CN113710365B - 用于在免疫测定中重复使用半抗原涂覆的探针的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫测定方法，所述方法在维持可接受的临床测定性能的同时重复使用半抗原固定化测试探针和试剂在任何地方约3到20次对不同样品中的分析物进行定量。所述方法在每个循环中使用包括针对所述分析物的抗半抗原抗体和捕获抗体的双抗体缀合物溶液。每个反应循环完成之后，将所述测试探针浸渍在pH为约1‑4的酸性溶液中，以洗脱形成在所述探针上的免疫复合物并且使所述半抗原固定化探针再生。半抗原涂覆的固相的稳健性允许利用多种变性试剂以在每个循环之后在不损害半抗原在所述固相上的结合活性的情况下高效洗脱所述免疫复合物。

Description

用于在免疫测定中重复使用半抗原涂覆的探针的方法
技术领域
本发明涉及一种免疫测定方法，所述方法重复使用经半抗原固定化测试探针以对不同样品中的分析物定量约3到10次。所述方法在每个循环中使用双抗体缀合物溶液，并且通过在每个反应循环完成之后将测试探针浸渍在pH为约1-4的酸性溶液中来再生半抗原涂覆的测试探针。
背景技术
成本控制是全球医疗保健提供者的主要目标。体外诊断(IVD)也不例外，其中生物标志物在诊断和预后中的临床效用已成为患者管理的标准。免疫测定技术在IVD行业中占很大部分并且正在稳定增长，在美国约为3％/年并且在发展中国家为15-20％/年。在一些情况下，如在诊断心肌梗塞时连续测量心脏标志物，成本可能会限制适当的测试量。
用于降低免疫测定的成本的典型方法需要最小化材料的制造费用、劳动力以及设施开销。
用于再循环免疫试剂的任何方法通常集中于将免疫复合物与如酸性/碱性pH溶液、有机溶剂、离液剂等变性剂解离。所述变性步骤在抗体不再与抗原结合的情况下会改变抗体电荷、水合、氢键合和三级结构。将抗体反向暴露于接近生理pH和离子强度的初始结合条件预期可恢复原始结合活性，然而，很少的抗体可以耐受反复暴露于变性条件而不会不利地影响其结合性质以及因此测定性能的某个方面。
需要在维持临床性能的同时降低免疫测定的成本。
附图说明
图1A和1B描绘了具有经荧光素(F)涂覆的探针、作为捕获抗体(AB)的抗F/抗PCT、作为信号AB的Cy5-抗PCT和pH 2洗脱的缀合物的降钙素原(PCT)测定配置。再循环方案中的初始步骤是“预读”，所述预读测量玻璃探针的固有荧光和从前一个循环保留在探针尖端上的任何残留荧光。在测定结束时从最终读取步骤中减去此信号，以得到免疫特异性荧光信号。pH 2洗脱步骤从探针表面剥离免疫复合物，包含捕获AB。每个循环都具有捕获AB的新鲜涂层，这在维持贯穿多个循环的测定性能方面至关重要。1mm直径的探针具有如此小的表面积，使得捕获AB或信号AB的任何结合消耗仅可忽略量的那些试剂，因此允许其在多个循环中重复使用。经荧光素涂覆的探针可以耐受直到pH 2洗脱并且返回到中性pH的多个循环，从而实现其重复使用。
图2示出了遵循方案A，v1利用图1B中描述的荧光素探针格式进行的PCT测定的数据。
图3示出了经荧光素涂覆的探针格式(图1B)中利用方案A，v1的PCT标准品的数据。
图4示出了再循环测定的与商业IVD仪器(Biomerieux Vidas)具有相关性(R2＝0.95)的PCT临床血清样品的结果。
图5呈现了对另一种免疫测定的心肌肌钙蛋白I(TnI)应用再循环测定(方案A，v2)的结果。格式如图1B，不同之处在于捕获AB是与抗TnI连接的抗F，并且信号AB是Cy5-抗TnI。
图6展示了替代性再循环测定。格式与图1B相同，不同之处在于信号AB是用不同的荧光染料Alexa Fluor 647标记的。
图7含有使用Alexa Fluor 647标记的信号AB(方案A，v3)进行的至多10个循环的不同PCT样品的数据。
图8示出了使用不同半抗原/抗半抗原格式的再循环测定。格式与图1B类似，不同之处在于探针涂覆有洋地黄毒苷，并且捕获AB是抗洋地黄毒苷-抗PCT缀合物。
图9呈现了使用洋地黄毒苷格式(方案A，v4)进行的至多10个循环的PCT水平。结果与图3中的荧光素探针形式非常相似。
图10示出了利用另外的扩增试剂的再循环格式。在此实例中，信号抗体是用生物素标记的，并且存在Cy5-抗生物素-试剂。/>(蔗糖和表氯醇的共聚物)的分子量为数百万道尔顿，并且其用于承载多种染料标记的抗生物素抗体。扩增试剂将与探针表面上含有生物素的免疫复合物结合，并且会产生比信号AB的直接染料标记更强的信号。
图11示出了利用方案B，v1使用pH 2洗脱用图10中的再循环格式执行的PCT测定。
图12展示了替代性扩增试剂。再循环格式与图10类似，不同之处在于扩增试剂是Cy5-链霉亲和素-链霉亲和素的分子大小比抗体小，因此更多的链霉亲和素分子可以与/>聚合物连接以生成与抗生物素连接的/>相比更多的荧光信号。基于链霉亲和素的扩增试剂的另外的优势在于其对生物素具有极高的结合亲和力。
图13示出了使用图12、方案B，v2的利用pH 2洗脱的链霉亲和素扩增试剂的PCT结果。
图14示出了类似于图12的再循环格式，不同之处在于在pH 2步骤之后，将探针进一步暴露于DMSO(100％)以供第二次洗脱。
图15含有如图14中的使用方案C利用双pH 2和DMSO洗脱进行的3个PCT水平的再循环测定的结果。
图16A和16B示出了两次读取方案，其中荧光信号被读取两次。荧光信号在pH 2酸洗脱之前读取为读取1(Read 1)，并且然后在pH 2酸洗脱后再次读取为读取2(Read 2)。从读取1中减去读取2信号，并且针对校准曲线对减去后的值进行定量。图16B的格式与图14的格式相似，不同之处在于荧光信号读取两次。图16A的测定格式与图16B的测定格式相似，不同之处在于第一结合步骤。在图16A中，在预读之后，将样品与双抗体(抗F-抗PCT)和生物素化的抗PCT混合。其余的结合步骤和图16A中的两个读取步骤与图16B中的步骤相同。
图17示出了通过两次读取/减法方案(图16B，方案D)进行的3个PCT水平(0、10和100ng/mL)的再循环测定的结果。
图18示出了通过两次读取再循环方案(图16B，方案D)进行的15个PCT临床血清样品的结果。
图19示出了15个PCT临床血清样品的结果与两次读取再循环方案(图16B，方案D)对商业IVD仪器(Biomerieux Vidas)具有高相关性(R2＝0.98)。
图20示出了使用方案D-1利用(i)低pH加上变性剂氯化胍(6M胍HCl，pH 1.6)洗脱和(ii)变性剂DMSO洗脱的3个PCT水平的再循环测定的结果。
图21示出了利用图16A的测定格式和方案E的PCT标准品的数据。
图22示出了利用(i)低pH加上变性剂氯化胍(6M胍HCl，pH 1.6)洗脱和(ii)变性剂DMSO洗脱的血清淀粉样蛋白A(SAA)的测定格式。
图23示出了利用双低pH加上变性剂氯化胍洗脱和变性剂DMSO洗脱利用图22的测定格式和方案F进行的三个SAA水平的再循环测定的结果。
图24展示了用于检测探针尖端上的荧光的光学配置。
具体实施方式
定义
权利要求书和说明书中使用的术语应根据本领域技术人员理解的通常含义来解释，除了并且如下文所阐述的定义。
如本文所用，“约”是指在所述值的±10％内。
如本文所用，“分析物结合”分子是指能够参与与分析物分子的特异性结合反应的任何分子。实例包含但不限于，(i)抗原分子，以用于检测针对所述抗原具有特异性的抗体的存在；(ii)抗体分子，以用于检测抗原的存在；(iii)蛋白质分子，以用于检测其蛋白质的结合伴侣的存在；(iv)配体，以用于检测结合伴侣的存在；或(v)单链核酸分子，以检测核酸结合分子的存在。
形状的“纵横比”是指其较长尺寸与较短尺寸的比率。
“结合分子”是指能够结合所关注的另一种分子的分子。
如本文所用，“结合对”是指彼此吸引并彼此特异性结合的两个分子。结合对的实例包含但不限于抗原和针对所述抗原的抗体、配体和其受体、核酸的互补链、生物素和亲和素、生物素和链霉亲和素、凝集素和碳水化合物。优选的结合对是生物素和链霉亲和素、生物素和亲和素、荧光素和抗荧光素、洋地黄毒苷/抗洋地黄毒苷。生物素和亲和素，包含生物素衍生物和如链霉亲和素等亲和素衍生物，可以用作采用复杂结合序列的测定方案中的中间结合物质。例如，可以用生物素标记抗体(“生物素化”)并且使用所述抗体以与先前固定在固相表面上的目标物质结合。然后可以使用根据本发明的采用亲和素或链霉亲和素的荧光组合物来引入荧光标记物。
“双特异性抗体”是可以与两种不同类型的抗原同时结合的人工蛋白质。
如本文所用，“固定化”是指将试剂固定到固体表面上。当试剂固定在固体表面上时，其被非共价结合或共价结合到表面上。
如本文所用，“单块衬底”是指单一块固体材料，如具有一个折射率的玻璃、石英或塑料。
如本文所用，“探针”是指在传感面涂有分析物结合分子的薄膜层的衬底。探针具有远侧端和近侧端。近侧端(也指本申请中的探针尖端)具有涂覆有分析物结合分子的薄层的感测表面。
本发明公开了一种用于在维持可接受的临床测定性能的同时重复使用免疫测定测试探针和试剂约3次到10次的方法。免疫测定测试探针和试剂可以容纳在一个测试条带或一个盒中。本发明重复使用测试探针和试剂，并且在每测试的基础上节省了成本。
实施本发明有几个关键要素。本发明的第一特征是固相捕获试剂涂覆有半抗原。半抗原，通常被定义为小于约1500道尔顿的小有机分子，是抗原性的但免疫原性非常差。因此，半抗原必须与更大的聚合物，典型地蛋白质连接，以生成抗半抗原抗体。半抗原的抗体结合基于其一级化学结构，并且其抗体结合中不存在构象依赖性。因此，即使在使抗半抗原抗体和免疫复合物变性的重复步骤之后，半抗原抗原仍将保留其抗体结合性质。本发明使用经半抗原固定化测试探针和抗半抗原抗体以与半抗原涂覆的固相结合；免疫复合物随后与变性试剂解离。随后将半抗原涂覆的固相重新浸没在具有抗半抗原抗体的试剂中使结合在固相上的抗半抗原抗体的原始量恢复。可以使半抗原涂覆的固相经受多次变性循环，然后经受抗半抗原抗体结合。半抗原涂覆的固相的稳健性允许利用多种变性试剂来高效地洗脱免疫复合物。
本发明的合适的半抗原包含例如小有机分子，如硝基酪氨酸、二硝基苯酚、三硝基苯酚、硝基苯酚和氨基苯甲酸；染料，如Alexa Fluor、花青染料、TRITC、荧黄(LuciferYellow)、德克萨斯红(Texas Red)和氟硼吡咯(Bodipy)；多肽，如Myc、Flag和多组氨酸；药物，如茶碱、苯妥英、苯巴比妥、丙戊酸、盘尼西林和庆大霉素；类固醇，如黄体酮、睾酮和雌二醇；以及维生素，如生物素和维生素D。优选的半抗原是荧光素、生物素和洋地黄毒苷。
本发明的第二特征是所述测定使用双抗体缀合物，其中所述抗半抗原抗体与和样品中的特定分析物结合的捕获抗体化学地且共价地缀合。捕获抗体取决于待测量的分析物而变化；这允许将测定格式应用于许多不同的免疫测定。本发明的固相再生和再循环，而在每个循环中将新鲜的双抗体缀合物试剂捕获在探针上，由此维持测定性能。
本发明的第三特征是探针尖端表面的尺寸小(直径≤5mm)，使得信号试剂和扩增试剂的消耗可忽略不计，并且在测定循环期间不需要补充那些试剂。
荧光检测系统
本发明使用如美国专利第8,492,139中所述的用于测量探针尖端上的荧光信号的荧光检测系统，所述美国专利通过引用并入本文。所述系统包括：(a)探针，所述探针的长度与宽度的纵横比为至少5比1，所述探针具有第一端和第二端，所述第二端具有与荧光标记物结合的感测表面；(b)光源，所述光源用于将激发光直接发射到探针的感测表面；(c)聚光透镜，所述聚光透镜指向所述感测表面；以及(d)光学检测器，所述光学检测器用于检测发射荧光光；其中所述聚光透镜收集所述发射荧光光并且将所述发射荧光光引导到所述光学检测器。
所述探针可以为单块衬底或光纤。所述探针可以呈任何形状，如条形、圆柱形、圆形、正方形、三角形等，其中长度与宽度的纵横比为至少5比1，优选10比1。因为在免疫测定期间探针被浸渍在样品溶液和一种或多种试剂溶液中，所以期望具有纵横比为至少5比1的长探针以使探针尖端能够浸没到溶液中。可以在将长探针转移到不同反应室的情况下执行异质测定。避免了在测定期间分配和抽吸试剂和样品。探针的感测表面涂覆有分析物结合分子并且与荧光标记物结合。
可以对荧光标记物发射适当的激发光的任何光源都适用于本发明。优选的光源是可以发射波长适合于荧光标记物的光的激光器。例如，对于Cy5荧光染料，激光器中心波长优选为649nm。用于检测发射光的合适的光学检测器是光电倍增器管(PMT)、电荷耦接的装置(CCD)或光电二极管。
光源和包含聚光透镜的光学检测器安装在探针尖端表面(感测表面)的同一侧上。如果感测表面面朝下，则其均安装在尖端表面下方。如果感测表面面朝上，则其均安装在尖端表面上方。其比探针的另一端更靠近感测表面。感测表面始终在聚光透镜的数值孔径内。探针可以但其不必与聚光透镜居中对齐。
图24展示了荧光检测系统的实施例。
I.通过再循环方案检测分析物
本发明涉及一种对不同的样品使用同一半抗原涂覆的测试探针、扩增试剂和同样的信号试剂通过荧光免疫测定检测多个液体样品中的分析物的方法。
所述方法包括以下步骤：(a)将探针浸渍在pH为6.0-8.5的水性溶液中以预读探针尖端的荧光信号，其中所述探针包括固定在探针的尖端上的半抗原，并且所述尖端表面的直径≤5mm；(b)在探针尖端上形成包括来自样品的所述分析物、捕获抗体和信号抗体的免疫复合物，其中所述捕获抗体和所述信号抗体是针对所述分析物的两种不同抗体，所述捕获抗体与针对所述半抗原的抗半抗原抗体共价连接，并且所述信号抗体与荧光标记物缀合；(c)将所述探针尖端浸渍到含有洗涤溶液的洗涤容器中；(d)通过测量所述探针尖端处的免疫复合物的荧光信号、减去(a)的预读的荧光信号并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量来确定样品中的分析物浓度；(e)将所述探针尖端浸渍在pH为约1.0-4.0的酸性溶液中以从所述探针尖端洗脱所述免疫复合物；以及(f)重复步骤(a)-(e)，但在步骤(b)中使用来自新样品的所述分析物，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。
在步骤(e)中，在将所述探针尖端浸渍在pH为约1.0-4.0的酸性溶液中之后，任选地将所述探针进一步浸渍在用于进一步洗脱所述免疫复合物的变性剂或离液剂中，如二甲基亚砜(DMSO)、正丁醇、乙醇、胍盐酸盐(氯化胍)、高氯酸锂、醋酸锂、氯化镁、苯酚、2-丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲和尿素。DMSO是优选离液剂。
在一个实施例中，步骤(b)的免疫复合物通过以下形成：(b1)将样品溶液与双抗体溶液和试剂溶液混合以形成混合物，其中所述样品溶液包括分析物，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗半抗原抗体，并且所述试剂溶液包括与荧光标记物缀合的信号抗体；并且(b2)将所述探针尖端浸渍在所述混合物中，以在所述探针尖端上形成所述免疫复合物。所述探针可以在一起添加组分时，立即浸渍到所述混合物中。可替代地，所述探针可以在将所述混合物温育一段时间，例如30秒到15分钟之后，浸渍到所述混合物中。此实施例展示在图1A中。
在一个实施例中，步骤(b)的所述免疫复合物通过以下形成：(b1)将所述探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗半抗原抗体；(b2)将所述探针尖端浸渍在包括所述样品的样品溶液中；(b3)将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的所述信号抗体的试剂溶液中，以在所述探针尖端上形成所述免疫复合物。此实施例展示在图1B中。
展示的实施例1
在另一个实施例中，检测分析物的方法包括以下步骤：(a)获得探针，所述探针具有固定在探针的所述尖端上的半抗原，其中尖端表面的直径≤5mm；(b)将所述探针浸渍在pH为6.0-8.5的水性溶液中以预读探针尖端的荧光信号；(c)将探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括与捕获抗体共价连接的抗半抗原抗体，其中所述捕获抗体是针对所述分析物的第一抗体；(d)将所述探针尖端浸渍在样品溶液中，所述样品溶液包括具有分析物的液体样品；(e)将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的信号抗体的试剂溶液中，以在探针尖端上形成包括分析物、捕获抗体和信号抗体的免疫复合物，其中所述信号抗体是针对分析物的第二抗体；(f)将所述探针尖端浸渍在含有洗涤溶液的洗涤容器中；(g)通过测量所述探针尖端处的免疫复合物的荧光信号、减去(b)的预读的荧光信号并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量来确定样品中的分析物浓度；(h)将所述探针尖端浸渍在pH为约1.0-4.0的酸性溶液中以从所述探针尖端洗脱所述免疫复合物；以及(i)重复步骤(b)-(h)，但在步骤(d)中使用包括新样品的新样品溶液，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。此实施例展示在图1B、6和8中。
所述方法在所有反应循环中使用同一探针和同样的洗涤溶液。优选地，所述方法在所有反应循环中使用同样的试剂溶液。然而，也可以在不同循环中使用新鲜的试剂溶液。
在本方法的步骤(a)中，获得具有用于结合分析物的小尖端的探针。尖端具有较小的表面积，其直径≤5mm，优选≤2mm或≤1mm。探针尖端的小表面赋予其几个优点。在固相免疫测定中，具有小表面积是有利的，因为其具有较少的非特异性结合并因此产生较低的背景信号。进一步地，由于尖端的小表面积，在探针尖端上携带的试剂或样品非常小。此特征使得探针尖端易于洗涤，并且其因为洗涤溶液的体积更大而导致对洗涤溶液的污染可忽略不计。探针尖端的小表面积的另一方面为其具有小的结合能力。因此，当探针尖端浸没在试剂溶液中时，试剂的结合不会消耗大量的试剂。试剂浓度实际上没有变化。洗涤溶液的污染可忽略不计并且试剂的消耗少使得试剂和洗涤溶液能够多次重复使用，例如3-10次或3-20次。
用于将半抗原固定化到固相(探针尖端的感测表面)的方法在免疫化学中很常见，并且涉及在固相与半抗原之间形成共价、疏水或静电键。例如，可以通过吸附到固体表面上或通过与涂覆在固体表面上的氨丙基硅烷共价结合来将半抗原与载体蛋白缀合，并且将半抗原蛋白固定化。
在步骤(b)中，由读取容器(或读取室或读取孔)中的荧光检测系统预读探针尖端的荧光信号。读取容器容纳水性溶液，如水或pH介于6.0到8.5的缓冲液。优选地，水性溶液含有1-10mM或1-100mM磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或适合于pH介于6.0-8.5之间用于在低pH再生后中和探针的其它缓冲液。
在第一样品结合之前需要预读以建立第一循环反应的任何潜在背景荧光的基线。在探针尖端再生之后和下一样品结合之前，还需要预读以建立用于后续循环的基线。在每个循环之后，预读的信号优选是相同的。如果预读的信号高于或低于前一循环的预读的信号，则在每个循环中的免疫测定之后从测得的荧光信号中减去预读的荧光信号，并且然后针对校准曲线对减去后的信号进行定量仍将提供对分析物的正确定量。
在所述方法的步骤(c)中，将探针尖端浸渍到含有双抗体溶液的双抗体容器中。所述双抗体溶液含有与捕获抗体共价连接的抗半抗原抗体，其中所述捕获抗体是针对分析物的第一抗体。可替代地，所述双抗体溶液含有同时与半抗原和分析物结合的双特异性抗体。
在一个实施例中，所述抗半抗原抗体和所述捕获抗体在没有接头的情况下彼此直接连接。
在一个优选实施例中，所述抗半抗原抗体和所述捕获抗体均与聚合物共价连接，所述聚合物充当接头或间隔子。所述聚合物的分子量通常为1,000道尔顿到500,000道尔顿。所述聚合物可以是多糖(例如，葡聚糖、直链淀粉)、树状物或聚乙二醇。在一个优选实施例中，所述聚合物是(蔗糖和表氯醇的共聚物)。
在所述方法的步骤(d)中，将所述探针尖端浸渍到样品容器(或样品室或样品孔)中，并温育5秒到5分钟、10秒到2分钟或30秒到1分钟，以将分析物与探针尖端上的第一抗体结合。
在步骤(d)之后，将所述探针在含有洗涤溶液的洗涤容器(或洗涤室或洗涤孔)中任选地洗涤1-5次，优选地1-3次。此额外的洗涤步骤可能不需要，因为遗留的溶液的量由于小的结合表面积而最小。洗涤溶液通常含有缓冲液和如Tween 20等表面活性剂。
在所述方法的步骤(e)中，将所述探针尖端浸渍到试剂容器(或试剂室或试剂孔)中持续5秒到5分钟、10秒到2分钟或30秒到1分钟，以将试剂与探针尖端上的分析物结合。所述试剂溶液包括荧光标记的第二抗体(信号抗体)。在此方法中可以使用任何合适的荧光标记物。荧光标记物的实例是如以下所述的芳基磺酸花青荧光染料：Mujumdar等人,(1993)《生物缀合物化学(Bioconjugate Chemistry)》4:105-111；Southwick等人(1990)《细胞术(Cytometry)》,11:418-430；以及美国专利第5,268,486号。Cy5是优选的芳基磺酸盐花青荧光染料，因为其消光系数高并且量子产率良好；其还具有范围在大多数生物材料和塑料的自体荧光波长之外(500nm到750nm)的荧光发射光谱。另外，Cy5在水中的溶解性良好，并且非特异性结合特性低。
荧光标记物可以使用如科学和专利文献中描述的常规缀合化学，通过多个部分，包含二硫键、羟基苯基、氨基、羧基、吲哚或其它官能团与信号抗体共价结合。用于将芳基磺酸盐花青荧光染料标记物与抗体和其它蛋白质结合的示例性技术描述于美国专利第5,268,486号、第5,650,334号中；所述美国专利的内容通过引用并入本文。用于将优选Cy5荧光标记物与抗体连接的技术描述于标识为目录号A25000的，由宾夕法尼亚州匹兹堡的生物检测系统公司(Biological Detection Systems,Inc.,Pittsburgh,Pa)出版的技术公报中。
在步骤(f)之后，将所述探针在含有洗涤溶液的洗涤容器中洗涤1-5次，优选地1-3次。洗涤溶液通常含有缓冲液和如Tween 20等表面活性剂。
在步骤(g)中，探针停留在洗涤容器中或移动到测量容器中，并且由如上所述的荧光检测系统检测结合的免疫复合物的荧光信号，其中光源和检测器安装在探针的感测表面的同一侧(近侧)。测量容器可以是单独的孔或者可以是同一预读容器。
可替代地，本发明的方法可以通过其它合适的荧光检测系统进行检测。
通过测量所述探针尖端处的免疫复合物的荧光信号、减去(b)的预读的荧光信号并且然后针对校准曲线(标准曲线)进行定量来确定样品中的分析物浓度。
校准曲线通常是根据的本领域技术人员众所周知的方法测定样品之前预先建立。在一个优选实施例中，同一样品的荧光信号(在减去预读的信号)在每个循环维持恒定，并且校准曲线对于每个循环是相同的。
在另一个实施例中，同一样品的荧光信号(在减去预读的信号)在每个循环会增加或减少，并且需要针对每个循环建立循环特异性校准曲线。在荧光信号变化的这些情况下，针对循环特异性校准曲线对样品进行定量，并且尽管不同循环的荧光信号增加或减少，但定量的结果仍一致。
在步骤(h)中，通过采用变性条件来再生探针，所述变性条件将与固相上的捕获抗体结合的免疫复合物解离。通常，pH约1到约4的酸或酸性缓冲液有效再生本发明的抗体探针。举例来说，可以使用盐酸、硫酸、硝酸、乙酸来再生探针。首先用酸性条件对探针处理，并且然后由中性水性溶液，如pH介于6.0-8.5之间的缓冲液使其中和。在一个实施例中，在预读之前在步骤(b)的读取容器中使经低pH处理的探针方便地中和。可替代地，可以在具有pH为6.0-8.5的缓冲液的单独容器中使经低pH处理的探针中和。再生过程可以为单一酸性处理，然后中和。举例来说，单一pH 1-3，或pH 1.5-2.5(例如，pH 2)暴露范围为10秒到2分钟是有效的。再生过程也可以为“脉冲”再生步骤，其中探针暴露于短pH处理(例如，10-20秒)的2-5个循环(例如3个循环)，然后在pH 6.5-8.0下中和(例如10-20秒)。
在探针再生之后，在随后的循环中在不同的样品的情况下用同一探针和同样的试剂将步骤(b)-(h)重复1-10次、1-20次、1-25次、3-20次、5-10次、5-20次、5-25次或5-30次。在每个循环中，再生的探针都有捕获在探针上的新鲜双抗体。
在一个实施例中，通过在容器中搅拌或混合溶液来加速反应。例如，可以在一个或多个反应容器，包含样品容器、试剂容器、洗涤容器和再生容器中诱导溶液跨探针尖端流动，如侧向流动或定轨流动，以加速结合反应、解离。例如，反应容器可以安装在定轨振荡器上，并且所述定轨振荡器以至少50rpm，优选地至少200rpm或至少500rpm，如50-200或500-1,500rpm的速度旋转。另外，探针尖端可以以0.01到10mm/秒的速度上下并垂直于定轨流的平面移动，以诱导溶液另外在探针尖端上方和下方混合。
展示的实施例2
在用于检测分析物的第二实施例中，所述方法类似于第一实施例的方法，不同之处在于步骤(b)和(c)的顺序相反。第二实施例的方法包括以下步骤：(a)获得探针，所述探针具有固定在探针的所述尖端上的半抗原，其中尖端表面的直径≤5mm；(b)将探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括双抗体，所述双抗体包括与捕获抗体共价连接的抗半抗原抗体，其中所述捕获抗体是针对所述分析物的第一抗体；
(c)将所述探针浸渍在pH为6.0-8.5的水性溶液中以预读所述探针尖端的荧光信号；(d)将所述探针尖端浸渍在样品溶液中，所述样品溶液包括具有分析物的液体样品；(e)将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的信号抗体的试剂溶液中，以在探针尖端上形成包括分析物、捕获抗体和信号抗体的免疫复合物，其中所述信号抗体是针对分析物的第二抗体；(f)将所述探针尖端浸渍在洗涤溶液中；(g)通过测量所述探针尖端处的免疫复合物的荧光信号、减去(c)的预读的荧光信号并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量来确定样品中的分析物浓度；(h)将所述探针尖端浸渍在pH为约1.0-4.0的酸性溶液中以从所述探针尖端洗脱所述免疫复合物；以及(i)重复步骤(b)-(h)，但在步骤(d)中使用含有新样品的新样品溶液，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。
每个步骤的细节与上面在第一实施例中描述的那些相似。
在第二实施例中，双抗体缀合物任选地包括在激发波长和发射波长方面与信号荧光标记物不同的第二荧光标记物。步骤(b)的预读确定了第二荧光标记物的信号，所述信号示出在与多个样品反应之后，再循环的探针是否仍提供双抗体缀合物与经半抗原固定化探针尖端的可接受结合。如果多次样品反应之后探针被干扰材料掩蔽，则步骤(b)中的对第二荧光信号的预读将示出第二荧光标记物的信号显著降低，并且应利用新鲜探针重复测定。
II.利用第二半抗原和抗第二半抗原抗体或链霉亲和素进行的扩增
下面描述的方法通过用第二半抗原和抗第二半抗原抗体或链霉亲和素扩增荧光信号向再循环方案I添加扩增步骤。第二半抗原不同于固定在探针尖端上的半抗原。每个步骤的细节与以上再循环方案I中描述的对应步骤的那些相同或相似。
所述方法包括以下步骤：(a)将探针浸渍在pH为6.0-8.5的水性溶液中以预读所述探针尖端的荧光信号，其中所述探针包括固定在探针的尖端上的第一半抗原，并且所述尖端表面的直径≤5mm；(b)在所述探针尖端上形成包括来自样品的所述分析物、捕获抗体和信号抗体的第一免疫复合物，其中所述捕获抗体和所述信号抗体是针对所述分析物的两种不同抗体，所述捕获抗体与针对所述第一半抗原的抗第一半抗原抗体共价连接，并且所述信号抗体与第二半抗原缀合，所述第一半抗原和所述第二半抗原不同；(c)将所述探针尖端浸渍在洗涤溶液中；(d)将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的(i)抗第二半抗原抗体或(ii)链霉亲和素的扩增溶液中，以在探针尖端上形成包括分析物、捕获抗体、信号抗体、第二半抗原和抗第二半抗原抗体或链霉亲和素的第二免疫复合物；(e)通过测量所述探针尖端处的第二免疫复合物的荧光信号、减去(a)的预读的荧光信号并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量来确定样品中的分析物浓度；(f)将所述探针尖端浸渍在pH为约1.0-4.0的酸性溶液中以从所述探针尖端洗脱所述免疫复合物；以及(g)重复相同步骤(a)-(f)，但在步骤(b)中使用来自新样品的所述分析物，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。
在一个实施例中，步骤(b)的第一免疫复合物通过以下形成：(b1)将样品溶液与双抗体溶液和试剂溶液混合以形成混合物，其中所述样品溶液包括分析物，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗第一半抗原抗体，并且所述试剂溶液包括与所述第二半抗原缀合的信号抗体；以及(b2)将所述探针尖端浸渍在所述混合物中，以在所述探针尖端上形成第一免疫复合物。
在另一个实施例中，步骤(b)的第一免疫复合物通过以下形成：(b1)将所述探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗第一半抗原抗体；(b2)将所述探针尖端浸渍在包括所述样品的样品溶液中；以及(b3)将所述探针尖端浸渍在包括与所述第二半抗原缀合的信号抗体的试剂溶液中，以在所述探针尖端上形成所述第一免疫复合物。
IIA.利用第二半抗原和抗第二半抗原抗体进行的扩增
在此方案中，用第二半抗原和抗第二半抗原抗体对荧光信号进行扩增。
所述方法包括以下步骤：(a)将探针浸渍在pH为6.0-8.5的水性溶液中以预读所述探针尖端的荧光信号，其中所述探针包括固定在探针的尖端上的第一半抗原，并且所述尖端表面的直径≤5mm；(b)在所述探针尖端上形成包括来自样品的所述分析物、捕获抗体和信号抗体的第一免疫复合物，其中所述捕获抗体和所述信号抗体是针对所述分析物的两种不同抗体，所述捕获抗体与针对所述第一半抗原的抗第一半抗原抗体共价连接，并且所述信号抗体与第二半抗原缀合，所述第一半抗原和所述第二半抗原不同；(c)将所述探针尖端浸渍在洗涤溶液中；(d)将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的抗第二半抗原抗体的扩增溶液中以在探针尖端上形成包括所述分析物、所述捕获抗体、所述信号抗体、所述第二半抗原和所述抗第二半抗原抗体的第二免疫复合物；(e)通过测量所述探针尖端处的第二免疫复合物的荧光信号、减去(a)的预读的荧光信号并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量来确定样品中的分析物浓度；(f)将所述探针尖端浸渍在pH为约1.0-4.0的酸性溶液中以从所述探针尖端洗脱所述免疫复合物；以及(g)重复相同步骤(a)-(f)，但在步骤(b)中使用来自新样品的所述分析物，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。
在步骤(f)中，将探针尖端浸渍在pH为约1.0-4.0的酸性溶液中，任选地，所述酸性溶液可以包括变性剂或离液剂。任选地，可以将探针进一步浸渍在变性剂或离液剂中。变性剂或离液剂例如包含用于进一步洗脱免疫复合物的二甲基亚砜(DMSO)、正丁醇、乙醇、胍盐酸盐、高氯酸锂、醋酸锂、氯化镁、苯酚、2-丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲和尿素。DMSO和胍盐酸盐是优选的变性剂或离液剂。
在一个实施例中，步骤(b)的第一免疫复合物通过以下形成：(b1)将样品溶液与双抗体溶液和试剂溶液混合以形成混合物，其中所述样品溶液包括分析物，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗第一半抗原抗体，并且所述试剂溶液包括与所述第二半抗原缀合的信号抗体；以及(b2)将所述探针尖端浸渍在所述混合物中，以在所述探针尖端上形成第一免疫复合物。
在另一个实施例中，步骤(b)的第一免疫复合物通过以下形成：(b1)将所述探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗第一半抗原抗体；(b2)将所述探针尖端浸渍在包括所述样品的样品溶液中；以及(b3)将所述探针尖端浸渍在包括与所述第二半抗原缀合的信号抗体的试剂溶液中，以在所述探针尖端上形成所述第一免疫复合物。
展示的实施例1
例如，所述方法包括以下步骤：(a)获得探针，所述探针具有固定在探针的所述尖端上的第一半抗原，其中尖端表面的直径≤5mm；(b)将所述探针浸渍在pH为6.0-8.5的水性溶液中以预读探针尖端的荧光信号；(c)将探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括与捕获抗体共价连接的抗第一半抗原抗体，其中所述捕获抗体是针对所述分析物的第一抗体；(d)将所述探针尖端浸渍在样品溶液中，所述样品溶液包括具有分析物的液体样品；(e)将所述探针尖端浸渍在包括与第二半抗原缀合的信号抗体的试剂溶液中，以在所述探针尖端上形成包括所述分析物、所述捕获抗体和所述信号抗体的第一免疫复合物，其中所述信号抗体是针对所述分析物的第二抗体，并且所述第一半抗原和所述第二半抗原不同；(f)将所述探针尖端浸渍在洗涤溶液中；(g)将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的抗第二半抗原抗体的扩增溶液中以在探针尖端上形成包括所述分析物、所述捕获抗体、所述信号抗体、所述第二半抗原和所述抗第二半抗原抗体的第二免疫复合物；(h)通过测量所述探针尖端处的第二免疫复合物的荧光信号、减去(b)的预读的荧光信号并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量来确定样品中的分析物浓度；(i)将所述探针尖端浸渍在pH为约1.0-4.0的酸性溶液中以从所述探针尖端洗脱所述免疫复合物；以及(j)重复相同步骤(b)-(i)，但在步骤(d)中使用含有新样品的新样品溶液，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。此实施例展示在图10中，其中生物素是第二半抗原。
展示的实施例2
在此实施例中，所述方法包括以下步骤：(a)获得探针，所述探针具有固定在探针的所述尖端上的第一半抗原，其中尖端表面的直径≤5mm；(b)将探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括双抗体，所述双抗体包括与捕获抗体共价连接的抗半抗原抗体，其中所述捕获抗体是针对所述分析物的第一抗体；(c)将所述探针浸渍在pH为6.0-8.5的水性溶液中以预读所述探针尖端的荧光信号；(d)将所述探针尖端浸渍在样品溶液中，所述样品溶液包括具有分析物的液体样品；(e)将所述探针尖端浸渍在包括与第二半抗原缀合的信号抗体的试剂溶液中，以在所述探针尖端上形成包括所述分析物、所述捕获抗体和所述信号抗体的第一免疫复合物，其中所述信号抗体是针对所述分析物的第二抗体，并且所述第一半抗原和所述第二半抗原不同；(f)将所述探针尖端浸渍在洗涤溶液中；(g)将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的抗第二半抗原抗体的扩增溶液中以在探针尖端上形成包括所述分析物、所述捕获抗体、所述信号抗体、所述第二半抗原和所述抗第二半抗原抗体的第二免疫复合物；(h)通过测量所述探针尖端处的第二免疫复合物的荧光信号、减去(c)的预读的荧光信号并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量来确定样品中的分析物浓度；(i)将所述探针尖端浸渍在pH为约1.0-4.0的酸性溶液中以从所述探针尖端洗脱所述免疫复合物；以及(j)重复相同步骤(b)-(i)，但在步骤(d)中使用含有新样品的新样品溶液，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。
在两种扩增方法中，可以将抗第二半抗原抗体和荧光标记物缀合物与进一步缀合以增加抗第二半抗原抗体和荧光标记物的负载。
IIB.利用生物素和链霉亲和素进行的扩增
下面描述的方法通过用生物素和链霉亲和素扩增荧光信号向再循环方案I添加扩增步骤。在这些方法中，探针尖端上的半抗原是非生物素半抗原。使用链霉亲和素扩增试剂需要更严格的洗脱条件，并且在酸性洗脱之后，使用二甲基亚砜(DMSO)作为第二洗脱剂。
所述方法包括以下步骤：(a)将探针浸渍在pH为6.0-8.5的水性溶液中以预读探针尖端的荧光信号，其中所述探针包括固定在探针的尖端上的非生物素半抗原，并且所述尖端表面的直径≤5mm；(b)在所述探针尖端上形成包括来自样品的所述分析物、捕获抗体和信号抗体的第一免疫复合物，其中所述捕获抗体和所述信号抗体是针对所述分析物的两种不同抗体，所述捕获抗体与抗半抗原抗体共价连接，并且所述信号抗体与生物素缀合；(c)将所述探针尖端浸渍在洗涤溶液中；(d)将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的链霉亲和素的扩增溶液中以在探针尖端上形成包括所述分析物、所述捕获抗体、所述信号抗体、所述生物素和链霉亲和素的第二免疫复合物；(e)通过测量所述探针尖端处的第二免疫复合物的荧光信号、减去(a)的预读的荧光信号并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量来确定样品中的分析物浓度；(f)将所述探针尖端浸渍在pH为约1.0-4.0的酸性溶液中以从所述探针尖端洗脱所述免疫复合物；以及(g)重复相同步骤(a)-(f)，但在步骤(b)中使用来自新样品的所述分析物，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。
在步骤(f)中，在将所述探针尖端浸渍在pH为约1.0-4.0的酸性溶液中之后，任选地将所述探针进一步浸渍在用于进一步洗脱所述免疫复合物的变性剂或离液剂中，如二甲基亚砜(DMSO)、正丁醇、乙醇、胍盐酸盐、高氯酸锂、醋酸锂、氯化镁、苯酚、2-丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲和尿素。DMSO是优选离液剂。
在一个实施例中，步骤(b)的第一免疫复合物通过以下形成：(b1)将样品溶液与双抗体溶液和试剂溶液混合以形成混合物，其中所述样品溶液包括分析物，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗半抗原抗体，并且所述试剂溶液包括与生物素缀合的信号抗体；以及(b2)将所述探针尖端浸渍在所述混合物中，以在所述探针尖端上形成第一免疫复合物。
在一个实施例中，步骤(b)的所述免疫复合物通过以下形成：(b1)将所述探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗半抗原抗体；(b2)将所述探针尖端浸渍在包括所述样品的样品溶液中；以及(b3)将所述探针尖端浸渍在包括与所述生物素缀合的所述信号抗体的试剂溶液中，以在所述探针尖端上形成所述第一免疫复合物。
展示的实施例1
在一个实施例中，所述方法包括以下步骤：(a)获得探针，所述探针具有固定在探针的所述尖端上的半抗原，其中尖端表面的直径≤5mm，并且所述半抗原不是生物素；(b)将所述探针浸渍在pH为6.0-8.5的水性溶液中以预读探针尖端的荧光信号；(c)将所述探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括与捕获抗体共价连接的抗半抗原抗体，其中所述捕获抗体是针对分析物的抗体；(d)将所述探针尖端浸渍在样品溶液中，所述样品溶液含有具有分析物的液体样品；(e)将所述探针尖端浸渍到包括与生物素缀合的信号抗体的试剂溶液中，以在探针尖端上形成包括所述分析物、所述捕获抗体和所述信号抗体的第一免疫复合物，其中所述信号抗体是针对所述分析物的第二抗体；(f)将所述探针尖端浸渍在洗涤溶液中；(g)将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的链霉亲和素的扩增溶液中，以在所述探针尖端上形成包括所述分析物、所述捕获抗体、所述信号抗体、所述生物素和所述链霉亲和素的第二免疫复合物；(h)通过测量所述探针尖端处的第二免疫复合物的荧光信号、减去(b)的预读的荧光信号并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量来确定样品中的分析物浓度；(i)将所述探针尖端浸渍在pH为约1.0-4.0的酸性溶液中，任选地进一步浸渍在用于从所述探针尖端洗脱所述免疫复合物的离液剂，如二甲基亚砜；以及(j)重复相同步骤(b)-(i)，但在步骤(d)中使用包括新样品的新样品溶液，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。此实施例展示在图12和14中。
展示的实施例2
在另一个实施例中，所述方法包括以下步骤：(a)获得探针，所述探针具有固定在探针的所述尖端上的半抗原，其中尖端表面的直径≤5mm，并且所述半抗原不是生物素；(b)将探针尖端浸渍在双抗体容器中，所述双抗体容器容纳双抗体溶液，所述双抗体溶液包括与捕获抗体共价连接的抗半抗原抗体，其中所述捕获抗体是针对所述分析物的第一抗体；(c)将所述探针浸渍在包括pH为6.0-8.5的水性溶液的预读容器中以预读所述探针尖端的荧光信号；(d)将所述探针尖端浸渍在样品溶液中，所述样品溶液含有具有分析物的液体样品；(e)将所述探针尖端浸渍到包括与生物素缀合的信号抗体的试剂溶液中，以在探针尖端上形成包括所述分析物、所述捕获抗体和所述信号抗体的第一免疫复合物，其中所述信号抗体是针对所述分析物的第二抗体；(f)将所述探针尖端浸渍在洗涤溶液中；(g)将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的链霉亲和素的扩增溶液中，以在所述探针尖端上形成包括所述分析物、所述捕获抗体、所述信号抗体、所述生物素和所述链霉亲和素的第二免疫复合物；(h)通过测量所述探针尖端处的第二免疫复合物的荧光信号、减去(b)的预读的荧光信号并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量来确定样品中的分析物浓度；(i)首先将所述探针尖端浸渍在pH为约1.0-4.0的酸性溶液中，任选地进一步浸渍在用于从所述探针尖端洗脱所述免疫复合物的离液剂，如二甲基亚砜；以及(j)重复相同步骤(b)-(i)，但在步骤(d)中使用包括新样品的新样品溶液，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。
在第二实施例的扩增中，双抗体缀合物任选地包括在激发波长和发射波长方面与信号荧光标记物不同的第二荧光标记物。
在两种扩增方法中，可以将链霉亲和素和荧光标记物缀合物与进一步缀合以增加链霉亲和素和荧光标记物的负载。
III.两次读取方案
两次读取方案读取探针尖端处的第二免疫复合物的第一荧光信号，然后读取经酸处理的探针尖端的第二荧光信号，并且然后从第一荧光信号中减去第二荧光信号以针对校准曲线对减去后的信号进行定量。利用此两次读取和减法方法，背景荧光信号在多于10个周期内维持较低。低背景提高了对浓度低的样品的检测并提高了测定的灵敏度。
每个步骤的细节与以上再循环方案I中描述的对应步骤的那些相同或相似。
所述方法包括以下步骤：(a)获得探针，所述探针具有固定在探针的所述尖端上的非生物素半抗原，其中尖端表面的直径≤5mm；(b)在所述探针尖端上形成包括来自样品的所述分析物、捕获抗体和信号抗体的第一免疫复合物，其中所述捕获抗体和所述信号抗体是针对所述分析物的两种不同抗体，所述捕获抗体与抗半抗原抗体共价连接，并且所述信号抗体与生物素缀合；(c)将所述探针尖端浸渍在洗涤溶液中；(d)将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的链霉亲和素的扩增溶液中以在探针尖端上形成包括所述分析物、所述捕获抗体、所述信号抗体、所述生物素和链霉亲和素的第二免疫复合物；(e)读取所述探针尖端处的所述第二免疫复合物的第一荧光信号；(f)将所述探针尖端浸渍在pH为约1.0-4.0的酸性溶液中；(g)读取经酸处理的探针尖端的第二荧光信号；(h)从所述第一荧光信号中减去所述第二荧光信号，并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量；(i)将所述探针尖端浸渍在如二甲基亚砜等离液剂中；以及(j)重复相同步骤(b)-(i)，但在步骤(b)中使用包括新样品的新样品溶液，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。
在一个实施例中，步骤(b)的第一免疫复合物通过以下形成：(b1)将样品溶液与双抗体溶液和试剂溶液混合以形成混合物，其中所述样品溶液包括分析物，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗半抗原抗体，并且所述试剂溶液包括与生物素缀合的信号抗体；以及(b2)将所述探针尖端浸渍在所述混合物中，以在所述探针尖端上形成第一免疫复合物。此实施例展示在图16A中。
在一个实施例中，步骤(b)的所述免疫复合物通过以下形成：(b1)将所述探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗半抗原抗体；(b2)将所述探针尖端浸渍在包括所述样品的样品溶液中；以及(b3)将所述探针尖端浸渍在包括与所述生物素缀合的所述信号抗体的试剂溶液中，以在所述探针尖端上形成所述第一免疫复合物。此实施例展示在图16B中。
例如，所述方法包括以下步骤：(a)获得探针，所述探针具有固定在探针的所述尖端上的半抗原，其中尖端表面的直径≤5mm，并且所述半抗原不是生物素；(b)将探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括与捕获抗体共价连接的抗半抗原抗体，其中所述捕获抗体是针对分析物的抗体；(c)将所述探针尖端浸渍在样品溶液中，所述样品溶液包括具有分析物的液体样品；(d)将所述探针尖端浸渍到包括与生物素缀合的信号抗体的试剂溶液中，以在探针尖端上形成包括所述分析物、所述捕获抗体和所述信号抗体的第一免疫复合物，其中所述信号抗体是针对所述分析物的第二抗体；(e)将所述探针尖端浸渍在洗涤溶液中；(f)将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的链霉亲和素的扩增溶液中，以在所述探针尖端上形成包括所述分析物、所述捕获抗体、所述信号抗体、所述生物素和所述链霉亲和素的第二免疫复合物；(g)读取所述探针尖端处的所述第二免疫复合物的第一荧光信号；(h)将所述探针尖端浸渍在pH为约1.0-4.0的酸性溶液中；(i)读取经酸处理的探针尖端的第二荧光信号；(j)从所述第一荧光信号中减去所述第二荧光信号，并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量；(k)将所述探针尖端浸渍在如二甲基亚砜等离液剂中；以及(j)重复相同步骤(b)-(k)，但在步骤(c)中使用包括新样品的新样品溶液，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。此实施例展示在图16B中。
在步骤(h)中，酸性溶液可以进一步包括浓度为2M-8M或5-7M，例如6M的变性剂或离液剂，例如氯化胍。
在两次读取方案中，在每个循环中在将探针浸渍在样品溶液之前预读探针的荧光信号是任选的。探针可以在步骤(b)之前或在步骤(b)之后但在步骤(c)之前预读。
在两次读取方案中，可以将链霉亲和素和荧光标记物缀合物与进一步缀合以增加链霉亲和素和荧光标记物的负载。
IV.双变性剂方案
对于有粘性或易于聚集的一些蛋白质，使用两种不同的变性剂有助于在每个免疫反应循环后去除形成在探针上的免疫复合物。
诸位发明人发现，使用酸性pH(pH 1-4或1.5到2.5)的氯化胍(胍盐酸盐)洗脱，然后用DMSO洗脱对于去除在每个循环之后结合的免疫复合物并且提供具有良好性能的再生的探针是有效的。
在一个实施例中，所述方法包括以下步骤：(a)将探针浸渍在pH为6.0-8.5的水性溶液中以预读探针尖端的荧光信号，其中所述探针包括固定在探针的尖端上的半抗原，并且所述尖端表面的直径≤5mm；(b)在探针尖端上形成包括来自样品的所述分析物、捕获抗体和信号抗体的免疫复合物，其中所述捕获抗体和所述信号抗体是针对所述分析物的两种不同抗体，所述捕获抗体与针对所述半抗原的抗半抗原抗体共价连接，并且所述信号抗体与荧光标记物缀合；(c)将所述探针尖端浸渍到含有洗涤溶液的洗涤容器中；(d)读取所述探针尖端处的所述免疫复合物的第一荧光信号；(e)将所述探针尖端浸渍在pH为约1.0-4.0并且含有氯化胍的酸性溶液中；(f)读取经酸处理的探针尖端的第二荧光信号；(g)从所述第一荧光信号中减去所述第二荧光信号，并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量；(h)将所述探针尖端浸渍在如二甲基亚砜等离液剂中；以及(i)重复相同步骤(b)-(h)，但在步骤(b)中使用包括新样品的新样品溶液，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。
在一个实施例中，步骤(b)的免疫复合物通过以下形成：(b1)将样品溶液与双抗体溶液和试剂溶液混合以形成混合物，其中所述样品溶液包括分析物，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗半抗原抗体，并且所述试剂溶液包括与荧光标记物缀合的信号抗体；并且(b2)将所述探针尖端浸渍在所述混合物中，以在所述探针尖端上形成所述免疫复合物。所述探针可以在一起添加组分时，立即浸渍到所述混合物中。可替代地，所述探针可以在将所述混合物温育一段时间，例如30秒到15分钟之后，浸渍到所述混合物中。
在一个实施例中，步骤(b)的所述免疫复合物通过以下形成：(b1)将所述探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗半抗原抗体；(b2)将所述探针尖端浸渍在包括所述样品的样品溶液中；(b3)将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的信号抗体的试剂溶液中，以在所述探针尖端上形成所述免疫复合物。此实施例展示在图22中。
在步骤(e)中，氯化胍浓度通常为2-8M，或3-7M，或4-6M，例如6M。
每个步骤的细节与以上再循环方案I-III中描述的对应步骤的那些相同或相似。
在上述所有方法中，试剂容器和扩增容器任选地覆盖有矿物油层以防止或减少容器中的溶液蒸发，这可以增加信号抗体缀合物或扩增缀合物的浓度。通常，容器中的溶液的体积为约50-300μL，优选地100-200μL。矿物油层的体积通常为20-80μL或30-50μL。矿物油通常用于最小化PCR样品管中的蒸发和随后的冷凝。诸位发明人已经证明探针尖端处的探针和免疫复合物不受穿过矿物油层的影响。
包括经固定化的半抗原的探针
本发明利用探针，所述探针包括固定在探针的尖端上的半抗原，其中所述探针的长度与宽度的纵横比为至少5比1，探针尖端表面的直径≤5mm，并且所述半抗原在酸处理之后基本上不从探针上解离；即，在酸处理的1-20个循环之后，不多于15％，优选地不多于10％或5％的半抗原从探针上解离。酸处理通常通过将探针浸渍在低pH缓冲液(pH 1-4、或1-3或1.5-2.5)中10秒到2分钟来执行。
通过以下实例进一步展示了本发明，所述实例不应被解释为将本发明的范围限制于其中所述的特定程序。
实例
实例1：半抗原和荧光染料标记
通过标准方法对BSA标记荧光素(F)。通过标准方法将生物素(B)与均来自Hytest有限公司的抗降钙素原(PCT)和抗肌钙蛋白I(TnI)连接。使洋地黄毒苷(Dig)NHS(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))与BSA在室温(RT)下以10的摩尔偶联比(MCR)反应1小时然后在Sephadex G25(通用电气医疗集团(GE Healthcare))柱上进行纯化。使Cy5tmNHS(通用电气医疗集团)与抗PCT抗体、抗TnI抗体、抗B抗体(杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoresearch))或链霉亲和素(Prozyme)在RT下在PBS pH 7.4中以10的MCR反应1小时，然后进行G25柱纯化。在RT下在PBS pH 7.4中以10的MCR对抗PCT标记AlexaFluorTM647 NHS(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher))持续1小时，然后进行G-24柱纯化。
实例2A：抗体-抗体缀合
抗F(杰克逊免疫研究公司)与抗PCT的连接按照已建立的SMCC(4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)缀合化学(Hermanson,G.T.(2008)《生物缀合技术(Bioconjugate Techniques)》,第2版,学术出版社(Academic Press),纽约(New York.))。使SMCC(西格玛奥尔里奇公司)与抗F在PBS Ph 7.4中以MCR 0f 15反应。室温1小时之后，用G-25柱对抗体进行纯化。使抗PCT与6-[3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯(SPDP，西格玛奥尔里奇公司)在RT下在PBS pH 7.4中以15的MCR反应1小时，然后通过G-25进行纯化。抗PCT-SPDP与二硫醚醇(DTT，西格玛奥尔里奇公司)的反应使巯基(SH)脱保护，并且在通过G-25色谱去除DTT之后，将抗PCT-SH与抗F-SMCC混合并且允许其在RT下反应过夜。用Sepharose 4B CL(通用电气医疗集团)柱对所产生的抗F-抗PCT缀合物进行纯化。抗F与抗TnI缀合并且抗Dig(杰克逊免疫研究公司)与抗PCT缀合遵循相同的程序。
实例2B：与的抗体-抗体缀合
如下制备抗半抗原和抗PCT的替代性双抗体缀合物。使2mg的氨基(什科尔德技术公司(Skold Technology))/PBS，pH 7.4与SPDP(赛默飞世尔公司)以10比1的摩尔偶联比反应1小时，然后进行过夜透析。通过添加30μl的DTT(赛默飞世尔公司)使硫醇的脱保护发生。1小时之后，在PD10柱上对材料进行纯化。
将2mg的抗半抗原——抗荧光素(杰克逊免疫研究公司)或抗洋地黄毒苷(赛默飞世尔公司)与2mg抗PCT(Hytest公司)混合并且与SMCC(赛默飞世尔公司)以15比1的摩尔偶联比反应1小时，然后在PD10柱上进行纯化。
将SMMC标记的抗体混合物与硫醇化的反应过夜，然后在琼脂糖CL-6B柱(通用电气医疗集团)上进行纯化，以制备与抗荧光素和抗PCT连接的/>此方法还用于制备其它双抗体缀合物，如抗荧光素和抗TnI。
实例3：交联的制备
交联的Cy5-抗F交联的/>和Cy5-链霉亲和素交联的/>的制备遵循美国专利第8,492,139号中描述的程序。将胺化以含有PBS中20mg/ml的88个胺每400kD(什科尔德技术公司)的2ml的/>400(西格玛/奥德里奇公司(Sigma/Aldrich))添加到10μL的SPDP(DMF中50mg/ml(N,N-二甲基甲酰胺)中。SPDP与/>的MCR为15。使混合物在室温下反应1小时，并且然后进行透析。按照标准方法估计，硫醇掺入估计为每/>400kD 5.5。
为了使SPDP标记的400上的硫醇脱保护，将38mg/ml PBS的30μL的DTT添加到1ml PBS中20mg，并允许其在室温下反应两小时。在PD10柱上对/>进行纯化。
如下将SMCC与胺化的400(88个胺//>)连接：将1ml PBS中10mg的胺化的/>400与10mg/ml DMF的25μL SMCC(皮尔斯化工公司(Pierce Chemical))混合，SMCC//>MCR为30。使混合物在室温下反应1小时，并且然后在PD10柱(通用电气医疗集团)上进行纯化。
为了使400和/>400交联，将1ml PBS中10mg的/>/>400与1ml PBS中10mg的/>400混合。使混合物在RT下反应过夜。
为了提供用于随后抗体或链霉亲和素与交联的400缀合的连接位点，然后将残留的胺与过量的SPDP反应。将20mg的交联的/>400与50mg/ml DMF的75μLSPDP混合。使混合物在室温下反应1小时，然后进行对PBS的透析。
然后在Sepharose 4B CL柱上对SPDP标记的交联的400制剂进行纯化。
实例4：Cy5-抗生物素交联的的制备
使1ml PBS中1.5mg/ml的Cy5-抗B与5mg/ml DMF的1.9μL SMCC混合，并且在室温下反应1小时，然后在PD 10柱上进行纯化。
通过将30μL DTT以1ml PBS中38mg/ml添加到0.7mg交联的400-SPDP中并且在室温下反应1小时，然后由PD 10柱对交联的/>进行纯化来使交联的/>400-SPDP上的硫醇脱保护。
使Cy5-抗B-SMCC与交联的400-SH混合并且在室温下反应过夜。然后添加12.5mg/ml的10μL NEM(N-乙基-马来酰亚胺，奥德里奇)并在室温下反应1/2小时。然后在Sepharose 4B CL柱上对缀合物进行纯化。
实例5：Cy5-链霉亲和素交联的的制备
使1ml PBS中1.5mg/ml的Cy5-链霉亲和素(SA)与5mg/ml DMF的5μL SMCC混合并且在室温下反应1小时，然后在PD 10柱上进行纯化。
通过将30μL DTT以1ml PBS中38mg/ml添加到0.7mg交联的400-SPDP中并且在室温下反应1小时，然后由PD 10柱对交联的/>进行纯化来使交联的/>400-SPDP上的硫醇脱保护。
使Cy5-SA-SMCC与交联的400-SH混合并且在室温下反应过夜。然后添加12.5mg/ml的10μL NEM(N-乙基-马来酰亚胺，奥德里奇)并在室温下反应1/2小时。然后在Sepharose 4B CL柱上对缀合物进行纯化。
实例6：半抗原涂覆的探针的制备
按照制造商的方案，使用化学气相沉积工艺(叶德工程化系统公司(YieldEngineering Systems)，1224P)使直径为1mm并且长度为2cm的石英探针涂覆有氨基丙基硅烷。然后将探针尖端浸没在于pH 7.4的PBS中30μg/ml的F-牛血清白蛋白(BSA)或Dig-BSA的溶液中。在允许BSA吸附到探针上持续10分钟之后，在PBS对探针尖端进行洗涤。
实例7：再循环免疫测定
在添加有40μL矿物油的情况下使用5mg/ml PHS pH 7.4、0.05％Tween 20作为缓冲液对120μL试剂和样品进行测定。洗涤缓冲液为200μL的PBS pH 7.4、0.05％Tween 20。探针保持固定，其中微孔固定在直径行程为1mm的定轨振荡器平台上。使用定轨流来加速结合动力学。方案A、B、C和D描述了测定结合步骤、时机、流速和试剂浓度的详细信息。洗脱试剂为10mM甘氨酸/HCl，200μL；无水DMSO(西格玛奥尔里奇公司)，200μL；和无水DMSO加上0.5mg/ml硼氢化钠(西格玛奥尔里奇公司)。
探针再循环测定格式和测定数据呈现在图1-16中。图17展示了用于检测探针尖端上的荧光的光学配置。从读取中减去预读会生成免疫特异性信号。
实例8：测定方案
方案A，v1(表1)的双抗体缀合物包括在无间隔子的情况下连接在一起的抗半抗原抗体和捕获抗体。
此实例中的所有其它方案的双抗体缀合物(表2-11)包括通过交联的400间隔子连接在一起的抗半抗原抗体和捕获抗体。
洗涤液＝具有Tween-20的PBS
表1
表2
表3
表4
表5
表6
表7
表8
表9
表10
表11
实例9：PCT测定结果(方案A，v1)
图2示出了遵循方案A，v1利用图1B中描述的荧光素探针格式进行的PCT测定的数据。来自阴性、10ng/ml和100ng/ml的PCT样品贯穿10个循环示出一致的荧光信号。100ng/ml样品表示此PCT测定中的最大信号。先前的实验示出，信号在每个循环下稳定增加，这归因于捕获AB和信号AB试剂蒸发。由于试剂体积为仅120μL，所以水蒸发可能导致AB浓度增加。通过添加40μL的矿物油从而在试剂顶部形成层以最小化水性蒸发，获得了如图2中的一致的信号。值得注意的是，含有免疫复合物的探针尖端未受到探针尖端穿过矿物油层转移的不利影响。
图3示出了经荧光素涂覆的探针格式(图1B)中利用方案A，v1的PCT标准品的数据。每个PCT水平下的结果跨10个周期非常一致，CV<10％。所述测定的高再现性表明所述方法可以应用于定量应用，并且仅需要单个校准曲线，而不是循环特定的校准。
图4示出了再循环测定的与商业IVD仪器(Biomerieux Vidas)具有相关性(R2＝0.95)的PCT临床血清样品的结果。为了对15个样品进行测量，Vidas使用了15个测试条，而再循环测定使用了单个探针和试剂组，其中样品以随机顺序测量。再循环测定格式可以耐受生物样品，并且可获得准确结果。
实例10：TnI测定结果(方案A，v2)
图5呈现了对另一种免疫测定的心肌TnI应用再循环测定(方案A，v2)的结果。格式如图1B，不同之处在于捕获AB是与抗TnI连接的抗F，并且信号AB是Cy5-抗TnI。
实例11：PCT测定结果(方案A，v3)
图7含有使用Alexa Fluor 647标记的信号AB(方案A，v3)进行的至多10个循环的不同PCT样品的数据。结果示出本发明可以应用于多种信号生成染料(荧光和化学发光)。本发明的原理集中于抗半抗原抗体与半抗原涂覆的探针表面解离。所采用的染料不应影响半抗原/抗半抗原解离，因为染料被标记为信号AB。
实例12：PCT测定结果(方案A，v4)
图9呈现了使用洋地黄毒苷格式(方案A，v4)进行至多10个循环的PCT水平，结果与图3中的荧光素探针格式非常相似。结果指示本发明可以在探针涂层中采用多个半抗原/抗半抗原对。
实例13：PCT测定结果(方案B)
图11示出了利用方案B，v1使用pH 2洗脱用图10中的再循环格式执行的PCT测定。图11示出了至多10个循环的3个PCT水平，这证明了使用与高分子量聚合物连接的标记的抗体的可行性。
实例14：PCT测定结果(方案B，v2)
图13示出了使用方案B，v2的利用pH 2洗脱的链霉亲和素扩增试剂的PCT结果。数据示出了每个周期的不断升高的预读数。使用从最终读取信号中减去预读信号以得到PCT特定信号。在此情况下，PCT特定信号贯穿10个周期维持不变。数据表明，除了PCT免疫复合物外，另外的荧光染料在探针表面上结合。认为可能的原因是链霉亲和素，因为已知在即使pH 2处理将不会抑制其生物素结合活性的情况其是稳健的。在pH 2洗脱之后保留在探针尖端上的任何残留的链霉亲和素在后续循环中都可以维持有活性。
实例15：PCT测定结果(方案C)
图15含有如图14中的使用方案C利用双pH 2和DMSO洗脱进行的3个PCT水平的再循环测定的结果。PCT信号贯穿10个循环维持一致，其中预读的信号显著减少。尽管许多有机溶剂可以充当合适的变性剂，但DMSO由于其相对较低的毒性而将成为优选选择之一。一致的PCT循环也表明半抗原涂覆的探针表面耐受重复的DMSO暴露。
实例16A：PCT测定结果(方案D)
图17示出了通过两次读取/减法方案(图16B，方案D)进行的3个PCT水平(0、10和100ng/mL)的再循环测定的结果。在12个循环中，PCT＝0ng/mL的荧光信号维持可忽略不计(约20-30个荧光单位)，这显著低于图15中示出的结果(在减去预读的荧光信号之后介于80-110个荧光单位之间)。
图18示出了通过两次读取再循环方案(图方案D)进行的15个PCT临床血清样品的结果。按从低浓度到高浓度(示出为Y轴线)以及从高浓度到低浓度(示出为X轴线)的顺序将15个样品测量两次。高到低以及低到高的结果高度相关(R2＝0.9985)，这表明无论样品浓度如何，都无残留问题。
图19示出了15个PCT临床血清样品的结果与两次读取再循环方案(方案D)对商业IVD仪器(Biomerieux Vidas)具有高相关性(R2＝0.98)。为了对15个样品进行测量，Vidas使用了15个测试条，而再循环测定使用了单个探针和试剂组，其中样品以随机顺序测量。
实例16B：PCT测定结果(方案D-1)
图20含有使用方案D-1利用双低pH加上变性剂氯化胍(6M胍HCl，pH 1.6)和DMSO洗脱的3个PCT水平的再循环测定的结果。所述方案与图16B中描述的那些类似，不同之处在于第一洗脱是在6M胍盐酸盐(pH 1.6)中执行的。与方案D类似，PCT信号贯穿11个循环维持一致，其中预读的信号显著减少。一致的PCT循环还表明，半抗原涂覆的探针表面耐受重复的变性剂氯化胍和DMSO暴露。
实例17：PCT测定结果(方案E)
图21示出了利用方案E的经荧光素涂覆的探针格式(图16A)中的PCT标准品的数据。在接触探针之前，首先将样品与双抗体抗F-抗PCT和信号抗体生物素-抗PCT混合。每个PCT水平下的结果跨12个周期非常一致，CV<10％。
实例18：血清淀粉样蛋白A(SAA)测定结果(方案F)
图23含有如图22中的使用方案F利用双(i)低pH加上变性剂氯化胍(6M胍HCl，pH1.6)洗脱和(ii)变性剂DMSO洗脱的3个SAA水平的再循环测定的结果。从GenScript获得了重组SAA、捕获抗体单克隆SAA抗体(6F9)和信号抗体单克隆SAA抗体(8C7)。
SAA趋向于聚合并且粘到探针上。在没有氯化胍的情况下，pH 2酸洗脱和DMSO洗脱似乎没有使免疫复合物基本上与探针解离。预读的信号在每个循环中逐步变高，这导致特定SAA结合信号在每个循环中下降(数据在此处未示出)。
然而，发明人发现，通过在酸洗脱中，即在(i)低pH加上变性剂氯化胍洗脱和(ii)变性剂DMSO洗脱两者的情况下添加氯化胍，预读的信号维持为低，并且SAA信号贯穿11个循环维持一致(图23)。
本发明和制造并使用其的方式和方法现描述于此完全、清楚、简洁和精确术语中，以便使其所属的本领域的技术人员能够制造并且使用本发明。应当理解，前文描述了本发明的优选实施例，并且可以在不脱离权利要求所述的本发明的范围的情况下进行修改。为特别指出并且清楚地要求保护被视为本发明的主题，以下权利要求书对本说明书进行了总结。

Claims (29)

1.一种检测多个液体样品中的分析物的方法，所述多个液体样品包括分析物，所述方法包括以下步骤：
（a）将探针浸渍在pH为6.0-8.5的水性溶液中以预读探针尖端的荧光信号，其中所述探针包括固定在所述探针的尖端上的半抗原，并且尖端表面的直径≤ 5 mm；
（b）在所述探针尖端上形成包括来自样品的所述分析物，捕获抗体，和信号抗体的免疫复合物，其中所述捕获抗体和所述信号抗体是针对所述分析物的两种不同抗体，所述捕获抗体与针对所述半抗原的抗半抗原抗体共价连接，并且所述信号抗体与荧光标记物缀合；
（c）将所述探针尖端浸渍到含有洗涤溶液的洗涤容器中；
（d）通过测量所述探针尖端处的所述免疫复合物的荧光信号，减去步骤（a）的预读的荧光信号并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量来确定所述样品中的分析物浓度；
（e）将所述探针尖端浸渍在pH为1.0-4.0的酸性溶液中以从所述探针尖端洗脱所述免疫复合物；和
（f）重复步骤（a）-（e），但在步骤（b）中使用来自新样品的所述分析物，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（b）的所述免疫复合物通过以下形成：
（b1）将样品溶液与双抗体溶液和试剂溶液混合以形成混合物，其中所述样品溶液包括所述分析物，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗半抗原抗体，并且所述试剂溶液包括与荧光标记物缀合的所述信号抗体；和
（b2）将所述探针尖端浸渍在所述混合物中，以在所述探针尖端上形成所述免疫复合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（b）的所述免疫复合物通过以下形成：
（b1）将所述探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗半抗原抗体；
（b2）将所述探针尖端浸渍在包括所述样品的样品溶液中；
（b3）将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的所述信号抗体的试剂溶液中，以在所述探针尖端上形成所述免疫复合物。
4.根据权利要求1–3中任一项所述的方法，其中步骤（e）中的所述酸性溶液的pH为1.5-2.5。
5.根据权利要求1–3中任一项所述的方法，其中在步骤（e）中，将所述探针尖端暴露于所述酸性溶液一次，持续10秒到2分钟。
6.根据权利要求1–3中任一项所述的方法，其中在步骤（e）中，将所述探针尖端暴露于具有2-5个循环的酸性溶液处理的脉冲处理，之后在读取容器中进行中和持续10-20秒。
7.根据权利要求1–3中任一项所述的方法，其中所述半抗原是荧光素，洋地黄毒苷，或生物素。
8.根据权利要求1–3中任一项所述的方法，其中所述抗半抗原抗体通过FICOLL（蔗糖和表氯醇的共聚物）与所述捕获抗体共价连接。
9.一种检测多个液体样品中的分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
（a）将探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括双抗体，所述双抗体包括与捕获抗体共价连接的抗半抗原抗体，其中所述捕获抗体是针对所述分析物的第一抗体；其中所述探针具有固定在所述探针的尖端上的半抗原，并且尖端表面的直径≤ 5 mm；
（b）将所述探针浸渍在pH为6.0-8.5的水性溶液中以预读所述探针尖端的荧光信号；
（c）将所述探针尖端浸渍在样品溶液中，所述样品溶液包括具有分析物的液体样品；
（d）将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的信号抗体的试剂溶液中，以在所述探针尖端上形成包括所述分析物，所述捕获抗体和所述信号抗体的免疫复合物，其中所述信号抗体是针对所述分析物的第二抗体；
（e）将所述探针尖端浸渍在洗涤溶液中；
（f）通过测量所述探针尖端处的所述免疫复合物的荧光信号，减去步骤（b）的预读的荧光信号并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量来确定所述样品中的分析物浓度；
（g）将所述探针尖端浸渍在pH为1.0-4.0的酸性溶液中以从所述探针尖端洗脱所述免疫复合物；和
（h）重复步骤（a）-（g），但在步骤（d）中使用含有新样品的新样品溶液，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述抗半抗原抗体通过FICOLL（蔗糖和表氯醇的共聚物）与所述捕获抗体共价连接。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述双抗体进一步包括与步骤（d）的所述荧光标记物不同的第二荧光标记物。
12.一种检测多个液体样品中的分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
（a）将探针浸渍在pH为6.0-8.5的水性溶液中以预读探针尖端的荧光信号，其中所述探针包括固定在所述探针的尖端上的第一半抗原，并且尖端表面的直径≤ 5 mm；
（b）在所述探针尖端上形成包括来自样品的所述分析物，捕获抗体和信号抗体的第一免疫复合物，其中所述捕获抗体和所述信号抗体是针对所述分析物的两种不同抗体，所述捕获抗体与针对所述第一半抗原的抗第一半抗原抗体共价连接，并且所述信号抗体与第二半抗原缀合，所述第一半抗原和所述第二半抗原不同；
（c）将所述探针尖端浸渍在洗涤溶液中；
（d）将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的抗第二半抗原抗体或链霉亲和素的扩增溶液中，以在所述探针尖端上形成包括所述分析物，所述捕获抗体，所述信号抗体，所述第二半抗原和所述抗第二半抗原抗体或链霉亲和素的第二免疫复合物；
（e）通过测量所述探针尖端处的所述第二免疫复合物的荧光信号，减去步骤（a）的预读的荧光信号并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量来确定所述样品中的分析物浓度；
（f）将所述探针尖端浸渍在pH为1.0-4.0的酸性溶液中以从所述探针尖端洗脱所述免疫复合物；和
（g）重复相同步骤（a）-（f），但在步骤（b）中使用来自新样品的所述分析物，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中步骤（b）的所述第一免疫复合物通过以下形成：
（b1）将样品溶液与双抗体溶液和试剂溶液混合以形成混合物，其中所述样品溶液包括所述分析物，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗第一半抗原抗体，并且所述试剂溶液包括与所述第二半抗原缀合的所述信号抗体；和
（b2）将所述探针尖端浸渍在所述混合物中，以在所述探针尖端上形成所述第一免疫复合物。
14.根据权利要求12所述的方法，其中步骤（b）的所述第一免疫复合物通过以下形成：
（b1）将所述探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗第一半抗原抗体；
（b2）将所述探针尖端浸渍在包括所述样品的样品溶液中；
（b3）将所述探针尖端浸渍在包括与所述第二半抗原缀合的所述信号抗体的试剂溶液中，以在所述探针尖端上形成所述第一免疫复合物。
15.根据权利要求12–14中任一项所述的方法，其中所述扩增溶液包括与所述荧光标记物缀合的抗第二半抗原抗体。
16.根据权利要求12–14中任一项所述的方法，其中所述第一半抗原和所述第二半抗原选自由以下组成的组：荧光素，洋地黄毒苷和生物素。
17.根据权利要求12–14中任一项所述的方法，其中所述第一半抗原是非生物素，所述第二半抗原是生物素，并且所述扩增溶液包括与所述荧光标记物缀合的链霉亲和素。
18.根据权利要求12–14中任一项所述的方法，其中所述扩增溶液包括与所述抗第二半抗原抗体或链霉亲和素和所述荧光标记物的缀合物结合的蔗糖和表氯醇共聚物。
19.一种检测多个液体样品中的分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
（a）将探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括双抗体，所述双抗体包括与捕获抗体共价连接的抗第一半抗原抗体，其中探针具有固定在探针的所述尖端上的第一半抗原，并且尖端表面的直径≤ 5 mm，所述捕获抗体是针对所述分析物的第一抗体；
（b）将所述探针浸渍在pH为6.0-8.5的水性溶液中以预读所述探针尖端的荧光信号；
（c）将所述探针尖端浸渍在样品溶液中，所述样品溶液包括具有分析物的液体样品；
（d）将所述探针尖端浸渍在包括与第二半抗原缀合的信号抗体的试剂溶液中，以在所述探针尖端上形成包括所述分析物，所述捕获抗体和所述信号抗体的第一免疫复合物，其中所述信号抗体是针对所述分析物的第二抗体，并且所述第一半抗原和所述第二半抗原不同；
（e）将所述探针尖端浸渍在洗涤溶液中；
（f）将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的抗第二半抗原抗体的扩增溶液中，以在所述探针尖端上形成包括所述分析物，所述捕获抗体，所述信号抗体，所述第二半抗原和所述抗第二半抗原抗体的第二免疫复合物；
（g）通过测量所述探针尖端处的所述第二免疫复合物的荧光信号，减去步骤（c）的预读的荧光信号并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量来确定所述样品中的分析物浓度；
（h）将所述探针尖端浸渍在pH为1.0-4.0的酸性溶液中以从所述探针尖端洗脱所述免疫复合物；和
（i）重复相同步骤（a）-（h），但在骤（c）中使用含有新样品的新样品溶液，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。
20.一种检测多个液体样品中的分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
（a）将探针尖端浸渍到双抗体容器中，所述双抗体容器容纳双抗体溶液，所述双抗体溶液包括与捕获抗体共价连接的抗半抗原抗体，其中探针具有固定在探针的所述尖端上的半抗原，其中尖端表面的直径≤ 5 mm，并且所述半抗原不是生物素，所述捕获抗体是针对所述分析物的抗体；
（b）将所述探针浸渍在包括pH为6.0-8.5的水性溶液的预读容器中以预读所述探针尖端的荧光信号；
（c）将所述探针尖端浸渍在样品溶液中，所述样品溶液含有具有分析物的液体样品；
（d）将所述探针尖端浸渍到包括与生物素缀合的信号抗体的试剂溶液中，以在所述探针尖端上形成包括所述分析物，所述捕获抗体和所述信号抗体的第一免疫复合物，其中所述信号抗体是针对所述分析物的第二抗体；
（e）将所述探针尖端浸渍在洗涤溶液中；
（f）将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的链霉亲和素的扩增溶液中，以在所述探针尖端上形成包括所述分析物，所述捕获抗体，所述信号抗体，所述生物素和所述链霉亲和素的第二免疫复合物；
（g）通过测量所述探针尖端处的所述第二免疫复合物的荧光信号，减去步骤（b）的预读的荧光信号并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量来确定所述样品中的分析物浓度；
（h）首先将所述探针尖端浸渍在pH为1.0-4.0的酸性溶液中，然后浸渍在二甲基亚砜中以从所述探针尖端洗脱所述免疫复合物；和
（i）重复相同步骤（a）-（h），但在步骤（c）中使用包括新样品的新样品溶液，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。
21.一种检测多个液体样品中的分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
（a）获得探针，所述探针具有固定在所述探针的尖端上的非生物素半抗原，其中尖端表面的直径≤ 5 mm；
（b）在所述探针尖端上形成包括来自样品的所述分析物，捕获抗体和信号抗体的第一免疫复合物，其中所述捕获抗体和所述信号抗体是针对所述分析物的两种不同抗体，所述捕获抗体与抗半抗原抗体共价连接，并且所述信号抗体与生物素缀合；
（c）将所述探针尖端浸渍在洗涤溶液中；
（d）将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的链霉亲和素的扩增溶液中，以在所述探针尖端上形成包括所述分析物，所述捕获抗体，所述信号抗体，所述生物素和链霉亲和素的第二免疫复合物；
（e）读取所述探针尖端处的所述第二免疫复合物的第一荧光信号；
（f）将所述探针尖端浸渍在pH为1.0-4.0的酸性溶液中；
（g）读取经酸处理的探针尖端的第二荧光信号；
（h）从所述第一荧光信号中减去所述第二荧光信号，并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量；
（i）将所述探针尖端浸渍在二甲基亚砜中；和
（j）重复相同步骤（b）-（i），但在步骤（b）中使用包括新样品的新样品溶液，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中步骤（b）的所述第一免疫复合物通过以下形成：
（b1）将样品溶液与双抗体溶液和试剂溶液混合以形成混合物，其中所述样品溶液包括所述分析物，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗半抗原抗体，并且所述试剂溶液包括与生物素物缀合的所述信号抗体；和
（b2）将所述探针尖端浸渍在所述混合物中，以在所述探针尖端上形成所述第一免疫复合物。
23.根据权利要求21所述的方法，其中步骤（b）的所述免疫复合物通过以下形成：
（b1）将所述探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗半抗原抗体；
（b2）将所述探针尖端浸渍在包括所述样品的样品溶液中；
（b3）将所述探针尖端浸渍在包括与所述生物素缀合的所述信号抗体的试剂溶液中，以在所述探针尖端上形成所述第一免疫复合物。
24.根据权利要求21–23中任一项所述的方法，其进一步在步骤（b）之前包括如下步骤：
在所述探针尖端上形成所述第一免疫复合物之前，将所述探针尖端浸渍在pH为6.0-8.5的水性溶液中以预读所述探针尖端的荧光信号。
25.根据权利要求21–23中任一项所述的方法，其中所述扩增溶液包括与荧光标记物缀合的链霉亲和素以及蔗糖和表氯醇共聚物。
26.一种检测多个液体样品中的分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
（a）将探针浸渍在pH为6.0-8.5的水性溶液中以预读探针尖端的荧光信号，其中所述探针包括固定在所述探针的尖端上的半抗原，并且尖端表面的直径≤ 5 mm；
（b）在所述探针尖端上形成包括来自样品的所述分析物，捕获抗体和信号抗体的免疫复合物，其中所述捕获抗体和所述信号抗体是针对所述分析物的两种不同抗体，所述捕获抗体与针对所述半抗原的抗半抗原抗体共价连接，并且所述信号抗体与荧光标记物缀合；
（c）将所述探针尖端浸渍到含有洗涤溶液的洗涤容器中；
（d）读取所述探针尖端处的所述免疫复合物的第一荧光信号；
（e）将所述探针尖端浸渍在pH为1.0-4.0并且含有氯化胍的酸性溶液中；
（f）读取经酸处理的探针尖端的第二荧光信号；
（g）从所述第一荧光信号中减去所述第二荧光信号，并且针对校准曲线对减去后的信号进行定量；
（h）将所述探针尖端浸渍在不同于氯化胍的离液剂中；和
（i）重复相同步骤（b）-（h），但在步骤（b）中使用包括新样品的新样品溶液，由此所述多个液体样品中的每个液体样品中的所述分析物得以检测。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中步骤（b）的所述免疫复合物通过以下形成：
（b1）将样品溶液与双抗体溶液和试剂溶液混合以形成混合物，其中所述样品溶液包括所述分析物，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗半抗原抗体，并且所述试剂溶液包括与荧光标记物缀合的所述信号抗体；和
（b2）将所述探针尖端浸渍在所述混合物中，以在所述探针尖端上形成所述免疫复合物。
28.根据权利要求26所述的方法，其中步骤（b）的所述免疫复合物通过以下形成：
（b1）将所述探针尖端浸渍在双抗体溶液中，所述双抗体溶液包括与所述捕获抗体共价连接的所述抗半抗原抗体；
（b2）将所述探针尖端浸渍在包括所述样品的样品溶液中；
（b3）将所述探针尖端浸渍在包括与荧光标记物缀合的所述信号抗体的试剂溶液中，以在所述探针尖端上形成所述免疫复合物。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述抗半抗原抗体通过FICOLL（蔗糖和表氯醇的共聚物）与所述捕获抗体共价连接。
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