JP2022543618A - 多重化のための化学発光化合物 - Google Patents

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Abstract

試料、例えば生体試料中の分析対象物質の存在を検出するために使用できる化合物、コンジュゲート及び方法が本明細書で開示される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月７日出願の米国仮特許出願第６２／８８３，９２６号の利益を主張し、この内容は参照により本明細書に組み込まれる。
単一の試験において、１つの試料からの２つ以上の分析対象物質を多重化し、測定する能力は、インビトロ診断市場内で強く求められている。試験の多重化は、向上したスループット、結果ごとの時間短縮、及び消耗品の削減を可能にする。内部コストを低下させ、全体の利益を改善する可能性も存在する。１つの試験における複数のシグナルを識別する一方法は、レポーター分子の発光波長を介する。化学発光を使用して波長シフトを達成するために、レッドシフト発光波長を有するトリガー可能な（ｔｒｉｇｇｅｒａｂｌｅ）化学発光化合物が望ましい。
（発明の簡単な要旨）
本開示は、式（Ｉ）の化合物、又はその塩
Figure 2022543618000002
 ［式中、Ｘは、－ＮＨ－又はジアミンリンカーであり、Ｙは、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は、－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在せず、Ｑは、－ＳＯ２－又は－ＣＯ－であり、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、アルキレン及びヘテロアルキレンから独立に選択され、Ｒ２は、－ＣＯＯＺ及び－ＣＮから選択され、Ｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、及びヘテロアルキルから選択され、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから独立に選択され、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、ヘテロアルキル、アルキレン、及びヘテロアルキレンは、１、２、３、４、又は５個の置換基で独立に任意選択的に置換されている。］を提供する。
本開示は、式（ＩＩ）のコンジュゲート、又はその塩
Figure 2022543618000003
 ［式中、Ｘは、－ＮＨ－又はジアミンリンカーであり、Ｙは、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は、－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在せず、Ｑは、－ＳＯ２－又は－ＣＯ－であり、Ｌ１は、アルキレン及びヘテロアルキレンから選択され、Ｌ３はリンカーであり、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから独立に選択され、結合メンバーは、標的分析対象物質に結合することが可能な分子であり、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキレン、及びヘテロアルキレンは、１、２、３、４、又は５個の置換基で独立に任意選択的に置換されている。］も提供する。
本開示は、前述のコンジュゲートを使用して、生体試料中の２つ以上の分析対象物質を検出する方法をさらに提供する。
アセトアミドリンカーを介して置換アクリジニウム部分に付着しているフルオレセインの５－及び６－異性体についての構造及び蛍光データを示す図である。 ピペラジンリンカーを介して置換アクリジニウム部分に付着しているフルオレセインの５－及び６－異性体についての構造及び蛍光データを示す図である。 様々なリンカーを介して置換アクリジニウム部分に付着しているローダミンの５／６－カルボキシ及び２－カルボキシ異性体についての構造及び蛍光データを示す図である。 様々な付着点を介してフルオロフォアに連結する置換アクリジニウム部分についての構造及び発光データを示す図である。 フルオロフォアが様々なリンカーを介して置換アクリジニウム部分に付着している化合物についての構造及び発光データを示す図である。 実施例７８に記載されているサイトメガロウイルスＩｇＧ及びＩｇＭの多重化アッセイの結果を示す図である。 実施例７９に記載されているＨＩＶ抗原及び抗体の組合せの多重化アッセイの結果を示す図である。 実施例８０に記載されているライム病ＩｇＧ及びＩｇＭの多重化アッセイの結果を示す図である。 実施例８１に記載されている遊離Ｔ４及び甲状腺刺激ホルモンの組合せの多重化アッセイの結果を示す図である。
試料、例えば生体試料中の分析対象物質の存在を検出するために使用できる化合物、コンジュゲート及び方法が本明細書で開示される。化合物は、硬質なジアミンリンカーを介して連結するアクリジニウム部分及びフルオロフォアを含む。アクリジニウム部分の化学発光がトリガーされると、光出力は、付着したフルオロフォアの発光波長にシフトされ得る。化合物は、試料中の目的の分析対象物質に特異的に結合することが可能な分子にコンジュゲートし、その結果、分析対象物質の有無を判定できる。単一のアッセイにおける、異なるフルオロフォアを有する複数のコンジュゲートの使用は、単一の試験における１つの試料からの２つ以上の分析対象物質の検出を可能にし得、これは、インビトロ診断に特に有用であり得る。
化学発光は、２０世紀中頃以来広範に研究されている。酵素に誘導される化学発光、生物発光、ペルオキシオキシレート（ｐｅｒｏｘｙｏｘｙｌａｔｅ）という化学物質、及びアクリジニウムという化学物質はそれぞれ、化学反応を通して光を生成する能力により定義される化学発光システムの例である。化学発光及び生物発光の調査は、無数の出版物及び特許、並びにホタル及びチョウチンアンコウ（生物発光菌を介する）のよりよい理解、また商用製品、例えばケミカルライト及びイムノアッセイにつながった（Ｓｅｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９６１年、４７、１１２９～１１３４頁；Ｎｅａｌｓｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９７９年、４３（４）、４９６～５１８頁；Ｒａｕｈｕｔ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９６９年、２（３）、８０～８７頁；Ｄｏｄｅｉｇｎｅら、Ｔａｌａｎｔａ、２０００年、５１、４１５～４３９頁）。化学発光の機構は、化学発光システムごとに異なるが、すべての理論は基底状態に緩和しつつ光子を放出する励起状態分子に帰結する。励起状態分子の性質は、放出される光子の発光波長を判定する。
化学発光種の発光波長を調節する能力は、イムノアッセイ多重化を含むいくつかの用途で有益である。調節可能な発光波長の化学発光の古典的な例は、様々な発光波長の発光団を使用して、分子間プロセスにて広域スペクトルのケミカルライトの色を生成できるケミカルライトである。励起されることが可能な分子を慎重に選択することにより、化学発光システムに対する発光波長を選択できる。シフト発光は、化学発光エネルギー又は電子移動プロセスを通して達成され得る。これらのプロセスは、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、Ｄｅｘｔｅｒ電子移動、化学発光エネルギー移動（ＣＲＥＴ）、及び化学的に開始される電子交換発光（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（ＣＩＥＥＬ）の変形を含む様々な仮定された機構を介して、分子間及び分子内の両方で機能することを示している。そのような分子内システムの例は、フルオロフォアタグ付きルシフェラーゼである酵素を使用するＢＲＥＴに基づくシステム（Ｈｉｂｌｏｔら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１７年、５６、１４５５６～１４５６０頁）、アダマンチルジオキセタンフルオロフォア構築体（Ｔｓｅｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．２０１５年、２２（１）、４）、アクリジニウム標識量子ドット（Ｓｋｌｅｎａｒｏｖａら、Ｊ．Ｌｕｍｉｎ．２０１７年、１８４、２３５～２４１頁）、及びアクリジニウム標識ＤＮＡシステム（Ｂｒｏｗｎｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２年、８４、９２２２～９２２９頁）を含む。アクリジニウムを化学開始剤、及び、分子内で連結するフルオロフォアエネルギー受容体として使用して、アクリジニウム／アクリドン化学発光のものからシフトする発光波長を生成して、エネルギー又は電子移動の現象を引き出すことが可能であり得る。
化学発光エネルギー／電子移動は、１９６０年代中頃以来研究されており、シフト発光を引き起こす機構に関して様々な仮説がある（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｎａｔｕｒｅ、１９６７年、２１５、１１６３～１１６５頁；Ｆｒｅｅｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９７１年、９３（９）、２０９７～２１０２頁；米国特許第６１５６８００号）。アクリジニウムが開始する電子／エネルギーの移動における有力な説は、開始剤（すなわちアクリジニウム）を受容体（すなわちフルオロフォア）に連結する部分の長さが、シフト発光管理の推進要因であるというものである。しかし、理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、開始剤（アクリジニウム）と受容体（フルオロフォア／発光団）の互いに対する配向は、シフト発光効率において重要な推進要因であり得る証拠を集めた。アクリジニウム部分とフルオロフォアとの間に硬質なジアミンリンカーを有する、本明細書に示されている化合物は、１００％シフト発光を達成できる、すなわち、シフト発光の光出力が、アクリジニウム単体から予想されるものの１００％であり、最適化したシステムでは、より狭い発光バンドで、光がほとんどからまったく観察されない。軌道整列の要件及び１００％シフト発光の観察は、電子移動のＤｅｘｔｅｒ機構に役立つ（Ｔｕｒｒｏら、Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ、Ｍｉｌｌ Ｖａｌｌｅｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、２０１０年；Ｄｅｘｔｅｒ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９５３年、２１、８３６頁）。相対的なリンカーの長さは、離れた適正な配向を推進し得、又は分子の割合を限定する高い自由度を可能にし得、フルオロフォア及び開始剤が適正な配向で存在して移動を促進する距離に関して、役割を果たすと思われる。しかし、リンカーの長さは配向とは独立に、長いリンカーは正しい配向を生じるために畳む／曲げることができるが、短いリンカーは、好ましくない配向で２つの部分を保持し得ると考えることができる。したがって、リンカーの長さ自体はシフト発光を推進しない。さらに、リンカーのタイプ、フルオロフォアの付着点、及び開始剤の付着点はそれぞれ、部分配向に影響を及ぼし、したがって、シフト発光化学発光化合物の調製において重要な要因になり得る。
定義
本明細書で使用されている「含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、及びそれらの変化形は、追加の作用又は構造の可能性を除外しないオープンエンドな移行句、用語又は単語を意図している。単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないと明らかに指示されない限り複数形の言及を含む。本開示は、はっきり明記されているかいないかを問わず、本明細書で提示される実施形態又は要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も想定する。
本明細書の数字範囲の記述では、同一の精度で間に存在するそれぞれの介在数ははっきり想定される。例えば、６～９の範囲では、６及び９に加えて７及び８の数が想定され、６．０～７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０の数がはっきり想定される。
特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、当業者により通例理解されるものと同じ意味を有する。不一致のケースでは、定義を含む本文書が優位である。好ましい方法及び材料は、以下に記載されているが、本明細書に記載されているものと同様又はそれに等しい方法及び材料は、本開示の実践又は試験に使用され得る。本明細書で言及されるすべての公報、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照によりその全体を組み込む。本明細書で開示されている材料、方法、及び例は、例証に過ぎず、限定することを意図するものではない。
特定の官能基及び化学用語の定義について、より詳細に以下に記載する。本開示では、化学元素は、Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ｔａｂｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ、ＣＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ、第７５版、表紙裏に従って特定され、特定の官能基は、その中に記載されているように一般に定義される。さらに、有機化学の一般原則、並びに特定の官能部分及び反応性については、Ｓｏｒｒｅｌｌ、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ社、Ｓａｕｓａｌｉｔｏ、２００６年；Ｓｍｉｔｈ， Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ， ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第７版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１３年；Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１８年；Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ、Ｓｏｍｅ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、１９８７年に記載されており、これらのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に組み込む。
本明細書で使用される場合、用語「アルキル」は、１～１６個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ１６アルキル）、例えば１～１４個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ１４アルキル）、１～１２個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ１２アルキル）、１～１０個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）、１～８個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ８アルキル）、１～６個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、又は１～４個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ４アルキル）を含む直鎖又は分枝状の飽和炭化水素鎖を意味する。アルキルの代表例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、３－メチルヘキシル、２，２－ジメチルペンチル、２，３－ジメチルペンチル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、及びｎ－ドデシルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「アルケニル」は、２～１６個の炭素原子及び少なくとも１個の炭素－炭素二重結合を含む直鎖又は分枝状の炭化水素鎖を指す。アルケニルの代表例としては、エテニル、２－プロペニル、２－メチル－２－プロペニル、３－ブテニル、４－ペンテニル、５－ヘキセニル、２－ヘプテニル、２－メチル－１－ヘプテニル、及び３－デセニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「アルキニル」は、２～１６個の炭素原子及び少なくとも１個の炭素－炭素三重結合を含む直鎖又は分枝状の炭化水素鎖を指す。アルキニルの代表例としては、エチニル、プロピニル、及びブチニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「アルキレン」は、１～１０個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ１０アルキレン）、例えば１～６個の炭素原子（Ｃ１～Ｃ６アルキレン）の直鎖又は分枝鎖の炭化水素に由来する２価基を指す。アルキレンの代表例としては、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、及び－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「アルコキシ」は、酸素原子を通して親分子部分に付属している、本明細書に定義されるアルキル基を指す。アルコキシの代表例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２－プロポキシ、ブトキシ及びｔｅｒｔ－ブトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「アリール」は、フェニル基、又は二環式又は三環式の芳香族縮合環系を指す。二環式縮合環系は、親分子部分に付属し、１つのフェニル基に縮合しているフェニル基によって例示される。三環式縮合環系は、親分子部分に付属し、他の２つのフェニル基に縮合しているフェニル基によって例示される。二環式アリールの代表例としては、ナフチルが挙げられるが、これに限定されない。三環式アリールの代表例としては、アントラセニル及びフェナントレニル（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅｙｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「アリールアルキル」は、本明細書に定義されるアルキル基を通して親分子部分に付属している、本明細書に定義されるアリール基を指す。アリールアルキルの代表例としては、フェニルメチル（すなわち、ベンジル）及びフェニルエチルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「アリールオキシ」は、酸素原子を通して親分子部分に付属している、本明細書で定義されているアリール基を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「シクロアルキル」は、３～１０個の炭素原子及び０個のヘテロ原子を含む飽和炭素環式環系を指す。シクロアルキルは、単環式、二環式、架橋、縮合、又はスピロ環式とすることができる。シクロアルキルの代表例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、アダマンチル、ビシクロ［１．１．１］ペンタニル、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル、ビシクロ［３．２．１］オクタニル、及びビシクロ［５．２．０］ノナニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「シクロアルケニル」は、少なくとも１個の炭素－炭素二重結合を含み、好ましくは１環当たり５～１０個の炭素原子を有する非芳香族単環式又は多環式の炭素環式環系を意味する。例示的な単環式シクロアルケニル環としては、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、及びビシクロ［２．２．１］ヘプテニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「シクロアルキルアルキル」は、本明細書に定義されるアルキレン基を通して親分子部分に付属している、本明細書に定義されるシクロアルキル基を指す。シクロアルキルアルキルの代表例としては、シクロヘキシルメチルが挙げられるが、これに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ジアミンリンカー」は、各端部にアミン官能基（－ＮＨ－又は－ＮＲ－）を有するリンカー部分を指す。ジアミンリンカーは、線状、分枝状、又は環式とすることができる。
本明細書で使用される場合、用語「ハロゲン」又は「ハロ」は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「ハロアルキル」は、１個以上の水素原子がハロゲンによって置き換えられている、本明細書に定義されるアルキル基を意味する。例えば、１、２、３、４、５、６、７若しくは８個の水素原子がハロゲンによって置き換えられてもよく、又はすべての水素原子がハロゲンによって置き換えられてもよい。ハロアルキルの代表例としては、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、２－フルオロエチル、２，２－ジフルオロエチル、２，２，２－トリフルオロエチル、ペルフルオロエチル、２－フルオロ－２－メチルプロピル、及び３，３，３－トリフルオロプロピルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ハロアルコキシ」は、本明細書に定義される少なくとも１つのハロアルキル基が酸素原子を通して親分子部分に付属していることを意味する。ハロアルコキシの代表例としては、トリフロオロメトキシが挙げられるが、これに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアルキル」は、少なくとも１個の炭素原子が例えばＮ、Ｏ、Ｐ、又はＳなどのヘテロ原子で置き換えられた、本明細書に定義されるアルキル基を指す。ヘテロアルキルの代表例としては、アルキルエーテル、第二級及び第三級アルキルアミン、アミド、並びにアルキルスルフィドが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアルキレン」は、少なくとも１個の炭素原子が例えばＮ、Ｏ、Ｐ、又はＳなどのヘテロ原子で置き換えられた、本明細書に定義されるアルキレン基を指す。ヘテロアルキレン基の代表例としては、ポリエチレンオキシド及びポリプロピレンオキシド鎖、ポリエチレンイミン基などが挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリール」は、芳香族単環式環又は芳香族二環式環系又は芳香族三環式環系を指す。芳香族単環式環は、Ｎ、Ｏ、及びＳからなる群から独立に選択される少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、及びＮから独立に選択される１、２、３、又は４個のヘテロ原子）を含む５又は６員環である。５員芳香族単環式環は２個の二重結合を有し、６員芳香族単環式環は３個の二重結合を有する。二環式ヘテロアリール基は、本明細書に定義される単環式アリール基又は本明細書に定義される単環式ヘテロアリール基に縮合している単環式ヘテロアリール環によって例示される。三環式ヘテロアリール基は、本明細書に定義される単環式アリール基又は本明細書に定義される単環式ヘテロアリール基から独立に選択される２つの環に縮合している単環式ヘテロアリール環によって例示される。単環式ヘテロアリールの代表例としては、ピリジニル（ピリジン－２－イル、ピリジン－３－イル、ピリジン－４－イルを含む）、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピロリル、ベンゾピラゾリル、１，２，３－トリアゾリル、１，３，４－チアジアゾリル、１，２，４－チアジアゾリル、１，３，４－オキサジアゾリル、１，２，４－オキサジアゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チエニル、フラニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、１，２，４－トリアジニル、及び１，３，５－トリアジニルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式ヘテロアリールの代表例としては、ベンゾイミダゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾピラゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾオキサゾリル、クロメニル、イミダゾピリジン、イミダゾチアゾリル、インダゾリル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリニル、ナフチリジニル、プリニル、ピリドイミダゾリル、キナゾリニル、キノリニル、キノキサリニル、チアゾロピリジニル、チアゾロピリミジニル、チエノピロリル、及びチエノチエニルが挙げられるが、これらに限定されない。三環式ヘテロアリールの代表例としては、ジベンゾフラニル及びジベンゾチエニルが挙げられるが、これらに限定されない。単環式、二環式、及び三環式ヘテロアリールは、環内に含まれている任意の炭素原子又は任意の窒素原子を通して親分子部分に連結されている。
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリールアルキル」は、本明細書に定義されるアルキレン基を通して親分子部分に付属している、本明細書に定義されるヘテロアリール基を指す。ヘテロアリールアルキルの代表例としては、フル－３－イルメチル、１Ｈ－イミダゾール－２－イルメチル、１Ｈ－イミダゾール－４－イルメチル、１－（ピリジン－４－イル）エチル、ピリジン－３－イルメチル、６－クロロピリジン－３－イルメチル、ピリジン－４－イルメチル、（６－（トリフルオロメチル）ピリジン－３－イル）メチル、（６－（シアノ）ピリジン－３－イル）メチル、（２－（シアノ）ピリジン－４－イル）メチル、（５－（シアノ）ピリジン－２－イル）メチル、（２－（クロロ）ピリジン－４－イル）メチル、ピリミジン－５－イルメチル、２－（ピリミジン－２－イル）プロピル、チエン－２－イルメチル、及びチエン－３－イルメチルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ環」又は「ヘテロ環式の」は、単環式ヘテロ環、二環式ヘテロ環、又は三環式ヘテロ環を意味する。単環式ヘテロ環は、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から独立に選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む３、４、５、６、７、又は８員環である。３又は４員環は、０又は１個の二重結合、並びにＯ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１個のヘテロ原子を含む。５員環は、０又は１個の二重結合、並びにＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１、２又は３個のヘテロ原子を含む。６員環は、０、１又は２個の二重結合、並びにＯ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１、２、又は３個のヘテロ原子を含む。７及び８員環は、０、１、２、又は３個の二重結合、並びにＯ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１、２、又は３個のヘテロ原子を含む。単環式ヘテロ環の代表例としては、アゼチジニル、アゼパニル、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３－ジオキサニル、１，３－ジオキソラニル、１，３－ジチオラニル、１，３－ジチアニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキセタニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、１，２－チアジナニル、１，３－チアジナニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、チオモルホリニル、１，１－ジオキシドチオモルホリニル（チオモルホリンスルホン）、チオピラニル、及びトリチアニルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式ヘテロ環は、フェニル基に縮合している単環式ヘテロ環、又は単環式シクロアルキルに縮合している単環式ヘテロ環、又は単環式シクロアルケニルに縮合している単環式ヘテロ環、又は単環式ヘテロ環に縮合している単環式ヘテロ環、又はスピロヘテロ環基、あるいは環の非隣接の２個の原子が１、２、３、若しくは４個の炭素原子のアルキレン架橋又は２、３、若しくは４個の炭素原子のアルケニレン架橋によってリンクされている架橋単環式ヘテロ環系である。二環式ヘテロ環の代表例としては、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、クロマニル、２，３－ジヒドロベンゾフラニル、２，３－ジヒドロベンゾチエニル、２，３－ジヒドロイソキノリン、２－アザスピロ［３．３］ヘプタン－２－イル、アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル（２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－イルを含む）、２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インドリル、イソインドリニル、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロリル、オクタヒドロピロロピリジニル、及びテトラヒドロイソキノリニルが挙げられるが、これらに限定されない。三環式ヘテロ環は、フェニル基に縮合している二環式ヘテロ環、又は単環式シクロアルキルに縮合している二環式ヘテロ環、又は単環式シクロアルケニルに縮合している二環式ヘテロ環、又は単環式ヘテロ環に縮合している二環式ヘテロ環、あるいは二環式環の非隣接の２個の原子が１、２、３、若しくは４個の炭素原子のアルキレン架橋又は２、３、若しくは４個の炭素原子のアルケニレン架橋によってリンクされている二環式ヘテロ環によって例示される。三環式ヘテロ環の例としては、オクタヒドロ－２，５－エポキシペンタレン、ヘキサヒドロ－２Ｈ－２，５－メタノシクロペンタ［ｂ］フラン、ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－メタノシクロペンタ［ｃ］フラン、アザ－アダマンタン（１－アザトリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン）、及びオキサ－アダマンタン（２－オキサトリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン）が挙げられるが、これらに限定されない。単環式、二環式、及び三環式ヘテロ環は、環内に含まれている任意の炭素原子又は任意の窒素原子を通して親分子部分に連結されている。
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロシクリルアルキル」は、本明細書に定義されるアルキレン基を通して親分子部分に付属している、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を指す。ヘテロシクリルアルキルの代表例としては、ピペリジン－４－イルメチル、ピペラジン－１－イルメチル、３－メチル－１－ピロリジン－１－イルブチル、（１Ｒ）－３－メチル－１－ピロリジン－１－イルブチル、（１Ｓ）－３－メチル－１－ピロリジン－１－イルブチル、及び３－モルホリノプロピルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロキシ」は、－ＯＨ基を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「ヒドロキシアルキル」は、少なくとも１つのヒドロキシ基で置換されている、本明細書に定義されるアルキル基を指す。ヒドロキシアルキルの代表例としては、ヒドロキシメチル、２－ヒドロキシエチル、３－ヒドロキシプロピル、２，３－ジヒドロキシプロピル、２，３－ジヒドロキシペンチル、４－ヒドロキシブチル、２－エチル－４－ヒドロキシヘプチル、３，４－ジヒドロキシブチル、及び５－ヒドロキシペンチルが挙げられるが、これらに限定されない。
場合によって、基（例えば、アルキル、アルコキシ、又はシクロアルキル）中の炭素原子の数は、接頭辞「Ｃｘ～Ｃｙ－」（ここで、ｘは基中の炭素原子の最小数であり、ｙは基中の炭素原子の最大数である）によって示される。したがって、例えば「Ｃ１～Ｃ３－アルキル」は、１～３個の炭素原子を含むアルキル基を指す。
用語「置換基」は、指示された基の原子に置換されている基を指す。
基又は部分が置換され得るとき、用語「置換された」は、「置換された」を使用する表現において指示された基の１個以上（例えば、１、２、３、４、５、又は６個；一部の実施形態では、１、２、又は３個；他の実施形態では、１又は２個）の水素が、記載された指示基の選択されたもの又は当業者に公知である好適な基（例えば、以下に記載される基の１つ以上）で置き換えられ得ることを示す。置換基としては、ハロゲン、＝Ｏ、＝Ｓ、シアノ、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキレン、アリールオキシ、アリールアルキルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、カルボキシ（－ＣＯＯＨ）、ケトン、アミド、カルバメート、ホスホリル、セレニル、及びアシルが挙げられるが、これらに限定されない。
化合物
式（Ｉ）の化合物、又はその塩
Figure 2022543618000004
 ［式中、Ｘは、－ＮＨ－又はジアミンリンカーであり、Ｙは、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は、－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在せず、Ｑは、－ＳＯ２－又は－ＣＯ－であり、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、アルキレン及びヘテロアルキレンから独立に選択され、Ｒ２は、－ＣＯＯＺ及び－ＣＮから選択され、Ｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、及びヘテロアルキルから選択され、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから独立に選択され、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、ヘテロアルキル、アルキレン、及びヘテロアルキレンは、１、２、３、４、又は５個の置換基で独立に任意選択的に置換されている。］が、本明細書で開示される。
Ｘ基は、－ＮＨ－又はジアミンリンカーである。一部の実施形態では、Ｘは－ＮＨ－である。一部の実施形態では、Ｘはジアミンリンカーである。一部の実施形態では、ジアミンリンカーは、式－ＮＲ’－Ｌ’－ＮＲ’’－を有することができ、式中、Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ、水素及びメチルから独立に選択され、Ｌ’は、アルキレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、及びシクロアルケニレンから選択される。一部の実施形態では、ジアミンリンカーは、環式ジアミンリンカー（例えば、単環式又は二環式のジアミンリンカー）とすることができる。一部の実施形態では、ジアミンリンカーは、硬質なジアミンリンカーとすることができる。例示的な硬質なジアミンリンカーは、以下
Figure 2022543618000005
 を含む。
一部の実施形態では、Ｘは、
Figure 2022543618000006
 から選択される。
一部の実施形態では、Ｘは、
Figure 2022543618000007
 である。
Ｙ基は、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在しない。
一部の実施形態では、Ｙは窒素であり、Ｒ１は－ＳＯ２－Ａである。一部の実施形態では、Ａはアリールである。一部の実施形態では、Ａはフェニルである。一部の実施形態では、Ａは非置換である又はＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、及びアミノから選択される１、２、３、４、若しくは５個の置換基で置換されている。一部の実施形態では、Ａは、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、及びアミノから選択される１個の置換基で置換されているフェニルである。一部の実施形態では、Ａは、Ｃ１～Ｃ４アルキルから選択される１個の置換基で置換されているフェニルである。一部の実施形態では、Ａは、１個のメチル基で置換されているフェニルである。一部の実施形態では、Ａはｐ－トリルである。
Ｒ２は、－ＣＯＯＺ及び－ＣＮから選択され、Ｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、及びヘテロアルキルから選択される。一部の実施形態では、Ｒ２は－ＣＯＯＺである。一部の実施形態では、Ｚは、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから選択される。一部の実施形態では、Ｚは水素である。
一部の実施形態では、Ｑは－ＣＯ－である。一部の実施形態では、Ｑは－ＳＯ２－である。
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、アルキレン及びヘテロアルキレンから独立に選択される。一部の実施形態では、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立にＣ１～Ｃ４－アルキレンである。一部の実施形態では、Ｌ１は－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。一部の実施形態では、Ｌ２は－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。
一部の実施形態では、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ水素である。
一部の実施形態では、化合物は、式（Ｉａ）の化合物、又はその塩
Figure 2022543618000008
 ［式中、それぞれのＲは独立に、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルからなる群から選択され、ｍは、０、１、２、３、４又は５であり、ｎは１、２、３、４、５又は６である。］である。
一部の実施形態では、ｍは、１又は２である。一部の実施形態では、ｍは１である。一部の実施形態では、ｍは１であり、ＲはＣ１～Ｃ４アルキルである。一部の実施形態では、ｍは１であり、Ｒはメチルである。一部の実施形態では、ｎは３である。
一部の実施形態では、化合物は、式（Ｉｂ）の化合物、又はその塩
Figure 2022543618000009
 である。
本明細書における式（Ｉ）の化合物への言及はいずれも、はっきりと記載されていようといまいと式（Ｉａ）又は式（Ｉｂ）の化合物への言及でもあると解釈されるべきである。
一部の実施形態では、式（Ｉ）、式（Ｉａ）、又は式（Ｉｂ）の化合物のいずれにおいても、フルオロフォアは、フルオレセイン、ローダミン、ホウ素－ジピロメテン、シアニン、オキサジン、チアジン、クマリン、ナフタルイミド、ロドール、ナフタレン、スクアライン、ポルフィリン、フラビン、及びランタニド系染料から選択される。
好適なフルオロフォアとしては、ＱＵＡＳＡＲ（登録商標）染料（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｎｏｖａｔｏ、Ｃａｌｉｆ．から入手可能）、フルオレセイン及びフルオレセイン染料（例えば、フルオレセインイソチオシアナート又はＦＩＴＣ、ナフトフルオレセイン、４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシ－フルオレセイン、６－カルボキシフルオレセイン（例えば、ＦＡＭ）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル染料、オキソノール染料、フィコエリトリン、エリトロシン、エオシン、ローダミン染料（例えば、カルボキシテトラメチルローダミン又はＴＡＭＲＡ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、リッサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン又はＴＭＲ）、クマリン及びクマリン染料（例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン及びアミノメチルクマリン又はＡＭＣＡ）、オレゴングリーン染料（例えば、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４）、テキサスレッド、テキサスレッド－Ｘ、ＳＰＥＣＴＲＵＭ ＲＥＤ（商標）、ＳＰＥＣＴＲＵＭ ＧＲＥＥＮ（商標）、シアニン染料（例えば、ＣＹ－３（商標）、ＣＹ－５（商標）、ＣＹ－３．５（商標）、ＣＹ－５．５（商標））、アレクサフルオル染料（例えば、アレクサフルオル３５０、アレクサフルオル４８８、アレクサフルオル５３２、アレクサフルオル５４６、アレクサフルオル５６８、アレクサフルオル５９４、アレクサフルオル６３３、アレクサフルオル６６０及びアレクサフルオル６８０）、ＢＯＤＩＰＹ染料（例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５）、ＩＲ染料（例えば、ＩＲＤ４０、ＩＲＤ ７００、ＩＲＤ ８００）などが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる他の好適な蛍光染料並びに蛍光染料をプローブなどのオリゴヌクレオチドにリンクさせる又は組み込む方法の例は、ＲＰ Ｈａｕｇｌａｎｄ、「Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ」、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．社、Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇ．（１９９２年６月））で見ることができる。蛍光染料及び標識キットは、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．社（Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇ．）、及びＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．社（Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓ．）から市販されている。
当業者が理解するように、フルオロフォアは、フルオロフォアにある１つの反応性部分と分子の残部にある１つの反応性部分の２つの反応性部分の反応を経由して分子に付着され得る。例えば、多くの市販フルオロフォアは、反応性官能基、例えばカルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、又はスクシンイミジル、ペンタフルオロフェニル若しくはテトラフルオロフェニルエステルなどのエステルで入手可能である。フルオロフォアは、分子の残部上の官能基と反応する反応性基を含むように選択され得る。例えば、フルオロフォアイソチオシアネート又はフルオロフォアスクシンイミジルエステルは、アミン基と反応することができる。本明細書に開示される分子を記載するときに使用される用語「フルオロフォア」は、蛍光部分自体と、蛍光部分を分子の残部に連結させる働きをする任意のリンキング原子を両方含むことが理解される。
一部の実施形態では、フルオロフォアは、
Figure 2022543618000010
Figure 2022543618000011
Figure 2022543618000012
から選択される。
本明細書に記載される化合物について、基及びその置換基は、選択及び置換によって、例えば転位、環化、脱離などによる変化を自発的には受けない安定な化合物が生じるように、原子及び置換基の許容原子価に従って選択され得る。
化合物は、不斉又はキラル中心が存在する立体異性体として存在することができる。立体異性体は、キラル炭素原子の周りの置換基の立体配置に応じて「Ｒ」又は「Ｓ」である。本明細書で用語「Ｒ」及び「Ｓ」は、ＩＵＰＡＣ １９７４ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｅ， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｉｎ Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ． Ｃｈｅｍ．、１９７６、４５：１３－３０に定義される立体配置である。本開示は、様々な立体異性体及びそれらの混合物を考慮し、これらは、本発明の範囲内に具体的に含まれる。立体異性体は、エナンチオマー及びジアステレオマー及びエナンチオマー又はジアステレオマーの混合物を含む。化合物の個々の立体異性体は、不斉又はキラル中心を含む市販の出発物質から合成することによって、又はラセミ混合物の調製後、当業者に周知の分割方法を行うことによって調製され得る。これらの分割方法は、（１）Ｆｕｒｎｉｓｓ、Ｈａｎｎａｆｏｒｄ、Ｓｍｉｔｈ、及びＴａｔｃｈｅｌｌ、「Ｖｏｇｅｌ’ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第５版（１９８９）、Ｌｏｎｇｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ社、Ｅｓｓｅｘ ＣＭ２０ ２ＪＥ， Ｅｎｇｌａｎｄに記載されているように、エナンチオマーの混合物のキラル補助物への付着、得られたジアステレオマー混合物の再結晶若しくはクロマトグラフィーによる分離、及び補助物からの光学純粋な生成物の任意選択な遊離、又は（２）光学エナンチオマーの混合物のキラルクロマトグラフ用カラムによる直接分離、又は（３）分別再結晶方法によって例示される。
化合物は互変異性形及び幾何異性体を有することができ、これらはまた本発明の態様を構成することを理解すべきである。
本開示は、１個以上の原子が自然界に通常見られる原子質量又は質量数と異なる原子質量又は質量数を有する原子によって置き換えられていること以外は、式（Ｉ）で記載されているものと同一である同位体標識化合物も含む。本発明の化合物に含まれるのに適している同位体の例は、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、及び塩素、例えばそれぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、及び３６Ｃｌであるが、これらに限定されない。より重い同位体、例えば重水素、すなわち２Ｈによる置換は、代謝安定性の向上、例えばインビボ半減期の増大から生じるいくつかの利点をもたらすことができ、したがって一部の状況では好ましいことがある。化合物は、医用画像処理及びポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）研究のためにポジトロン放出同位体を組み入れ、受容体の分布を決定することができる。式（Ｉ）の化合物に組み入れることができる好適なポジトロン放出同位体は、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、及び１８Ｆである。式（Ｉ）の同位体標識化合物は、一般に、当業者に公知の従来の技法又は非同位体標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を使用する添付の実施例に記載されているものと類似している方法によって調製され得る。
本明細書に開示される化合物は、塩の形をとることができる。塩は、化合物の最終の単離及び精製時に、又は別々に、例えば化合物の塩基性基（例えば、アミノ基）を好適な酸と反応させることによって、若しくは化合物の酸性基（例えば、カルボン酸基）を好適な塩基と反応させることによって調製され得る。
酸塩は、化合物の最終の単離及び精製時に、又は別々に、化合物の好適な基、例えばアミノ基を好適な酸と反応させることによって調製され得る。例えば、化合物は、メタノールや水などこれらに限定されないが好適な溶媒に溶解され、少なくとも１当量の酸、例えば塩酸で処理され得る。得られた塩は沈殿し、減圧下における濾過及び乾燥によって単離され得る。あるいは、溶媒及び過剰の酸を減圧下で除去して、塩を得ることができる。代表的な塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ギ酸塩、イセチオン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフチレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、グルタミン酸塩、パラ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などが挙げられる。化合物のアミノ基は、またメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ラウリル、ｍスチル、ステアリルなどのアルキルクロリド、ブロミド及びヨージドで四級化され得る。
塩基性付加塩は、開示された化合物の最終の単離及び精製時に、カルボキシル基と好適な塩基、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、若しくはアルミニウムなどの金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、又は炭酸水素塩、又は有機第一級、第二級、若しくは第三級アミンの反応により調製され得る。第四級アミン塩、例えばメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ－ジベンジルフェネチルアミン、１－エフェナミン及びＮ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジンなどに由来するものが調製され得る。
式（Ｉ）の化合物は、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、１９９８， ６３（１６）， ５６３６－５６３９によって記載されている化合物カルボキシプロピルスルホプロピル－アクリジニウム（ＣＰＳＰ－アクリジニウム、９－［Ｎ－トシル－Ｎ－（３－カルボキシプロピル）］－１０－（３－スルホプロピル）アクリジニウムカルボキサミド）を出発物とするスキーム１に例示されるものを含めて様々な方法によって合成され得る。
Figure 2022543618000013
当業者は、スキーム１が特定の置換基（例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｘ、及びＹ基）を有するいくつかの化合物の合成を例示するが、対応する位置に他の基を有する化合物が同様にして調製され得ることを理解する。
合成経路の反応条件、試薬及び順序の適切な操作、反応条件と適合性があるはずがない任意の化学官能性の保護、並びに方法の反応順序で好適な点における脱保護を含めて、ルーチンの実験法は、本開示の範囲に含まれる。好適な保護基及びそのような好適な保護基を使用して異なる置換基を保護及び脱保護する方法は、当業者に周知である。それらの例は、ＰＧＭ Ｗｕｔｓ及びＴＷ Ｇｒｅｅｎｅ、Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ ｂｏｏｋ ｔｉｔｌｅｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （第４版）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社、ＮＹ（２００６）に見ることができ、これは、全体として参照により本明細書に組み込まれる。本開示の化合物の合成は、本明細書に記載される合成スキーム及び具体例に記載されているものと類似している方法によって実施され得る。
開示された化合物の光学活性形が必要とされるとき、（例えば、好適な反応ステップの不斉誘導によって調製された）光学活性出発物質を使用する本明細書に記載される手順の１つを実施することによって、又は標準手順（クロマトグラフ分離、再結晶又は酵素分割など）を使用する化合物若しくは中間体の立体異性体の混合物の分割によって得ることができる。
同様に、化合物の純粋な幾何異性体が必要とされるとき、純粋な幾何異性体を出発物質として使用する上記の手順の１つを実施することによって、又はクロマトグラフ分離などの標準手順を使用する化合物若しくは中間体の幾何異性体の混合物の分割によって得ることができる。
記載されている合成スキーム及び具体例は例示であり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲に定義されると理解され得る。合成法及び具体例のすべての代替、修正、及び均等形態は、特許請求の範囲に含まれる。
コンジュゲート
式（ＩＩ）のコンジュゲート
Figure 2022543618000014
 ［式中、Ｘは、－ＮＨ－又はジアミンリンカーであり、Ｙは、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は、－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在せず、Ｑは、－ＳＯ２－又は－ＣＯ－であり、Ｌ１は、アルキレン及びヘテロアルキレンから選択され、Ｌ３はリンカーであり、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから独立に選択され、結合メンバーは、標的分析対象物質に結合することが可能な分子であり、それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキレン、及びヘテロアルキレンは、１、２、３、４、又は５個の置換基で独立に任意選択的に置換されている。］も本明細書で開示される。
Ｘ、Ｙ、Ｒ１、Ａ、Ｌ１、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ基、及びフルオロフォアは、式（Ｉ）について以上に記載されているものと同一である。式（Ｉ）の化合物について以上に記載されている任意の基又は基の組合せは、式（ＩＩ）の化合物にも含まれ得る。
式（ＩＩ）の化合物では、Ｌ３はリンカーである。多種多様なリンカーは、式（ＩＩ）の化合物において使用され得る。一部の実施形態では、リンカーは共有結合とすることができる。一部の実施形態では、リンカーは、Ｃ１～Ｃ４０アルキレンリンカーなどのアルキレンリンカー、例えばＣ１～Ｃ３０、Ｃ１～Ｃ２０、Ｃ１～Ｃ１２、Ｃ１～Ｃ１０、Ｃ１～Ｃ８、Ｃ１～Ｃ６、又はＣ１～Ｃ４アルキレンリンカーとすることができる。例えば、リンカーは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ３１、Ｃ３２、Ｃ３３、Ｃ３４、Ｃ３５、Ｃ３６、Ｃ３７、Ｃ３８、Ｃ３９、又はＣ４０アルキレンリンカーとすることができる。
一部の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコールリンカーなどヘテロアルキレンリンカーとすることができる。そのようなリンカーは、式－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ１－ＣＨ２ＣＨ２－を有することができ、式中、ｎ１は１～２０の整数である。例えば、一部の実施形態では、ｎ１は、１～２０、１～１８、１～１６、１～１４、１～１２、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、又は１～４の整数である。一部の実施形態では、ｎ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０である。
一部の実施形態では、リンカーは、Ｅ部分を含むことができ、ここで、Ｅは、２つの反応性基間の反応の生成物である。例えば、Ｅ基は、アミド、エステル、カルバメート、トリアゾール、スルホンアミド、ホスホルアミド、ホスフェート、又はスルフェートとすることができる。
結合メンバーは、本明細書に記載されている方法において目的の分析対象物質を検出するために使用できる分子である。「結合メンバー」、「特異的結合パートナー」、及び「特異的結合メンバー」という用語は、本明細書で互換的に使用され、他の分子の実質的に少ない認識と比較して、他の分子を特異的に認識する２つ以上の異なる分子の１つを指す。「特異的に結合する」又は「結合特異性」とは、結合メンバーが、試料の分析対象物質分子と他の成分又は汚染物質を区別するのに十分な特異性を有する分析対象物質分子を結合することを意味する。当業者によって理解されているように、適切な特異的結合メンバーは、分析される分析対象物質によって決定される。
多種多様な標的分子のための結合メンバーが公知であり、又は公知の技法を使用して容易に見出す若しくは開発することができる。例えば、標的分析対象物質がタンパク質であるとき、結合メンバーとしては、タンパク質、特に抗体又はそれらの断片（例えば、抗原結合性断片（Ｆａｂ）、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片）、組換え抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、例えばラクダ科の動物に由来する可変重鎖ドメイン（「ＶＨＨ」；「ＶＨＨ断片」とも呼ばれる）（ＶＨＨ及びそれらを作製する方法については、Ｇｏｔｔｌｉｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、１４：７７－８５（２００９）に記載されている）、組換えＶＨＨ単一ドメイン抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（「ｓｄＦｖ」）、抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体、及び上記のいずれかの機能的に活性なエピトープ結合断片、全長ポリクローナル又はモノクローナル抗体、抗体様断片など、他のタンパク質、例えば受容体タンパク質、タンパク質Ａ、又はタンパク質Ｃを挙げることができる。分析対象物質がステロイド、ビリン、レチノイド、又は脂質などの低分子である実施形態では、第１及び／又は第２の結合メンバーは、足場タンパク質（例えば、リポカリン）又は受容体とすることができる。場合によって、タンパク質分析対象物質のための結合メンバーは、ペプチドとすることができる。例えば、標的分析対象物質が酵素であるとき、好適な結合メンバーとしては、ペプチド、低分子などとすることができる酵素基質及び／又は酵素阻害薬を挙げることができる。場合によって、標的分析対象物質がリン酸化種であるとき、結合メンバーはホスフェート結合剤を含むことができる。例えば、ホスフェート結合剤は、金属イオン親和性媒体を含むことができる（例えば、米国特許第７，０７０，９２１号及び米国特許出願公開第２００６／０１２１５４４号を参照のこと）。他の実施形態では、結合メンバーは、ビタミン、栄養素、栄養素代謝産物、核酸、炭水化物、デンドリマー、樹枝状構造、糖タンパク質、抗原、受容体、酵素、医薬品（例えば、抗生物質）又は乱用薬物であり得る。
ある特定の場合では、特異的結合メンバーは、アプタマー、例えば米国特許第５，２７０，１６３号；同第５，４７５，０９６号；同第５，５６７，５８８号；同第５，５９５，８７７号；同第５，６３７，４５９号；同第５，６８３，８６７号；及び同第５，７０５，３３７号に記載されているものとすることができる。本明細書で使用される場合、用語「アプタマー」は、とりわけ高い親和性及び特異性を有する低分子、タンパク質、及びペプチドを含めて、前選択された標的に結合することができる核酸又はペプチド分子を指す。核酸アプタマー（例えば、一本鎖ＤＮＡ分子又は一本鎖ＲＮＡ分子）は、任意の標的分子を実質的に捕捉するために開発され得る。アプタマーは、より低い結合親和性のアプタマーも選択され得るが、典型的には非常に高い親和性で標的分子を高特異的、立体構造依存的に結合する。アプタマーは、標的分析対象物質分子を非常にわずかな構造的差異、例えばメチル又はヒドロキシル基の有無に基づいて識別することができ、ある特定のアプタマーは、Ｄ－とＬ－のエナンチオマー及びジアステレオマーを識別することができる。アプタマーは、薬物、金属イオン、及び有機染料、ペプチド、ビオチン、並びにタンパク質を含めて低分子標的を結合することができる。アプタマーは、ビオチン化、フルオレセイン標識後、並びにガラス表面及びミクロスフェアに付着しているとき機能活性を保持することができる。
核酸アプタマーは、オリゴヌクレオチドであり、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、又は修飾オリゴデオキシヌクレオチド若しくはオリゴリボヌクレオチドとすることができる。「修飾」オリゴデオキシヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチドは、共有結合で修飾された塩基及び／又は糖を有するヌクレオチドを指す。例えば、修飾ヌクレオチドとしては、糖が３’位のヒドロキシル基以外及び５’位のホスフェート基以外の低分子量有機基に共有結合しているヌクレオチドが挙げられる。こうした修飾ヌクレオチドとしては、２’置換糖、例えば２’－Ｏ－メチル；２－Ｏ－アルキル；２－Ｏ－アリル；２’－Ｓ－アルキル；２’－Ｓ－アリル；２’－フルオロ－；２’－ハロ又は２－アジド－リボース、炭素環式糖類似体、アノマー糖；エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース又はリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、及びセドヘプツロースも挙げることができる。
ペプチドアプタマーは、タンパク質相互作用に干渉するように設計され得る。ペプチドアプタマーは、可変ペプチドループが付着され、それによってアプタマーの立体構造を制約するタンパク質足場をベースにすることができる。場合によって、ペプチドアプタマーの足場部分は、細菌チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）に由来する。
分析対象物質が炭水化物であるとき、好適な結合メンバーとしては、例えば抗体、レクチン、及びセレクチンが挙げられる。当業者によって理解されているように、目的の分析対象物質と特異的に結合することができる分子であればいずれも、結合メンバーとして潜在的に使用することができる。
一部の実施形態では、コンジュゲートは、色素構築体に対する担体部分としての役割を果たし得る追加の特異的結合メンバーを含む。追加の特異的結合メンバーは、上記の特異的結合メンバーのいずれかに共有結合で連結し得る、又は化合物、例えば、リソソーム、ヒドロゲル、若しくは空洞内に挿入された色素を有するデンドリマーに非共有結合で連結し得る。
ある実施形態では、好適な分析対象物質／結合メンバー複合体は、抗体／抗原、抗原／抗体、受容体／リガンド、リガンド／受容体、タンパク質／核酸、酵素／基質及び／又は阻害剤、炭水化物（糖タンパク質及び糖脂質を含む）／レクチン及び／又はセレクチン、タンパク質／タンパク質、タンパク質／小分子などを含み得るが、それらに限定されない。
方法
本開示は、本明細書に記載されているコンジュゲートを使用して、生体試料中の１つ以上の目的の分析対象物質を検出する方法を提供する。
目的の分析対象物質
「分析対象物質」、「標的分析対象物質」、及び「目的の分析対象物質」という用語は互換的に使用され、本明細書で開示されている方法で測定される分析対象物質を指す。当業者によって理解されているように、結合メンバー（例えば、第１の特異的結合メンバー、及び第２の特異的結合メンバー）によって特異的に結合され得る任意の分析対象物質は、本開示の方法を使用して検出され、任意選択的に定量され得る。
一部の実施形態では、分析対象物質は生体分子とすることができる。生体分子の非限定的な例としては、タンパク質、脂質、及び炭水化物などの高分子が挙げられる。ある特定の場合では、分析対象物質としては、ホルモン、抗体、増殖因子、サイトカイン、酵素、受容体（例えば、神経、ホルモン、栄養物、及び細胞表面受容体）又はそれらのリガンド、がんマーカー（例えば、ＰＳＡ、ＴＮＦ－アルファ）、心筋梗塞のマーカー（例えば、トロポニン、及びクレアチンキナーゼ）、毒素、薬物（例えば、嗜癖薬物）、及び代謝作用剤（例えば、ビタミン）が挙げられる。タンパク質分析対象物質の非限定的な実施形態は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質断片、タンパク質複合体、融合タンパク質、組換えタンパク質、リンタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質などを含む。
ある特定の実施形態では、分析対象物質は、翻訳後修飾タンパク質（例えば、リン酸化、メチル化、グリコシル化タンパク質）とすることができ、（上記）対応する結合メンバーは、翻訳後修飾に特異的な抗体とすることができる。修飾タンパク質は、固体支持体に固定化された第１の結合メンバーに結合され得る。その第１の結合メンバーは、修飾タンパク質に結合するが、未修飾タンパク質に結合しない。他の実施形態では、第１の結合メンバーは、未修飾及び修飾タンパク質の両方に結合し得、第２の結合メンバーは、翻訳後修飾タンパク質に特異的であり得る。
一部の実施形態では、分析対象物質は、例えば、循環腫瘍細胞、病原性細菌細胞、又は真菌細胞などの細胞とすることができる。他の実施形態では、分析対象物質は、ウイルス（例えば、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、フィロウイルス（Ｅｂｏｌａ）、肝炎ウイルス（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ）、又はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））とすることができる。
本開示に従って分析され得る分析対象物質の非限定的な一覧には、サイログロブリン、プロラクチン、Ａβ４２アミロイドベータ－タンパク質、フェチュイン－Ａ、タウ、セクレトグラニンＩＩ、プリオンタンパク質、アルファ－シヌクレイン、タウタンパク質、ニューロフィラメント軽鎖、パーキン、ＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１、ＤＪ－１、ロイシンリッチリピートキナーゼ２、変異型ＡＴＰ１３Ａ２、アポＨ、セルロプラスミン、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体ガンマコアクチベータ－１アルファ（ＰＧＣ－１α）、トランスチレチン、ビタミンＤ結合タンパク質、アポトーシス促進キナーゼＲ（ＰＫＲ）及びそのリン酸化ＰＫＲ（ｐＰＫＲ）、ＣＸＣＬ１３、ＩＬ－１２ｐ４０、ＣＸＣＬ１３、ＩＬ－８、Ｄｋｋ－３（精液）、ｐ１４エンドカン断片、血清、ＡＣＥ２、ＣＤ２５に対する自己抗体、ｈＴＥＲＴ、ＣＡＩ２５（ＭＵＣ １６）、ＶＥＧＦ、ｓＩＬ－２、オステオポンチン、ヒト精巣上体タンパク質４（ＨＥ４）、アルファ－フェトタンパク質（ＡＦＰ）、アルブミン、アルブミン尿、微量アルブミン尿、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、インターロイキン１８（ＩＬ－１８）、腎傷害分子－１（ＫＩＭ－１）、肝臓型脂肪酸結合タンパク質（Ｌ－ＦＡＢＰ）、ＬＭＰ１、ＢＡＲＦ１、ＩＬ－８、胎児性癌抗原（ＣＥＡ）、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＩ、ＥＧＲＦ、ＦＧＦ１９、ＦＲＳ２、ＧＲＥＢ１、ＬＺＴＳ１、アルファ－アミラーゼ、胎児性癌抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１２５、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、チオレドキシン、ベータ－２ミクログロブリン、腫瘍壊死因子－アルファ受容体、ＣＡ１５－３、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、Ｔ細胞リンパ腫浸潤転移１（ＴＩＡＭ１）、Ｎ－カドヘリン、ＥＣ３９、アンフィレギュリン、ｄＵＴＰアーゼ、分泌ゲルゾリン（ｐＧＳＮ）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、チモシンβｌ５、インスリン、血漿Ｃ－ペプチド、グリコシル化ヘモグロビン（ＨＢＡ１ｃ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＡＲＨＧＤＩＢ（Ｒｈｏ ＧＤＰ－解離阻害物質２）、ＣＦＬ１（コフィリン－１）、ＰＦＮ１（プロフィリン－１）、ＧＳＴＰ１（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼＰ）、Ｓ１００Ａ１１（タンパク質Ｓ１００－Ａ１１）、ＰＲＤＸ６（ペルオキシレドキシン－６）、ＨＳＰＥ１（１０ｋＤａ熱ショックタンパク質、ミトコンドリアｌ）、ＬＹＺ（リゾチームＣ前駆体）、ＧＰＩ（グルコース－６リン酸イソメラーゼ）、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＡＡ（ヒストンＨ２Ａタイプ２－Ａ）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）、ＨＳＰＧ２（基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質前駆体）、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ（ガレクチン－３－結合タンパク質前駆体）、ＣＴＳＤ（カテプシンＤ前駆体）、ＡＰＯＥ（アポリポタンパク質Ｅ前駆体）、ＩＱＧＡＰ１（Ｒａｓ ＧＴＰアーゼ活性化様タンパク質ＩＱＧＡＰ１）、ＣＰ（セルロプラスミン前駆体）、及びＩＧＬＣ２（ＩＧＬＣ１タンパク質）、ＰＣＤＧＦ／ＧＰ８８、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＭＵＣ４、ＩＧＦ－ＩＲ、ｐ２７（ｋｉｐ１）、Ａｋｔ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＨＩＰ、Ｇｒｂ２、Ｇａｂ２、ＰＤＫ－１（３－ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ－１）、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ｍＴＯＲ、ＭＩＧ－６（ＥＲＢＢ受容体フィードバック阻害物質１）、Ｓ６Ｋ、ｓｒｃ、ＫＲＡＳ、ＭＥＫマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１、ｃＭＹＣ、ＴＯＰＯ ＩＩトポイソメラーゼ（ＤＮＡ）ＩＩアルファ １７０ｋＤａ、ＦＲＡＰ１、ＮＲＧ１、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＰＧＲ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＮＥＤＤ４－１、Ｆオキソ３Ａ、ＰＰＰ１Ｒ１Ｂ、ＰＸＮ、ＥＬＡ２、ＣＴＮＮＢ１、ＡＲ、ＥＰＨＢ２、ＫＬＦ６、ＡＮＸＡ７、ＮＫＸ３－１、ＰＩＴＸ２、ＭＫＩ６７、ＰＨＬＰＰ、アディポネクチン（ＡＤＩＰＯＱ）、フィブリノゲンアルファ鎖（ＦＧＡ）、レプチン（ＬＥＰ）、終末糖化産物特異的受容体（ＡＧＥＲ又はＲＡＧＥ）、アルファ－２－ＨＳ－糖タンパク質（ＡＨＳＧ）、アンジオゲニン（ＡＮＧ）、ＣＤ１４分子（ＣＤ１４）、フェリチン（ＦＴＨ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インターロイキン２受容体、アルファ（ＩＬ２ＲＡ）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）及びＶｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＩＬ１α、ＴＮＦα、核周囲型抗好中球細胞質抗体（ｐ－ＡＮＣＡ）、ラクトフェリン、カルプロテクチン、ウィルムス腫瘍－１タンパク質、アクアポリン－１、ＭＬＬ３、ＡＭＢＰ、ＶＤＡＣ１、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）エンテロトキシン（易熱性エキソトキシン、耐熱性エンテロトキシン）、インフルエンザＨＡ抗原、破傷風毒素、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、志賀毒素、志賀毒素様毒素Ｉ、志賀毒素様毒素ＩＩ、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａ及びＢ、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨ－Ｌ１）、Ｓ１００Ｂ、ニューロフィラメント軽鎖ポリペプチド（ＮＦ－Ｌ）、タウ、ｐタウ、アミロイドベータ４０及び４２、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｎ末端（ＮＴ）－プロホルモンＢＮＰ（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）、ＣＡ１９－９、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ｓＦｌｔ－１、オピオイド、タクロリムス、ビタミンＫ欠乏によって誘発されるタンパク質－ＩＩ（ＰＩＶＫＡ－ＩＩ）などが含まれる。
分析対象物質の他の例としては、乱用薬物（例えば、コカイン）、タンパク質バイオマーカー（ヌクレオリン、核内因子－κＢ必須モジュレーター（ＮＥＭＯ）、ＣＤ－３０、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＭＵＣ１グリコフォーム、免疫グロブリンμ重鎖（ＩＧＨＭ）、免疫グロブリンＥ、αｖβ３インテグリン、α－トロンビン、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＮＦ－κＢ、Ｅ２Ｆ転写因子、ＨＥＲ３、プラスミノーゲンアクチベーター阻害物質、テネイシンＣ、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ－１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、及びＨＧＣ－２７を含むがこれらに限定されない）；細胞（非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん細胞、（ＤＬＤ－１）、Ｈ２３肺腺癌細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）細胞、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞（ＨＬ６０）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）細胞、ＮＣＩＨ６９、ヒト膠芽腫細胞、Ｕ１１８－ＭＧ、ＰＣ－３細胞、ＨＥＲ－２過剰発現ヒト乳がん細胞、ＳＫ－ＢＲ－３、膵がん細胞（Ｍｉａ－ＰａＣａ－２）を含むがこれらに限定されない）；並びに感染病原体（マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、シゲラ・ディゼンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラＯ８（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｏ８）、及びサルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）を含むがこれらに限定されない）が挙げられる。
試料
用語「試料」、「試験試料」、及び「生体試料」は、本明細書で同義に使用され、目的の分析対象物質を含む又は含むと疑われる流体試料を指す。場合によって、試料は、液体、流動性の粒子固体、又は固体粒子の流体懸濁液を含むことができる。ある特定の実施形態では、試料は、液体試料又は固体試料の液体抽出物とすることができる。場合によって、試料は、本明細書に記載される分析より前に処理され得る。例えば、試料は、分析より前にその供給源から分離され得る又は精製され得る。しかし、ある特定の実施形態では、分析対象物質を含む未処理試料は、直接アッセイされ得る。試料は、いずれか好適な供給源に由来し得る。例えば、試料供給源は、合成（例えば、実験室で生成）、環境（例えば、空気、土壌、流体試料、例えば、水供給物など）、動物（例えば、哺乳類）、植物、又はそれらの任意の組合せとすることができる。特定の例では、試料は、人体物質（例えば、体液、血液、血清、血漿、尿、唾液、汗、痰、精液、粘液、涙液、リンパ液、羊水、間質液、肺洗浄、脳脊髄液、糞便、組織、又は器官）である。組織としては、骨格筋組織、肝組織、肺組織、腎組織、心筋組織、脳組織、骨髄、頸部組織、皮膚などを挙げることができるが、これらに限定されない。ある特定の場合では、試料の供給源は、組織崩壊／細胞溶解によって可溶化され得る生検試料などの器官又は組織とすることができる。
場合によって、流体試料は、アッセイにおいて使用前に希釈され得る。例えば、分析対象物質分子の供給源がヒト体液（例えば、血液、血清）である実施形態では、流体は、適切な溶媒（例えば、ＰＢＳ緩衝剤などの緩衝剤）で希釈され得る。流体試料は、使用前に約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約１０倍、約１００倍、又はそれ以上希釈され得る。
場合によって、上記のように、試料は、分析前処理を受けることができる。分析前処理は、非特異的タンパク質除去及び／又は効果的ではあるが安価で実行可能な混合機能性などの追加の機能性をもたらすことができる。分析前処理の一般方法は、当技術分野において公知である動電トラッピング、ＡＣ動電、表面弾性波、等速度電気泳動、誘電泳動、電気泳動、又は他の予濃縮技法の使用を含むことができる。場合によって、流体試料は、アッセイにおける使用より前に濃縮され得る。例えば、試料がヒト体液（例えば、血液、血清）である実施形態では、流体は、沈殿、蒸発、濾過、遠心、又はそれらの組合せによって濃縮され得る。流体試料は、使用より前に約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約１０倍、約１００倍、又はそれ以上濃縮され得る。
固体支持体
ある実施形態では、式（ＩＩ）の１つ以上の化合物は、固体支持体上に固定化されている。「固相」又は「固体支持体」という用語は、本明細書で互換的に使用され、１つ以上の特異的結合メンバーを付着させる、引き付ける、及び／又は固定するために使用できる任意の材料を指す。例えば、特異的結合メンバーは、本明細書で開示されている式（ＩＩ）のコンジュゲートの一部であり得る。当業界で公知の任意の固体支持体を、本明細書に記載されている方法に使用でき、これは、ポリマー材料で作られている、平面基材又はビーズの形態の固体支持体を含むが、それらに限定されない。ある実施形態では、ビーズは、粒子、例えば、マイクロ粒子であり得る。用語「ビーズ」及び「粒子」は、本明細書で互換的に使用され、実質的に球状の固体支持体を指す。用語「マイクロ粒子」及び「マイクロビーズ」は、本明細書で互換的に使用され、例えば検出モジュールの一連のウェルなど一連のウェルに居る又は定着することを可能にするマイクロビーズ又はマイクロ粒子を指す。マイクロ粒子又はマイクロビーズは、目的の分析対象物質に結合する少なくとも１つの特異的結合メンバーを含有する式（ＩＩ）の少なくとも１つの化合物を含有し得る。２つ以上の目的の分析対象物質が検出されるとき、方法は、第１の分析対象物質に結合する第１及び第２の特異的結合メンバーを含有する式（ＩＩ）の２つ以上の異なる化合物を含有する１種のマイクロ粒子、並びに第２の分析対象物質に結合する第３及び第４の特異的結合メンバーを含有する第２のマイクロ粒子などを含み得る。
一部の実施形態では、マイクロ粒子は、約０．１ｎｍ～約１０ミクロン、約５０ｎｍ～約５ミクロン、約１００ｎｍ～約１ミクロン、約０．１ｎｍ～約７００ｎｍ、約５００ｎｍ～約１０ミクロン、約５００ｎｍ～約５ミクロン、約５００ｎｍ～約３ミクロン、約１００ｎｍ～７００ｎｍ、又は約５００ｎｍ～７００ｎｍとすることができる。例えば、マイクロ粒子は、約４～６ミクロン、約２～３ミクロン、又は約０．５～１．５ミクロンとすることができる。約５００ｎｍ未満の粒子は、「ナノ粒子」と呼ばれ得る。したがって、マイクロ粒子は、任意選択的に約０．１ｎｍ～約５００ｎｍ、約１０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５００ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍ、又は約５００ｎｍのナノ粒子とすることができる。
ある実施形態では、ビーズは、磁性ビーズ又は磁性粒子であり得る。磁性ビーズ／粒子は、強磁性、フェリ磁性、常磁性、超常磁性又は強磁性流体とすることができる。例示的な強磁性材料としては、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｇｄ、Ｄｙ、ＣｒＯ２、ＭｎＡｓ、ＭｎＢｉ、ＥｕＯ、ＮｉＯ／Ｆｅが挙げられる。フェリ磁性材料の例としては、ＮｉＦｅ２Ｏ４、ＣｏＦｅ２Ｏ４、Ｆｅ３Ｏ４（又はＦｅＯ．Ｆｅ２Ｏ３）が挙げられる。ビーズは、磁性の固体コア部分が１層以上の非磁性層によって取り囲まれていることがある。あるいは、磁性部分は、非磁性コア周囲の層であり得る。結合メンバー（例えば、式（ＩＩ）の化合物）が固定化されている固体支持体は、乾燥形態又は液体で保存され得る。磁性ビーズは、試料を結合メンバーが固定化されている磁性ビーズと接触させる前又は後に磁場にかけることができる。
固体支持体は、当業界で公知の任意の好適な方法を使用して一定量の試料と接触させることができる。本明細書で使用される場合、用語「接触させること」は、結合メンバーに特異的な目的の分析対象物質が試料中に存在する場合に結合相互作用が生じるように、固体支持体に固定化された結合メンバーを試料中の目的の分析対象物質の近傍に十分近づける任意のタイプの組み合わせ作用を指す。接触させることは、試料をマイクロ粒子と組み合わせること、又は分析対象物質のすぐ近くにマイクロ粒子を導入することによって標的分析対象物質を結合メンバーを含むマイクロ粒子に曝露することを含めて、様々な方式で達成され得る。接触させることは、必要に応じて何度繰り返してよい。
どのような方法が使用されても、固体支持体は、１つ以上の分析対象物質が試料中に存在する場合、固体支持体（例えば、マイクロ粒子）の表面に固定化された少なくとも１つの特異的結合メンバー（例えば、本明細書で開示されている式（ＩＩ）のコンジュゲートの一部）に結合することによる状態下で、一定量の試料と接触する。一実施形態では、固体支持体と試料量との間の接触は、特異的結合メンバーと分析対象物質との間の結合相互作用が発生することを可能にするのに十分な時間、維持される（すなわち、インキュベーションされる）。一実施形態では、試料量は、固体支持体で少なくとも３０秒及び１０分間以下インキュベーションされる。例えば、試料は、固体支持体と約１、２、３、４、５、６、７、８又は９分間インキュベーションされ得る。一実施形態では、試料は、マイクロ粒子と約２分間インキュベーションされ得る。さらに、インキュベートすることは、例えば、アルブミン（例えば、ＢＳＡ）、非イオン性洗浄剤（Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、及び／又はプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＰＭＳＦ）など、特異的結合相互作用を促進する結合緩衝剤中で行われ得る。特異的結合メンバーの結合親和性及び／又は特異性は、アッセイにおいて、結合緩衝剤を変えることによって操作され得る又は変更され得る。一部の実施形態では、結合親和性及び／又は特異性は、結合緩衝剤を変えることによって増加され得る又は低下され得る。例えば、温度及び塩濃度など結合相互作用の他の条件は、経験的に決定することができ、又は製造業者の指示書に基づくことができる。例えば、接触させることは、室温（２１℃～２８℃、例えば、２３℃～２５℃）、３７℃、又は４℃で実施され得る。
一実施形態では、固体支持体は、望ましくは、その表面に固定化された、目的の分析対象物質に結合する特異的結合メンバーを多数（例えば、２以上、５０以上、１００以上、１，０００以上、又は５，０００以上）含む。上で論じたような固体支持体と試料との間の十分なインキュベーション時間後、試料中に存在する１つ以上の目的の分析対象物質は、望ましくは、固体支持体の表面に固定化された特異的結合メンバーを介して、固体支持体の表面で捕捉される。本明細書で使用される場合、用語「固定化」は、結合メンバーと固体支持体の表面との安定な結合を指す。
上で論じたように、本明細書で開示されている方法は、２つ以上の異なる分析対象物質を検出するのに好適である。したがって、一部の実施形態では、方法は、第２、第３、第４又はそれ以降の固体支持体の表面で、第２、第３、第４又はそれ以降の目的の分析対象物質を捕捉するステップであって、（ｉ）第１、第２、第３、第４、及びそれ以降の分析対象物質のそれぞれは、互いに異なり、（ｉｉ）第２、第３、第４又はそれ以降の固体支持体は、第２、第３、第４、又はそれ以降の分析対象物質に結合するその表面に固定化された１つ以上の特異的結合メンバーを含む、ステップを含み得る。方法は、捕捉された第２、第３、第４、又はそれ以降の分析対象物質を、第２、第３、第４又はそれ以降のコンジュゲートと反応させるステップであって、第２、第３、第４又はそれ以降のコンジュゲートは、フルオロフォアで標識されており、第２、第３、第４、又はそれ以降の分析対象物質に結合する特異的結合メンバーを含み、それぞれのフルオロフォアが異なる、ステップをさらに含み得る。
ある特定の実施形態では、固体支持体は、検出時における偽陽性シグナル又はシグナルの消失を導くことがある、アッセイ時における非捕捉成分（例えば、分析対象物質分子、結合メンバー）の結合表面への非特異的付着を無くす又は最小限に抑えることができる保護、ブロッキング、又は不動態化層も含むことができる。ある実施形態で、不動態化層を形成するために利用され得る材料の例は、タンパク質の非特異的結合を阻むポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）；天然に存在するタンパク質（例えば、血清アルブミン及びカゼイン）；界面活性剤（例えば、両性イオン界面活性剤、スルホベタイン）；天然に存在する長鎖脂質；ポリマーブラシ、及び核酸、例えばサケ精子ＤＮＡを含むが、それらに限定されない。
特定の実施形態では、特異的結合メンバー（例えば、特異的結合メンバーを含有する式（ＩＩ）の化合物）は、任意の部分を含み得る連結、官能基化、又は結合メンバーの支持体への付着を促す支持体及び／若しくは結合メンバーの修飾を介して固体支持体に付着し得る。結合メンバーと支持体とのリンケージは、１つ以上の化学的若しくは物理的（例えば、ファンデルワールス力、水素結合、静電的相互作用、疎水性／親水性相互作用などを介した非特異的付着）結合及び／又はそのような結合をもたらす化学的スペーサーを含むことができる。ある特定の実施形態は、タンパク質又はポリペプチドである結合メンバーを利用し、多数の技法を使用して、ポリペプチドを多種多様な固体支持体に付着させることができる（例えば、米国特許第５，６２０，８５０号；及びＨｅｌｌｅｒ、Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．、２３：１２８（１９９０）を参照のこと）。
一部の実施形態では、分析対象物質分子と結合メンバーとの結合親和性は、非特異的に結合している分子又は粒子を除去する洗浄ステップを含めてアッセイの条件下で結合された状態のままであるのに十分な程度であるべきである。場合によって、例えばある特定の生体分子の検出において、分析対象物質分子のその相補的結合メンバーへの結合定数は、少なくとも約１０４～約１０６Ｍ－１、少なくとも約１０５～約１０９Ｍ－１、少なくとも約１０７～約１０９Ｍ－１、約１０９Ｍ－１超、又はそれ以上とすることができる。
多重化
一部の実施形態では、方法は、試料中の分析対象物質の存在及び／又は濃度の判定に関与する。この点において、方法は、生体試料を少なくとも１つの第１の特異的結合メンバー及び少なくとも１つの第２の特異的結合メンバーと接触させるステップであって、少なくとも１つの第１の特異的結合メンバー及び少なくとも１つの第２の特異的結合メンバーがそれぞれ、目的の分析対象物質に特異的に結合し、それにより第１の特異的結合メンバー－分析対象物質－第２の特異的結合メンバーを含む１つ以上の第１の複合体を生成し、第２の特異的結合メンバーが、上記のコンジュゲートのいずれか１つを含む、ステップを含み得る。そのような実施形態では、方法は、第２の特異的結合メンバーからのシグナルの有無を検出するステップであって、シグナルの検出は、分析対象物質が試料中に存在することを示し、シグナルがないことは、分析対象物質が試料中に存在しないことを示すステップをさらに含む。これらの実施形態のそれぞれでは、特異的結合メンバーは、式（ＩＩ）の化合物の一部であり得る。
ある実施形態では、方法は、試料中に存在する複数の異なる分析対象物質の存在及び／又は濃度の判定（すなわち、多重化）にも使用され得る。この点において、開示されている方法は、試料中の２つ以上（例えば、２、３、４、５又はそれ超）の標的分析対象物質を検出する、２つ以上の特異的結合メンバー及び固体支持体（例えば、２、３、４、５又はそれ超）を含み得、これは、本明細書で「多重化イムノアッセイ」又は「多重化アッセイ」といわれる。特異的結合メンバーのそれぞれは、異なる分析対象物質に結合し、それぞれの特異的結合メンバー及び／又は固体支持体（例えば、マイクロ粒子）は、様々な検出可能な標識を含み得る。
一部の実施形態では、本開示は、生体試料中の２つ以上の目的の分析対象物質を検出する方法であって、（ａ）生体試料を、（ｉ）第１の目的の分析対象物質に結合して、少なくとも１つの第１の複合体を形成する少なくとも１つの第１の特異的結合メンバー；及び（ｉｉ）第２の目的の分析対象物質に結合して、少なくとも１つの第２の複合体を形成する少なくとも１つの第２の特異的結合メンバーと同時に、又は連続して接触させるステップであって、第１及び第２の特異的結合メンバーのそれぞれが、上記のコンジュゲートのいずれか１つを含み、第１及び第２の特異的結合メンバーのそれぞれにおけるコンジュゲートのフルオロフォアが異なる、ステップ、並びに（ｂ）第１及び第２の特異的結合メンバーのそれぞれからのシグナルの有無を検出するステップであって、（ｉ）第１の特異的結合メンバーからのシグナルの検出は、第１の分析対象物質が試料中に存在することを示し、第１の特異的結合メンバーからのシグナルがないことは、第１の分析対象物質が試料中に存在しないことを示し、（ｉｉ）第２の特異的結合メンバーからのシグナルの検出は、第２の分析対象物質が試料中に存在することを示し、第２の特異的結合メンバーからのシグナルがないことは、第２の分析対象物質が試料中に存在しないことを示す、ステップを含む方法を提供する。
他の実施形態では、本開示は、生体試料中の２つ以上の目的の分析対象物質を検出する方法であって、（ａ）生体試料を少なくとも１つの第１の特異的結合メンバー及び少なくとも１つの第２の特異的結合メンバーと接触させるステップであって、少なくとも１つの第１の特異的結合メンバー及び少なくとも１つの第２の特異的結合メンバーのそれぞれが、第１の目的の分析対象物質に特異的に結合し、それにより第１の特異的結合メンバー－第１の分析対象物質－第２の特異的結合メンバーを含む１つ以上の第１の複合体を生成し、第２の特異的結合メンバーが、上記のコンジュゲートのいずれか１つを含む、ステップ、並びに（ｂ）生体試料を、少なくとも１つの第３の特異的結合メンバー及び少なくとも１つの第４の特異的結合メンバーと同時に、又は連続して接触させるステップであって、少なくとも１つの第３の特異的結合メンバー及び少なくとも１つの第４の特異的結合メンバーがそれぞれ、第２の目的の分析対象物質に特異的に結合し、それにより、第３の特異的結合メンバー－第２の分析対象物質－第４の特異的結合メンバーを含む１つ以上の第２の複合体を生成し、第４の特異的結合メンバーが、上記のコンジュゲートのいずれか１つを含み、第２及び第４の特異的結合メンバーのそれぞれにおけるコンジュゲート中のフルオロフォアが異なる、ステップ、並びに（ｃ）第２及び第４の特異的結合メンバーのそれぞれからのシグナルの有無を検出するステップであって、（ｉ）第２の特異的結合メンバーからのシグナルの検出は、第１の分析対象物質が試料中に存在することを示し、第２の特異的結合メンバーからのシグナルがないことは、第１の分析対象物質が試料中に存在しないことを示し、（ｉｉ）第４の特異的結合メンバーからのシグナルの検出は、第２の分析対象物質が試料中に存在することを示し、第４の特異的結合メンバーからのシグナルがないことは、第２の分析対象物質が試料中に存在しないことを示す、ステップを含む方法を提供する。
ある実施形態では、本明細書に記載されている方法は、目的の２つ超の分析対象物質を検出するために使用され得る。例えば、生体試料が３つの目的の分析対象物質を含むとき、方法は、生体試料を、少なくとも１つの第５の特異的結合メンバー及び少なくとも１つの第６の特異的結合メンバーと同時に、又は連続して接触させるステップであって、少なくとも１つの第５の特異的結合メンバー及び少なくとも１つの第６の特異的結合メンバーがそれぞれ、第３の目的の分析対象物質に特異的に結合し、それにより、第５の特異的結合メンバー－第３の分析対象物質－第６の特異的結合メンバーを含む１つ以上の第３の複合体を生成し、第６の特異的結合メンバーが、上記のコンジュゲートのいずれか１つを含み、第２、第４及び第６の特異的結合メンバーのそれぞれにおけるコンジュゲートのフルオロフォアが異なる、ステップ、並びに第２、第４及び第６の特異的結合メンバーのそれぞれからのシグナルの有無を検出するステップであって、（ｉ）第２の特異的結合メンバーからのシグナルの検出は、第１の分析対象物質が試料中に存在することを示し、第２の特異的結合メンバーからのシグナルがないことは、第１の分析対象物質が試料中に存在しないことを示し、（ｉｉ）第４の特異的結合メンバーからのシグナルの検出は、第２の分析対象物質が試料中に存在することを示し、第４の特異的結合メンバーからのシグナルがないことは、第２の分析対象物質が試料中に存在しないことを示す、（ｉｉｉ）第６の特異的結合メンバーからのシグナルの検出は、第３の分析対象物質が試料中に存在することを示し、第６の特異的結合メンバーからのシグナルがないことは、第３の分析対象物質が試料中に存在しないことを示す、ステップをさらに含み得る。
１つ以上の捕捉される分析対象物質と、本明細書に記載されているコンジュゲートの反応後、任意の特異的結合メンバー（例えば、抗体又は抗体断片）、又は捕捉される分析対象物質に結合していないコンジュゲートの成分は除去してよく、任意選択の洗浄ステップが続く。任意の結合していない抗体、抗体断片、又はコンジュゲートの成分は、任意の好適な手段、例えば、小滴アクチュエーション、電気泳動、エレクトロウェッティング、誘電泳動、静電アクチュエーション、電場媒介、電極媒介、毛管力、クロマトグラフィー、遠心分離、吸引、又は表面弾性波（ＳＡＷ）に基づく洗浄方法により複合体から分離され得る。
異なる立体配座の分析対象物質の捕捉、及び上記の複合体形成方法は、本開示の範囲内であることが認識される。実際に、上記の様々な固体支持体の部品、特異的結合メンバー、コンジュゲート、及びフルオロフォアは、任意の好適な組合せ、立体配座、又はフォーマットで配置又は利用され得る。例えば、開示されている方法は、１ステップ、ディレイ１ステップ、又は２ステップフォーマットで行われ得る。アッセイ試薬（例えば、マイクロ粒子、コンジュゲート、フルオロフォア）は、予混合又は必要に応じて連続して添加してよい。
分析対象物質の検出及び定量
試料中に存在する目的の分析対象物質の存在又は量は、当業界で公知の任意の好適な方法を使用して判定され（例えば、定量され）得る。そのような方法は、イムノアッセイを含むが、それらに限定されない。任意の好適なイムノアッセイ、例えば、サンドイッチイムノアッセイ（例えば、モノクローナル－ポリクローナルサンドイッチイムノアッセイ）、競合阻害イムノアッセイ（例えば、フォワード及びリバース）、化学発光イムノアッセイ、競合結合アッセイ、不均一アッセイ、及びキャプチャーオンザフライアッセイ（ｃａｐｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｆｌｙ ａｓｓａｙ）が利用され得る。開示されている方法に使用され得るイムノアッセイ成分及び技術は、例えば、国際特許出願公開第２０１６／１６１４０２号及び第２０１６／１６１４００号にさらに記載されている。方法は、単一分子計数に関与し得る。一態様では、使用されるアッセイは、臨床化学フォーマットにおけるものである。
本明細書で論じられているように、開示されている化合物は、硬質なジアミンリンカーを介して連結するアクリジニウム部分及びフルオロフォアを含む。したがって、アクリジニウム部分の化学発光誘発時に、光出力は、付着しているフルオロフォアの発光波長にシフトされ得る。均一化学発光アッセイにおける検出可能な標識としてのアクリジニウム化合物の使用は、例えば、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １６：１３２４－１３２８（２００６）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ４：２３１３－２３１７（２００４）；Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １４：３９１７－３９２１（２００４）；及びＡｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ． ５：３７７９－３７８２（２００３））に記載されている。一実施形態では、アクリジニウム部分の化学発光誘発は、検出ステップより前に、過酸化水素を生体試料に添加するものである。過酸化水素は、上記コンジュゲートを含む特異的結合メンバーの添加の前に、それと同時に、又はその後に、生体試料に提供され得る又は供給され得る。過酸化水素の供給源は、過酸化水素を含むことが公知である１つ以上の緩衝剤又は他の溶液とすることができる。この点に関して、過酸化水素の溶液を生体試料に添加するだけでよい。
他の実施形態では、第１、第２、第３、第４、第５又はそれ以降の特異的結合メンバーのそれぞれにおけるコンジュゲートのフルオロフォアは異なる。当業界で公知の、また本明細書に記載されている任意の好適なフルオロフォアは、開示されている化合物に付着し得る。それぞれの特異的結合メンバーからの蛍光シグナルは、光電子増倍管、フォトダイオードアレイ、又は電荷結合デバイスカメラを含むが、それらに限定されない当業界で公知の任意の好適なデバイスを使用して、視覚化及び識別され得る。一部の実施形態では、これらのデバイスに、１波長ごとに区別することができるフィルターを装着することができる。
一部の実施形態では、実質的に正確に決定され得る試料中の分析対象物質の濃度は、約５０００ｆＭ未満（フェムトモル濃度）、約３０００ｆＭ未満、約２０００ｆＭ未満、約１０００ｆＭ未満、約５００ｆＭ未満、約３００ｆＭ未満、約２００ｆＭ未満、約１００ｆＭ未満、約５０ｆＭ未満、約２５ｆＭ未満、約１０ｆＭ未満、約５ｆＭ未満、約２ｆＭ未満、約１ｆＭ未満、約５００ａＭ未満（アトモル濃度）、約１００ａＭ未満、約１０ａＭ未満、約５ａＭ未満、約１ａＭ未満、約０．１ａＭ未満、約５００ｚＭ未満（ゼプトモル濃度）、約１００ｚＭ未満、約１０ｚＭ未満、約５ｚＭ未満、約１ｚＭ未満、約０．１ｚＭ未満、又はそれ以下である。例えば、実質的に正確に決定され得る試料中の分析対象物質の濃度は、約５０００ｆＭ～約０．１ｆＭの間、約３０００ｆＭ～約０．１ｆＭの間、約１０００ｆＭ～約０．１ｆＭの間、約１０００ｆＭ～約０．１ｚＭの間、約１００ｆＭ～約１ｚＭの間、約１００ａＭ～約０．１ｚＭの間、又は上記の値のうちの２つのいずれかによって定義される範囲である。
一部の実施形態では、下方の検出限界（例えば、溶液状態で決定され得る分析対象物質の最低濃度）は、約１００ｆＭ、約５０ｆＭ、約２５ｆＭ、約１０ｆＭ、約５ｆＭ、約２ｆＭ、約１ｆＭ、約５００ａＭ（アトモル濃度）、約１００ａＭ、約５０ａＭ、約１０ａＭ、約５ａＭ、約１ａＭ、約０．１ａＭ、約５００ｚＭ（ゼプトモル濃度）、約１００ｚＭ、約５０ｚＭ、約１０ｚＭ、約５ｚＭ、約１ｚＭ、約０．１ｚＭ以下である。
上方の検出限界（例えば、溶液状態で決定され得る分析対象物質の上方濃度）は、少なくとも約１００ｆＭ、少なくとも約１０００ｆＭ、少なくとも約１０ｐＭ（ピコモル濃度）、少なくとも約１００ｐＭ、少なくとも約１００ｐＭ、少なくとも約１０ｎＭ（ナノモル濃度）、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約１０００ｎＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約１０００μＭ、少なくとも約１０ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約１０００ｍＭ、又はそれ以上とすることができる。
場合によって、試料中の分析対象物質の存在及び／又は濃度は、通常約１時間未満、例えば４５分、３０分、１５分、１０分、５分、１分、又は３０秒で迅速に検出され得る。
開示されている方法は、品質管理構成要素を含み得る。「品質管理構成要素」は、本明細書に記載されているイムノアッセイ及びキットに関して、キャリブレーター、対照、及び感受性パネルを含むが、それらに限定されない。「キャリブレーター」又は「標準」は、分析対象物質、例えば抗体の濃度を内挿するための較正（標準）曲線を確立するために使用できる（例えば、１つ以上、例として複数）。あるいは、基準レベル又は対照レベルに近い（例えば、「低」、「中」、又は「高」レベル）である単一のキャリブレーターを使用できる。複数のキャリブレーター（すなわち、１つ超のキャリブレーター又は変動量のキャリブレーター（複数可））を「感受性パネル」を含むように併用できる。キャリブレーターは、任意選択的に、例えば、濃度又は検出方法（例えば、比色検出又は蛍光検出）によりキャリブレーターのそれぞれが一連の他のキャリブレーターと異なる一連のキャリブレーターの一部である。
開示されている方法に関するバリエーション
開示されている方法は、分析対象物質を分析するための他の方法に関して、必要に応じて適応させることができる。周知のバリエーションの例は、イムノアッセイ、例えばサンドイッチイムノアッセイ（例えば、モノクローナル－ポリクローナルサンドイッチイムノアッセイ）、酵素検出を含むイムノアッセイ（酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））、競合阻害イムノアッセイ（例えば、フォワード及びリバース）、酵素増幅イムノアッセイ技術（ＥＭＩＴ）、競合結合アッセイ、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、１ステップ抗体検出アッセイ、均一アッセイ、不均一アッセイ、キャプチャーオンザフライアッセイを含むが、それらに限定されない。いくつかの例では、以下の説明は、上記の方法と重複し得、他に以下の説明は、代替物を示し得る。
イムノアッセイ
目的の分析対象物質、及び／又はペプチド若しくはその断片は、イムノアッセイを使用して分析され得る。任意のイムノアッセイを利用してよい。イムノアッセイは、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、競合阻害アッセイ、例えばフォワード若しくはリバース競合阻害アッセイ、又は競合結合アッセイであり得る。一部の実施形態では、検出可能な標識（例えば、１つ以上の蛍光標識）は、捕捉抗体及び／又は検出抗体に付着する。
不均一フォーマットを使用してよい。例えば、試料が対象から得られた後、第１の混合物が調製される。混合物は、目的の分析対象物質について評価される試料及び第１の特異的結合メンバーを含有し、第１の特異的結合メンバー及び試料中に含有される任意の目的の分析対象物質は、第１の特異的結合メンバー－目的の分析対象物質複合体を形成する。好ましくは、第１の特異的結合メンバーは、目的の抗分析対象物質に対する抗体又はその断片である。試料及び第１の特異的結合メンバーが混合物を形成するために添加される順番は重要ではない。好ましくは、第１の特異的結合メンバーは、固相に固定化されている。イムノアッセイ（第１の特異的結合メンバー、任意選択的に、第２の特異的結合メンバーで）に使用される固相は、当業界で公知の任意の固相、例えば、以下に限定されないが、磁性粒子、ビーズ、ナノビーズ、マイクロビーズ、ナノ粒子、マイクロ粒子、膜、スキャフォールド分子、フィルム、濾紙、ディスク、又はチップ（例えば、マイクロ流体チップ）であり得る。
第１の特異的結合メンバー－目的の分析対象物質複合体を含有する混合物が形成された後、結合していない目的の分析対象物質が、当業界で公知の任意の技術を使用して複合体から除去される。例えば、結合していない目的の分析対象物質は、洗浄により除去され得る。しかし望ましくは、第１の特異的結合メンバーは、試料中に存在する任意の目的の分析対象物質を超えて存在し、その結果、試料中に存在する目的の分析対象物質はすべて、第１の特異的結合メンバーにより結合される。
任意の結合していない目的の分析対象物質が除去された後、第２の特異的結合メンバーは、第１の特異的結合メンバー－目的の分析対象物質－第２の特異的結合メンバー複合体を形成するために、混合物に添加される。第２の特異的結合メンバーは、好ましくは、第１の特異的結合メンバーにより結合される目的の分析対象物質上の抗原決定基と異なる目的の分析対象物質上の抗原決定基に結合する目的の抗分析対象物質（例えば抗体）である。さらにまた、好ましくは、第２の特異的結合メンバーは、検出可能な標識（例えば、検出可能な標識、切断可能なリンカーにより付着するタグ）で標識される、又はそれを含有する。
固定化された抗体又はその断片の使用は、イムノアッセイ中に組み込まれ得る。抗体は、多彩な支持体、例えば磁性又はクロマトグラフィーのマトリックス粒子、ラテックス粒子又は修飾表面ラテックス粒子、ポリマー又はポリマーフィルム、プラスチック又はプラスチックフィルム、平面基材、マイクロ流体表面、固体基材材料片などの上に固定する。
サンドイッチイムノアッセイ
サンドイッチイムノアッセイは、抗体の２つの層（すなわち、捕捉抗体（すなわち、少なくとも１つの捕捉抗体）及び検出抗体（すなわち、少なくとも１つの検出抗体））の間における抗原の量を測定する。捕捉抗体及び検出抗体は、抗原上の異なる抗原決定基、例えば、目的の分析対象物質に結合する。望ましくは、捕捉抗体の抗原決定基への結合は、検出抗体の抗原決定基への結合に干渉しない。モノクローナル又はポリクローナル抗体は、サンドイッチイムノアッセイで捕捉及び検出抗体として使用され得る。
一般的に、試料中の目的の分析対象物質を分離及び定量するために、少なくとも２つの抗体が使用される。より具体的には、少なくとも２つの抗体は、「サンドイッチ」と呼ばれる免疫複合体を形成する目的の分析対象物質又は目的の分析対象物質の断片の、ある抗原決定基に結合する。１つ以上の抗体が、試料中の目的の分析対象物質を捕捉するために使用され得（これらの抗体は、「捕捉」抗体（複数可）と呼ばれることが多い）、また、目的の分析対象物質にも結合する、検出可能な標識（例えば、蛍光標識、切断可能なリンカーにより付着したタグ）を有する１つ以上の抗体（これらの抗体は、「検出」抗体（複数可）と呼ばれることが多い）が、サンドイッチを完成させるために使用され得る。一部の実施形態では、アプタマーが第２の結合メンバーとして使用され得る。サンドイッチアッセイでは、抗体のその抗原決定基への結合は、望ましくは、アッセイにおける任意の他の抗体の、それぞれの抗原決定基への結合により減少しない。言い換えれば、抗体は、１つ以上の第１の抗体が、第２、又はそれ以降の抗体により認識される抗原決定基のすべて又は一部に結合しない目的の分析対象物質を含有すると疑われる試料と接触し、それにより、１つ以上の第２の検出抗体が、目的の分析対象物質に結合する能力に干渉するように選択される。
一実施形態では、目的の分析対象物質を含有すると疑われる試料は、少なくとも１つの捕捉抗体（複数可）及び少なくとも１つの検出抗体と同時に、又は連続して接触し得る。サンドイッチアッセイのフォーマットでは、目的の分析対象物質（例えば膜に結合した目的の分析対象物質、目的の可溶性分析対象物質、膜に結合した目的の分析対象物質の断片、目的の可溶性分析対象物質の断片、目的の分析対象物質の変化形（膜に結合した、又は可溶性の目的の分析対象物質）又はそれらの任意の組合せ））を含有すると疑われる試料は、最初に、抗体－目的の分析対象物質複合体の形成を可能にする条件下で、特定の抗原決定基に特異的に結合する少なくとも１つの捕捉抗体と接触させる。１つ超の捕捉抗体が使用される場合、複数の捕捉抗体－目的の分析対象物質複合体が形成される。サンドイッチアッセイでは、抗体、好ましくは少なくとも１つの捕捉抗体は、試料中で予想される目的の分析対象物質、又は目的の分析対象物質の断片の最大量のモル過剰量で使用される。
任意選択的に、試料を少なくとも１つの第１の捕捉抗体と接触させる前に、少なくとも１つの捕捉抗体を固体支持体に結合させることができ、これにより、抗体－目的の分析対象物質複合体の試料からの分離が促される。当業界で公知の任意の固体支持体を使用でき、これは、ポリマー材料で作られている、平面基材又はビーズの形態などの固体支持体を含むが、それらに限定されない。抗体（複数可）は、吸着により、化学カップリング剤を使用した共有結合により、又は当業界で公知の他の手段により固体支持体に結合することができるが、ただし、そのような結合は、抗体が目的の分析対象物質又は目的の分析対象物質の断片を結合する能力に干渉しないことを条件とする。さらに、必要な場合は、固体支持体は、抗体上における様々な官能基との反応性を可能にするために、誘導体化することができる。そのような誘導体化は、あるカップリング剤、例えば、以下に限定されないが、無水マレイン酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アジド、アルキニル、及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの使用を必要とする。
目的の分析対象物質を含有すると疑われる試料が少なくとも１つの捕捉抗体と接触させた後、捕捉抗体（複数可）－目的の分析対象物質複合体の形成を可能にするために、試料をインキュベーションする。インキュベーションは、約４．５～約１０．０のｐＨで、約２℃～約４５℃の温度にて、また少なくとも約１分～約１８時間、約２～６分、又は約３～４分の期間で実行できる。
捕捉抗体（複数可）－目的の分析対象物質複合体の形成後、次いで、複合体を少なくとも１つの検出抗体と（捕捉抗体（複数可）－目的の分析対象物質－検出抗体（複数可）複合体の形成を可能にする条件下で）接触させる。捕捉抗体－目的の分析対象物質複合体が１つ超の検出抗体と接触する場合、次いで、捕捉抗体（複数可）－目的の分析対象物質－検出抗体（複数可）検出複合体が形成される。捕捉抗体と同様に、少なくとも１つの検出（及び後続の）抗体が捕捉抗体－目的の分析対象物質複合体と接触するとき、捕捉抗体（複数可）－目的の分析対象物質－検出抗体（複数可）複合体の形成には、上記のものと同様の条件下でのインキュベーションの期間が必要とされる。好ましくは、少なくとも１つの検出抗体は、検出可能な標識（例えば、蛍光標識、切断可能なリンカーにより付着したタグ）を含有する。検出可能な標識は、捕捉抗体（複数可）－目的の分析対象物質－検出抗体（複数可）複合体の形成前に、それと同時に、又はその後に、少なくとも１つの検出抗体に結合することができる。当業界で公知の任意の検出可能な標識、例えば、本明細書で論じられているなど、当業界で公知の蛍光標識を使用できる。
アッセイの混合物を形成するために試料及び特異的結合メンバー（複数可）が添加される順番は重要ではない。第１の特異的結合メンバーが検出可能に標識されている（例えば、蛍光標識）場合、検出可能に標識されている第１の特異的結合メンバー－目的の分析対象物質複合体が形成される。あるいは、第２の特異的結合メンバーが使用され、第２の特異的結合メンバーが検出可能に標識されている（例えば、蛍光標識）場合、第１の特異的結合メンバー－目的の分析対象物質－第２の特異的結合メンバーの検出可能に標識されている複合体が形成される。任意の結合していない特異的結合メンバーは、標識されているか標されていないかを問わず、当業界で公知の任意の技術、例えば洗浄を使用して混合物から除去できる。
次に、目的の分析対象物質又はその断片の存在を示すシグナルが生成される。生成されたシグナルのパラメーターに基づき、試料中の目的の分析対象物質の量が定量され得る。任意選択的に、標準曲線は、質量分光、重量法、及び当業界で公知の他の技術により、目的の分析対象物質の段階希釈又は公知の濃度の溶液を使用して生成できる。
フォワード競合阻害
フォワード競合のフォーマットでは、目的の分析対象物質抗体への結合に関して試料中の目的の分析対象物質と競合するように、公知の濃度の、標識された目的の分析対象物質（例えば、蛍光標識を有する分析対象物質）のアリコートを使用する。
フォワード競合アッセイでは、固定化された特異的結合メンバー（例えば抗体）は、連続して、又は同時に試料及び標識された目的の分析対象物質、目的の分析対象物質の断片、又は目的の分析対象物質のその変化形と接触させることができる。目的の分析対象物質、目的の分析対象物質の断片、又は目的の分析対象物質の変化形は、切断可能なリンカーで付着したタグからなる検出可能な標識を含む任意の検出可能な標識で標識できる。このアッセイでは、抗体は、固体支持体に固定できる。あるいは、抗体は、固体支持体、例えばマイクロ粒子又は平面基材に固定化されている別の抗体、例えば抗種抗体にカップリングできる。
リバース競合アッセイ
リバース競合アッセイでは、固定化された目的の分析対象物質は、連続して、又は同時に、試料及び少なくとも１つの標識された抗体と接触させることができる。目的の分析対象物質を固体支持体、例えばサンドイッチアッセイのフォーマットに関連して上で論じられている固体支持体に結合させることができる。
１ステップイムノアッセイ又は「キャプチャーオンザフライ」
キャプチャーオンザフライイムノアッセイでは、固体基材は、固定剤でプレコーティングされている。捕捉剤、分析対象物質、及び検出剤が、固体基材に一緒に添加され、検出の前に洗浄ステップが続く。捕捉剤は、分析対象物質を結合し得、固定剤に対するリガンドを含み得る。捕捉剤及び検出剤は、本明細書に記載されている、又は当業界で公知の、捕捉又は検出することが可能な抗体又は任意の他の部分であり得る。リガンドは、ペプチドタグを含み得、固定剤は、抗ペプチドタグ抗体を含み得る。あるいは、リガンド及び固定剤は、キャプチャーオンザフライアッセイに使用されるように、一緒に結合することが可能な任意の作用剤のペアであり得る（例えば、特異的結合ペアは当業界で公知である）。１つ超の分析対象物質が測定され得る。一部の実施形態では、固体基材は、抗原でコーティングされ得、分析される分析対象物質は、抗体である。
ある他の実施形態では、１ステップイムノアッセイ又は「キャプチャーオンザフライ」において、固定剤（例えばビオチン、ストレプトアビジン）でプレコーティングされた固体支持体（例えばマイクロ粒子）、並びに少なくとも第１の特異的結合メンバー及び第２の特異的結合メンバー（捕捉試薬及び検出試薬としてそれぞれ作用する。）が使用される。第１の特異的結合メンバーは、固定剤のリガンドを含み（例えば、固体支持体上の固定剤がストレプトアビジンである場合、第１の特異的結合メンバー上のリガンドはビオチンであり得る）、また、目的の分析対象物質に結合する。第２の特異的結合メンバーは、検出可能な標識を含み、目的の分析対象物質に結合する。固体支持体及び第１及び第２の特異的結合メンバーは、試料に（連続して、又は同時に）添加され得る。第１の特異的結合メンバー上のリガンドは、固体支持体上の固定剤に結合して、固体支持体／第１の特異的結合メンバー複合体を形成する。試料中に存在する任意の目的の分析対象物質は、固体支持体／第１の特異的結合メンバー複合体に結合して、固体支持体／第１の特異的結合メンバー／分析対象物質複合体を形成する。第２の特異的結合メンバーは、固体支持体／第１の特異的結合メンバー／分析対象物質複合体に結合し、検出可能な標識が検出される。任意選択の洗浄ステップが検出の前に使用され得る。ある実施形態では、１ステップアッセイでは、１つ超の分析対象物質が測定され得る。ある他の実施形態では、２つ超の特異的結合メンバーを使用できる。ある他の実施形態では、複数の検出可能な標識が添加され得る。ある他の実施形態では、複数の目的の分析対象物質を検出できる。
キャプチャーオンザフライアッセイは、本明細書に記載されている、また、当業界で公知の多彩なフォーマットで行うことができる。例えば、フォーマットは、例えば上記のサンドイッチアッセイであってよいか、あるいは、単一の特異的結合メンバーを使用でき、又は他の公知のバリエーションを使用できる競合アッセイであってよい。
組合せアッセイ
組合せアッセイでは、固体基材、例えばマイクロ粒子は、抗原及び抗体で同時コーティングされて、試料からの抗体及び抗原をそれぞれ捕捉する。固体支持体は、２つ以上の異なる抗原で同時コーティングされて、試料からの２つ以上の異なる抗体を捕捉し得る。固体支持体は、２つ以上の異なる抗体で同時コーティングされて、試料からの２つ以上の異なる抗原を捕捉し得る。
さらに、本明細書に記載されている方法は、アッセイ化合物のうち、特異的又は非特異的結合反応（例えば、ＨＡＭＡ問題）を防止するブロッキング剤を使用し得る。作用剤（及び任意選択的に任意の対照）が支持体に固定化されると、作用剤の残りの結合部位は、支持体上でブロックされ得る。当業者に公知の任意の好適なブロッキング試薬が使用され得る。例えば、ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）、ＰＢＳ中のカゼインのリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）溶液、Ｔｗｅｅｎ ２０（商標）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）、又は他の好適な界面活性剤、並びに他のブロッキング試薬が使用され得る。
本開示から明らかなように、バリエーションを含む本明細書で開示されている方法は、疾患、障害、又は状態を有すると疑われる対象における疾患、障害又は病態の診断に使用され得る。例えば、試料分析は、疾患マーカー、例えば、がんマーカー、心臓状態のマーカー、毒素、病原体、例えば、ウイルス、細菌、又はそれらの一部の検出に有用であり得る。方法は、生体試料に存在する分析対象物質の測定にも使用され得る。方法は、標的分析対象物質を検出する血液スクリーニングアッセイにも使用され得る。血液スクリーニングアッセイは、血液供給をスクリーニングするために使用され得る。
分析対象物質を分析するためのデバイス
本明細書に記載されている方法は、分析対象物質の分析に好適な任意のデバイスを使用して行うことができ、多彩なデバイスが当業界で公知であり、例えば、蠕動ポンプシステム（例えば、ＦＩＳＨＥＲＢＲＡＮＤ（商標）Ｖａｒｉａｂｌｅ－Ｆｌｏｗ Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ Ｐｕｍｐｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡから入手できる蠕動ポンプシステム）、自動化／ロボット試料送達システム（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｒｏｂｏｔｉｃｓ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ；及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡから市販されている）、マイクロ流体デバイス、小滴ベースのマイクロ流体デバイス、デジタルマイクロ流体デバイス（ＤＭＦ）、表面弾性波ベースのマイクロ流体（ＳＡＷ）デバイス、又は誘電体上のエレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）デジタルマイクロ流体デバイス（例えば、Ｐｅｎｇら、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ、１４（６）：１１１７～１１２２頁（２０１４年）；及びＨｕａｎｇら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、１０（５）：ｅ０１２４１９６（２０１５年）を参照されたい）、並びに他の自動化システム、例としてＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ（商標）機器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（商標）アナライザー（Ａｂｂｏｔｔ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）、並びに当業界で公知の他の自動化機器を含む。
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、デジタルマイクロ流体（ＤＭＦ）デバイスなどのマイクロ流体デバイスを使用して行われ得る。例えば、国際出願第２００７／１３６３８６号、同第２００９／１１１４３１号、同第２０１０／０４０２２７号、同第２０１１／１３７５３３号、同第２０１３／０６６４４１号、同第２０１４／０６２５５１号、同第２０１４／０６６７０４号、及び米国特許第８，２８７，８０８号に記載されているものなど当技術分野において公知であるいずれか好適なマイクロ流体デバイスを使用して、本明細書に記載される方法を行うことができる。ある特定の場合に、デバイスは、分析対象物質分析が分析対象物質を含む又は含むと疑われる試料の小滴で実施され得るラボオンチップデバイスとすることができる。
一実施形態では、本明細書に記載されている方法の少なくとも２つのステップ（例えば、２、３、又はすべてのステップ）は、デジタルマイクロ流体デバイスで実行される。「デジタルマイクロ流体（ＤＭＦ）」、「デジタルマイクロ流体モジュール（ＤＭＦモジュール）」、又は「デジタルマイクロ流体デバイス（ＤＭＦデバイス）」という用語は、本明細書で互換的に使用され、個別の、かつ少量の液体を小滴の形態で操作させるデジタル又は小滴ベースのマイクロ流体技術を利用するモジュール又はデバイスを指す。デジタルマイクロ流体は、エマルション科学の原理を使用して、流体－流体分散体（主として油中水エマルション）をチャネル内に作り出し、多分散性が低い、単分散滴／泡の生成を可能にする。デジタルマイクロ流体は、再構成可能なネットワーク内での不連続な流体小滴の顕微操作に基づく。小滴の形成、移動、分割、及び融合といった基本的作業を組み合わせることにより、複雑な指示をプログラムできる。
デジタルマイクロ流体は、バイナリ電気シグナルにより操作できる個別の流体体積で作動する。個別の単位体積の小滴を使用することにより、マイクロ流体作業は、一連の反復基本的作業、すなわち、１単位の流体による１単位の距離にわたる移動と定義され得る。小滴は、液体の表面張力性を使用して形成され得る。小滴のアクチュエーションは、小滴が位置する底面の下に置かれた電極により生成される静電力の存在に基づく。異なるタイプの静電力を使用して、小滴の形状及び動きを管理できる。先述の静電力を作り出すのに使用できる一技術は、小滴及び周囲の媒体との間の誘電率の差による誘電泳動に基づき、高周波ＡＣ電場を利用し得る。先述の静電力を作り出すのに使用できる別の技術は、エレクトロウェッティングに基づき、これは、表面に存在する液体小滴と表面との間の表面張力の、表面に印加される電場に対する依存性による。
別の実施形態では、本明細書に記載されている方法は、表面弾性波（ＳＡＷ）ベースのマイクロ流体デバイスと共に、フロントエンドというアッセイ処理法として遂行され得る。本明細書で使用されている「表面弾性波（ＳＡＷ）」という用語は、一般的に表面に沿う方向に伝播する音波を指す。「トラベリング表面弾性波」（ＴＳＡＷ）は、表面弾性波を液体中へとカップリングすることができる。一部の実施形態では、カップリングは、表面弾性波の液体中への浸透又は漏洩の形態であり得る。他の実施形態では、表面弾性波は、Ｒａｙｌｅｉｇｈ波（例えば、Ｏｌｉｎｅｒ，Ａ．Ａ．（編）、Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｗａｖｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９７８年）を参照されたい）である。表面弾性波の伝播は、トランスデューサー、例えば一連の、若しくは複数の電極による電位の生成、又は表面弾性波を液体中に流すことを含む、多彩な異なる手段で、及び異なる材料を使用することにより実施され得る。
一部の実施形態では、ＤＭＦデバイス又はＳＡＷデバイスは、ロールツーロールベースのプリンテッドエレクトロニクス方法により製造される。そのようなデバイスの例は、国際特許出願公開第２０１６／１６１４０２号及び第２０１６／１６１４００号に記載されている。
上記のデバイスの多くが、目的の分析対象物質の１分子の検出を可能にする。目的の１つ以上の分析対象物質の１分子検出を可能にする、当技術分野において公知である他のデバイス及びシステムも、本明細書に記載される方法で使用され得る。そのようなデバイス及びシステムとしては、例えば、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ ＳＩＭＯＡ（商標）（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）技術、Ｓｉｎｇｕｌｅｘの１分子カウント（ＳＭＣ（商標））技術（Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ、例えば米国特許第９，２３９，２８４号を参照のこと）、並びに例えば米国特許出願公開第２０１７／０１５３２４８号及び同第２０１８／００１７５５２号に記載されているデバイスが挙げられる。
キット及びカートリッジ
上記方法を行うのに使用するためのキットも本明細書で提供される。キットは、上記のデバイスのいずれかと使用され得る。キットに含まれている説明書は、パッケージング材料に貼られていてよく、又は添付文書として含まれていてよい。説明書は、書類又は印刷物であるが、それらに限定されない。そのような説明書を保存すること、及びが説明書をエンドユーザーに伝えることが可能ないかなる媒体も、本開示により想定される。そのような媒体は、電子保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）などを含むが、それらに限定されない。本明細書で使用されている「説明書」という用語は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。
キットは、マイクロ流体モジュールを含むカートリッジを含み得る。一部の実施形態では、マイクロ流体モジュールは、カートリッジに統合され得る。カートリッジは、使い捨てであり得る。カートリッジは、上で開示されている方法を実践するのに有用な１つ以上の試薬を含み得る。カートリッジは、試薬を１つ以上の別々の組成物として、又は任意選択的に、試薬の適合性が許容される混和物として保持する１つ以上の容器を含み得る。カートリッジは、ユーザーの見地から望ましいことがある他の材料（複数可）、例えば緩衝液（複数可）、希釈剤（複数可）、標準（複数可）（例えば、キャリブレーター及び対照）、及び／又は試料の処理、洗浄、若しくはアッセイの任意の他のステップの実施に有用な任意の他の材料も含み得る。カートリッジは、上記のように１つ以上の特異的結合メンバーを含み得る。
キットは、目的の分析対象物質を定量するための参照標準をさらに含み得る。参照標準は、目的の分析対象物質の濃度を内挿及び／又は外挿するための標準曲線を確立するように使用され得る。キットは、濃度レベルに関して変動する参照標準を含み得る。例えば、キットは、高濃度レベル、中濃度レベル、又は低濃度レベルの１つ以上の参照標準を含み得る。参照標準に対する濃度の範囲に関して、これは、アッセイごとに最適化され得る。参照標準に対する例示的な濃度範囲は、例えば、約１０ｆｇ／ｍＬ、約２０ｆｇ／ｍＬ、約５０ｆｇ／ｍＬ、約７５ｆｇ／ｍＬ、約１００ｆｇ／ｍＬ、約１５０ｆｇ／ｍＬ、約２００ｆｇ／ｍＬ、約２５０ｆｇ／ｍＬ、約５００ｆｇ／ｍＬ、約７５０ｆｇ／ｍＬ、約１０００ｆｇ／ｍＬ、約１０ｐｇ／ｍＬ、約２０ｐｇ／ｍＬ、約５０ｐｇ／ｍＬ、約７５ｐｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬ、約１５０ｐｇ／ｍＬ、約２００ｐｇ／ｍＬ、約２５０ｐｇ／ｍＬ、約５００ｐｇ／ｍＬ、約７５０ｐｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１２．５ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約４５ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約５５ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約８５ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１２５ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１６５ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２２５ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、約２７５ｎｇ／ｍＬ、約３００ｎｇ／ｍＬ、約４００ｎｇ／ｍＬ、約４２５ｎｇ／ｍＬ、約４５０ｎｇ／ｍＬ、約４６５ｎｇ／ｍＬ、約４７５ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、約５２５ｎｇ／ｍＬ、約５５０ｎｇ／ｍＬ、約５７５ｎｇ／ｍＬ、約６００ｎｇ／ｍＬ、約７００ｎｇ／ｍＬ、約７２５ｎｇ／ｍＬ、約７５０ｎｇ／ｍＬ、約７６５ｎｇ／ｍＬ、約７７５ｎｇ／ｍＬ、約８００ｎｇ／ｍＬ、約８２５ｎｇ／ｍＬ、約８５０ｎｇ／ｍＬ、約８７５ｎｇ／ｍＬ、約９００ｎｇ／ｍＬ、約９２５ｎｇ／ｍＬ、約９５０ｎｇ／ｍＬ、約９７５ｎｇ／ｍＬ、約１０００ｎｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ、約７０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ、約９０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ、約１０００μｇ／ｍＬ、約２０００μｇ／ｍＬ、約３０００μｇ／ｍＬ、約４０００μｇ／ｍＬ、約５０００μｇ／ｍＬ、約６０００μｇ／ｍＬ、約７０００μｇ／ｍＬ、約８０００μｇ／ｍＬ、約９０００μｇ／ｍＬ、又は約１００００μｇ／ｍＬを含むが、それらに限定されない。
キットは、特異的結合メンバーを標識するための試薬、特異的結合メンバーを検出するため及び／若しくは分析対象物質を標識するための試薬、並びに／又は分析対象物質を検出するための試薬を含み得る。キットは、タグの切断を導く成分、例えば切断媒介試薬も含み得る。例えば、切断媒介試薬は、還元剤、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）ＴＣＥＰを含み得る。特異的結合メンバー、キャリブレーター、及び／若しくは対照は、別々の容器で用意され得る、又は適切なアッセイフォーマット若しくはカートリッジ中に予め分注され得る。
キットは、品質管理構成要素（例えば、感受性パネル、キャリブレーター、及び陽性対照）も含み得る。品質管理試薬の調製は、当業界で周知であり、免疫診断製品用の挿入シートに記載されている。感受性パネルメンバーは、任意選択的に、アッセイ性能特性を確立するために使用され、キット試薬の完全性及びアッセイの標準化の有用な指標となる。
キットは、任意選択的に、診断アッセイを実施する、又は品質管理評価を促すのに必要とされる他の試薬、例えば緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬も含み得る。他の成分、例えば、試験試料（例えば、前処理試薬）を単離及び／又は処理するための緩衝液及び溶液も、キットに含まれ得る。キットは、１つ以上の他の対照をさらに含み得る。キットの成分の１つ以上は、凍結乾燥することができ、このケースでは、キットは、凍結乾燥成分の再構成に好適な試薬をさらに含み得る。成分の１つ以上は、液体形態であり得る。
キットの様々な成分は、任意選択的に、必要に応じて好適な容器で用意され得る。キットは、試料を保持又は保存する容器をさらに含み得る（例えば、尿、唾液、血漿、脳脊髄液、若しくは血清試料のための容器又はカートリッジ、又は、組織吸引物を作り出すように組織を保存、輸送若しくは処理するための適切な容器）。適切な場合、キットは、任意選択的に、試薬又は試験試料の調製を促す反応容器、混合容器、及び他の成分を含有し得る。キットは、試験試料を得るのを補助する１つ以上の試料採取／取得機器、例えば様々な血液採取／移送デバイス（例えば、マイクロサンプリングデバイス、マイクロニードル、又は他の最小侵襲性の無痛血液採取方法；血液採取チューブ（複数可）；ランセット；キャピラリー血液採取チューブ；他の単一の指先穿刺血液採取方法；バッカルスワブ、経鼻／咽喉スワブ；１６ゲージ又は他の大きさの針、パンチ生検用円形ブレード（例えば、１～８ｍｍ、又は他の適切な大きさ）、メス若しくはレーザー（例えば、特にハンドヘルド）、シリンジ、無菌容器、又は組織試料を得る、保存する、若しくは吸引するためのカニューレ）も含み得る。キットは、関節吸引、円錐生検、パンチ生検、ファインニードル吸引生検、画像誘導経皮針吸引生検、ブロンコアヴェオラー（ｂｒｏｎｃｈｏａｖｅｏｌａｒ）洗浄、内視鏡下生検、内視鏡生検、及びラプロスコピック（ｌａｐｒｏｓｃｏｐｉｃ）生検を補助するための１つ以上の機器を含み得る。
以下の実施例は、本発明をさらに例証するが、もちろん、その範囲を限定するとは決して解釈されるべきではない。
以下の実施例で使用される試薬は、商用供給源から購入し、特に指示がない限り入手したまま使用した。
［実施例１］
Figure 2022543618000015
１．０ｇ（１．７ｍｍｏｌ）のＣＰＳＰ－アクリジニウム（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８年、６３巻、５６３６～５６３９頁）を、２５ｍＬの塩化メチレン（ＤＣＭ）中の２ｍＬの［ＣＯＣｌ］２（２３ｍｍｏｌ）で処理し、これに続いて５μＬのジメチルホルムアミドを添加した。スラリーを室温で２時間撹拌し、黄色の溶液を得た。この後、揮発性成分を、真空下、回転式エバポレーターで反応物から除去して、二酸クロリドを黄色の粘着性泡状物質として得た。残渣をＤＣＭ（２５ｍＬ）に再溶解した。フッ化水素カリウムの飽和水性溶液（１５ｍＬ）を調製し、ＤＣＭ溶液に加えた。２相系を２時間激しく撹拌した。この後、反応物の上側の水相をピペットで除去し、下側のＤＣＭ層を回転式エバポレーターで、真空下で蒸発させた。生成した黄色の固体を水（約２５ｍＬ）に懸濁させ、Ｂｕｃｈｎｅｒ漏斗を介して濾過した。固体を少ない分量の冷水（約６５ｍＬ）で洗浄した。収量１．０８ｇの黄色の固体。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ２８Ｈ２８ＦＮ２Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：５８７．１３；分子量：５８７．６６。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値５８７．３９。
［実施例２］
Figure 2022543618000016
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた２５ｍＬ丸底フラスコに、０．１ｇ（０．１７ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＣＭ（１０ｍＬ）を投入し、次いで０．１４ｇ（１．７ｍｍｏｌ）のピペラジンを黄色のスラリーに一度に加えると、透明な溶液が生じた。反応物を室温で５．５日間撹拌した。この後、乳状の白色スラリーを得た。反応物を真空下で蒸発乾固し、固体を水（５ｍＬ）、メタノール（５ｍＬ）及び１Ｎ ＨＣｌ（２ｍＬ）に溶解した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ５０×２５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムを使用して、生成した溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速７０ｍＬ／分）、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５ＴＦＡを使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を、回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量：０．１６３ｇの黄色のガラス状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３２Ｈ３７Ｎ４Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：６５３．２１；分子量：６５３．７９。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値６５３．３３。
［実施例３］
Figure 2022543618000017
実施例２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．１ｇ（０．１７ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＣＭ（５ｍＬ）及び０．０５７ｍＬ（０．８５ｍｍｏｌ）のエチレンジアミン（ＥＤＡ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．０２７ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３０Ｈ３５Ｎ４Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：６２７．１９４２；分子量：６２７．７５１０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値６２７．４３。
［実施例４］
Figure 2022543618000018
実施例２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０２６ｇ（０．０４４ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＣＭ（５ｍＬ）及び０．１ｍＬ（０．４５ｍｍｏｌ）の４，７，１０－トリオキサ－１，１３－トリデカンジアミンを利用して、表題化合物を調製した。収量０．０１８ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３８Ｈ５１Ｎ４Ｏ１０Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：７８７．３０４１；分子量：７８７．９６１８。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値７８７．５３。
［実施例５］
Figure 2022543618000019
実施例２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０３ｇ（０．０５１ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＣＭ（１ｍＬ）及び０．１ｇ（０．５７ｍｍｏｌ）の１，８－ビス（メチルアミノ）－３，６－ジオキサオクタンを利用して、表題化合物を調製した。収量０．０１６ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３６Ｈ４７Ｎ４Ｏ９Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：７４３．２７７９；分子量：７４３．９０９２。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値７４３．３９。
［実施例６］
Figure 2022543618000020
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた５ｍＬ丸底フラスコに、０．０１５ｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＭＦ（１ｍＬ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０．３４ｍＬ、２ｍｍｏｌ）を投入し、次いで（１Ｓ，４Ｓ）－（＋）－２，５－ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタンジヒドロブロミド（０．１４ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を一度に加えた。反応物を室温で２日間撹拌した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムを使用して、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．００８４ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３３Ｈ３７Ｎ４Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：６６５．２０９８；分子量：６６５．７９８９。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値６６５．２０。
［実施例７］
Figure 2022543618000021
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた５ｍＬ丸底フラスコに、０．０１５ｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）、ＤＩＥＡ（０．１７ｍＬ、１ｍｍｏｌ）を投入し、次いで（ｃｉｓ－ラセミ０－ｔｅｒｔ－ブチルヘキサヒドロピロロ［３，４－ｃ］ピロール－２（１Ｈ）－カルボキシレート（０．０５５ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を黄色のスラリーに一度に加えた。反応物を室温で１８時間撹拌した。窒素流を使用して、反応物を蒸発乾固し、次いで少量のＭｅＯＨに溶解した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムを使用して、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５ギ酸で使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．０２０５ｇの黄色のフィルム状物質（Ｂｏｃ保護されたアミン中間体）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３９Ｈ４７Ｎ４Ｏ９Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：７７９．２７７９；分子量：７７９．９４１３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値７７９．１６。
磁気撹拌棒を備えた４ｍＬバイアルに、Ｂｏｃ保護したアミン中間体及びＤＣＭ（０．５ｍＬ）を投入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（０．５ｍＬ）を加え、混合物をＲＴで１時間撹拌した。窒素流を使用して、反応物を終夜蒸発乾固した。粗生成物を少量のＭｅＯＨに溶解した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムを使用して、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．０１７５ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３４Ｈ３９Ｎ４Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：６７９．２２５５；分子量：６７９．８２５５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値６７９．２４。
［実施例８］
Figure 2022543618000022
実施例７の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０１５ｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、５－Ｂｏｃ－オクタヒドロ－ピロロ［３，４－ｃ］ピリジン（０．０１ｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）、ＤＣＭ（アミンカップリングに０．５ｍＬ及び脱保護ステップに０．５ｍＬ）、ＤＩＥＡ（アミンカップリング用、０．１７ｍＬ、１ｍｍｏｌ）、及びＴＦＡ（Ｂｏｃ脱保護用、０．５ｍＬ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００７４ｇの黄色のフィルム状物質（Ｂｏｃ保護されたアミン中間体）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ４０Ｈ４９Ｎ４Ｏ９Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：７９３．２９３５；分子量：７９３．９６７９。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値７９３．２０。
収量０．００７７ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３５Ｈ４１Ｎ４Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：６９３．２４１１；分子量：６９３．８５２１。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値６９３．２０。
［実施例９］
Figure 2022543618000023
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた５ｍＬ丸底フラスコに、０．０１５ｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）及びＤＩＥＡ（０．１７ｍＬ、１ｍｍｏｌ）を投入した。ｔｒａｎｓ－１，２－ジアミノシクロヘキサンを黄色のスラリーに一度に加えた。反応物を室温で１８時間撹拌した。窒素流を使用して反応物を蒸発乾固し、次いで少量のＭｅＯＨに溶解した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムを使用して、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．０１０ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３４Ｈ４１Ｎ４Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：６８１．２４１１；分子量：６８１．８４１４。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値６８１．２７。
［実施例１０］
Figure 2022543618000024
実施例９の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０１５ｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）、ＤＩＥＡ（０．１７ｍＬ、１ｍｍｏｌ）及び（＋－）－ｔｒａｎｓ－１，２－ジアミノシクロヘキサン（０．０２９ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．０１５４ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３４Ｈ４１Ｎ４Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：６８１．２４１１；分子量：６８１．８４１４。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値６８１．３４。
［実施例１１］
Figure 2022543618000025
実施例９の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０１５ｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）の実施例１の生成物、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）、ＤＩＥＡ（０．１７ｍＬ、１ｍｍｏｌ）及び（Ｓ，Ｓ）－（＋）－ｎ，Ｎ’－ジメチル－１，２－シクロヘキサンジアミン（０．０３７ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００５６ｇの黄色のフィルム状物質（ＴＦＡ塩としての表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ３６Ｈ４５Ｎ４Ｏ７Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：７０９．２７２４；分子量：７０９．８９４６。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値７０９．２７。
［実施例１２］
Figure 2022543618000026
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた５ｍＬ丸底フラスコに、０．００５ｇ（０．００６５ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）及び０．０１ｇ（０．０２１ｍｍｏｌ）の（５）６－カルボキシフルオレセイン－ＮＨＳエステルの混合物を投入し、これに続いてＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．２８ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を室温で２．５日間撹拌した。数滴の水を加え、混合物を室温で３０分間撹拌した。反応物をＭｅＯＨ（２ｍＬ）で希釈し、２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍスチールカラムを使用して、逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空下３０℃で除去し、高真空で（１ｍｍＨｇ）２時間にわたり乾燥させた。収量：０．００１２ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５３Ｈ４７Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０１１．２５７６；分子量：１０１２．０８８７。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０１１．３９。
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた５ｍＬ丸底フラスコに、０．０１２ｇの上記ステップの生成物、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）及びピリジン（（０．５ｍＬ、０．６２ｍｍｏｌ）を投入した。次いで、ペンタフルオロフェニルトリフルオロ酢酸塩（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を混合物に一度に加え、反応物を室温で１時間撹拌した。揮発性成分を真空下で混合物から除去し、残渣を１：１エーテル－ヘキサンで５×粉砕し、微量の揮発性成分を高真空で（１ｍｍＨｇ）で２時間にわたり除去した。収量０．００８ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物、Ｒ＝－Ｏ－ペンタフルオロフェニル）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５９Ｈ４６Ｆ５Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１１７７．２４１７；分子量：１１７８．１３７０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１１７７．２１。次の反応及びコンジュゲーション用に生成物を２つの等しい部分に分割した。
最後のステップからの０．００４ｇのペンタフルオロフェニルエステル生成物をＤＣＭ（０．５ｍＬ）に溶解した。次いで、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中アジド－ｄＰＥＧ３－アミン（０．１ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を滴下添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。揮発性成分を、窒素流の下で１８時間にわたり反応混合物から除去した。反応混合物をＭｅＯＨ（１ｍＬ）及び水（１ｍＬ）で希釈し、２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍスチールカラムで溶出させることにより、逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空下３０℃で除去し、高真空で（１ｍｍＨｇ）１８時間にわたり乾燥させた。収量０．００７ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物、Ｒ＝－Ｏ－ＰＥＧ－アジド）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ６１Ｈ６３Ｎ８Ｏ１５Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１２１１．３８４９；分子量：１２１２．３２７０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１２１１．４７。
［実施例１３］
Figure 2022543618000027
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０３９ｇ（０．０４９ｍｍｏｌ）の実施例３の生成物、ＤＭＦ（２．０ｍＬ）、０．０２８ｇ（０．０６ｍｍｏｌ）の（５）６－カルボキシフルオレセイン－ＮＨＳエステル及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）の混合物を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００８ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５１Ｈ４５Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：９８５．２４１９；分子量：９８６．０５１５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値９８５．４９。
［実施例１４］
Figure 2022543618000028
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０１ｇ（０．０１３ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）、０．０３ｇ（０．０５５ｍｍｏｌ）の５－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（５－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから得た）及びＤＩＥＡ（０．０２５ｍＬ、０．０５５ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００１８ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５３Ｈ４７Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０１１．２５７６；分子量：１０１２．０８８７。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０１１．３８。
［実施例１５］
Figure 2022543618000029
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０１ｇ（０．０１３ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）、０．０３ｇ（０．０５５ｍｍｏｌ）の６－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（６－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから得た）及びＤＩＥＡ（０．０２５ｍＬ、０．０５５ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００２９ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５３Ｈ４７Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０１１．２５７６；分子量：１０１２．０８８７。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０１１．４５。
［実施例１６］
Figure 2022543618000030
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０１ｇ（０．０１３ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）、０．０１１ｇ（０．０２１ｍｍｏｌ）の（５）６－ＴＡＭＲＡ－ＮＨＳエステル及びＤＩＥＡ（０．０２５ｍＬ、０．０５５ｍｍｏｌ）の混合物を利用して表題化合物を調製した。個々の生成物異性体を精製中に分離した。収量、画分９から異性体Ａ：０．００２ｇの紫色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５７Ｈ５７Ｎ６Ｏ１１Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０６５．３５２１；分子量：１０６６．２２５５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０６５．５５（弱）；Ｍ＋＋５３３．４５（強）。
収量、画分１０から異性体Ｂ：０．００２ｇ紫フィルム状物質を生成（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５７Ｈ５７Ｎ６Ｏ１１Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０６５．３５２１；分子量：１０６６．２２５５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０６５．４８（弱）；Ｍ＋＋５３３．４５（強）。
［実施例１７］
Figure 2022543618000031
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０１ｇ（０．０１１ｍｍｏｌ）の実施例４の生成物、ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）、０．０１４ｇ（０．０２６ｍｍｏｌ）の６－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（６－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから調製）及びＤＩＥＡ（０．０２５ｍＬ、０．０５５ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００５ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５９Ｈ６１Ｎ４Ｏ１６Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１１４５．３５１８；分子量：１１４６．２６２３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１１４５．３０。
［実施例１８］
Figure 2022543618000032
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．００４９ｇ（０．００５７ｍｍｏｌ）の実施例５の生成物、ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）、０．０１ｇ（０．０１６ｍｍｏｌ）のローダミンＢ－ＰＦＰエステル（ローダミンＢ及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから調製）及びＤＩＥＡ（０．０２５ｍＬ、０．０５５ｍｍｏｌ）を利用して表題化合物を調製した。収量０．００１６ｇの紫色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ６４Ｈ７５Ｎ６Ｏ１１Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１１６７．４９；分子量：１１６８．４５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１１６７．６１。
［実施例１９］
Figure 2022543618000033
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．００４２ｇ（０．００５４ｍｍｏｌ）の実施例６の生成物、ＤＭＦ（０．２ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）の５－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（５－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから得た）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００４８ｇのオレンジ色の黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５４Ｈ４７Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０２３．２５７６；分子量：１０２４．０９９４。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０２３．２２。
［実施例２０］
Figure 2022543618000034
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．００４５ｇ（０．００５ｍｍｏｌ）の実施例７の生成物、ＤＭＦ（０．２ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）の５－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（５－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから得た）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００３３ｇのオレンジ色－黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５５Ｈ４９Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０３７．２７３２；分子量：１０３８．１２６０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０３７．１８。
［実施例２１］
Figure 2022543618000035
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．００３８ｇ（０．００４２ｍｍｏｌ）の実施例８の生成物、ＤＭＦ（０．２ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）の５－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（５－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから得た）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００２３ｇのオレンジ色－黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５４Ｈ４７Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０５１．２８８９；分子量：１０５２．１５２６。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０５１．３０。
［実施例２２］
Figure 2022543618000036
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．００５ｇ（０．００６３ｍｍｏｌ）の実施例９の生成物、ＤＭＦ（０．２ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）の５－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（５－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから得た）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００４２ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５５Ｈ５１Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０３９．２８８９；分子量：１０４０．１４１９。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０３９．２９。
［実施例２３］
Figure 2022543618000037
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して０．００５７ｇ（０．００７２ｍｍｏｌ）の実施例１０の生成物、ＤＭＦ（０．２ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）の５－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（５－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから得た）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００２４ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５５Ｈ５１Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０３９．２８８９；分子量：１０４０．１４１９。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０３９．２１。
［実施例２４］
Figure 2022543618000038
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して０．００３ｇ（０．００３６ｍｍｏｌ）の実施例１１の生成物、ＤＭＦ（０．２ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）の５－カルボキシフルオレセイン－ＰＦＰエステル（５－カルボキシフルオレセイン及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから得た）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．０００６ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５７Ｈ５５Ｎ４Ｏ１３Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０６７．３２；分子量：１０６８．２０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０６７．１４。
［実施例２５］
Figure 2022543618000039
実施例１２の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．００６ｇ（０．００８ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．２ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１３ｍｍｏｌ）のローダミンＢ－ＰＦＰエステル（ローダミンＢ及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートから調製）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００３１ｇの紫色のフィルム状物質を（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ６０Ｈ６５Ｎ６Ｏ９Ｓ２＋に対する計算値：正確な質量：１０７７．４２；分子量：１０７８．３３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０７７．５１。
［実施例２６］
Figure 2022543618000040
ＣＰ－アクリジンメチルエステル（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８年、６３巻、５６３６～５６３９頁）（０．０１２ｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）及び５－（ヨードアセトアミド）フルオレセイン（０．０１５ｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）を、窒素入口を備えた５ｍＬ丸底フラスコ内で混合した。溶媒なしで、フラスコを油浴内で、１６０～１７０℃で１５分間加熱した。この後ＬＣＭＳは、構成成分として、出発材料が両方とも並びに表題化合物が存在する複合混合物を示した。反応物をＤＭＦ／ＭｅＯＨ／水（それぞれ約０．５ｍＬ）中に溶解させ、２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍスチールカラムを使用して、逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ギ酸で使用した。揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空下３０℃で除去し、高真空で（１ｍｍＨｇ）２４時間にわたり乾燥させた。収量０．０００７ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ４８Ｈ３８Ｎ３Ｏ１１Ｓ＋に対する計算値：正確な質量：８６４．２２２２；分子量：８６４．８９３３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値８６４．４３。
［実施例２７］
Figure 2022543618000041
実施例２６の調製に対して概説されている同じ手順を使用して、０．０１２ｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）のＣＰ－アクリジニウムメチルエステル及び０．００６ｇ（０．０１２ｍｍｏｌ）の６－（ヨードアセトアミド）フルオレセインを利用して、表題化合物を調製した。収量０．００１１ｇの黄色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ４８Ｈ３８Ｎ３Ｏ１１Ｓ＋に対する計算値：正確な質量：８６４．２２２２；分子量：８６４．８９３３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値８６４．５１。
［実施例２８］
Figure 2022543618000042
上記化合物は、
Figure 2022543618000043
 から調製した。
ＳＰＣＮ（０．０４８ｇ）、（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００３年、５巻（２１号）、３７７９頁）を０．５ｍＬのＤＭＦに溶解した。０．１２８ｍＬのＤＩＥＡを加え、これに続いてＰｙＡＯＰ（０．０３２ｇ）を加えた。反応物を周辺温度で５分間撹拌した（予備活性化）。０．０３２ｇの５－アセトアミドアミノフルオレセイン（５－ＡＡＦ）（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９２年、４巻（４号）、８７９～８４頁）を１ｍＬのＤＭＦ及び０．０６４ｍＬのＤＩＥＡに溶解した。５－ＡＡＦ溶液をＳＰＣＮ溶液に加えた。１８時間後、反応物を３ｍＬの水で処理した。溶液をＹＭＣ ＯＤＳ－ＡＱカラム（４０×１００）に直接注入することにより、溶液をＨＰＬＣで精製した。４５ｍＬ／分で、５～４０％アセトニトリルの勾配で７０分間にわたり溶出した（移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ＴＦＡ）。生成物を含有する画分を凍結し、凍結乾燥した。収量０．０２６ｇ（表題化合物）。ＭＳは表題化合物と一致する。
［実施例２９］
Figure 2022543618000044
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０１ｇの実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、０．００５ｇ（０．０１２ｍｍｏｌ）のＢＯＤＩＰＹ（商標）４９３／５０３ＮＨＳエステル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。反応物を終夜撹拌した。収量０．００２１ｇの赤色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ４８Ｈ５４ＢＦ２Ｎ６Ｏ８Ｓ２＋に対する計算値；正確な質量：９５５．３５００；分子量：９５５．９２０３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値９５５．３８。
［実施例３０］
Figure 2022543618000045
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０１４ｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、０．００５ｇ（０．０１１ｍｍｏｌ）のＢＤＰ５５８／５６８ＮＨＳエステル（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。反応物を終夜撹拌した。収量０．００３３ｇの紫色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ４８Ｈ４８ＢＦ２Ｎ６Ｏ８Ｓ３＋に対する計算値；正確な質量：９８１．２７５１；分子量：９８１．９３２３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値９８１．３３。
［実施例３１］
Figure 2022543618000046
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０３ｇ（０．０３９ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（１ｍＬ）、０．０１ｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）のＢＤＰ ＦＬ ＮＨＳエステル（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）及びＤＩＥＡ（０．０２ｍＬ、０．１２ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。反応物を終夜撹拌した。収量０．００２６ｇの赤色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ４６Ｈ５０ＢＦ２Ｎ６Ｏ８Ｓ２＋に対する計算値；正確な質量：９２７．３１８７；分子量：９２７．８６６３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値９２７．５２。
［実施例３２］
Figure 2022543618000047
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０３ｇ（０．０３９ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（１ｍＬ）、０．０１４ｇ（０．０２７ｍｍｏｌ）のＢＤＰ ＴＲ ＮＨＳエステル（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ）及びＤＩＥＡ（０．０２ｍＬ、０．１２ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。反応物を終夜撹拌した。収量０．０１９ｇの青色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５３Ｈ５０ＢＦ２Ｎ６Ｏ９Ｓ３＋に対する計算値；正確な質量：１０５９．２８５７；分子量：１０６０．００２３。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０５９．２６。
［実施例３３］
Figure 2022543618000048
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．００５ｇ（０．００６９ｍｍｏｌ）のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２カルボン酸、０．００２９ｇのＨＢＴＵ（０．００７６ｍｍｏｌ）、ＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を投入した。反応物を室温で１５分間撹拌してから、実施例２の生成物（０．０１５ｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を含有するＤＭＳＯ溶液（０．５ｍＬ）を加えた。反応物を終夜撹拌した。粗製の反応混合物をＭｅＯＨ及び水で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．００２５ｇの赤色のフィルム状物質。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ６２Ｈ６４Ｎ６Ｏ１５Ｓ４に対する計算値：正確な質量：１２６０．３３１２；分子量：１２６１．４６１０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１２６２．４２。
［実施例３４］
Figure 2022543618000049
実施例３３の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０１２ｇ（０．０１６ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）、０．００５ｇ（０．００５９ｍｍｏｌ）のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８カルボン酸、０．００２５ｇ（０．００６６ｍｍｏｌ）のＨＢＴＵ、及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００２ｇの赤色のフィルム状物質（表題化合物５（６）－混合異性体）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５３Ｈ４８Ｎ６Ｏ１７Ｓ４に対する計算値；正確な質量：１１６８．１９５９；分子量：１１６９．２３２０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１１６９．２８。
［実施例３５］
Figure 2022543618000050
実施例３３の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．００８５ｇ（０．０１１ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）、０．００５ｇ（０．００５ｍｍｏｌ）のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８カルボン酸、０．００２１ｇ（０．００５５ｍｍｏｌ）のＨＢＴＵ、及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００２５ｇの紫色のフィルム状物質（表題化合物５（６）－混合異性体）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ６５Ｈ６４Ｎ６Ｏ１７Ｓ４に対する計算値；正確な質量：１３２８．３２１１；分子量：１３２９．４９２０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１３３０．２４。
［実施例３６］
Figure 2022543618000051
磁気撹拌棒を備えた２０ｍＬ反応バイアルに、０．０７５ｇ（０．１７ｍｍｏｌ）のメチル－４－カルボキシ－ケイ素ローダミン（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２０１８年、５７巻、２４３６～２４４０頁）及び水性ＨＣｌ（１ｍＬ、６Ｍ）を投入した。内容物を９０℃に１時間加熱した。混合物を室温に冷却してから、４：１のＣＨＣｌ３：メタノール溶媒混合物で希釈した。有機層を水で洗浄し、次いでブラインで洗浄してから、硫酸ナトリウムで脱水した。溶媒を真空下で除去した。粗製の固体をＭｅＯＨ及び水に溶解した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ５０×２５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速７０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空下３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．０５４ｇの青色のフィルム状物質。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ２６Ｈ２９Ｎ２Ｏ２Ｓｉ＋に対する計算値；正確な質量：４２９．１９９３；分子量：４２９．６１４５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値４２９．１９。
［実施例３７］
Figure 2022543618000052
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０２５ｇ（０．０３３ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（１ｍＬ）、０．００９ｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）の４－カルボキシ－ＳｉＲ－ＰＦＰエステル（実施例３７及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート）及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００４ｇの青色のフィルム状物質（表題化合物）。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５８Ｈ６４Ｎ６Ｏ８Ｓ２Ｓｉ２＋に対する計算値；正確な質量：１０６４．３９８５；分子量：１０６５．３８７９。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０６４．４４（弱）；Ｍ＋＋５３２．４６（強）。
［実施例３８］
Figure 2022543618000053
磁気撹拌棒を備えた２０ｍＬ反応バイアルに、０．３１５ｇ（０．８４ｍｍｏｌ）の５－カルボキシフルオレセイン及び発煙硫酸（５ｍＬ、３０％遊離ＳＯ３ベース）を投入し、９０℃に１時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、次いで氷を含有するビーカーに慎重に加えてから、ＫＣｌ（１ｇ）を加えると、黄色の沈殿物が生じた。固体を濾過し、冷水及びアセトンで洗浄し、高真空下で１８時間乾燥させた。固体はさらに精製せずに次のステップで使用した。収量０．２５０ｇの黄色の固体。ＭＳ（Ｍ－）：Ｃ２１Ｈ１１Ｏ１３Ｓ２－に対する計算値；正確な質量：５３４．９６４７；分子量：５３５．４２６５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値５３４．９３。
［実施例３９］
Figure 2022543618000054
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．００９ｇ（０．０１２ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、０．００９ｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）の５－カルボキシ－４’，５’－ジスルホフルオレセイン－ＰＦＰエステル（実施例３８及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート）及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量０．００７ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（Ｍ－）：Ｃ５３Ｈ４５Ｎ４Ｏ１９Ｓ４ －に対する計算値；正確な質量：１１６９．１５６６；分子量：１１７０．１９２５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１１６９．９９。
［実施例４０］
Figure 2022543618000055
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．０１３ｇ（０．０４ｍｍｏｌ）のフルオレセイン、０．０１４ｇのＨＢＴＵ（０．０３７ｍｍｏｌ）、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を投入した。反応物を４５℃で６０分間撹拌した。次いで、溶液を室温に冷却してから、実施例２の生成物（０．０４ｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）を含有するＤＭＳＯ溶液（０．５ｍＬ）を加えた。反応物を終夜撹拌した。粗製の反応混合物をＭｅＯＨ及び水で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ５０×２５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速７０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．００２ｇの赤色のフィルム状物質。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５２Ｈ４７Ｎ４Ｏ１１Ｓ２＋に対する計算値；正確な質量：９６７．２６７７；分子量：９６８．０８４５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値９６７．３２（弱）；Ｍ＋＋４８４．３８（強）。
［実施例４１］
Figure 2022543618000056
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０１５ｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１６ｍｍｏｌ）のローダミン１９－ＮＨＳエステル（ローダミン１９及びＴＳＴＵ）及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００２ｇの赤色のフィルム状物質。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ５８Ｈ６２Ｎ６Ｏ９Ｓ２ ２＋に対する計算値；正確な質量：１０５０．４００９；分子量：１０５１．２８５９。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０４９．３１（弱）；Ｍ＋＋５２５．４６（強）。
［実施例４２］
Figure 2022543618000057
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．００６５ｇ（０．００８５ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（０．４ｍＬ）、０．００２ｇ（０．００３ｍｍｏｌ）のＡｔｔｏ ７００ ＮＨＳ－エステル、及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００３ｇの緑色のフィルム状物質。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ６２Ｈ７０Ｎ７Ｏ１２Ｓ３＋に対する計算値；正確な質量：１２００．４２３９；分子量：１２０１．４５８５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１２００．５６（弱）；Ｍ＋＋６００．９２（強）。
［実施例４３］
Figure 2022543618000058
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた２０ｍＬ反応バイアルに、０．２ｇ（０．３０ｍｍｏｌ）のＩＲ７８０ヨウ化物、ＤＭＦ（２ｍＬ）、及びメチルアミンのＴＨＦ（３ｍＬ、２Ｍ）中溶液を投入した。これを８０℃に１時間加熱し、この間溶液の色が緑色から青色に変わった。反応混合物を室温に冷却してから、生成物をジエチルエーテル中で粉砕した。生成物はさらに精製せずに次のステップで使用した。収量：０．１６０ｇの青色の粉末。ＭＳ（Ｍ＋）：化学式に対する計算値：Ｃ３７Ｈ４８Ｎ３＋；正確な質量：５３４．３８４３；分子量：５３４．８１１５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値５３４．３７。
［実施例４４］
Figure 2022543618000059
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた２０ｍＬ反応バイアルに、０．０２５ｇ（０．０３８ｍｍｏｌ）の実施例４３の生成物、ＤＣＭ（１０ｍＬ）、及び０．０３３ｇ（０．１１４ｍｍｏｌ）のトリホスゲンを投入した。反応混合物を氷浴内で０℃に冷却してから、０．３ｍＬのＤＩＥＡを加えた。撹拌を１時間継続してから、溶媒を真空下で除去した。次いで、粗材料に、０．０４０ｇ（０．０５２ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（１ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を投入した。反応混合物を室温で３６時間撹拌した。粗製の反応混合物をＭｅＯＨ及び水で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ５０×２５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速７０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．００４ｇの緑色のフィルム状物質。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ７０Ｈ８３Ｎ７Ｏ８Ｓ２ ２＋に対する計算値；正確な質量：１２１３．５７３４；分子量：１２１４．５９３９。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１２１２．５０（弱）；Ｍ＋＋６０７．０５（強）。
［実施例４５］
Figure 2022543618000060
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０１６５ｇ（０．０２１ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（１ｍＬ）、０．００８ｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）のルシファーイエローＶＳ二リチウム塩、及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００９ｇの黄色の粉末。ＭＳ（Ｍ－）：Ｃ５２Ｈ４９Ｎ６Ｏ１７Ｓ５ －に対する計算値；正確な質量：１１８９．１７６３；分子量：１１９０．２８９５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１１８９．４２。
［実施例４６］
Figure 2022543618000061
磁気撹拌棒を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．１１０ｇ（０．３０ｍｍｏｌ）のルシファーイエロー無水物、０．１２３ｇ（１．６５ｍｍｏｌ）のグリシン、及び酢酸ナトリウム（３ｍＬ、１Ｍ）の水溶液を投入した。混合物を９０℃に加熱し、終夜撹拌した。粗製の反応混合物をＭｅＯＨ及び水で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ５０×２５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速７０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量：０．１２０ｇの黄色の粉末。ＭＳ（Ｍ－）：Ｃ１４Ｈ９Ｎ２Ｏ１０Ｓ２に対する計算値；正確な質量：４２８．９７０４；分子量：４２９．３５０５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値４２９．０５。
［実施例４７］
Figure 2022543618000062
実施例１２の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０８５ｇ（０．１１ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、ＤＭＦ（１ｍＬ）、０．０４０ｇ（０．０７６ｍｍｏｌ）の実施例４６の生成物－ＮＨＳエステル（実施例４６及びＴＳＴＵ）及びＤＩＥＡ（０．１７ｍＬ、１ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．０１８ｇの黄色の粉末。ＭＳ（Ｍ－）：Ｃ４６Ｈ４３Ｎ６Ｏ１６Ｓ４－に対する計算値、正確な質量：１０６３．１６２４、分子量：１０６４．１１６５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１０６３．２４。
［実施例４８］
Figure 2022543618000063
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．０１３ｇ（０．０１２ｍｍｏｌ）の実施例４７の生成物、０．００５５ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）のＴＳＴＵ、ＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を投入した。ミックスを室温で１時間撹拌してから、少量のＡＣＮ中で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．０５％ギ酸で使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量：０．００８ｍｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ５０Ｈ４６Ｎ７Ｏ１８Ｓ４－に対する計算値；正確な質量：１１６０．１７８８；分子量：１１６１．１８９５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１１６０．２８。
［実施例４９］
Figure 2022543618000064
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．００６ｇ（０．００５２ｍｍｏｌ）の実施例４８の生成物、０．０２０ｇ（０．０６２ｍｍｏｌ）のアミノ－ｄＰＥＧ（登録商標）４－ｔ－ブチルエステル、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を投入した。混合物を１時間撹拌してから、少量のＡＣＮ中で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ギ酸で使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。精製した材料を、撹拌棒を備えた４ｍＬ反応バイアルに移し、１ｍＬのＤＣＭ及び１ｍＬのＴＦＡに溶解した。混合物を１時間撹拌してから、溶媒を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。さらなる精製は必要なかった。収量：０．００８８ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ５７Ｈ６４Ｎ７Ｏ２１Ｓ４－に対する計算値；正確な質量：１３１０．３０４４；分子量：１３１１．４０７５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１３１０．８２。
［実施例５０］
Figure 2022543618000065
実施例４８の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．００８８ｇ（０．００６７ｍｍｏｌ）の実施例４９の生成物、０．００３ｇ（０．０１０ｍｍｏｌ）のＴＳＴＵ、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。精製及び蒸発後、１０％の材料を加水分解して、カルボン酸形態に戻した。収量：０．００６ｇ。ＭＳ（－）：Ｃ６１Ｈ６７Ｎ８Ｏ２３Ｓ４－に対する計算値；正確な質量：１４０７．３２０７；分子量：１４０８．４８０５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１４０８．５０。
［実施例５１］
Figure 2022543618000066
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．００７ｇ（０．００７２ｍｍｏｌ）の実施例２９の生成物、０．００２６ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）のＥＤＣ、０．００３６ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）のＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を投入した。反応物を終夜撹拌してから、少量のＡＣＮ中で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．０５％ギ酸で使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量：０．００２５ｇ。ＭＳ（＋）：Ｃ５２Ｈ５６ＢＦ２Ｎ７Ｏ１３Ｓ３に対する計算値；正確な質量：１１３１．３１５９；分子量：１１３２．０４２８。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値（Ｍ－Ｆ）＋１１１２．２０。
［実施例５２］
Figure 2022543618000067
実施例５１の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．００９ｇ（０．００８５ｍｍｏｌ）の実施例３２の生成物、０．００２６ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）のＥＤＣ、０．００３６ｇ（０．０１７ｍｍｏｌ）のＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００１３ｇ。ＭＳ（＋）：Ｃ５７Ｈ５２ＢＦ２Ｎ７Ｏ１４Ｓ４に対する計算値；正確な質量：１２３５．２５１６；分子量：１２３６．１２４８。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値（Ｍ－Ｆ）＋１２１６．４０。
［実施例５３］
Figure 2022543618000068
撹拌棒及び窒素入口を備えた１００ｍＬ ＲＢフラスコに、プロパルギルトリフレート（Ｊ．Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．、１９７７年、４２巻、３１０９～３１１３頁）（２０．９８ｍｍｏｌ）及びＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を投入した。この溶液に、２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルピリジン（６．９６ｍＬ、３１．４５ｍｍｏｌ）を加え、これに続いてアクリジン（Ｊ．Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ．、１９９８年、６３巻、５６３６～５６３９頁）（１．００ｇ、２．１０ｍｍｏｌ）を加え、１８時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮した。１０％～９０％アセトニトリル／０．５％ＴＦＡを含むＨ２Ｏの勾配法を使用して、残渣を逆相ＨＰＬＣで精製した。所望の画分を収集し、プールし、凍結し、凍結乾燥させて、１．２１３ｇの表題化合物を黄色の固体として生成した（定量的収量）。収量：１．２１３ｇの黄色の固体。ＭＳ（＋）：Ｃ２９Ｈ２７Ｎ２Ｏ５Ｓ＋に対する計算値；正確な質量：５１５．６；分子量：５１５．６。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値（Ｍ）＋５１４．８５。
［実施例５４］
Figure 2022543618000069
撹拌棒及び窒素入口を備えた５０ｍＬ Ｒｂフラスコに、実施例５３の生成物（０．０１４ｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）、５－アジドフルオレセイン（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４巻、１７４２８～１７４３１頁）（０．０１０ｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ：Ｈ２Ｏ（２ｍＬ、１：１）の溶液を投入した。この混合物に、銅（ＩＩ）硫酸塩（０．００１ｇ、０．００１ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１００μＬ）中溶液を加え、これに続いてアスコルビン酸ナトリウム（０．００１ｇ、０．００５ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１００μＬ）中溶液を加え、１８時間撹拌した。混合物を、１０％～９０％アセトニトリル／０．５％ＴＦＡを含むＨ２Ｏの勾配法を使用して精製した逆相ＨＰＬＣで精製した。所望の画分を収集し、凍結し、凍結乾燥して、１４ｍｇの表題化合物を生成した（５８％）。収量：０．０１４ｇ。ＭＳ（＋）：Ｃ４９Ｈ３９Ｎ５Ｏ１１Ｓ＋に対する計算値；正確な質量：８８８．２３；分子量：８８８．９２。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値（Ｍ）＋８８８．４６。
［実施例５５］
Figure 2022543618000070
撹拌棒及び窒素入口を備えた２５ｍＬ ＲＢフラスコに、ＣＰＳＰ（０．０２０ｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．０１４ｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．００５ｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（２ｍＬ）を投入した。この混合物に、ＤＩＥＡ（０．０３０ｍＬ、０．１７１ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌した。この混合物に、４’－アミノメチルフルオレセイン（米国特許第４，５１０，２５１号、１９８５年）（０．０３４ｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）を加え、１８時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮した。１０％～９０％アセトニトリル／０．５％ＴＦＡを含むＨ２Ｏの勾配法を使用して、残渣を逆相ＨＰＬＣで精製した。所望の画分を収集し、凍結し、凍結乾燥させて、０．０１０ｇの表題化合物を黄色－オレンジ色の固体を生成した（３２％）。収量：０．０１０ｇの黄色－オレンジ色の固体。ＭＳ（＋）：Ｃ４９Ｈ４１Ｎ３Ｏ１２Ｓ２ ＋に対する計算値；正確な質量：９２７．２１；分子量：９２８．００。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値（Ｍ）＋９２８．５０。
［実施例５６］
Figure 2022543618000071
撹拌棒及び窒素入口を備えた２５ｍＬ ＲＢフラスコに、ＣＰＳＰ（０．０５０ｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．０３６ｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）、及びＨＯＢｔ（０．０１３ｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（２ｍＬ）を投入した。この混合物に、ＤＩＥＡ（０．０７４ｍＬ、０．４２８ｍｍｏｌ）を加え、反応物を３０分間撹拌した。この混合物に、５－アミノメチルフルオレセイン（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１９９２年、３巻、４３０～４３１頁）（０．０３４ｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）を加え、１８時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮した。１０％～９０％アセトニトリル／０．５％ＴＦＡを含むＨ２Ｏの勾配法を使用して、残渣を逆相ＨＰＬＣで精製した。所望の画分を収集し、凍結乾燥して、０．０２７ｇの表題化合物を黄色－オレンジ色の固体を生成した（３４％）。収量：０．０２７ｇの黄色の－オレンジ色の固体。ＭＳ（＋）：Ｃ４９Ｈ４１Ｎ３Ｏ１２Ｓ２ ＋に対する計算値；正確な質量：９２７．２１；分子量：９２８．００。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値（Ｍ＋Ｈ）＋９２９．４５。
［実施例５７］
Figure 2022543618000072
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．００７ｇ（０．００７２ｍｍｏｌ）の実施例２の生成物、０．００３ｇ（０．００３ｍｍｏｌ）のＤＴＢＴＡ－Ｅｕ３＋（Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００６年、４巻、４０８８～４０９６頁）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を投入した。反応物を終夜撹拌してから、少量のＡＣＮ／Ｈ２Ｏ中で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．０５ギ酸で使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量０．００２ｇの薄黄色の粉末。ＭＳ（Ｍ＋）：Ｃ７２Ｈ６５ＣｌＥｕＮ１３Ｏ１５Ｓ２ ４＋に対する計算値；正確な質量：１６０３．３０４３；分子量：１６０３．９１９８。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１６０４．６５。
［実施例５８］
Figure 2022543618000073
実施例４９の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．０１１ｇ（０．００９５ｍｍｏｌ）の実施例４８の生成物、０．０４５ｇ（０．０９０ｍｍｏｌ）のアミノ－ｄＰＥＧ（登録商標）８－ｔ－ブチルエステル、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００６ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ６５Ｈ８１Ｎ７Ｏ２５Ｓ４－に対する計算値；正確な質量：１４８７．４１６５；分子量：１４８８．６２７０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１４８７．７１。
［実施例５９］
Figure 2022543618000074
実施例４８の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．００６ｇ（０．００６７ｍｍｏｌ）の実施例５８の生成物、０．００２ｇ（０．００６７ｍｍｏｌ）のＴＳＴＵ、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．０３ｍＬ、０．１７ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００４ｇＭＳ（－）：Ｃ６９Ｈ８４Ｎ８Ｏ２７Ｓ４－に対する計算値；正確な質量：１５８４．４３２９；分子量：１５８５．７０００。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１５８４．７５。
［実施例６０］
Figure 2022543618000075
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．００６ｇ（０．００５２ｍｍｏｌ）の実施例４８の生成物、０．０２５ｇ（０．２５ｍｍｏｌ）の３－アジド－１－プロパンアミン、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を投入した。混合物を１時間撹拌してから、少量のＡＣＮ中で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ギ酸で使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量：０．００３ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ４９Ｈ５０Ｎ１０Ｏ１５Ｓ４ －に対する計算値；正確な質量：１１４５．２２６７；分子量：１１４６．２２６５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１１４５．６３。
［実施例６１］
Figure 2022543618000076
実施例６０の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．００６ｇ（０．００５２ｍｍｏｌ）の実施例４８の生成物、０．０３０ｇ（０．０７６ｍｍｏｌ）のアジド－ｄＰＥＧ（登録商標）７－アミン、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００４ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ６２Ｈ７６Ｎ１０Ｏ２２Ｓ４に対する計算値；正確な質量：１４４０．４０１８；分子量：１４４１．５７８０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１４４０．８２。
［実施例６２］
Figure 2022543618000077
実施例６０の調製に対して概説されている類似の手順を使用して、０．００７５ｇ（０．００６５ｍｍｏｌ）の実施例４８の生成物、０．０２０ｇ（０．０７６ｍｍｏｌ）のＭＰＳ－ＥＤＡ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００２ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ５５Ｈ５４Ｎ９Ｏ１８Ｓ４ －に対する計算値；正確な質量：１２５６．２４７５；分子量：１２５７．３２２５。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１２５６．５３
［実施例６３］
Figure 2022543618000078
実施例６０の調製に対して概説されている類似の手順を使用して０．００６ｇ（０．００５２ｍｍｏｌ）の実施例４８の生成物、０．００５ｇ（０．００６７ｍｍｏｌ）の２－（６－アミノヘキサンアミド）－チロキシン（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１９９７年、８巻、１３３～１４５頁）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を利用して、表題化合物を調製した。収量：０．００５ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ６７Ｈ６５Ｉ３Ｎ８Ｏ２０Ｓ４ －に対する計算値；正確な質量：１８１０．０３３２；分子量：１８１１．２４６４。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１８１０．５９（弱）；Ｍ２－９０４．９９（強）。
［実施例６４］
Figure 2022543618000079
磁気撹拌棒及び窒素入口を備えた４ｍＬ反応バイアルに、０．００４ｇ（０．００２５ｍｍｏｌ）の実施例５９の生成物、０．００８２ｇ（０．０１３ｍｍｏｌ）のチロキシン、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（０．０１ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を投入した。混合物を１時間撹拌してから、少量のＡＣＮ中で希釈した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムで溶出することにより、全溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）を移動相ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５％ギ酸で使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収量：０．００２ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ８０Ｈ９０Ｉ３Ｎ８Ｏ２８Ｓ４ －に対する計算値；正確な質量：２１１９．１８８７；分子量：２１２０．５８２０。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値Ｍ２－１０５９．８２
［実施例６５］
Figure 2022543618000080
実施例５０（０．００１８ｇ、０．００１３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．２５ｍＬ）中溶液を、ビオチン－ｄＰＥＧ７－ＮＨ２（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎカタログ＃１０８２６、０．０３０ｇ）のＤＭＦ（１ｍＬ）中で処理することにより表題化合物を調製した。反応物を室温で１時間撹拌した。２５４ｎｍでモニターするＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ２０００システムを有するＹＭＣ ＯＤＳ ＡＱ ３０×１５０ｍｍＩ．Ｄ．スチールカラムを使用して、生成した溶液を逆相ＨＰＬＣで精製した。レコーダーチャートのスピードは５ｍｍ／分である。マニュアルステップ勾配法（流速４０ｍＬ／分）をＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｈ２Ｏ～０．５ＴＦＡで使用した。生成物を含有する画分を合わせ、揮発性成分を回転式エバポレーターで、真空中３０℃で、これに続いて高真空で、室温で１８時間除去した。収率０．００２４ｇの黄色のフィルム状物質。ＭＳ（－）：Ｃ８３Ｈ１１２Ｎ１１Ｏ２９Ｓ５ －に対する計算値；正確な質量：１８８６．６２３６；分子量：１８８８．１６。ＵＰＬＣ／ＭＳ実測値１８８７．５９。
［実施例６６］
化学発光データ
可視波長帯における全化学発光スペクトルの測定のためのプロトコル。装置：Ａｎｄｏｒ Ｓｈａｍｒｏｃｋ ３０３ｉ画像分光器、５０ライン／ｍｍでの刻線格子、６００ｎｍブレーズ、ＭｇＦ２コーティングしたアルミニウム、１００μｍ入射スリット。Ａｎｄｏｒ ｉＸｏｎＥＭ＋５１２×５１２ＣＣＤカメラ、モデルＤＵ－８９７Ｅ－ＣＳＯ－＃ＢＶ、５５０ｎｍＡＲコーティングした裏面照射型センサー。ＣＣＤ検出器チップは、１６μｍ２ピクセルを有する、電子増倍読出し付きＥ２Ｖ Ｔｅｃｈ ＣＣＤ９７。熱電冷却は－７０℃までであった。最大感受性のために、チップの大部分の範囲をカバーする、垂直線に沿ったピクセル（カラム）ビニング（スリットの画像）を選択した。分光器のソフトウェアを使用して、Ａｒ－Ｈｇペンランプのいくつかの水銀ラインにより、検出波長を較正し、検出器において得たスペクトル分散はおよそ１ｎｍ／ピクセルであった。統合は５秒であった。これは普通、化学発光の約５の減衰寿命である。ソフトウェア：Ａｎｄｏｒ Ｓｏｌｉｓ ｆｏｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｘ３９６４、バージョン４．３。試薬：Ａｒｃｈｉｔｅｃｔプレトリガー溶液、６Ｅ２３－６５と洗剤、酸性、及び過酸化水素；Ａｒｃｈｉｔｅｃｔトリガー溶液、６Ｃ５５－６０と洗剤及び塩基。方法：Ｈｉ－Ｔｅｃｈ Ｒａｐｉｄ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ、モデルＳＦＡ－１１を使用して、ユーザーマニュアルに従い、チャンバ内で、２０ｍｓ未満の溶液を混合した。ホットキーによりソフトウェアデータ収集をトリガーし、２本の２．５ｍＬシリンジを手作業で押して、キュベット内で５０：５０の混合を達成した。統合の開始から混合までの遅延は０．５秒未満であると予測された。２ｍｍの経路長をもたらすようにキュベットを方向づけた。フルオロフォアごとに適当な波長においてＵＶ吸光度により決定される場合、試料は通常５００ナノモル濃度で試験した。
複数波長での化学発光の照度計プレートリーダー測定に対するプロトコル。装置：Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０マイクロプレートリーダー；オプティカルフィルター、Ｓｅｍｒｏｃｋ Ｂｒｉｇｈｔｌｉｎｅ シングル－バンドバンドパス、多層誘電体、４４２／４６ｎｍ、５３１／４６ｎｍ；ホワイト９６ウェルプレート、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ Ｉ、Ｔｈｅｒｍｏ ６９０５。ソフトウェア：Ｍｉｋｒｏｗｉｎ ２０００ｖ．４．４１。試薬：Ａｒｃｈｉｔｅｃｔプレトリガー溶液、６Ｅ２３－６５と洗剤、酸、及び過酸化水素；Ａｒｃｈｉｔｅｃｔトリガー溶液、６Ｃ５５－６０と洗剤及び塩基。Ａｒｃｈｉｔｅｃｔプレトリガー溶液中の５０μＬの試験化合物を９６ウェルプレートのウェル内に配置し、各波長測定に対して別個のウェルに充填した。方法：フルオロフォアごとの適当な波長における吸光度により決定される場合、試料は通常２０～２００ｐＭ濃度で試験した。照度計において、適当な波長のオプティカルフィルターを読出し用に選択した。７５μＬのＡｒｃｈｉｔｅｃｔトリガー溶液を検出直前に各ウェルに注入した。０．１秒間隔で１０秒にわたり、光カウント数を光電子増倍管により測定した。読取値は三重反復で測定した。上記アッセイの結果は表１に提示されている。
Figure 2022543618000081
Figure 2022543618000082
［実施例６７］
アセトアミドリンカー及びフルオレセインの単離した５カルボキシ異性体及び６カルボキシ異性体を使用して、フルオロフォア結合点及びリンカー長を試験した。図１に示されているデータにより、シフトした発光は、フルオロフォア結合点により決定され、このフルオロフォア結合点は、２つの種又は種の凝集の全体的方向性に違いをもたらすことができ、短いリンカー構成において発光をシフトさせる能力を変化させたことが実証されている。
フルオレセインの５及び６カルボキシ異性体を、ピペラジンリンカーを使用してさらに試験した。データは図２に示されている。シフトした発光は１００％付近の効率で観察されたが、強度の差異が５異性体部分と６異性体部分の間で観察された。強度の差異は、化学発光をもたらす化学反応の障害、おそらくクエンチ若しくは非放射性減衰経路をもたらす好ましくない方向性、又は吸光度／発光プロファイルの変化をもたらす化合物の凝集、に起因し得る。これらの結果は、フルオロフォア結合点の選択がシフトした発光に対する重要な要素であることを表している。
５／６カルボキシローダミン染料混合物と２カルボキシローダミン染料の両方を使用して、発光効率についてフルオロフォア結合点及びリンカー長も試験した。データは図３に示されている。５／６カルボキシローダミンは効率的なシフトした発光を示した一方で、２カルボキシローダミンは、大部分の状況で効率的なシフトした発光を示したが、リンカーの種類に応じて一部の相違があった。例えば、２－カルボキシローダミンＢはジメチル－ＰＥＧ（２）－ジアミンリンカーを介してアクリジニウムに結合した場合、効率的な安定した、シフトした発光を示したが、同じ２－カルボキシローダミンＢはピペラジン連結を介してアクリジニウムに結合した場合、測定間隔内でアクリドンの発光レベルの増加を示した。これらの知見は、構造体は利用したトリガー条件下で安定し得ないことを示唆している。対照的に、２カルボキシローダミン６Ｇは、シフトした発光が９０％のみで、１０％の青色光が観察されたが、ピペラジン連結を介してアクリジニウムに結合した場合、安定したシフトした発光を生成するようにみえた。
カルボキシプロピルスルホプロピルアクリジニウムの、スルホプロピル部分とカルボキシプロピル部分の間でフルオロフォアの位置を変化させて、開始剤結合点について試験した。カルボキシプロピル基への結合は、フルオロフォアをアクリジニウム／アクリドン分子の脱離基上に位置づける。したがって、トリガーすると、フルオロフォアは生成したアクリドン部分から解離する。２つのフルオレセイン化合物を、キサンテン環結合点又はフェニル環結合点を介してアクリジニウムに結合させて、２つの異なる分子の方向性を試験した。４４２ｎｍ及び５３１ｎｍフィルターを装着した照度計で発光を測定した。データは図４に示されている。カルボキシプロピル開始剤の結合を用いて調製したフルオレセイン化合物は、シフトした発光を示すことができず、アクリジニウム対照と類似の波長光を生成した。好ましいピペラジン連結でのカルボキシプロピルの修飾も試したが、アクリジニウム対照と類似の発光をもたらした。図４は、調製したカルボキシプロピル化合物の選択に対して、各フィルターチャネルにおける光の出力及び分布が、アクリジニウム対照化合物のものと合致したことを示している。
様々な長さ及び剛性のジアミンリンカーを使用して、リンカーの種類及びリンカー長を試験した。剛性リンカーは、開始剤及び受容体を、シフトした発光に対して好ましい方向性に保持することができる一方、より長いリンカーは好ましい方向性へと曲げる及び巻き付けるための柔軟性を有し得る。データは図５に示されている。シフトした発光は化合物のそれぞれに対して１００％付近の効率で観察された。しかし強度の差異がエチレンジアミンリンカーに対して観察された。強度の差異は、化学発光をもたらす化学反応の障害、又はおそらくクエンチ又は非放射性減衰経路をもたらす好ましくない方向性、に起因し得る。これらのデータは、リンカーの選択がシフトした発光に対して重要な要素であり得ることを例示している。
本実施例は、いくつかの構造的要素が、シフトした波長発光を有する化学発光性アクリジニウム化合物を開発する上で重要であることを実証している。トリガー条件に対するフルオロフォアの安定性は有意な重要性を持つ。例えば、シアニン及びケイ素ローダミン染料のアクリジニウムへの連結は、短いシフトした発光、これに続くアクリドン発光をもたらし、これは、マトリックスをトリガーする上で起こり得る構造体の不安定さを示している。水溶性は、イムノアッセイなど、水性ベースでの使用に機能するために必要とされる別の要素である。全体として、リンカー長、フルオロフォア結合点、及び開始剤結合の選択は、シフトした発光を促進する。理論により限定されることを望むことなく、これら３つの基準は互いに対するフルオロフォア及び開始剤の方向性、したがってシフトした発光の効率を決定するようにみえる。
［実施例６８］
ＨＩＶ ｐ２４ｍＡｂ－アクリジニウム－ルシファーイエローコンジュゲート。乾燥粉末をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で再構成することにより、実施例４８の化合物のストック溶液を調製した。ｐＨ５．５ ＭＥＳ緩衝液を使用して、ストック溶液の２つの１００×希釈物を調製した。Ｃａｒｙ６０ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を使用して、吸光度を３７０ｎｍで読み取ることにより濃度を決定した。
およそ０．３ｍｇのＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂを、３５μＬの１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加え、５μＬのスパイキング緩衝液（７．５％ＣＨＡＰＳを含む２５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ８）を使用してｐＨを調節して、別個の反応容器内で最終反応ｐＨ７．５及び最終ＣＨＡＰＳ濃度０．５％を達成した。容器を光から保護し、ｍＡｂのモルに対してモルインプット比６、９、又は１２を達成するように、実施例４８の化合物のストック溶液をそれぞれ反応容器に加えた。反応容器を軽くボルテックスして、次いで、光から保護しながら、終夜およそ２０時間静的にインキュベートした。この後、反応容器を遠心分離して、不溶性凝集物を分離し、移動相１０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ６．３を有するＴＳＫＧｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム上で、ＨＰＬＣにより、上澄み液中に残留するタンパク質を精製した。流速１ｍＬ／分を使用し、溶出液をフォトダイオードアレイ検出器で、２８０ｎｍ、３７０ｎｍ、及び４３１ｎｍでモニターした。タンパク質及び実施例４８の標識濃度をＵＶ－Ｖｉｓ（それぞれ２８０及び３７０ｎｍ）で決定した。ＨＩＶ ｍＡｂのモル濃度に対して実施例４８のモル濃度を割り算することにより、タンパク質組込み比（ＩＲ）に対する標識を決定した。最終ＩＲ値２．０、２．５、及び３．０を、１：６、１：９、１：１２のモルインプット比に対してそれぞれ達成した。タンパク質コンジュゲートは、使用時まで、光から保護しながら２～８℃で貯蔵した。
補正したＡ２８０濃度（Ａ２８０吸光度から、アクリジニウムのＡ２８０寄与率を引いたもの）をアクリジニウムのＡ３７０吸光度で割ることにより、タンパク質組込み比に対する標識を決定した。タンパク質コンジュゲートは、使用時まで２～８℃で貯蔵した。
［実施例６９］
抗ヒトＩｇＭ ｍＡｂ－アクリジニウム－ルシファーイエローコンジュゲート。乾燥粉末をＤＭＳＯ中で再構成することにより、実施例４８の化合物のストック溶液を調製した。ｐＨ５．５ ＭＥＳ緩衝液を使用して、ストック溶液の２つの１００×希釈物を調製した。Ｃａｒｙ６０ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を使用して、吸光度を３７０ｎｍで読み取ることにより濃度を決定した。
およそ０．３ｍｇの抗ヒトＩｇＭ ｍＡｂを３５μＬの１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加え、５μＬのスパイキング緩衝液（７．５％ＣＨＡＰＳを含む２５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ８）を使用してｐＨを調節して、最終反応ｐＨ７．５及び最終ＣＨＡＰＳ濃度０．５％を達成した。容器を光から保護し、ｍＡｂのモルに対してモルインプット比８．５を達成するように、実施例４８の化合物のストック溶液を加えた。反応容器を軽くボルテックスして、次いで、光から保護しながら、５時間静的にインキュベートした。この後、反応容器を遠心分離して、不溶性凝集物を分離し、移動相１０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ６．３を有するＴＳＫＧｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム上で、ＨＰＬＣにより、上澄み液中に残留するタンパク質を精製した。流速１ｍＬ／分を使用し、溶出液をフォトダイオードアレイ検出器で、２８０ｎｍ、３７０ｎｍ、及び４３１ｎｍでモニターした。タンパク質及び実施例４８の標識濃度を、ＵＶ－Ｖｉｓ（それぞれ２８０及び３７０ｎｍ）で決定した。ＨＩＶ ｍＡｂモル濃度に対して実施例４８のモル濃度を割り算することにより、タンパク質組込み比（ＩＲ）に対する標識を決定した。最終ＩＲ値２．６を、１：８．５モルのインプット比に対して達成した。タンパク質コンジュゲートは、使用時まで、光から保護しながら２～８℃で貯蔵した。
［実施例７０］
抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂ－アクリジニウム－フルオレセインコンジュゲート。乾燥粉末をＤＭＳＯ中で乾燥重量５ｍｇ／ｍＬに再構成することにより実施例１２の活性エステル化合物のストック溶液を調製した。
別個の反応容器内で、およそ２ｍｇの抗ヒトＩｇＧ抗体をおよそ８９０μＬの１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ８．０に加えた。容器を光から保護し、ｍＡｂのモルに対してモルインプット比３、５、又は７を達成するように、実施例１２溶液の活性エステルを各反応容器に加えた。反応容器を軽くボルテックスして、次いで、光から保護しながら、終夜、およそ１６時間静的にインキュベートした。この後、反応容器を遠心分離して、不溶性凝集物を分離し、移動相１０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ６．３を有するＰＤ１０ Ｇ２５脱塩カラムを使用して、上澄み液中に残留するタンパク質を脱塩した。７０ｎｇ／ｍＬコンジュゲートを、Ａｒｃｈｉｔｅｃｔプレトリガー及びトリガーに加えることにより、トリガー可能なカウント数を、Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ ９４０照度計で測定した。タンパク質コンジュゲートは、使用時まで光から保護しながら２～８℃で貯蔵した。
［実施例７１］
ＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂ－アクリジニウム－フルオレセインコンジュゲート。乾燥粉末をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で再構成することにより、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－ＮＨＳ（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ Ａ１３４）の１０ｍｇ／ｍＬストック溶液を調製した。ｚｅｂａスピンカラムを使用して、ＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂを脱塩し、抗体濃度をＵＶ－Ｖｉｓ吸光度２８０ｎｍで決定した。反応容器を光から保護し、ｍＡｂのモルに対してモルインプット比８を達成するように、ＤＢＣＯ溶液を加えた。反応容器を軽くボルテックスして、次いで、終夜（およそ２０時間）静的にインキュベートした。生成した溶液をＨＰＬＣで精製した。ＤＢＣＯ抗体濃度をＵＶ－Ｖｉｓ吸光度２８０ｎｍで再度決定した。実施例１２のアジド化合物のストック溶液をＤＭＳＯ中乾燥重量３．２μＭで調製した。ＤＢＣＯ抗体を、５０μＬの実施例１２アジド溶液を含む５０μＬのＤＢＣＯ抗体溶液と共に、反応容器内で、光から保護しながら終夜（２０時間）室温でインキュベートすることにより、実施例１２アジドと反応させた。ＨＩＶ ｍＡｂのモル濃度に対して実施例１２のモル濃度を割り算することにより、タンパク質組込み比（ＩＲ）に対する標識を決定した。最終ＩＲ値およそ２．０を達成した。タンパク質コンジュゲートは、光から保護しながら使用時まで２～８℃で貯蔵した。
［実施例７２］
ＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂ－アクリジニウム－ＢＯＤＩＰＹ４９３コンジュゲート。乾燥粉末をＤＭＳＯ中で再構成することによって、実施例５１の化合物のストック溶液を調製した。ｐＨ５．０ ＭＥＳ緩衝液を使用して、ストック溶液の２つの１００×希釈物を調製した。Ｃａｒｙ６０ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を使用して、吸光度を３７０ｎｍで読み取ることにより濃度を決定した。
およそ０．３ｍｇのＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂを別個の反応容器内のおよそ４０μＬの１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加えた。容器を光から保護し、ｍＡｂのモルに対してモルインプット比５、１０、又は１５を達成するように、実施例５１の化合物のストック溶液を各反応容器に加えた。反応容器を軽くボルテックスして、次いで、光から保護しながら、終夜、およそ１６時間静的にインキュベートした。この後、反応容器を遠心分離して、不溶性凝集物を分離し、移動相１０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ６．３を有するＴＳＫＧｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム上で、ＨＰＬＣにより上澄み液中に残留するタンパク質を精製した。流速１ｍＬ／分を使用して、溶出液をフォトダイオードアレイ検出器で、２８０ｎｍ、３７０ｎｍ、及び４３１ｎｍでモニターした。タンパク質及び実施例５１標識濃度をＵＶ－Ｖｉｓ（それぞれ２８０及び３７０ｎｍ）で決定した。ＨＩＶ ｍＡｂのモル濃度に対して実施例５１のモル濃度を割り算することにより、タンパク質組込み比（ＩＲ）に対する標識を決定した。溶解性コンジュゲート凝集物は、ＩＲ値８．８、７．９、及び８．４をそれぞれ１：５、１：１０、１：１５モルインプット比に対して生成し、調査したインプット比を有するＩＲに対する飽和点を表している。タンパク質コンジュゲートは、光から保護しながら使用時まで２～８℃で貯蔵した。
［実施例７３］
ＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂ－アクリジニウム－ＢＯＤＩＰＹ Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ （ＴＲ）コンジュゲート。乾燥粉末をＤＭＳＯ中で再構成することにより、実施例５２の化合物のストック溶液を調製した。ｐＨ５．５ ＭＥＳ緩衝液を使用して、ストック溶液の２つの１００×希釈物を調製した。Ｃａｒｙ ６０ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を使用して、３７０ｎｍで吸光度を読み取ることにより濃度を決定した。
およそ０．３ｍｇのＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂを、別個の反応容器内のおよそ７．５μＬの１０ｍＭリン酸緩衝液に加えた。容器を光から保護し、実施例５２の化合物のストック溶液を各反応容器に加えていずれかの１：１０のモルインプット比を達成した。実施例５２の化合物の可溶化を助けるため、量を３０％の反応容量まで増加させながら、ＤＭＳＯを加えた。最終反応容量は２５μＬであった。反応容器を軽くボルテックスし、次いで光から保護しながら、終夜、およそ１６時間、静的にインキュベートした。この後、反応容器を遠心分離して、不溶性凝集物を分離し、移動相１０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ６．３を有するＴＳＫＧｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム上でＨＰＬＣにより上澄み液中に残留するタンパク質を精製した。流速１ｍＬ／分を使用して、溶出液をフォトダイオードアレイ検出器で、２８０ｎｍ、３７０ｎｍ、及び４３１ｎｍでモニターした。溶解性凝集物が観察され、さらなる試験のために単離した。タンパク質コンジュゲートは、光から保護しながら使用時まで２～８℃で貯蔵した。
［実施例７４］
ＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂ－ＰＥＧ－アクリジニウム－ルシファーイエローコンジュゲート。乾燥粉末をＤＭＳＯ中で再構成することにより、実施例５０の化合物のストック溶液を調製した。ｐＨ５．５ ＭＥＳ緩衝液を使用して、ストック溶液の２つの１００×希釈物を調製した。Ｃａｒｙ６０ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を使用して、３７０ｎｍで吸光度を読み取ることにより濃度を決定した。
およそ０．３ｍｇのＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂを、３５μＬの１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加え、５μＬのスパイキング緩衝液（７．５％ＣＨＡＰＳを含む２５０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ８）を使用してｐＨを調節して、最終反応ｐＨ７．５及び最終ＣＨＡＰＳ濃度０．５％を達成した。容器を光から保護し、ｍＡｂのモルに対してモルインプット比２０を達成するように、実施例５０のストック溶液からの化合物を反応容器に加えた。反応容器を軽くボルテックスして、次いで、光から保護しながら、終夜、およそ１６時間静的にインキュベートした。この後、反応容器を遠心分離して、不溶性凝集物を分離し、上澄み液中に残留するタンパク質を、移動相１０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ６．３を有するＴＳＫＧｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム上で、ＨＰＬＣにより精製した。流速１ｍＬ／分を使用し、フォトダイオードアレイ検出器で、２８０ｎｍ、３７０ｎｍ、及び４３１ｎｍで溶出液をモニターした。タンパク質及び実施例５０標識濃度をＵＶ－Ｖｉｓ（それぞれ２８０及び３７０ｎｍ）で決定した。ＨＩＶ ｍＡｂのモル濃度に対して実施例５０のモル濃度を割り算することにより、タンパク質組込み比（ＩＲ）に値する標識を決定した。１：２０モルインプット比に対して、最終ＩＲ値４．０を達成した。タンパク質コンジュゲートは、光から保護しながら使用時まで２～８℃で貯蔵した。
［実施例７５］
抗ヒトＩｇＧ ＭＡＢ－ルシファーイエロー－ＣＰＳＰ－ＰＥＧ４アクリジニウムコンジュゲート。乾燥粉末をＤＭＳＯ中で９．３ｍｇ／ｍＬに再構成することにより、ルシファーイエロー－ＣＰＳＰ－ＰＥＧ４活性エステル（実施例５０）のストック溶液を調製した。
およそ１ｍｇの抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂを、５０ｍＭリン酸カリウム１５０ｍＭ塩化カリウムｐＨ８．０に対して、０．２Ｌ／ｍＬの比で透析した。透析後、光から保護された反応容器内で、０．７ｍｇの抗体を、シクロデキストリン（反応物中３０％）を含有する６０μＬのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０に加えた。ｍＡｂのモルに対してモルインプット比１０を達成するように、ルシファーイエロー－ＣＰＳＰ－ＰＥＧ４アクリジニウム溶液を反応容器に加えた。反応容器を軽くボルテックスし、光から保護しながら、終夜、およそ２２時間静的にインキュベートした。反応容器を遠心分離して不溶性凝集物を分離し、移動相１０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ６．３を有するＧ３０００カラム上でＳＥＣ－ＨＰＬＣを介して残留する上澄み液を精製した。ＵＶ－ＶＩＳを介してコンジュゲートＩＲを決定し、Ａ２８０及びＡ３７０を測定した。タンパク質コンジュゲートは２～８℃で貯蔵した。
［実施例７６］
抗ＴＳＨＭＡＢ－ルシファーイエロー－ＣＰＳＰ－ＰＥＧ４アクリジニウムコンジュゲート。乾燥粉末をＤＭＳＯ中で９．３ｍｇ／ｍＬに再構成することにより、ルシファーイエロー－ＣＰＳＰ－ＰＥＧ４活性エステル（実施例５０）のストック溶液を調製した。
およそ３ｍｇの抗ＴＳＨ ｍＡｂをＺｅｂａ脱塩カラム上でリン酸緩衝液ｐＨ８．０へと脱塩した。脱塩後、光から保護された反応容器内で、２．６ｍｇの抗体をシクロデキストリン（反応物中３０％）、ｐＨ８．０を含有する２００μＬのリン酸緩衝液に加えた。ｍＡｂのモルに対してモルインプット比７．５を達成するように、ルシファーイエロー－ＣＰＳＰ－ＰＥＧ４アクリジニウム溶液を反応容器に加えた。反応容器を軽くボルテックスして、光から保護しながら、終夜およそ１８時間静的にインキュベートした。反応容器を遠心分離して、不溶性凝集物を分離し、移動相１０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ６．３を有するＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００カラム上でＳＥＣを介して、残留する上澄み液を精製した。ＵＶ－ＶＩＳを介してコンジュゲートＩＲを決定し、Ａ２８０及びＡ３７０を測定した。タンパク質コンジュゲートは２～８℃で貯蔵した。
［実施例７７］
抗ＮＧＡＬ ｍＡｂビオチン－アクリジニウム－ルシファーイエロー（ＬＹ）。ＤＭＳＯ中で乾燥粉末を乾燥重量１０ｍｇ／ｍＬへと別々に再構成することにより、ビオチン活性エステル（購入したもの）及びアクリジニウムルシファーイエロー（実施例４８）のストック溶液を調製した。
およそ２００μｇの抗ＮＧＡＬ ＩｇＧ抗体をおよそ１００μＬの１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ８．０に加えた。容器を光から保護し、ｍＡｂのモルに対して５倍のモルインプット比を達成するように、ビオチンの活性エステル溶液を加えた。反応容器を軽くボルテックスし、次いで、光から保護しながら、終夜、およそ１６時間静的にインキュベートした。次いで、溶液を脱塩カラム（Ｚｅｂａスピン脱塩カラム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ製）に充填した。吸収スペクトルをＡ２８０ｎｍで測定することにより、標識した抗体の濃度を決定した。Ａ２８０に対する吸光係数は１．４５／ｍｇ／ｍＬであった。次いで、精製したタンパク質を、１：０．５のモル比（ｍＡｂ：アクリジニウム－ＬＹ）で、アクリジニウム－ルシファーイエローの活性エステルともう１６時間反応させた。標識に使用したアクリジニウム－ＬＹの量は、故意に低く保持した。未反応のアクリジニウム－ＬＹを別の脱塩カラムで除去することが好ましいが、生成物はさらに精製せずに使用することもできる。タンパク質コンジュゲートは、光から保護しながら使用時まで２～８℃で貯蔵した。
［実施例７８］
多重化アッセイの評価 － サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩｇＧ及びＩｇＭアッセイ。ＣＭＶ ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体検出キット（総ＣＭＶ（Ｔｏｔａｌ ＣＭＶ））は、ＣＭＶ ＩｇＧ抗体検出では抗ヒトＩｇＧ抗体－アクリジニウム－フルオレセインコンジュゲート（７０ｎｇ／ｍＬ、実施例７０）、また、ＣＭＶ ＩｇＭ抗体検出では抗ヒトＩｇＭ抗体－アクリジニウムコンジュゲート（２５ｎｇ／ｍＬ）を、ＭＥＳ緩衝液を含有するＡｒｃｈｉｔｅｃｔ ＣＭＶ ＩｇＧコンジュゲート希釈剤中で希釈することにより組み立てた。実験コンジュゲートボトルを、Ａｂｂｏｔｔが市場に出しているＣＭＶマイクロ粒子、及びアッセイ特異的希釈剤（ＡＳＤ）（Ａｂｂｏｔｔリストナンバー６Ｃ１５）と組み合わせた。マイクロ粒子の処理は、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ機器の９６ウェルプレートを使用して行い、発光の読取は、Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ ９４０ルミノメーターで行った。簡潔には、９６ウェルプレートは、マイクロ粒子、ＡＳＤ、及び１列目の試料で調製し、およそ１８分振とうしながらインキュベーションした。２～４列目は、２００μＬ洗浄緩衝液と入れ、試料のインキュベーション後に粒子を３回洗浄した。マイクロ粒子を、コンジュゲートを含有する５列目に移し、４分間インキュベーションした。マイクロ粒子は、６～８列目中の２００μＬ洗浄緩衝液を使用してさらに３回洗浄した。最終的に、マイクロ粒子は、１００μＬ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔプレトリガーを含有する９列目に移し、５分間インキュベーションした。インキュベーション後、３３μＬの反応混合物を３通りで新しい９６ウェルプレートに移し、Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ ９４０ルミノメーターに置いた。ルミノメーター上の注入器は、Ａｒｃｈｉｔｅｃｔトリガーを各ウェルに分注し、続いて、波長フィルターの有無を問わず１０秒化学発光を採光するようにプログラムした。３通りの反応ウェルを使用して、フィルターなし、緑色フィルター、及び青色フィルターで読み取った。４４２／４６ｎｍフィルターを使用して青色光を捕捉し、５３１／４６ｎｍフィルターを使用して緑色光を捕捉した。各ウェルに対する相対光単位（ＲＬＵ）の読取値は、読取窓の最初の３秒の全体の光出力を加算することにより生成した。
ＣＭＶ ＩｇＧのみの試料（Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ ＣＭＶ陽性対照）を、相対量の公知のＣＭＶ ＩｇＭのみを含有する試料と組み合わせた多重化試験を行った。比が０：１００、２５：７５、５０：５０、７５：２５、及び１００：０のＩｇＭとＩｇＧを含有する試料を作り出した。フィルターなし、緑色フィルター、及び青色フィルターで生成されたシグナルを処理及び分析した。図６に示されている結果から、組み立てられた試薬キットは、単一の試料における混合されたＩｇＭ及びＩｇＧシグナルを識別できることが実証された。
［実施例７９］
多重化アッセイ評価 － ＨＩＶ抗原及び抗体の組合せアッセイ。ＨＩＶ抗原及び抗体検出キット（ＨＩＶ Ｃｏｍｂｏ）は、ＨＩＶ抗原検出ではＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂ－アクリジニウム－フルオレセインコンジュゲート（１２５ｎｇ／ｍＬ、実施例７１）、また、ＨＩＶ抗体検出ではＨＩＶ抗原－アクリジニウムコンジュゲート（５０ｎｇ／ｍＬ）を、リン酸緩衝液、ウシ血清アルブミン、及び界面活性剤を含有するＡｒｃｈｉｔｅｃｔ ＨＩＶ Ｃｏｍｂｏコンジュゲート希釈剤中で希釈することにより組み立てた。実験コンジュゲートボトルを、Ａｂｂｏｔｔが市場に出しているＨＩＶ Ｃｏｍｂｏマイクロ粒子及びアッセイ特異的希釈剤（Ａｂｂｏｔｔリストナンバー２Ｐ３６）と組み合わせた。アッセイ試験は、２チャネル光学構成で改造したＡｂｂｏｔｔ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ自動化イムノアッセイアナライザーで行った。簡潔には、デュアル光電子増倍管（ＰＭＴ）組立体を構築し、そこで、５００ｎｍ波長をカットオフするダイクロイックミラーを使用して、低波長の光（青）を垂直のＰＭＴに反射させる一方、高波長の光（緑）に、第２のＰＭＴへ向けて鏡を通過させた。適切なフィルターは、ダイクロイックミラーの後方に置いて、光を、それぞれのＰＭＴに達する前にさらにフィルターした。Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ機器のハードウェアを使用して、反射された（青）ＰＭＴからの出力を読み取る一方、別のカウンターモジュール及びラップトップコンピュータのインターフェースを使用して、インライン（緑）ＰＭＴからのシグナルを集めた。カスタムＩＤＬコードを開発して、インラインＰＭＴからのシグナルを自動的に処理した。ＣＭＩＡ技術を使用して２－ステップイムノアッセイを行うアッセイ試験は、市場に出ているＡｒｃｈｉｔｅｃｔ ＨＩＶ Ｃｏｍｂｏアッセイファイルを使用して行った。簡潔には、試料、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ洗浄緩衝液、アッセイ希釈剤、及びマイクロ粒子を、第１のステップで組み合わせた。試料中に存在するＨＩＶ ｐ２４ 抗原及びＨＩＶ抗体は、ＨＩＶ抗原及びＨＩＶ ｐ２４ ｍＡｂコーティングマイクロ粒子に結合する。洗浄後、アクリジニウム－標識コンジュゲートを添加し、マイクロ粒子上に捕捉されたＨＩＶ ｐ２４抗原及びＨＩＶ抗体に結合させる。もう１つの洗浄サイクル後、プレトリガー及びトリガー溶液を反応混合物に加えて、化学発光性シグナルを誘発し、これを相対的光単位（ＲＬＵ）として測定する。
通常のヒト血漿が上昇又は低下レベルのＨＩＶ抗体及びＨＩＶ ｐ２４ 抗原でスパイクされる多重化試験を行った。４００、３００、２００、１００、及び０ｐｇ／ｍＬ ｐ２４抗原を、０、４５、９０、１３５、及び１８０ｎｇ／ｍＬ抗ＨＩＶ抗体と組み合わせて含有する試料を作り出した。試料は、標準化された試料の量が０：１００、２５：７５、５０：５０、７５：２５、及び１００：０パーセントの混合物比を表す。両方のデータチャネルで生成されたシグナルを処理及び分析した。図７に示されている結果から、組み合わせた試薬キット及び２つのチャネルＰＭＴ設定は、単一の試料における混合された抗原及び抗体シグナルを識別できることが実証された。
［実施例８０］
多重化アッセイの評価 － ライム病ＩｇＧ及びＩｇＭアッセイ。ライム病ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体検出キット（総ライム（ｔｏｔａｌ Ｌｙｍｅ））は、ライムＩｇＧ抗体検出では抗ヒトＩｇＧ抗体－アクリジニウム－ルシファーイエローコンジュゲート溶液（２５ｎｇ／ｍＬ、実施例６９）、また、ライムＩｇＭ抗体検出では抗ヒトＩｇＭ抗体－アクリジニウムコンジュゲート溶液（１５ｎｇ／ｍＬ）を、ライムＩｇＧコンジュゲート希釈剤（ＭＥＳ、洗剤、及びタンパク質安定剤を含有する。）中で調製することにより組み立てた。キットは、実験コンジュゲート、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の可変主要タンパク質様配列発現（ＶｌｓＥ）に由来する組換え抗原でコーティングされたマイクロ粒子、及びｐＨ７．５のアッセイ特異的希釈剤からなっていた。アッセイ試験は、２チャネル光学構成で改造したＡｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）自動化イムノアッセイアナライザーで行った。簡潔には、デュアル光電子増倍管（ＰＭＴ）組立体を構築し、そこで、５００ｎｍ波長をカットオフするダイクロイックミラーを使用して、低波長の光（青）を垂直のＰＭＴに反射させる一方、高波長の光（緑）に、第２のＰＭＴへ向けて鏡を通過させた。適切なフィルターは、ダイクロイックミラーの後方に置いて、光を、それぞれのＰＭＴに達する前にさらにフィルターした。Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ装置のハードウェアを使用して、反射した（ブルー）ＰＭＴからの出力を読み取り、その一方で別個のカウンターモジュール及びラップトップコンピュータインターフェースを使用して、インライン（グリーン）ＰＭＴからのシグナルをコンパイルした。インラインＰＭＴからのシグナルを自動的にプロセスするための特注のコンピュータプログラム（ＩＤＬコード）を開発した。ＣＭＩＡ技術を使用して２－ステップイムノアッセイを行うアッセイ試験は、アッセイファイルを使用して行った。簡潔には、試料、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）洗浄緩衝液、アッセイ希釈剤、及びマイクロ粒子を第１のステップで組み合わせた。試料中に存在するヒト抗ライムＩｇＧ及びＩｇＭ抗体は、ライム抗原コーティングマイクロ粒子に結合する。洗浄後、抗ヒトアクリジニウム－標識コンジュゲートを添加し、マイクロ粒子上に捕捉されたヒト抗体に結合させる。別の洗浄サイクル後、プレトリガー及びトリガー溶液を反応混合物に添加して、化学発光シグナルを生成し、これを相対発光単位（ＲＬＵ）として測定する。
ライムＩｇＧのみの試料を、ライムＩｇＭのみを含有する試料と１：１比で組み合わせた多重化試験を行い、混合した試料の結果を、単一の構成成分試料のものと比較した。緑色及び青色チャネルのそれぞれで生成されたシグナルを処理及び分析した。図８に示されている結果から、組み立てた試薬キットは、単一の試料において混合されたＩｇＭ及びＩｇＧシグナルを識別できることが実証された。
［実施例８１］
遊離Ｔ４及び甲状腺刺激ホルモンの組合せアッセイ － 遊離Ｔ４及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）検出キット（ＦＴ４／ＴＳＨ）は、Ｔ４検出ではＴ３－アクリジニウム－ルシファーイエローコンジュゲート溶液（７５０ｎｇ／ｍＬ、実施例６４）を、洗剤及びＭＥＳ緩衝液を含有するＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）－遊離Ｔ４コンジュゲート希釈剤中で調製することにより組み立てた。マイクロ粒子バルク溶液は、トリス緩衝液、ウシ血清アルブミン、及び洗剤を含有するＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）－遊離Ｔ４マイクロ粒子希釈剤中で、抗Ｔ４抗体－コーティングマイクロ粒子を抗ＴＳＨ抗体－コーティングマイクロ粒子と組み合わせることにより作り出した。実験Ｔ４コンジュゲート及びＦＴ４／ＴＳＨマイクロ粒子ボトルを、Ａｂｂｏｔｔが市場に出しているＴＳＨコンジュゲート（アクリジニウムで標識された抗ＴＳＨ抗体）、及びトリス緩衝液、ｐＨ７．４で構成されるアッセイ特異的希釈剤と組み合わせた。アッセイ試験は、２チャネル光学構成で改造したＡｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）自動化イムノアッセイアナライザーで行った。簡潔には、デュアル光電子増倍管（ＰＭＴ）組立体を構築し、そこで、５００ｎｍ波長をカットオフするダイクロイックミラーを使用して、低波長の光（青）を垂直のＰＭＴに反射させる一方、高波長の光（緑）に、第２のＰＭＴへ向けて鏡を通過させた。適切なフィルターは、ダイクロイックミラーの後方に置いて、光を、それぞれのＰＭＴに達する前にさらにフィルターした。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器におけるハードウェアを使用して、反射された（青）ＰＭＴからの出力を読み取る一方、別のカウンターモジュール及びラップトップコンピュータのインターフェースを使用して、インライン（緑）ＰＭＴからのシグナルを集めた。カスタムコンピュータプログラム（ＩＤＬコード）を開発して、インラインＰＭＴからのシグナルを自動的に処理した。アッセイ試験は、ＣＭＩＡ技術、並びに、１－ステップイムノアッセイ及び２－ステップイムノアッセイを連続して作り出すコンジュゲート試薬を異なるステップで添加する４－ボトルアッセイファイルを使用して行った。簡潔には、試料、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）洗浄緩衝液、アッセイ希釈剤、マイクロ粒子、及び実験Ｔ４コンジュゲートを第１のステップで組み合わせた。Ｔ４は、試料中で、抗Ｔ４マイクロ粒子に結合するために、Ｔ３アクリジニウム－ルシファーイエローコンジュゲートと競合し、ＴＳＨは、試料中で、抗ＴＳＨコーティングマイクロ粒子に結合する。洗浄後、アクリジニウム－標識抗ＴＳＨ抗体コンジュゲートが添加され、マイクロ粒子上に捕捉されたＴＳＨに結合する。別の洗浄サイクル後、プレトリガー及びトリガー溶液を、反応混合物に添加して、相対発光単位（ＲＬＵ）として測定される化学発光シグナルを促進する。
アッセイ性能は、遊離Ｔ４及びＴＳＨに対する較正曲線の形状及び単一の成分対照を読み取る能力により測定した（使用されるＦＴ４キャリブレーターのレベルは、０、０．５、１、２、３．５、及び６ｎｇ／ｄＬであった。使用されるＴＳＨキャリブレーターのレベルは、０、０．５、２、１０、４０、及び１００ｍＩＵ／Ｌであった。）。両方のデータチャネルで生成されたシグナルを処理及び分析した。図９及び表２に示されている結果から、組み立てられた試薬キット及び２つのチャネルＰＭＴ設定は、規格限界内で遊離Ｔ４及びＴＳＨ対照を較正し、読み取ることができると実証された。
Figure 2022543618000083

Claims (50)

  1. 式（Ｉ）の化合物、又はその塩
    Figure 2022543618000084
     ［式中、
    Ｘは、－ＮＨ－又はジアミンリンカーであり、
    Ｙは、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、
    Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は、－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、
    Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在せず、
    Ｑは、－ＳＯ２－又は－ＣＯ－であり、
    Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、アルキレン及びヘテロアルキレンから独立に選択され、
    Ｒ２は、－ＣＯＯＺ及び－ＣＮから選択され、
    Ｚは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、及びヘテロアルキルから選択され、
    Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから独立に選択され、
    それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アリールオキシ、ヘテロアルキル、アルキレン、及びヘテロアルキレンは、１、２、３、４、又は５個の置換基で独立に任意選択的に置換されている。］。
  2. Ｘが、
    Figure 2022543618000085
     から選択されるジアミンリンカーである、請求項１に記載の化合物、又はその塩。
  3. Ｘが、
    Figure 2022543618000086
     である、請求項１又は２に記載の化合物。
  4. Ｙが窒素である、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物、又はその塩。
  5. Ａが、非置換である又はＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから選択される１、２、３、４、若しくは５個の置換基で置換されているアリールである、請求項４に記載の化合物、又はその塩。
  6. Ｑが、－ＳＯ２－である、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物、又はその塩。
  7. Ｒ２が、－ＣＯＯＺである、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物、又はその塩。
  8. Ｚが、水素及びＣ１～Ｃ４アルキルから選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。
  9. Ｌ１及びＬ２がそれぞれ独立にＣ１～Ｃ４－アルキレンである、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物。
  10. Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈがそれぞれ水素である、請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物。
  11. 式（Ｉａ）
    Figure 2022543618000087
     ［式中、
    それぞれのＲは独立に、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルからなる群から選択され、
    ｍは、０、１、２、３、４又は５であり、
    ｎは、１、２、３、４、５又は６である。］を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物、又はその塩。
  12. ｍが１であり、ＲがＣ１～Ｃ４アルキルである、請求項１１に記載の化合物、又はその塩。
  13. ｍが１であり、Ｒがメチルである、請求項１１又は１２に記載の化合物、又はその塩。
  14. ｎが３である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の化合物、又はその塩。
  15. 式（Ｉｂ）
    Figure 2022543618000088
     を有する、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の化合物、又はその塩。
  16. フルオロフォアが、フルオレセイン、ローダミン、ホウ素－ジピロメテン、シアニン、オキサジン、チアジン、クマリン、ナフタルイミド、ロドール、ナフタレン、スクアライン、ポルフィリン、フラビン、及びランタニド系染料から選択される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の化合物、又はその塩。
  17. フルオロフォアが、
    Figure 2022543618000089
    Figure 2022543618000090
    から選択される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の化合物、又はその塩。
  18. 式（ＩＩ）のコンジュゲート、又はその塩
    Figure 2022543618000091
     ［式中、
    Ｘは、－ＮＨ－又はジアミンリンカーであり、
    Ｙは、窒素、酸素、及び硫黄から選択され、
    Ｙが窒素であるとき、Ｒ１は、－ＳＯ２－Ａであり、Ａは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、及びヘテロシクリルアルキルから選択され、
    Ｙが酸素又は硫黄であるとき、Ｒ１は存在せず、
    Ｑは、－ＳＯ２－又は－ＣＯ－であり、
    Ｌ１は、アルキレン及びヘテロアルキレンから選択され、
    Ｌ３はリンカーであり、
    Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈはそれぞれ、水素、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから独立に選択され、
    結合メンバーは、標的分析対象物質に結合することが可能な分子であり、
    それぞれのアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルアルキル、アルキレン、及びヘテロアルキレンは、１、２、３、４、又は５個の置換基で独立に任意選択的に置換されている。］。
  19. Ｘが、
    Figure 2022543618000092
     から選択されるジアミンリンカーである、請求項１８に記載のコンジュゲート、又はその塩。
  20. Ｘが、
    Figure 2022543618000093
     である、請求項１８又は１９に記載のコンジュゲート。
  21. Ｙが窒素である、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又はその塩。
  22. Ａが、非置換である又はＣ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルから選択される１、２、３、４、若しくは５個の置換基で置換されているアリールである、請求項２１に記載のコンジュゲート又はその塩。
  23. Ｑが、－ＳＯ２－である、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の化合物、又はその塩。
  24. Ｌ１が、Ｃ１～Ｃ４－アルキレンである、請求項１８～２３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  25. 化合物が、式（ＩＩａ）
    Figure 2022543618000094
     ［式中、
    Ｒは、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルコキシ、Ｃ１～Ｃ４ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ４ハロアルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、スルホニル、ホスホリル、及びセレニルからなる群から選択され、
    ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
    ｎは、１、２、３、４、５、又は６である。］を有する、請求項１８～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又はその塩。
  26. ｍが１であり、Ｒが、Ｃ１～Ｃ４アルキルである、請求項２５に記載のコンジュゲート、又はその塩。
  27. ｍが１であり、Ｒがメチルである、請求項２５若しくは２６に記載のコンジュゲート、又はその塩。
  28. ｎが３である、請求項２５～２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又はその塩。
  29. リンカーが、アルキレン及びヘテロアルキレンリンカーから選択される、請求項１８～２８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又はその塩。
  30. リンカーが、２個の反応基の間の反応の生成物である部分Ｅを含む、請求項１８～２９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  31. Ｅが、アミド、エステル、カルバメート、及びトリアゾールからなる群から選択される、請求項３０に記載のコンジュゲート。
  32. フルオロフォアが、フルオレセイン、ローダミン、ホウ素－ジピロメテン、シアニン、オキサジン、チアジン、クマリン、ナフタルイミド、ロドール、ナフタレン、スクアライン、ポルフィリン、フラビン、及びランタニド系染料から選択される、請求項１８～３１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又はその塩。
  33. フルオロフォアが、
    Figure 2022543618000095
    Figure 2022543618000096
    Figure 2022543618000097
    から選択される、請求項１８～３２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  34. 結合メンバーが、タンパク質、ペプチド、小分子、核酸、炭水化物、及びデンドリマー又は樹枝状構造から選択される、請求項１８～３３のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又はその塩。
  35. 結合メンバーが、タンパク質であり、タンパク質が、抗体、抗原、受容体、酵素、及び糖タンパク質から選択される、請求項３４に記載のコンジュゲート。
  36. タンパク質が、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、ＨＩＶ抗体、ＨＩＶ抗原、ＨＣＶ抗体、ＨＣＶ抗原、ｐ２４抗原、トロポニン、及び脳性ナトリウム利尿ペプチドから選択される、請求項３５に記載のコンジュゲート、又はその塩。
  37. 結合メンバーが、小分子であり、小分子が、酵素基質、酵素阻害剤、ステロイド、レチノイド、脂質、ビタミン、栄養素、栄養素代謝産物、医薬品又は乱用薬物から選択される、請求項３４に記載のコンジュゲート。
  38. 結合メンバーが、リシン、システイン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸から選択されるアミノ酸残基を介して、式（ＩＩ）のコンジュゲートの残部に付着している、請求項１８～３７のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又はその塩。
  39. コンジュゲートに共有結合で連結する追加の結合メンバーをさらに含む、請求項１８～３８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  40. 生体試料中の目的の分析対象物質を検出する方法であって、
    ａ）生体試料を目的の分析対象物質に結合する少なくとも１つの特異的結合メンバーと接触させて、少なくとも１つの複合体を形成するステップであって、前記特異的結合メンバーが請求項１８～３９のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、ステップ、及び
    ｂ）前記特異的結合メンバーからのシグナルの有無を検出するステップであって、前記シグナルの検出は、前記分析対象物質が前記試料中に存在することを示し、前記シグナルがないことは、前記分析対象物質が前記試料中に存在しないことを示す、ステップ
    を含む、方法。
  41. ａ）生体試料を少なくとも１つの第１の特異的結合メンバー及び少なくとも１つの第２の特異的結合メンバーと接触させるステップであって、前記少なくとも１つの第１の特異的結合メンバー及び前記少なくとも１つの第２の特異的結合メンバーそれぞれが、目的の分析対象物質に特異的に結合し、それにより、第１の特異的結合メンバー－分析対象物質－第２の特異的結合メンバーを含む１つ以上の第１の複合体を生成し、前記第２の特異的結合メンバーが請求項１８～３９のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、ステップ、並びに
    ｂ）第２の特異的結合メンバーからのシグナルの有無を検出するステップであって、前記シグナルの検出は、前記分析対象物質が前記試料中に存在することを示し、前記シグナルがないことは、前記分析対象物質が前記試料中に存在しないことを示す、ステップ
    を含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 生体試料中の２つ以上の目的の分析対象物質を検出する方法であって、
    ａ）生体試料を、（ｉ）第１の目的の分析対象物質に結合して、少なくとも１つの第１の複合体を形成する少なくとも１つの第１の特異的結合メンバー；及び（ｉｉ）第２の目的の分析対象物質に結合して、少なくとも１つの第２の複合体を形成する少なくとも１つの第２の特異的結合メンバーと同時に、又は連続して接触させるステップであって、前記第１及び第２の特異的結合メンバーのそれぞれが、請求項１８～３９のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含み、前記第１及び第２の特異的結合メンバーのそれぞれにおけるコンジュゲートのフルオロフォアが異なる、ステップ、並びに
    ｂ）前記第１及び第２の特異的結合メンバーのそれぞれからのシグナルの有無を検出するステップであって、（ｉ）前記第１の特異的結合メンバーからのシグナルの検出は、第１の分析対象物質が試料中に存在することを示し、前記第１の特異的結合メンバーからのシグナルがないことは、第１の分析対象物質が試料中に存在しないことを示し、（ｉｉ）前記第２の特異的結合メンバーからのシグナルの検出は、前記第２の分析対象物質が試料中に存在することを示し、前記第２の特異的結合メンバーからのシグナルがないことは、前記第２の分析対象物質が試料中に存在しないことを示す、ステップ
    を含む、方法。
  43. 生体試料中の２つ以上の目的の分析対象物質を検出する方法であって、
    ａ）生体試料を少なくとも１つの第１の特異的結合メンバー及び少なくとも１つの第２の特異的結合メンバーと接触させるステップであって、前記少なくとも１つの第１の特異的結合メンバー及び前記少なくとも１つの第２の特異的結合メンバーがそれぞれ、第１の目的の分析対象物質に特異的に結合し、それにより前記第１の特異的結合メンバー－第１の分析対象物質－第２の特異的結合メンバーを含む１つ以上の第１の複合体を生成し、前記第２の特異的結合メンバーが請求項１８～３９のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、ステップ、及び
    ｂ）生体試料を少なくとも１つの第３の特異的結合メンバー及び少なくとも１つの第４の特異的結合メンバーと同時に、又は連続して接触させるステップであって、前記少なくとも１つの第３の特異的結合メンバー及び前記少なくとも１つの第４の特異的結合メンバーがそれぞれ、第２の目的の分析対象物質に特異的に結合し、それにより、前記第３の特異的結合メンバー－第２の分析対象物質－第４の特異的結合メンバーを含む１つ以上の第２の複合体を生成し、前記第４の特異的結合メンバーは、請求項１６～３４のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含み、前記第２及び第４の特異的結合メンバーのそれぞれにおけるコンジュゲート中のフルオロフォアが異なる、ステップ、並びに
    ｃ）第２及び第４の特異的結合メンバーのそれぞれからのシグナルの有無を検出するステップであって、（ｉ）前記第２の特異的結合メンバーからのシグナルの検出は、前記第１の分析対象物質が試料中に存在することを示し、前記第２の特異的結合メンバーからのシグナルがないことは、前記第１の分析対象物質が試料中に存在しないことを示し、さらに（ｉｉ）前記第４の特異的結合メンバーからのシグナルの検出は、前記第２の分析対象物質が試料中に存在することを示し、前記第４の特異的結合メンバーからのシグナルがないことは、前記第２の分析対象物質が試料中に存在しないことを示す、ステップ
    を含む、方法。
  44. 生体試料を少なくとも１つの第５の特異的結合メンバー及び少なくとも１つの第６の特異的結合メンバーと同時に、又は連続して接触させるステップであって、前記少なくとも１つの第５の特異的結合メンバー及び前記少なくとも１つの第６の特異的結合メンバーがそれぞれ、第３の目的の分析対象物質に特異的に結合し、それにより、前記第５の特異的結合メンバー－第３の分析対象物質－第６の特異的結合メンバーを含む１つ以上の第３の複合体を生成し、前記第６の特異的結合メンバーが請求項１８～３９のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含み、前記第２、第４及び第６の特異的結合メンバーのそれぞれにおけるコンジュゲートのフルオロフォアが異なる、ステップ、並びに
    第２、第４及び第６の特異的結合メンバーのそれぞれからのシグナルの有無を検出するステップであって、（ｉ）前記第２の特異的結合メンバーからのシグナルの検出は、第１の分析対象物質が試料中に存在することを示し、前記第２の特異的結合メンバーからのシグナルがないことは、前記第１の分析対象物質が試料中に存在しないことを示し、（ｉｉ）前記第４の特異的結合メンバーからのシグナルの検出は、第２の分析対象物質が試料中に存在することを示し、前記第４の特異的結合メンバーからのシグナルがないことは、前記第２の分析対象物質が試料中に存在しないことを示し、（ｉｉｉ）前記第６の特異的結合メンバーからのシグナルの検出は、第３の分析対象物質が試料中に存在することを示し、前記第６の特異的結合メンバーからのシグナルがないことは、前記第３の分析対象物質が試料中に存在しないことを示す、ステップをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 生体試料が、全血、血清、尿、脳脊髄液、羊水、唾液又は血漿である、請求項４０～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 第１の特異的結合メンバー及び／又は第２の特異的結合メンバーが、固体支持体上に固定化されている、請求項４１に記載の方法。
  47. 第１の特異的結合メンバー、第２の特異的結合メンバー、第３の特異的結合メンバー、及び／又は第４の特異的結合メンバーが、固体支持体上に固定化されている、請求項４２に記載の方法。
  48. 第１の特異的結合メンバー、第２の特異的結合メンバー、第３の特異的結合メンバー、第４の特異的結合メンバー、第５の特異的結合メンバー及び／又は第６の特異的結合メンバーが、固体支持体上に固定化されている、請求項４４に記載の方法。
  49. 臨床化学アッセイ、イムノアッセイ又は単一分子検出アッセイを使用して行われる、請求項４０～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 検出するステップの前に、過酸化水素を生体試料に添加するステップをさらに含む、請求項４０～４９のいずれか一項に記載の方法。
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