하는 분석물의 존재 또는 그의 양을 검출하기 위한 측면 흐름 분석 장치에 관한 것이다.
종래의 측면 흐름 방법에서는 시료가 입자의 재현탁을 도움으로써 시험이 진행될 수 있도록 하기 위하여 시료를 전형적으로 고정화된 접합체 입자의 위치로부터 상류에 적용시킨다. 그러나, 대조적으로 본 발명은 예를 들면, 혈액에 기초한 분석법에서와 같이 소량의 시료와 관련된 문제들을 감소시키거나 제거하기 위하여 시료를 적용시키는 신규한 방법 및/또는 위치를 개시한다. 시료의 용량이 더욱 한 정되어 있는 특정화된 적용의 경우에 있어서는 (예로서, 혈액에 기초한 적용 및 면봉에 기초한 적용), 희석제를 시료와 함께 혼합하여 사용함으로써 필요한 체액의 양을 감소시킬 수 있다. 이 경우, 희석제 그 자체가 고정화된 입자를 재현탁시킬 수 있다.
공지된 분석법에서는 시료중 표적된 분석물이 증착 지점으로부터 검출될 수 있는 지점까지 이동할 것을 요한다. 공지된 분석법은 접합체 입자를 함유하는 구역을 거쳐, 이어서 검출 구역까지 시료를 이동시킨다. 상기 공지된 분석법중 일부는 시료를 접합체 입자로 및 검출 구역상으로 이동시키기 위해 액상 희석제 또는 "완충액"을 사용한다.
공지된 분석법과 대조적으로, 본 장치는 시료가 접합체 입자로부터 하류에 증착되는 것을 허용한다. 희석제 (예로서, 완충액)는 이후 방출되고, 초기에 접합 패드상에 위치하는 입자를 입자와 검출 구역 사이에 위치하는 시료로 이동시킨다.
본 발명자는 상기 입자의 하류에 첨가되었던 시료로 검출 입자가 희석제와 함께 이동할 수 있도록 함으로써 극소량의 시료를 사용할 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 희석제는 검출 프로브를 매우 효율적으로 재현탁시켜 접합 패드 아래로 막을 따라 더욱 멀리 이동할 수 있도록 함으로써 시험 결과를 제공하는 역할을 한다. 종래의 측면 흐름 장치에서의 액상 시료는 접합체 입자를 재현탁시키기 위해서 사용되었기 때문에 본 방법은 반-직관적이다. 추가로, 면역분석 및 결합 발생을 위해서는 시료 및 입자가 접촉하는 것이 통상 바람직하다. 그러나, 놀랍게도, 시료가 입자로부터 하류에 적용되고, 이어서, 희석제중 재현탁된 접합체 입자에 의 해 "추적(chase)"되는 본 방법이 일부 경우에는 실제로 신호 강도를 증가시킬 수 있다고 밝혀졌다.
본 장치는 접합 패드, 시료 적용 구역 및 검출 구역을 갖는 다공성 막을 이용한다. 검출 구역에는 고정화된 포획 시약이 있다. 시료 적용 구역은 고정된 입자로부터 하류에 존재하는 접합 패드 물질상에 위치할 수 있거나, 막상에서 전방에 위치할 수 있거나 (검출 구역의 상류), 접합 패드와 검출 구역을 포함하는 막 사이에 위치하는 별개의 물질일 수 있다. 본 장치는 추가로 희석제 방출 구역과 시료 사이에 위치하는 접합 패드 및 시료 적용 구역 이전에 장치의 상류 말단상에 희석제 방출 구역을 사용한다. 흡상 패드는 장치의 하류 말단상의 다공성 막의 반대쪽 말단과 액상 소통하고 있다. 사용시, 시료는 시료 적용 구역에 적용되고, 일정 기간 후, 희석제는 방출된다. 희석제는 접합체 입자를 재현탁시키고 시료로 이송하고, 더욱더 멀리 검출 구역까지 하류로 이송하여 분석물의 존재에 대하여 표시한다.
본 발명을 사용하여 검출할 수 있는 적절한 분석물의 일례로, 제한하는 것은 아니지만, 독소, 유기 화합물, 단백질, 펩티드, 미생물, 아미노산, 핵산, 호르몬, 스테로이드, 비타민, 약물 (치료 목적으로 투여되는 것 뿐만 아니라 불법적인 목적으로 투여되는 것도 포함), 약물 중간체 또는 부산물, 박테리아, 바이러스 입자, 효모, 진균, 원생동물, 및 상기 물질들중 임의의 것의 대사물질, 또는 그에 대한 항체를 포함한다. 일부 분석물의 구체적인 일례로 페리틴; 크레아티닌 키나제 MB (CK-MB); 디곡신; 페니토인; 페노바르비톨; 카바마제핀; 반코마이신; 젠타마이신; 테오필린; 밸프로산; 키니딘; 황체형성 호르몬 (LH); 여포자극 호르몬 (FSH); 에스트라디올, 프로게스테론; C-반응성 단백질; 리포칼린; IgE 항체; 사이토카인; 비타민 B2 마이크로-글로불린; 당화 혈색소 (GIy. Hb); 코르티솔; 디기톡신; N-아세틸프로카인아미드(NAPA); 프로카인아미드; 루벨라에 대한 항체, 예로서, 루벨라-IgG 및 루벨라 IgM; 톡소플라스마증에 대한 항체, 예로서, 톡소플라스마증 IgG (Toxo-IgG) 및 톡소플라스마증 IgM (Toxo-IgM); 테스토스테론; 살리실레이트; 아세트아미노펜; B형 간염 바이러스 표면 항원 (HBsAg); B형 간염 핵 항원에 대한 항체, 예로서, 항-B형 간염 핵 항원 IgG 및 IgM (항-HBC); 인간 면역 결핍 바이러스 1 및 2 (HIV 1 및 2); 인간 T-세포 백혈병 바이러스 1 및 2 (HTLV); B형 간염 e 항원 (HBeAg); B형 간염 e 항원에 대한 항체 (항-HBe); 인플루엔자 바이러스; 갑상선 자극 호르몬 (TSH); 티록신 (T4); 토탈 트리요오드티로닌 (토탈 T3); 유리 트리요오드티로닌 (유리 T3); 암배아 항원 (CEA); 지질단백질, 콜레스테롤, 및 트리글리세리드; 및 알파 태아단백질 (AFP)을 포함한다. 남용 약물 및 규제 약물은 제한하고자 하는 것은 아니지만, 암페타민; 메탐페타민; 바르비튜레이트, 예로서, 아모바르비탈, 세코바르비탈, 펜토바르비탈, 페노바르비탈, 및 바르비탈; 벤조디아제핀, 예로서, 리브륨 및 발륨; 카나비노이드, 예로서, 해시시 및 마리화나; 코카인; 펜타닐; LSD; 메타콸론; 아편제, 예로서, 헤로인, 모르핀, 코데인, 하이드로모르폰, 하이드로코돈, 메타돈, 옥시코돈, 옥시모르폰 및 아편; 펜시클리딘; 및 프로폭시펜을 포함한다. 기타 잠재적 분석물은 미국특허 제 6,436,651호에 기재되어 있을 수 있다.
도 1을 참조하여, 형성될 수 있는 측면 흐름 분석 장치(20)의 한 실시태양을 더욱 상세하게 설명할 것이다. 장치가 동일한 효과를 갖도록 다른 방식으로도 배열될 수 있는 바, 용어 "측면 흐름"이란 설명적인 것이고 제한적이지는 않음에 주목해야 한다. 예를 들면, 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않으면서 본 발명과 동일한 원리를 이용하여, 방사상 또는 수직 흐름 장치를 용이하게 구상할 수 있다. 나타난 바와 같이, 장치(20)은 임의적으로 경질 물질(24)에 의해 지지되는 다공성 막(22)를 포함한다. 다공성 막(22)는 검출 구역 (또는 선)(30)을 갖는다. 다공성 막(22)는 또한 조절 구역 (또는 선)(32)를 가질 수 있다.
일반적으로, 다공성 막(22)는 검출 프로브가 통과할 수 있는 다양한 물질중 임의의 것로부터 제조될 수 있다. 예를 들면, 다공성 막(22)를 제조하기 위해 사용되는 물질은, 제한하는 것은 아니지만, 천연, 합성, 또는 합성적으로 변형되어진 자연적으로 발생된 물질, 예로서, 다당류 (예로서, 셀룰로오스 물질, 예로서, 종이 및 셀룰로오스 유도체, 예로서, 셀룰로오스 아세테이트 및 니트로셀룰로오스); 폴리에테르 설폰; 폴리에틸렌; 나일론; 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF); 폴리에스테르; 폴리프로필렌; 실리카; 무기 물질, 예로서, 비활성화된 알루미나, 규조토, MgSO4, 또는 중합체와 함께 다공성 중합체 매트릭스중에 균일하게 분산되어진 미분화된 다른 무기 물질, 예로서, 비닐 클로라이드, 비닐 클로라이드-프로필렌 공중합체, 및 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트 공중합체; 자연적으로 발생된 천 (예로서, 면) 및 합성 천 (예로서, 나일론 또는 레이온) 양자 모두; 다공성 겔, 예로서, 실리카 겔, 아가로스, 덱스트란, 및 젤라틴; 중합체 필름, 예로서, 폴리아크릴아미드 등을 포함한다. 하나의 특정 실시태양에서, 다공성 막(22)는 니트로셀룰로오스 및/또는 폴리에테르 설폰 물질로부터 형성된다. 용어 "니트로셀룰로오스"는 니트로셀룰로오스 단독일 수 있거나, 질산 및 다른 산, 예로서, 1개 내지 7개의 탄소 원자를 갖는 지방족 카복실산의 혼합 에스테르일 수 있는, 셀룰로오스의 질산 에스테르를 언급함을 이해하여야 한다. 적절한 막은 미국 매사추세츠주 빌레리카에 소재하는 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation)으로부터의 니트로셀룰로오스 막 HF075 및 HF120을 포함한다.
장치(20)은 흡상 패드(26)을 포함할 수 있다. 흡상 패드(26)은 일반적으로 다공성 막(22) 전체를 통과하여 이동한 유체를 수용한다. 본 분야에 잘 공지되어 있는 바와 같이, 흡상 패드(26)은 모세관 작용 및 막(22)를 통한 유체 흐름을 촉진시키는데 도움을 줄 수 있다.
장치(20)은 희석제 방출 구역(34)를 갖는다. 한 실시태양에서, 희석제 방출 구역(34)는 희석제(38)이 내부에 저장될 수 있는 희석제 저장소(36)을 갖는다. 희석제(38)은 다르게는 별도의 저장소에 의해 공급될 수 있다. 희석제(28)은 본 발명에 사용되는 검출 프로브를 이송해갈 임의의 액체일 수 있다. 적절한 희석제의 일례로 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS) 용액 (pH 7.2), 트리스-완충처리된 염수 (TBS) 용액 (pH 8.2) 또는 2-(N-모르폴리노) 에탄 설폰산 (MES) (pH 5.3)을 포함한다. 분석법의 수행능을 돕기 위한 다른 첨가제, 예로서, 계면활성제, 수용성 중합체, 단백질, 비특이성 결합을 막는 차단제, 및 방부제를 포함할 수 있다.
접합 패드(40)은 희석제 방출 구역(34)와 액상 소통하고 있고, 희석제 방출 구역(34)과 다공성 막(22) 사이에 위치하며, 희석제(38)은 희석제 방출 구역(34)로부터 이동함에 따라, 접합 패드(40)을 통과하고 접합체 입자를 다공성 막(22)상의 검출 구역(30) 및 조절 구역(32)로 이송할 것이다. 접합 패드(40)은 희석제가 통과할 수 있는 물질로부터 형성된다. 접합 패드(40)은 예를 들면, 유리 섬유로부터 형성될 수 있다. 오직 하나의 접합 패드(40)만이 제시되었지만, 다른 접합 패드들 또한 본 발명에 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
시험 시료내 분석물의 검출을 개시하기 위해, 사용자는 다공성 막(22)의 접합 패드(40)과 검출 구역(30) 부분 사이의 적용 구역(42)에 시험 시료를 직접 적용시키거나 접촉시키거나 증착시킬 수 있다. 일단 시료가 적용 구역(42)와 접촉하게 되면, 희석제(38)은 희석제 방출 구역(34)으로 방출된다. 희석제(38)은 통합 저장소에 의해, 또는 별개의 공급원, 예로서, 피펫 또는 본 분야에 기술자에 공지되어 있는 임의의 다른 효과적인 수단에 의해 적용될 수 있다. 희석제(38)은 다공성 막(22)와 액상 소통하는 접합 패드(40)을 통과하여 적용 구역(42), 검출 구역(30) 및 조절 구역(32)으로 이동하게 된다.
시험 시료내 분석물의 존재 또는 부재에 대한 정확한 검출을 촉진시키기 위하여 소정량의 적어도 한가지 타입의 접합체 입자를 접합 패드상에 적용시킨다. 일반적으로 시각적으로 또는 기계 장치에 의해 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 임의의 물질이 검출 프로브로서 사용될 수 있다. 다양한 적절한 물질은 색소원; 촉매; 발광성 화합물 (예로서, 형광, 인광성 등); 방사성 화합물; 콜로이드성 금속 성 (예로서, 금) 및 비금속성 입자, 염색된 입자, 효소 또는 기질, 또는 유기 중합체 라텍스 입자를 비롯한 시각적 표지; 리포좀 또는 신호 생성 물질을 함유하는 다른 소포체 등을 포함할 수 있다. 검출 프로브로서 사용하기에 적절한 일부 효소는 미국 특허번호 제 4,275,149호에 개시되어 있다. 효소/기질 시스템의 일례는 효소 알칼리성 인산분해효소 및 기질 니트로 블루 테트라졸륨-5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트, 또는 그의 유도체 또는 유사체, 또는 기질 4-메틸움벨리페릴-포스페이트이다. 다른 적절한 접합체 입자는 미국 특허번호 제 5,670,381호 및 제 5,252,459호에 개시되어 있을 수 있다. 일부 실시태양에서, 접합체 입자는 검출가능한 신호를 생성하는 형광 화합물을 함유할 수 있다. 형광 화합물은 형광 분자, 중합체, 덴드리머, 입자 등일 수 있다. 적절한 형광 분자의 일부 일례로서 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, 형광 물질, 유로퓸 킬레이트, 피코빌리단백질, 로다민 및 그의 유도체 및 유사체를 포함한다.
예로서, 상기 기술된 접합체 입자는 단독으로 사용될 수 있거나, 미세입자 (때때로 "비드" 또는 "마이크로비드"로서 언급됨)와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 자연적으로 발생된 미세입자, 예로서, 핵, 미코플라스마, 플라스미드, 플라스티드, 포유동물 세포 (예로서, 적혈구 허깨비(erythrocyte ghosts)), 단세포 미생물 (예로서, 박테리아), 다당류 (예로서, 아가로스) 등을 사용할 수 있다. 추가로, 합성 미세입자 또한 사용할 수 있다. 예를 들면, 한 실시태양에서, 형광 또는 착색 염료로 표지된 라텍스 미세입자를 사용한다. 임의의 라텍스 미세입자가 본 발명에서 사용될 수 있지만, 라텍스 미세입자는 전형적으로 폴리스티렌, 부타디엔 스티렌, 스티렌아크릴-비닐 삼량체, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸메타크릴레이트, 스티렌-무수 말레산 공중합체, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐피리딘, 폴리디비닐벤젠, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 아크릴로니트릴, 비닐클로라이드-아크릴레이트 등, 또는 알데히드, 카복실, 아미노, 하이드록실, 또는 그의 하이드라지드 유도체로부터 형성된다. 다른 적절한 미세입자는 미국 특허번호 제 5,670,381호 및 제 5,252,459호에 기재되어 있을 수 있다. 상업적으로 이용할 수 있는 적절한 형광 입자의 일례로는 몰레큘라 프로브스 인코포레이티드(Molecular Probe, Inc.)에서 "플루오스피어(FluoSphere)"(레드 580/605) 및 "트랜스플루오스피어(TransfluoSphere)"(543/620)란 상표명 하에 판매하는 형광 카르복실화 미세입자를 비롯하여, 역시 몰레큘라 프로브스 인코포레이티드에서 판매하는 "텍사스 레드(Texas Red)" 및 5- 및 6-카르복시테트라메틸로다민이 포함된다. 또한, 적당한 착색된 라텍스 미세입자의 상업적으로 입수가능한 예에는 뱅스 라보라토리, 인코포레이티드(Bang's Laboratory, Inc.)에서 판매하는 카르복실화 라텍스 비드가 포함된다.
사용시, 입자의 모양은 일반적으로 다양할 수 있다. 하나의 특정 실시태양에서, 예를 들면, 입자의 모양은 구형이다. 그러나, 판, 로드, 원반, 막대, 관, 불규칙한 모양 등과 같은 다른 모양 또한 본 발명에서 구상될 수 있다는 점을 이해해야 한다. 추가로, 입자의 크기 또한 다양할 수 있다. 예를 들면, 입자의 평균 크기 (예로서, 직경)는 약 0.1 나노미터 내지 약 1,000 마이크론, 일부 실시태양에서는 약 1 나노미터 내지 약 100 마이크론, 일부 실시태양에서는 약 10 나노미터 내지 약 10 마이크론 범위일 수 있다. 예를 들면, "마이크론-규모" 입자가 종종 바람직하다. 사용시, 상기 "마이크론-규모" 입자의 평균 크기는 약 1 마이크론 내지 약 1,000 마이크론, 일부 실시태양에서는 약 1 마이크론 내지 약 100 마이크론, 및 일부 실시태양에서는 약 1 마이크론 내지 약 10 마이크론일 수 있다. 유사하게, "나노-규모" 입자 또한 사용될 수 있다. 상기 "나노-규모" 입자의 평균 크기는 약 0.1 내지 약 80 나노미터, 일부 실시태양에서는 0.1 내지 약 5 나노미터, 및 일부 실시태양에서는 약 1 내지 약 20 나노미터일 수 있다.
일부의 경우에 있어서, 입자가 분석물에 더욱 용이하게 결합할 수 있도록 하기 위하여 입자를 일부 방식으로 개질시키는 것이 바람직하다. 상기 경우, 입자는 그에 부착되어 접합된 입자를 형성하는 특정의 특이적 결합 부재로 개질될 수 있다. 특이적 결합 부재는 일반적으로 특이 결합쌍, 즉, 분자들중 하나가 화학적으로 및/또는 물리적으로 제 2의 분자에 결합하는 2개의 상이한 분자의 구성원을 언급한다. 예를 들면, 면역반응성 특이적 결합 부재는 항원, 합텐, 압타머, 항체 (1차 또는 2차), 및 재조합 DNA 방법 또는 펩티드 합성에 의해 형성된 것을 비롯한 그의 복합체를 포함할 수 있다. 항체는 단클론성 또는 다클론성 항체, 재조합 단백질 또는 그의 혼합물(들) 또는 단편(들) 뿐만 아니라, 항체 및 다른 특이적 결합 부재의 혼합물을 포함할 수 있다. 이와 같은 항체의 제조의 세부사항 및 이들을 특이적 결합 부재로서 사용하는 것에 대한 적합성은 당업자에게 잘 알려져 있다. 다른 통상의 특이 결합쌍은 제한하는 것은 아니지만, 바이오틴 및 아비딘 (또는 그의 유도체), 바이오틴 및 스트렙타비딘, 탄수화물 및 렉틴, 상보성 뉴클레오티드 서열 (표적 핵산 서열을 검출하기 위하여 DNA 혼성화 분석법에서 사용되는 포획 핵산 서열 및 프로브 포함), 재조합 방법에 의해 형성된 것을 비롯한 상보성 펩티드 서열, 효과기 및 수용체 분자, 호르몬 및 호르몬 결합 단백질, 효소 보조 인자 및 효소, 효소 저해제 및 효소 등을 포함한다. 추가로, 특이 결합쌍은 원래의 특이적 결합 부재의 유사체인 부재를 포함할 수 있다. 예를 들면, 분석물의 유도체 또는 단편, 즉, 분석물-유사체는 분석물과 하나 이상의 에피토프를 공통으로 갖고 있는 한, 사용될 수 있다.
특이적 결합 부재는 일반적으로 잘 공지되어 있는 임의의 다양한 기술을 사용하여 입자에 부착될 수 있다. 예를 들면, 특이적 결합 부재의 검출 프로브(예컨대, 입자)에 대한 공유 부착은 카르복실, 아미노, 알데히드, 브로모아세틸, 요오도아세틸, 티올, 에폭시 및 기타 반응성 또는 연결 작용기를 비롯하여, 단백질 커플링 반응을 달성시킬 수 있는 잔류 자유 라디칼 및 라디칼 양이온을 사용하여 이루어질 수 있다. 입자 표면은 상대적으로 높은 표면 농도로 극성 기를 포함할 수 있기 때문에 표면 작용기는 또한 작용화된 공단량체로서 혼입될 수 있다. 추가로, 접합체 입자는 대개 합성된 후 작용화되지만, 폴리(티오페놀)의 경우와 같이 특별한 경우에 미세입자는 추가로 개질될 필요없이도 단백질과 직접 공유 결합할 수 있다.
도 1을 다시 참조하면, 분석 장치(20)은 분석물 또는 접합체 입자-분석물 복합체에 결합할 수 있는 제1 포획 시약이 내부에 고정되어 있는 검출 구역(30)을 포함한다. 분석물의 결합은 분석물이 존재한다는 검출가능한 표시로 제시되고 상기 표시는 눈으로 볼 수 있거나, 하기 논의되는 다른 수단, 예로서, 다양한 검출기 또는 판독기 (예로서, 형광 판독기)를 통해 볼 수 있다. 판독기는 또한 검출 구역에서 신호의 강도에 기초하여, 검출 부위에서의 분석물의 상대적인 양을 결정하도록 고안될 수 있다.
일부 실시태양에서, 제1 포획 시약은 생물학적 포획 시약일 수 있다. 상기 생물학적 포획 시약은 본 분야에 잘 공지되어 있고 제한하는 것은 아니지만, 항원, 합텐, 단백질 A 또는 G, 뉴트라비딘, 아비딘, 스트렙타비딘, 캡타비딘, 1차 또는 2차 항체 (예로서, 다클론성, 단클론성 등), 및 그의 복합체를 포함할 수 있다. 대개의 경우, 상기의 생물학적 포획 시약은 접합체 입자상에 존재하는 특이적 결합 부재 (예로서, 항체)에 결합할 수 있는 것이 바람직하다.
포획 시약을 위해서 다양한 비-생물학적 물질을 사용하는 것 또한 바람직할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시태양에서, 시약은 고분자 전해질을 포함할 수 있다. 고분자 전해질은 알짜 양전하 또는 음전하, 또는 일반적으로 중성인 알짜 전하를 가질 수 있다. 알짜 양전하를 갖는 고분자 전해질의 몇몇 적절한 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 폴리리신 (미주리주 세인트루이스에 소재하는 시그마-알드리치 케미칼 코포레이션 인코포레이티드(Sigma-Aldrich Chemical Co. Inc.)로부터 상업적으로 이용가능), 폴리에틸렌이민; 에피클로로히드린-작용화된 폴리아민 및/또는 폴리아미도아민, 예로서, 폴리(디메틸아민-코-에피클로로히드린); 폴리디알릴디메틸-암모늄 클로라이드; 양이온 셀룰로오스 유도체, 예로서, 셀룰로오스 공중합체 또는 4급 암모늄 수용성 단량체와 융합된 셀룰로오스 유도체 등을 포함한다. 하나의 특정 실시태양에서, 4급 암모늄 수용성 단량체를 포함하는 셀룰로오스 유도체인 셀콰트(CelQuat)® SC-230M 또는 H-100 (내셔날 스타치 & 케미칼 인코포레이티드(National Starch & Chemical, Inc.)로부터 이용가능)을 사용할 수 있다. 알짜 음전하를 갖는 고분자 전해질의 몇몇 적절한 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 폴리아크릴감, 예로서, 폴리(에틸렌-코-메타크릴산, 나트륨 염) 등을 포함한다. 다른 고분자 전해질 또한 사용될 수 있다는 것 또한 이해되어야 한다. 이들중 일부, 예로서, 양쪽성 고분자 전해질 (즉, 극성 및 비극성 부위를 갖는 것)은 일반적으로 중성인 알짜 전하를 가질 수 있다. 예를 들면, 적절한 양쪽성 고분자 전해질의 몇몇 적절한 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 폴리(스티릴-b-N-메틸 2-비닐 피리디늄 요오다이드) 및 폴리(스티릴-b-아크릴산) (상기 양자 모두는 캐나다 도발에 소재하는 폴리머 소스 인코포레이티드(Polymer Source Inc.)로부터 이용가능함)을 포함한다
제1 포획 시약은 분석물과 접합체 입자 사이에서 형성된 복합체에 대한 고정적 결합 부위로서 역할을 한다. 특히, 분석물, 예로서, 항체, 항원 등은 전형적으로 2개 이상의 결합 부위 (예로서, 에피토프)를 갖는다. 검출 구역(30)에 도달할 때, 상기 결합 부위들중 하나는 프로브의 특이적 결합 부재에 의해 점유된다. 그러나, 분석물의 자유 결합 부위는 고정화된 포획 시약에 결합할 수 있다. 고정화된 포획 시약에 결합할 때, 복합체화된 프로브는 새로운 3원의 샌드위치 복합체를 형성한다.
검출 구역(30)은 일반적으로, 사용자가 시험 시료내 특정 분석물의 농도를 더욱 잘 측정할 수 있도록 하기 위하여 임의 갯수의 별개의 검출 구역을 제공할 수 있다. 각 구역은 동일한 포획 시약을 포함할 수 있거나, 다중 분석물을 포획하기 위한 상이한 포획 시약들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 검출 구역(30)은 2개 이상의 별개의 검출 구역 (예로서, 선, 점 등)을 포함할 수 있다. 검출 구역은 분석 장치(20)을 통한 시험 시료의 흐름에 실질적으로 수직인 방향으로 선의 형태로 배치될 수 있다. 유사하게, 일부 실시태양에서, 검출 구역은 분석 장치를 통한 시험 시료의 흐름에 실질적으로 평행인 방향으로 선의 형태로 배치될 수 있다.
종래의 측면 흐름 샌드위치 장치에서, 복합체화되지 않은 분석물은 검출 구역에 위치하는 포획 시약에 대하여 복합체화된 분석물과 경쟁함으로써, 분석물 존재에 대한 표시를 감소시킬 것이다. 신호 강도 대 시간에 대한 그래프 설명에서, 상기의 감소는 후크 모양과 유사한 바, 이러한 현상은 "후크 효과(hook effect)"로서 공지되어 있다. 시험 시료를 접합체 입자로부터의 하류에 증착시키면 접합체 입자와 접촉하기 전에 일부 분석물이 포획 시약과 복합체를 형성한다. 이를 통해 일반적으로 시약의 모든 또는 실질적으로 모든 포획 부위가 분석물에 의해 점유되게 된다. 이어서, 접합체 입자가 검출 구역에 도달할 때 신규한 3원 샌드위치 복합체를 형성한다. 분석물이 사실상 모든 포획 시약과 결합하고 (단, 분석물이 충분히 존재할 경우) 과량의 검출 프로브는 사실상 모든 포획 시약 부위가 복합체화된 분석물을 포함하도록 보장하기 때문에 상기의 순서가 이전 분석법에서 발견되는 "후크 효과"를 제거시키는데 도움을 준다.
도 1을 다시 참조하면, 다공성 막(22)는 또한 검출 구역(30)으로부터 하류에 위치하는 조절 구역(32)를 포함할 수 있다. 다중 구역이 본 발명에 의해 확실하게 구상되고 있지만, 조절 구역(32)는 일반적으로 단일의 별개 구역 (예로서, 선, 점 등)을 제공한다. 예를 들면, 도시된 실시태양에서, 단일 선이 사용된다. 조절 구역(32)는 장치(20)을 통한 완충액 및 검출 프로브의 흐름에 실질적으로 수직인 방향으로 배치될 수 있다. 유사하게, 일부 실시태양에서, 구역(32)는 장치(20)을 통하는 흐름에 실질적으로 평행인 방향으로 배치될 수 있다.
그의 배열과 상관없이, 제2 포획 시약은 다공성 막(22)상의 조절 구역(32)내 에 고정화될 수 있다. 제2 포획 시약은 검출 구역(30)에서 제1 포획 시약에 결합하지 못한 임의의 접합체 입자 및/또는 분석물/접합된 입자 복합체에 대한 고정적 결합 부위로서 역할을 한다. 제2 포획 시약은 복합체화된 접합체 입자 및 복합체화되지 않은 접합체 입자 양자 모두에 결합하는 것이 바람직하기 때문에, 제2 포획 시약은 정상적으로 제1 포획 시약과는 상이하다. 한 실시태양에서, 제2 포획 시약은 제1 포획 시약과 상이한 생물학적 포획 시약 (예로서, 항원, 합텐, 단백질 A 또는 G, 뉴트라비딘, 아비딘, 스트렙타비딘, 1차 또는 2차 항체 (예로서, 다클론성, 단클론성 등), 및 그의 복합체)이다. 예를 들면, 제1 포획 시약은 단클론성 항체 (예로서, CRP Mab1 )일 수 있는 반면, 제2 포획 시약은 아비딘 (고도로 양이온성인 66,000-달톤 당단백질), 스트렙타비딘 (비당화 52,800-달톤 단백질), 뉴트라비딘 (당제거 아비딘 유도체), 및/또는 캡타비딘 (질산화 아비딘 유도체)일 수 있다. 상기 실시태양에서, 비오틴화되거나 제1 포획 시약의 단클론성 항체와는 상이한 단클론성 항체 (예를 들면, CRP Mab2)와 접합된 검출 프로브 상에 함유된 비오틴과 제2 포획 시약은 결합할 수 있다.
추가로, 조절 구역(32)의 제2 포획 시약을 위해 다양한 비-생물학적 물질을 사용하는 것 또한 바람직할 수 있다. 다수의 경우에 있어서, 상기의 비-생물학적 포획 시약은 남아있는 접합된 검출 프로브 및/또는 분석물/접합된 프로브 모두가 복합체화하도록 더욱 잘 보장하기 위해 특히 바람직할 수 있다. 일례는 고분자 전해질 물질이다. 형광 검출을 사용하여 검출 및 조절 구역내 분석물의 존재를 검출할 수 있고, 일반적으로 여기 광자로부터 방사 광자를 단리하기 위한 파장 여과, 및 방사 광자를 등록하고, 보통 전기 신호 또는 사진 영상으로서 기록가능하게 출력하는 검출기를 사용한다. 상기 타입의 검출기의 예로서, 분광 형광계 및 마이크로플레이트 판독기; 형광 현미경; 형광 스캐너; 및 유식세포 측정기를 포함한다. 본 발명에 사용하기 적절한 형광 검출기는 뉴저지주 에디슨에 소재하는 SPEX 인더스트리즈 인코포레이티드(SPEX Industries, Inc.)에 의해 시판되고 있는 플루오로로그 III 스펙트로플루오로미터(FluoroLog III Spectrofluorometer)이다.
바람직한 경우, "시분해(time-resolved) 형광 검출"로서 공지되어 있는 기술 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 시분해 형광 검출은 예로서, 유로퓸 (Eu (III)) 및 테르븀 (Tb (III))의 란탄족 킬레이트와 같은 특정 형광 물질의 형광 특징을 이용함으로써, 방사원으로부터 또는 산란 공정 (여기 방사의 산란으로부터 형성)으로부터 배경 신호를 감소시키기 위하여 고안된 것이다. 상기 킬레이트는 실질적으로 더 짧은 파장에서의 킬레이트의 여기 후에 강하게 적색 이동된, 좁은 밴드의 긴 수명 방사를 나타낼 수 있다. 전형적으로, 킬레이트는 분자내 란탄족 원소에 근접하 게 위치한 발색단으로 인한 강한 자외선 흡수 밴드를 보유한다. 발색단에 의한 빛 흡수에 이어서, 여기 에너지는 여기된 발색단으로부터 란탄족 원소로 전달될 수 있다. 이어서, 란탄족 원소의 형광 방사 특징으로 이어진다. 펄스형 여기 및 시간-게이트 검출을 좁은 밴드의 방사 필터와 조합하여 사용하면, 란탄족 킬레이트만으로부터의 형광이 특이적으로 검출되어, 전형적으로 단수명이거나 더욱 짧은 파장 방사를 하는, 시료에 존재하는 다른 화학종들로부터의 방사를 거부한다.
본 고안을 하기 실험 설비를 사용하여 시험하였다:
염소 항-마우스 항체 ("GAM")를 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS) (pH 7.2)중에서 0.1mg/ml로 희석시키고, 1ul/cm의 분사율(dispense rate) 및 5cm/s의 층 속도(bed speed)로 키네마틱(Kinematic) 1600 도포기를 사용하여 밀리포어 니트로셀룰로오스 HF120 막상에 스트리핑하였다. 스시팩(Scipac) C-반응성 단백질 (CRP) (영국 켄트에 소재하는 시팅보우메(Sittingboume))을 물에 희석시켜 최종 농도는 2.6mg/ml가 되도록 하고, 1ul/cm의 분사율로 GAM 시험선(test line) 아래쪽에 스트리핑하였다. 카드는 건조시키기 위하여 37℃에서 1시간동안 방치하였다.
VF2 (뉴저지주 클리프턴에 소재하는 왓트맨 코포레이션(Whatman Corp.)으로부터 입수) 및 GF33 (유리 섬유) 접합 패드 물질 (매사추세츠주 빌레리카에 소재하는 밀리포어 코포레이션)을 수동식(hand operated) 길로틴(guillotine) 절단기를 사용하여 34mm의 밴드에 의해 30mm로 절단하였다. 접합체에 대한 단클론성 항체는 Mab1 (카달로그 번호 10-C07, 미국 매사추세츠주 01742-3049 콩코드에 소재하는 피 츠제럴드 인더스트리즈 인터내셔날 인코포레이티드(Fitzgerald Industries International, Inc.))이었다. 상기 CRP 항체를 직경 20nm의 금 입자에 접합시켰다. 생성된 접합체를 염소 항-래빗 (GAR) 접합체 금 입자 (직경 40nm)와 1:1로 혼합하였다. 항-CRP 스톡 접합체의 광학 밀도 (OD)는 32이고, 따라서, 1:1의 비로 GAR과 혼합되었을 때에는 OD가 16으로 저하되었다. 2mM 보락스(Borax) (pH 7.2) 및 50% 수크로스 (최종 10%의 수크로스)중에서 상기를 추가로 희석시켜 최종 OD가 10이 되도록 하였다. 보락스는 유효한 몇몇 완충액 종류중 하나이고, 수크로스 또는 다른 친수성 물질들은 그들의 고도한 수용성에 기인하여 건성 입자의 재현탁을 돕는다.
밴드의 가장자리로부터 10mm 떨어진 곳 및 대조군 밴드의 반대쪽 가장자리로부터 3mm 떨어진 곳에서 키네마틱 1600 도포기를 사용하여 5ul/cm, 5cm/s로 접합체를 VF2 밴드상에 분무하였다. 20% 미만의 상대습도 및 실온하에서 밤새도록 상기를 방치시켜 건조시켰다. 접합 밴드 및 흡상 물질 (왓트맨으로부터의 CF6)을 폭 20mm의 밴드로 절단하고 스트리핑된 HF120 막상에 적층시켰다. 이어서, 적층된 밴드는 키네마틱 2360을 사용하여 폭 4mm의 스트립(strip)으로 절단하여 딥스틱(dipstick)을 제조하였다.
EDTA로 처리된 전혈 또는 보정된 혈청 (워싱턴주 시애틀에 소재하는 가마야 스탠다즈(Kamaya standards))을 본 실험에서 사용하였다. 스시팩 CRP을 전혈에 혼합시켜(spike) 최종 농도가 2.5, 10, 20, 40, 80 및 160ug/ml가 되도록 하였다. 가마야 스탠다즈 혈청을 GF33 실험에 사용하였다. 대조군 시험 스트립을 위해서는 양성 치환 피펫을 사용하여 VF2 패드의 바닥으로부터 대략 13mm되는 선에 용량 1ul의 전혈을 첨가한 반면, 본 분석법을 위해서는 분무된 접합 밴드 바로 뒤 (밴드 말단으로부터 ~13mm)에 1ul의 혈액을 첨가하였다. 이어서, 2% 트윈(TWEEN)® 20 계면활성제 (시그마-알드리치 케미칼 코포레이션으로부터)와 함께 PBS를 흡상 스트팁 반대쪽 말단에 있는 완충액 저장소에 가하고 하우징 뚜껑을 적절히 죄었다(clamp). 눈으로 결과를 판독하기 앞서, 시험 스트립이 30분동안 전개되도록 방치하였다.
본 분석법은 시험선에서 더욱 강력한 신호를 나타내었다. 예를 들면, "저해/월류 분석법"의 이러한 상기의 특별한 경우, 그의 강도는 분석물 (본 경우에는 CRP)의 수준이 증가함에 따라 증가하기 때문에 신호선으로서 작용하는 GAM 선은 본 방법을 사용할 때 더욱 강력한 신호를 가졌다.
상기와 같은 시험 스트립의 베이스로부터 13mm 떨어진 곳에 혈액 시료를 적용시키는 것외에, 혈액 시료에 대한 다른 위치에서도 평가하였다. 시험 스트립의 베이스로부터 측정한 바, 그의 범위는 5mm 내지 29mm였다. 상기의 모든 위치가 시험 신호 (예로서, 선 강도 또는 질)의 결과에 영향을 줄 수 있다. 특히, 시료 (예로서, 혈액)를 베이스에 더욱 가깝게 적용시킬수록 배경은 더욱 뚜렷하였고, 이로써 시험선에서의 신호가 개선된다는 것이 밝혀졌다. 상기의 신호 개선은 더욱 강력하고 더욱 짙은 선의 형태이거나; 선의 질이 더욱 우수한 형태이거나; 다른 부위의 시험 스트립의 배경 신호가 더욱 낮은 형태인 것이었다.
본 발명을 그의 구체적인 실시태양과 관련하여 상세하게 설명하였으나, 본 분야의 기술자는 상기 언급한 것을 이해할 때, 상기 실시태양의 변경, 변형, 및 균 등물도 용이하게 이해할 수 있을 것으로 인지될 것이다. 다라서, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위의 것 및 그의 임의의 균등물로서 평가되어야 한다.

Claims (20)

  1. 시험 시료 내에 체류하는 분석물의 존재 또는 그의 양을 검출하기 위한 측면 흐름 분석 장치로서,
    상기 측면 흐름 분석 장치는 다공성 막을 포함하며,
    상기 다공성 막은 접합 패드(conjugate pad) 및 흡상 패드(wicking pad)와 소통하고,
    상기 다공성 막은
    제1 포획 시약이 내부에 고정화되어 있는 검출 구역;
    상기 검출 구역으로부터 상류에 위치한 접합 패드;
    상기 접합 패드의 상류에 위치하고, 장치에 완충액 첨가를 제공하는 완충액 방출 구역; 및
    상기 접합 패드와 상기 검출 구역 사이에 증착되는 시료
    를 정하는 것이며,
    상기 제1 포획 시약은 분석물 및 분석물-접합체 복합체의 적어도 일부와 결합하여 강도를 갖는 검출 신호를 생성하도록 하는 것이며,
    상기 접합 패드는 분석물에 대한 특이적 결합 부재와 함께 검출 입자를 갖는 것이며,
    상기 완충액은 상기 검출 프로브를 상기 검출 구역으로 이동시키는 역할을 하는 것인,
    측면 흐름 분석 장치.
  2. 제1항에 있어서, 접합된 검출 입자가 색소원, 촉매, 발광성 화합물, 방사성 화합물, 시각적 표지, 리포좀, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것인 측면 흐름 분석 장치.
  3. 제1항에 있어서, 접합된 검출 입자가 발광성 화합물을 포함하는 것인 측면 흐름 분석 장치.
  4. 제1항에 있어서, 접합된 검출 입자가 시각적 표지를 포함하는 것인 측면 흐름 분석 장치.
  5. 제1항에 있어서, 특이적 결합 부재가 항원, 합텐(hapten), 압타머(aptamer), 1차 또는 2차 항체, 바이오틴(biotin), 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 측면 흐름 분석 장치.
  6. 제1항에 있어서, 제1 포획 시약이 항원, 합텐, 단백질 A 또는 G, 뉴트라비딘, 아비딘, 스트렙타비딘, 캡타비딘, 1차 또는 2차 항체, 및 그의 복합체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 측면 흐름 분석 장치.
  7. 제1항에 있어서, 제2 포획 시약이 항원, 합텐, 단백질 A 또는 G, 뉴트라비딘, 아비딘, 스트렙타비딘, 캡타비딘, 1차 또는 2차 항체, 및 그의 복합체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 측면 흐름 분석 장치.
  8. 제1항에 있어서, 분석물이 살모넬라(Salmonella) 종, 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitides) 군, 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 아스퍼질루아(aspergillua), 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza), HIV, 트리코모나스(Trichomonas) 및 플라스모디움(Plasmodium)으로 구성된 군으로부터 선택되는 큰 병원체인 측면 흐름 분석 장치.
  9. 제1항에 있어서, 분석물이 독소, 유기 화합물, 단백질, 펩티드, 미생물, 아미노산, 핵산, 호르몬, 스테로이드, 비타민, 약물, 약물 중간체 또는 부산물, 박테리아, 바이러스 입자, 및 상기 물질의 대사물질 또는 상기 물질에 대한 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 측면 흐름 분석 장치.
  10. 제1항에 있어서, 다공성 막, 접합 패드 및 흡상 패드가 단일 물질로부터 제조되는 것인 측면 흐름 분석 장치.
  11. i) 접합 패드 및 흡상 패드와 액상 소통하는 다공성 막을 포함하는 측면 흐 름 분석 장치를 제공하는 단계;
    ii) 분석물을 함유하는 시험 시료를 접합 패드와 검출 구역 사이에 접촉시키는 단계;
    iii) 완충액 방출 구역에서 완충액을 방출시켜 완충액이 상기 검출 입자를 상기 검출 및 조절 구역으로 이송하도록 하는 단계; 및
    iv) 검출 신호를 검출하는 단계
    를 포함하며,
    상기 접합 패드는 분석물에 대한 특이적 결합 부재와 접합되는 검출 입자를 가지며, 상기 다공성 막은 제1 포획 시약이 고정화되어 있는 검출 구역, 및 제2 포획 시약이 고정화되어 있는 조절 구역을 정하며, 상기 조절 구역은 상기 검출 구역으로부터 하류에 위치하고, 상기 접합 패드는 상기 다공성 막의 상류에 위치하며, 상기 완충액 방출 구역은 상기 접합 패드의 상류에 존재하는 것인,
    시험 시료 내에 체류하는 분석물의 존재 또는 그의 양을 검출하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 접합된 검출 입자가 색소원, 촉매, 발광성 화합물, 방사성 화합물, 시각적 표지, 리포좀, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 접합된 검출 입자가 시각적 표지를 포함하는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 특이적 결합 부재가 항원, 합텐, 압타머, 1차 또는 2차 항체, 바이오틴, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 제1 포획 시약이 항원, 합텐, 단백질 A 또는 G, 뉴트라비딘, 아비딘, 스트렙타비딘, 캡타비딘, 1차 또는 2차 항체, 및 그의 복합체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제11항에 있어서, 제2 포획 시약이 항원, 합텐, 단백질 A 또는 G, 뉴트라비딘, 아비딘, 스트렙타비딘, 캡타비딘, 1차 또는 2차 항체, 및 그의 복합체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  17. 제11항에 있어서, 제2 포획 시약이 고분자 전해질을 포함하는 것인 방법.
  18. 제11항에 있어서, 분석물이 살모넬라 종, 네이세리아 메닌기티디스 군, 스트렙토코커스 뉴모니에, 칸디다 알비칸스, 칸디다 트로피칼리스, 아스퍼질루아, 헤모필러스 인플루엔자, HIV, 트리코모나스 및 플라스모디움으로 구성된 군으로부터 선택되는 큰 병원체인 것인 방법.
  19. 제11항에 있어서, 분석물이 독소, 유기 화합물, 단백질, 펩티드, 미생물, 아미노산, 핵산, 호르몬, 스테로이드, 비타민, 약물, 약물 중간체 또는 부산물, 박테 리아, 바이러스 입자, 및 상기 물질의 대사물질 또는 상기 물질에 대한 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 초기에는 접합 패드상에 위치한 검출 입자가 포획 시약을 갖는 검출 구역에 위치한 병원체로 이동되는, 시험 시료내에 체류하는 분석물의 존재를 검출하기 위한 측면 흐름 분석 장치.
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